programa de pÓs-graduaÇÃo em biologia animallivros01.livrosgratis.com.br/cp032309.pdfos animais...

1UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS, LETRAS E CIÊNCIAS EXATAS

SÃO JOSÉ DO RIO PRETO - SP

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ANIMAL

SÍLVIA ROSANA PAGLIARINI CABRAL

CCiicclloo RReepprroodduuttiivvoo MMaassccuulliinnoo ddee PPhhrryynnooppss ggeeooffffrrooaannuuss ((TTeessttuuddiinneess,,

CChheelliiddaaee))

ORIENTADOR: PROF. DR. CLASSIUS DE OLIVEIRA

CO-ORIENTADOR: PROF. DR. SEBASTIÃO ROBERTO TABOGA

- 2007

Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Universidade Estadual Paulista, para obtenção do título de Mestre em Biologia

Animal.

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

2RESUMO

No Brasil, os trabalhos referentes à biologia reprodutiva de quelônios, relatam

principalmente, o comportamento reprodutivo e a interferência da temperatura na

determinação do sexo. Várias pesquisas reportam o ciclo reprodutivo em espécies

de clima temperado do Hemisfério Norte, entretanto, poucos trabalhos enfatizam a

histologia e o ciclo testicular em espécies tropicais. Com o objetivo de contribuir com

o conhecimento sobre aspectos da biologia reprodutiva dos Testudines, o presente

estudo descreve o ciclo reprodutivo masculino de Phrynops geoffroanus (Pleurodira:

Testudines: Chelidae), com base na biometria (IGS e volume) e histologia dos

testículos, morfometria (área, diâmetro e altura do epitélio) e análise da população

celular dos túbulos seminíferos, verificando as variações ao longo do ano. Descreve,

ainda, a histologia das vias seminíferas extratesticulares (dúctulos eferentes,

epidídimos e ductos deferentes) e analisa as variações na altura do epitélio

epididimário. Os animais foram coletados mensalmente durante o período de junho

de 2005 a maio de 2006, num afluente do Rio Preto, na zona urbana de São José do

Rio Preto, estado de São Paulo/Brasil. Métodos convencionais de preparação

histológica para microscopia de luz foram adotados. Análise estatística foi utilizada

para melhor interpretação dos resultados. Phrynops geoffroanus, são cágados de

médio porte e amplamente distribuídos na região Neotropical. Possuem testículos

ovais, formados por túbulos seminíferos interconectados pelo interstício. Mudanças

anuais na biometria dos testículos foram observadas ao longo do ano, com médias

de IGS e volume maiores durante o final da primavera e início do verão. Variações

das médias da área, diâmetro e altura do epitélio dos túbulos seminíferos, assim

como da população de células germinativas foram verificadas, permitindo a divisão

do ciclo testicular em cinco fases: recrudescência, espermiogênica, reprodução

completa, regressão e quiescência, com pico da atividade espermatogênica em

dezembro. Como a espermatogênese ocorre antes ou simultaneamente ao período

reprodutivo, a espermatogênese é considerada pré-nupcial, ao contrário do que

ocorre nas espécies de clima temperado onde o padrão é descrito como pós-nupcial.

A presença de espermatozóides nos epidídimos durante todos os meses analisados,

sugere que os machos podem utilizar tanto os espermatozóides produzidos em

ciclos anteriores e que ficam armazenados nos epidídimos, como os produzidos no

novo ciclo. A temperatura parece ser um fator abiótico importante, pois o aumento

3do IGS e dos parâmetros morfométricos dos túbulos seminíferos, estão

correlacionados com a elevação da temperatura na primavera e verão, e a

regressão e quiescência aos meses mais frios (outono e inverno). A

espermatogênese em Phrynops geoffroanus, é mais longa, e os períodos de

regressão e quiescência são bastante curtos, quando se compara com espécies de

Testudines de clima temperado.

4ABSTRACT

In Brazil, the assignments concerning reproductive biology of the chelonians mention,

mainly, the reproductive behavior and the interference of the temperature in the sex

determination. Several researches mention the reproductive cycle in species

belonging to the tempered weather in the North Hemisphere; however, few

assignments emphasize the histology and the testicular cycle in tropical species.

Aiming at contributing to the knowledge about aspects of the reproductive biology of

the Testudines, this study describes the male reproductive cycle of Phrynops

geoffroanus (Pleurodiran: Testudines: Chelidae), based on biometry (IGS and

volume) and on the histology of the testicles, morfometry (area, diameter, and

epithelium height) and analyses of the cellular population of the seminiferous tubules,

verifying the variations throughout the year. Yet, it describes the histology of the

estratesticular seminiferous tubules (efferent ductules, epididymis and defferent

ducts) and it analyses the variations in the height of the epididimarium epithelium.

The animals were monthly collected from June 2005 to May 2006, in an afluent of Rio

Preto, in the city of São José do Rio Preto, state of São Paulo, Brazil. Conventional

methods of histological preparation for the light microscopy were adopted. The

statistical analysis was used for a better interpretation of the results. Phrynops

geoffroanus are freswater of small size and widely distributed in the Neotropical

region. They have oval testes, formed by seminiferous tubules interconnected by the

interstice. Annual changes in the testes biometry were observed throughout the year,

with higher IGS averages and volumes during late spring and early summer.

Variations of the averages of the area, diameter and height of the epithelium of the

seminiferous tubules, as well as the population of germinative cells were verified,

allowed the division of the testicular cycle into five phases: recrudescence,

spermiogenic, complete reproduction, regression and quiescence, with peak at the

spermatogenic activity in December. As the spermatogenesis happens before or

simultaneously to the reproductive period, it is considered prenuptial, the opposite

that happens in the species of tempered weather where the pattern is described as

postnuptial. The presence of spermatozoa in the epididymis during all the analyzed

months, suggest that the males can use the spermatozoa produced in previous

cycles and that are stored in the epididymis, as much as the ones produced in the

new cycle. The temperature seems to be an important abiotic factor, because the

5increase of the IGS and the morfometrical parameters of the seminiferous tubules

are correlated to the elevation of the temperature of spring and summer, and the

regression and quiescence to the coldest months (autumn and winter). The

spermatogenesis in Phrynops geoffroanus is the longest one, and the regression

periods and quiescence are quite short when compared to species of Testudines

from tempered weather.

61 INTRODUÇÃO

1.1 Panorama geral dos répteis

Os répteis constituem o primeiro grupo de vertebrados a conquistar o

ambiente terrestre. Evoluíram de anfíbios, durante a era Paleozóica. Os fósseis mais

antigos são do período Carbonífero (ORR, 1986).

A transição entre anfíbios e répteis é menos clara no registro fossilífero, do

que entre peixes e anfíbios, pois as principais diferenças entre ambos não são

encontradas na configuração do esqueleto, mas sim, no modo de reprodução. O

grande salto evolutivo foi o desenvolvimento do ovo amniótico, que liberou estes

vertebrados terrestres do ambiente aquático, permitindo a ocupação do continente,

para a procura de alimentos e novos hábitats (McALESTER, 1978).

Uma vez estabelecidos no ambiente terrestre, os répteis tornaram-se os

vertebrados dominantes. Durante a era Mesozóica apresentaram uma grande

irradiação adaptativa com uma grande diversidade de formas, sendo representados

por 16 ordens descritas. O declínio do grupo no final do mesozóico tem sido motivo

de especulações.

As espécies atuais de répteis, estimadas em 6000, estão distribuídas em 5

ordens. Assim como os demais amniotas, e também as formas extintas, estão

agrupados de acordo com o grau de fenestração do osso temporal, em Anapsida,

Diapsida e Sinapsida. As aberturas temporais refletem o aumento do grau de

complexidade da musculatura mandibular. Os Anapsida consistem de répteis cujos

crânios não possuem nenhuma fossa temporal. Os representantes atuais são os

Chelonia, Testudomorpha ou Testudines, que inclui os cágados, jabutis e tartarugas.

Os Diapsida possuem duas aberturas temporais no crânio e estão

representados nos grupos atuais pelos Lepidosauromorpha (lagartos, serpentes,

tuatara e anfisbenias) e Archosauromorpha (crocodilianos e aves).

Os Sinapsida são amniotas com uma abertura temporal lateral. São

reconhecidas 2 ordens, ambas extintas: os Pelycosauria e os Therapsida.

Atualmente são representados pelos mamíferos (POUGH et al., 2002; POUGH et al.,

2003).

Uma das principais divisões entre os amniota é em Synapsideos e

Sauropsídeos (répteis e aves). Os sauropsídeos podem ser subdivididos em

Parareptilia (para-répteis), que provavelmente inclui os Testudines, e Eureptilia

7(répteis verdadeiros), que inclui os lepidossauros e arcossauros. Estudos recentes

consideram o crânio anapsídio como uma característica secundariamente derivada

dos diapsídios. Esta posição radicalmente diferente é sustentada por similaridades

anatômicas e moleculares. (POUGH et al., 2003; RIEPPEL, 1999).

1.2 Os Testudines

Os Testudines (sinonímia: Testudinata ou Chelonia) contam atualmente com

aproximadamente 260 espécies. O grupo descobriu um modo de vida bem sucedido

durante o Triássico, e desde então sofreram poucas modificações. Os fósseis mais

antigos foram encontrados em depósitos do Triássico superior da Alemanha,

Tailândia e Argentina (McALESTER, 1978; ERNEST e BARBOUR, 1989).

Apresentam uma combinação de caracteres primitivos e altamente

especializados, que não são partilhados com nenhum outro grupo de vertebrados. O

casco, que é a chave de seu sucesso, limitou a diversificação do grupo. A morfologia

do casco reflete a ecologia da espécie: as formas mais terrestres, possuem cascos

em forma de cúpula e pés semelhantes aos dos elefantes. Cascos mais achatados e

pés com membranas interdigitais, ou mesmo ausência de dedos, indica hábito

aquático ou semi-aquático (POUGH et al., 2003).

São representados pelas tartarugas, cágados e jabutis. As tartarugas são

principalmente espécies marinhas, onde geralmente, apenas as fêmeas saem da

água para a postura dos ovos. São animais basicamente aquáticos e seus membros

evoluíram para nadadeiras planas com pequenas garras. Os cágados são

representados por quelônios que geralmente habitam rios, tendo hábitos aquáticos

ou semi-aquáticos. Possuem patas palmadas, com membranas interdigitais e garras

afiadas utilizadas na locomoção terrestre, para subir em troncos, escavar o solo ou o

leito dos rios à procura de alimento e para auxiliar a cópula. Os jabutis são formas

adaptadas para habitar a terra firme. Possuem cascos mais côncavos, patas

robustas e cilíndricas, geralmente em forma de tocos. Sua musculatura é bastante

desenvolvida para suportar o elevado peso que algumas espécies podem atingir

(GOULART, 2004).

A fauna de quelônios da América do Sul é rica e variada. Aproximadamente

20% das espécies catalogadas ocorrem na região neotropical (PRITCHARD e

TREBBAU, 1984), incluindo representantes de oito das treze famílias viventes.

8 A presença de um casco é a característica mais distintiva dos quelônios. Os

termos carapaça e plastrão são aplicados aos cascos dorsal e ventral,

respectivamente. São formados por placas dérmicas ósseas, que se unem por uma

ponte. Externamente, são revestidas por escamas epidérmicas.

As tartarugas atuais e também as extintas, são comumente divididas em 2

sub-ordens: as Cryptodira (cripto: escondido; dire: pescoço) retraem a cabeça para

dentro do casco, curvando o pescoço na forma de um “S” vertical. Os Pleurodira

(pleuro: lado) retraem a cabeça curvando o pescoço horizontalmente. Os Cryptodira

são os testudines dominantes, estão distribuídas em nove famílias, sendo a maioria

encontradas no hemisfério norte, com formas terrestres e aquáticas na América do

Sul e terrestres na África. Na Austrália o grupo é ausente (POUGH et al., 2003)

Os Pleurodira atuais são encontrados apenas no hemisfério sul (América do

Sul, região Australiana e África). Atualmente estão agrupadas em três famílias:

Chelidae, Pelomedusidae e Podocnemidae (POUGH et al., 2003; GOULART, 2004).

1.3 A família Chelidae

A família Chelidae foi descrita por Ogilby em 1905. Seus representantes são

conhecidos como cágados de “pescoço-de-cobra”. Estão naturalmente distribuídos

nas regiões Neotropical (América do Sul) e Australiana (Austrália e Nova Guiné).

Todas as espécies viventes são dulcícolas (PRITCHARD e TREBBAUD, 1984).

Várias características morfológicas direrenciam os cágados da família

Chelidae dos demais grupos, dentre elas destaca-se a retenção lateral do pescoço,

com especializações vertebrais associadas; pelve fundida à carapaça e plastrão;

ossos neurais freqüentemente reduzidos ou ausentes; treze escudos no plastrão;

ausência de mesoplastrão e doze pares de escudos marginais.

No Brasil, ocorrem cinco gêneros da família Chelidae: Achantochelys, Chelus,

Hydromedusa, Phrynops e Platemis, num total de 16 espécies, sendo a família que

apresenta maior diversidade local. São encontrados em rios, lagos e córregos de

diversos ecossistemas desde a floresta Amazônica e Atlântica, Pantanal, Caatinga e

banhado do Taim. Molina (1998) e Mittermeier et al. (1980) consideram o gênero

Phrynops o menos conhecido de sua família e também o mais complexo e diverso

taxonomicamente. Tem havido uma certa confusão na história taxomômica do grupo

que ainda não foi resolvida definitivamente. Das onze espécies reconhecidas, nove

9ocorrem no Brasil (POUGH et al., 2002; PRITCHARD e TREBBAUD, 1984; RIBAS

e MONTEIRO FILHO, 2002).

1.4 A espécie

A espécie Phrynops geoffroanus foi descrita por Schweigger em 1812. Sua

distribuição na região neotropical é bastante ampla (Amazônia colombiana,

Venezuela, Guianas, Uruguai, norte da Argentina e Brasil, de norte a sul) (GUIX et

al., 1989; DUELLMAN, 1979).

São facilmente reconhecidos quando jovens por apresentarem um padrão de

coloração característico com manchas pretas e laranja escuro no plastrão e ponte.

Estas manchas tornam-se menos intensas no indivíduo adulto. Possuem carapaça

achatada e larga, com coloração marrom escura ou cinza esverdeada. O plastrão

possui um entalhe anal e tem uma coloração vermelha rosada com manchas pretas

irregulares. A cabeça é larga e lisa com coloração preta, linhas brancas e

irregulares. A parte inferior é branca com linhas e pontos pretos. A característica

mais marcante dessa espécie é uma linha preta e larga que se estende

longitudinalmente pelo olho. Possui, também, um par de barbelas brancas com

extremidades pretas no queixo, característica responsável pela denominação

popular da espécie como cágados-de-barbicha ou barbelas. Em Phrynops hilarii, as

extremidades das barbelas são brancas (PRITCHARD e TREBBAUD, 1984).

São cágados de médio porte, com as fêmeas maiores que os machos.

Poucos trabalhos têm relatado as médias de tamanho corporal para esta espécie.

Estudos realizados com animais adultos de cativeiro indicam um tamanho médio de

Macho adulto de Phrynops geoffroanus.

1021cm (comprimento total da carapaça) para machos e 35 cm para fêmeas. (GUIX

et al., 1989). O maior indivíduo conhecido de Phrynops geoffroanus é um espécime

(MNHNP 9417) depositado na coleção de um museu de História Natural em Paris,

com 39,1cm (PRITCHARD e TREBBAU, 1984).

Em ambiente natural, os adultos são observados durante as horas de sol,

repousando nas margens e troncos emersos de rios, remansos e lagoas.

Freqüentemente caem em redes de pescadores e abocanham iscas em anzóis

(ERNEST e BARBOUR, 1989). Podem ser vistos em grupos de 15-20 indivíduos

repousando juntos. Geralmente entram na água quando observados à distância.

Possuem hábito predominantemente diurno. Dormem à noite, abaixo da superfície

em troncos submersos e galhos.

Estudos realizados por Madem (1960) apud (PRITCHARD e TREBBAU,

1984) examinando o conteúdo estomacal de vários indivíduos, concluíram tratar-se

de uma espécie predominantemente carnívora. Os itens alimentares encontrados

constaram de restos de pequenos peixes, insetos (Orthoptera e Coleóptera) e

material vegetal.

O dimorfismo sexual dos cágados pode ser observado pelo tamanho da

cauda e a disposição da cloaca. As fêmeas possuem cauda pequena, curta e uma

cloaca junto ao corpo. Nos machos, a cauda é mais longa e robusta e a cloaca tem

uma posição mais distal, após o final da carapaça. O plastrão é ligeiramente mais

côncavo e mais colorido nos machos (GOULART, 2004; GUIX et al, 1989).

1.5 Aspectos reprodutivos dos Testudines

Os quelônios são animais de vida longa, mesmo espécies pequenas

demoram anos para atingir a maturidade sexual. Espécies maiores têm vida mais

m f

Vista ventral de macho (m) e fêmea (f) de Phrynops geoffroanus evidenciando o dimorfismo sexual quanto ao tamanho dos indivíduos e forma do plastrão.

11longa. A longevidade dificulta o estudo da história de vida do grupo e está

geralmente associada a uma baixa taxa de reposição de indivíduos na população, o

que pode aumentar o risco de extinção em ambientes poluídos (POUGH et al.,

2003).

Os quelônios são todos ovíparos de fecundação interna, e todos enterram

seus ovos no solo. Depois de depositados e cobertos são abandonados pelas

fêmeas, não exibindo nenhum cuidado parental (HICKMAN et al., 2004). Podem

empregar sinais táteis, visuais, olfativos e apresentar interações agonísticas,

relacionados à reprodução (MOLINA e GOMES, 1992). O número de ovos varia com

a espécie e o tamanho do animal. Os fatores ambientais exercem efeitos

importantes sobre o desenvolvimento do ovo, destacando-se a temperatura, a

umidade e as concentrações de oxigênio e de dióxido de carbono, que podem

afetar significativamente o desenvolvimento embrionário. A temperatura pode

determinar o sexo em muitas espécies de quelônios, como também acontece com

crocodilianos e lagartos (VENEZUELA et al., 1997; VANZOLINI, 1977; TORRES et

al., 2002; VOGT e BULL, 1982).

Variações geográficas e climáticas interferem nos parâmetros reprodutivos.

Estudos realizados por Gibbons (1970), com tartarugas almiscaradas, revelam que

indivíduos da mesma idade atingem a maturidade sexual e apresentam dimorfismo

sexual em épocas diferentes, dependendo da região onde vivem.

Pesquisas sobre o comportamento reprodutivo de Phrynops geoffroanus

(GUIX et al., 1989; MOLINA, 1992; MOLINA, 1998) em cativeiro, indicam que o

período de acasalamento ocorre entre outubro e abril. Interações agressivas foram

observadas principalmente durante esse período. Tais comportamentos envolvem os

indivíduos de ambos os sexos, sendo mais freqüentes entre machos. O macho

aproxima-se de outro indivíduo da espécie para examinar olfativamente a região

cloacal, mordendo-lhe a cauda e a porção posterior do casco. A interação agressiva

só prossegue se os indivíduos forem machos (MOLINA, 1992).

O período de nidificação da espécie ocorre nos meses de março até

novembro e as desovas ocorrem predominantemente no período da tarde e

envolvem várias etapas, que incluem a escolha do local, abertura da cova, postura

dos ovos e cobertura do ninho. É comum a eliminação de um líquido cloacal (GUIX

et al., 1989).

12 O número de ovos depositado por ninhada é variado (7 a 26). Os ovos são

esféricos, de cor branca, casca calcária e lisa, pesando de 9,7 a 20g. O tempo de

incubação é longo, variando entre 206 e 319 dias, em cativeiro. A temperatura

exerce forte influência sobre a velocidade de desenvolvimento embrionário: em

estufa 150 dias (PRITCHARD e TREBBAU, 1984) (GUIX et al., 1989) e 120 dias sob

condições artificiais (28-31º).

Em cativeiro os nascimentos estiveram relacionados ao regime pluviométrico

e após dias de índices pluviométricos elevados. Esta condição parece favorecer a

eclosão dos ovos e a saída dos filhotes dos ninhos (emergência), bem como a

conquista de ambientes temporários (GUIX et al., 1989).

Quanto aos aspectos morfológicos, o sistema urogenital de tartarugas adultas

é constituído em ambos os sexos por um par de rins e ureteres, uma bexiga urinária,

um par de bexigas acessórias, gônadas e cloaca (HILDEBRAND, 1995; MALVASIO,

1986). Nos machos as estruturas sexuais são um par de testículos, os dúctulos

eferentes, um par de epidídimos, um par de ductos deferentes, um pênis, e em

indivíduos jovens, ovidutos remanescentes (MALVASIO, 1986). Os testículos são

esféricos ou ovais e de coloração branco-amarelada. Estão presos ventralmente

aos rins pelo mesórquio. Os epidídimos são alongados e enovelados. De cada

testículo partem os dúctulos eferentes, que após se confluírem, são denominados

ductos epididimários. Estão presentes os bulbos do corpo cavernoso, uma massa de

tecido esponjoso responsável pela eversão do pênis (ASHLEY, 1969). Os corpos

cavernosos do pênis situam-se na parede ventral da cloaca e têm formato de cristas

longitudinais, estando separadas por um sulco (ROMER e PARSONS, 1985).

Nas fêmeas as estruturas são um par de ovários, um par de ovidutos e um

clitóris, algumas espécies de quelônios têm capacidade de armazenar

espermatozóides em seus tratos genitais por longos períodos (GIST e JONES,

1987).

A independência da água para a reprodução, com o desenvolvimento do ovo

amniótico e a fertilização interna que passou a ser adotada entre todos os amniotas,

envolveu uma série de adaptações morfológicas e fisiológicas. Nos machos o

sistema reprodutor apresenta epidídimos, relacionados com o armazenamento

temporário de espermatozóides, e órgãos intromitentes – pênis- para a transferência

de gametas para o corpo das fêmeas. (ROMER e PARSONS, 1985). Nos Testudines

13a maturidade sexual nos machos pode ser demonstrada pela presença de

espermatozóides nos túbulos seminíferos e ductos do epidídimo.

Os Testudines constituem o mais antigo grupo de amniotas viventes e

representam um dos grupos de vertebrados que mais cedo utilizaram os epidídimos

para armazenamento de espermatozóides (HOLMES e GIST, 2004). Os

espermatozóides podem ficar armazenados por longos períodos de tempo. Entre os

quelônios de zona temperada que se reproduzem sazonalmente, os

espermatozóides produzidos no verão são armazenados no epidídimo e utilizados

em acasalamentos que ocorrem durante o ano (JONES, 1999; GIST et al., 2000).

Como os demais amniotas, os quelônios possuem testículos formados por

túbulos seminíferos, ao contrário da maioria dos vertebrados anamniotas (peixes e

anfíbios) onde a organização testicular é cística (OLIVEIRA et al., 2002; OLIVEIRA

et al., 2003). Este padrão de organização testicular é considerado uma adaptação à

independência da água para a reprodução, contribuindo para a conquista do

ambiente terrestre (GRIBBINS et al., 2003).

Estudos com espécies de quelônios de clima temperado, revelam variações

do diâmetro testicular e os túbulos seminíferos com um padrão de crescimento e

regressão cíclicos ao longo do ano (MAHMOUD e KLICKA, 1972; FLORES-VILELA

e ZUG, 1995). Análises histológicas de testículos de Trachemys scripta (GRIBBINS

et al., 2003) indicam que há mudanças citológicas cíclicas durante a

espermatogênese e diferentes tipos morfológicos de espermatogônias e demais

células da linhagem germinativa foram identificadas. As células que iniciam a

meiose, caracterizam-se por apresentar aumento do núcleo e do citoplasma e

condensação da cromatina em cromossomos. Células em diferentes estádios da

meiose foram identificadas, revelando haver predomínio de determinados tipos

celulares em diferentes épocas do ano. A espermiogênese pode ser divida em 8

etapas culminando com a formação do espermatozóide (SPRANDO e RUSSEL,

1998; IBARGÜENGOYTÍA et al., 1999; GRIBBINS et al., 2003).

Os padrões de atividade reprodutiva dos répteis estão geralmente associados

aos fatores ambientais (MARION, 1982; SAINT GIRONS, 1982). Espécies de zonas

temperadas exibem ciclos reprodutivos com fases de atividade reprodutiva e

quiescência evidentes (CHRISTIANSEN e DUNHAN, 1972; MAHMOUD e KLICKA,

1972; SHINE, 1977; McPHERSON e MARION, 1981; ETCHEMBERG e STOVAL,

1990; MAHMOUD e CYRUS, 1992; ROSTAL et al., 1992; FLORES-VILELA e ZUG,

141995; BULL et al., 1997; FERREIRA et al., 2002; GRIBBINS et al., 2003;

GRIBBINS et al., 2003; GRIBBINS et al., 2005; OCHOTORENA et al., 2005;

RAMIRES-SANDOVAL et al., 2005; GRIBBINS et al., 2006). Nas espécies de clima

tropical os ciclos reprodutivos são, geralmente, descritos como contínuos, pois a

produção de espermatozóides ocorre durante todo o ano (LICHT, 1982). Entre os

Testudines existem três padrões de espermatogênese: o pré-nupcial, o pós-nupcial

e a espermatogênese acíclica. De acordo com Meyland et al., (2002), no tipo pré-

nupcial a espermatogênese precede a reprodução; no padrão pós-nupcial os

espermatozóides utilizados na estação reprodutiva (geralmente na primavera) são

produzidos em ciclos reprodutivos do ano anterior e que foram armazenados nos

epidídimos (LOFTS e TSUI, 1977). Na espermatogênese acíclica há uma contínua

produção de espermatozóides, sem apresentar uma fase definida de pico ou

quiescência testicular (MEYLAND et al., 2002; GRIBBINS et al., 2003).

Segundo Crew, (1987) apud (MEYLAND et al., 2002), a espermatogênese

pré-nupcial de recrudescência gonadal é esperada em ambientes tropicais, e de

acordo com Georges (1983), também tem sido descrita para aves e mamíferos de

regiões temperadas. Entre os Testudines 9 das 13 famílias foram estudadas, e

apenas os Trionichidae, Testudinidae e Chelidae possuem padrão pré e pós-nupcial

(MEYLAND et al., 2002). Os padrões cíclicos de atividade gonadal são influenciados

pelos fatores abióticos e controlados pelos hormônios gonadotrópicos e testosterona

(LOFTS e TSUI, 1977; CALLARD et al., 1976; LICHT, 1982; LICHT et al.,1985;

DUBOIS et al., 1988).

O hábito aquático da maioria dos quelônios dificulta as observações na

natureza e contribuem para a falta de informações detalhadas sobre sua história

natural. São poucos os estudos anatômicos com ênfase na morfologia gonadal. A

escassez de dados referentes à morfologia e histologia do aparelho reprodutor de

quelônios foi um dos principais fatores que motivou-nos a desenvolver esta

pesquisa. As informações referentes à biologia reprodutiva de quelônios brasileiros

estão direcionadas, geralmente, para estudos da ecologia, estratégias reprodutivas

e a interferência da temperatura na determinação do sexo.

A reprodução é um dos imperativos para a perpetuação da espécie e está

diretamente relacionada às condições ambientais. No presente trabalho, machos de

Phrynops geoffroanus foram coletados em seu ambiente natural, ao longo de um

ano, para demonstrar a interferência da sazonalidade na morfofisiologia gonadal.

15 Os dados obtidos poderão contribuir para um maior conhecimento dos

aspectos relacionados à atividade reprodutiva dos cágados permitindo o

desenvolvimento de ações e técnicas de manejo que minimizem o impacto da

atividade humana nos ambientes onde estes animais vivem.

162 OBJETIVOS

2.1 Geral:

Este trabalho teve como objetivo geral avaliar aspectos da biologia

reprodutiva de machos de Phrynops geoffroanus (Pleurodira, Chelidae) relacionados

com a estrutura e o ciclo testicular.

2.2 Específicos:

• Descrição anatômica do sistema reprodutor masculino.

• Caracterizar histologicamente os testículos e as vias seminíferas.

• Descrever sucintamente as células da linhagem espermatogênica.

• Relacionar as variações estruturais e histológicas dos testículos durante o

ciclo reprodutivo com a influência da sazonalidade por meio de parâmetros

morfométricos e biométricos dos testículos e células da linhagem

espermatogênica.

173 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Geral

Machos adultos de Phrynops geoffroanus (N=16) foram coletados

mensalmente no período de junho de 2005 à maio de 2006 (Licença de captura nº

061/2005-RAN/IBAMA). Os animais foram capturados por meio de pesca manual

com a utilização de anzóis com fisga, em excursões durante o período vespertino no

córrego Felicidade, (S 20º 46’ 20.6”, W 49º 21’ 18.0”) um afluente do Rio Preto, na

zona urbana de São José do Rio Preto, SP, Brasil. Os pontos de coleta recebem

esgoto de origem doméstica, apresentam margem plana intercalada com barrancos,

que são predominantes na extensão da área de coleta. A vegetação marginal é

predominantemente herbácea, e o local é bastante degradado devido à atividade

antrópica.

Os animais capturados foram transportados ao IBILCE/UNESP e mantidos

vivos em tanques por um período de até três dias. Foram sacrificados de acordo

com as recomendações do COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal),

utilizando-se dosagens elevadas do anestésico Cloridrato de Ketamina

administrados por injeção intraperitonial, por conduzirem a uma morte calma e

minimizar o sofrimento do animal (AURICCHIO e SALOMÃO, 2002). Adicionalmente

foram utilizadas injeções de etanol no encéfalo dos animais.

Dados de natureza biométrica como o comprimento máximo da carapaça

(cmc), e comprimento máximo do plastrão (cmp) foram obtidos, segundo o método

descrito por Cagle (1939) apud Molina (1998). Para medir o comprimento máximo da

carapaça e do plastrão utilizou-se uma fita métrica de precisão (1mm). O peso total

foi obtido com uma balança de precisão (1g).

18Os animais foram abertos com auxílio de uma serra circular vibratória,

adequada para osteotomia. Após a remoção do plastrão esternal, os órgãos foram

afastados para melhor visualização das vísceras e então o sistema reprodutor foi

removido e submetido aos demais procedimentos.

Os testículos foram pesados (g) por uma balança analítica de precisão

(0,001g) e medidos (cm) com paquímetro de metal com precisão de 0,05 (mm).

Dados do comprimento e largura foram obtidos para se estimar o volume das

gônadas segundo a fórmula: V= ¾ x π x a x b2, onde a= eixo maior (comprimento) e

b= eixo menor (largura). A massa (peso em gramas), dos testículos e do corpo foram

utilizadas para o cálculo do o índice gonadossomático (IGS= massa total dos

testículos/ massa total do corpo x 100).

3.2 Preparação do tecido para microscopia

Por conveniência foram utilizados os testículos e os epidídimos esquerdos

para o processamento histológico. Foram retirados fragmentos da extremidade

cranial, porção medial e extremidade caudal do testículo e da região da cabeça, do

corpo e da cauda do epidídimo. Fragmentos do terço médio do ducto deferente

esquerdo foram retirados. Após serem fixados em solução Bouin por 24 horas, e

desidratados em série crescente de álcool (Hopwood, 1990) foram incluídos em

resina do tipo Methacrilato glicol, Historesin (Leica, Germany) e Paraplast,

(Oxford, Labware, USA). Secções de 3 µm foram cortadas e posteriormente coradas

com Hematoxilina-Eosina e PAS (Periodic Acid Schiff’s).

3.3 Analise histológica

Para análise morfológica, as lâminas montadas foram observadas ao

microscópio Olympus BX 60 e analisadas por meio do programa de análise de

imagens, Image Pro-plus, no Centro de Microscopia e Microanálise do

IBILCE/UNESP -SJRP-SP/BR. Para a identificação dos tipos celulares foram

utilizadas imagens digitalizadas de secções de túbulos seminíferos com aumento de

20x (50µm).

Dez túbulos seminíferos em cortes transversais por animal, aleatoriamente

selecionados, em 3 cortes histológicos diferentes foram analisados (N=30 por

animal).

19Dados morfométricos, como o diâmetro dos túbulos seminíferos (largura

maior e largura menor), área e altura do epitélio seminífero foram obtidos, utilizando

a objetiva de 5x para o cálculo do diâmetro e área, e 20x para a altura do epitélio.

Secções dos epidídimos em cortes transversais, aleatoriamente selecionados

e em três cortes histológicos diferentes (cabeça, corpo e cauda) foram medidos (8

medidas por região), totalizando em 24 por animal.

Para verificar a existência de diferenças histológicas entre as regiões da

cabeça, corpo e da cauda do epidídimo, a altura do epitélio e a espessura da túnica

muscular foram medidas, padronizando-se a objetiva com aumento de 20X (50µm).

Para averiguar a ocorrência de diferenças morfométricas no epitélio dos epidídimos

ao longo do ano, foram analisados cinco animais da estação ou período reprodutivo

e cinco da não reprodutiva.

3.4 Dados climáticos

Dados meteorológicos mensais da temperatura do ar (ºC) foram obtidos junto

ao CATI - Coordenadoria de Assistência Técnica Integral.

3.5 Análise das variáveis biométricas, morfométricas e climáticas

Primeiramente foi verificada a existência de valores discrepantes (outliers),

em seguida, a normalidade dos dados foi testada por Shapiro-Wilk, e quando

necessários, foram submetidos à normalização (raiz quadrada). Todos os resultados

obtidos foram comparados entre os meses de junho de 2005 à maio de 2006. Os

dados biométricos das gônadas foram analisados entre as estações do ano pelo

teste One-Way ANOVA e para cada mês (entre a gônada direita e esquerda) através

do teste Wilcoxon. Os dados morfométricos dos túbulos seminíferos (diâmetro, área

e a altura do epitélio seminífero) e dos epidídimos (altura do epitélio do epidídimo e

espessura da túnica muscular), foram analisados pelo teste One-Way ANOVA e

Kruskal-Wallis e quando necessário, completado pelo Teste de Tukey. Para verificar

a ocorrência de variações dos parâmetros considerados ao longo do ano, aplicou-se

o teste de Mann-Whitney.

Foi considerado p ≤ 0,05 como referência para se atribuir significância

estatística, sendo todas as análises baseadas em Zar (1999).

20Os dados biométricos e morfométricos das gônadas foram relacionados

com a temperatura atmosférica por meio do teste de Regressão Linear Simples,

utilizando correlação de Pearson para dados paramétricos e de Spearman para

dados não paramétricos.

4 REFERÊNCIAS

ASHLEY, L.M. 1969. Laboratory Anatomy of the Turtle, 1ª ed. WM. C. Brown

Company Publishers, Dubuque, Iowa p.32-36.

AURICCHIO, P.; SALOMÃO, M. 2002. Técnicas de coleta e preparação de vertebrados para fins científicos e didáticos. Instituto Pau Brasil de História

Natural. SP. p 89-93.

BULL, K.H.; MASON, R.T.; WHITTIER, J. 1997. Seasonal Testicular and Sperm

Storage in Tropical and Subtropical Populations of the Brown Tree Snakes

(Boiga irregularis). 1997. Australian Journal of Zoology. 45: 479-488.

CALLARD,I.P.; CALLARD, G.V.; LANCE, V. e ECCLES, S. 1976. Seasonal Changes

in Testicular Structure and Function and Effects of Gonadotropins in the

Freshwater Turtle, Chrysemys picta. General and Comparative Endocrinology.

30:347-356.

CHRISTIANSEN, J. L. e DUNHAM, A. E. 1972. Reproduction of the Yellow Mud

Turtle (Kinosternon flavescens flavescens) in New Mexico. Herpetologica.

28:130-137.

DUBOIS, W. PUDNEY, J. e CALLARD, I.P. 1988. The anual testicular cycle in the

turtle, Chrysemis picta: a histochemical and electron microscopic study. General and Comparative Endocrinology. 71: 191-204.

DUELLMAN, W.E. 1979. The South American Herpetofauna: Its Origin, Evolution

and Dispersal. Monograph of the Museum of Natural History, the University of

Kansas nº7.

ERNEST, C.H.; BARBOUR, R.W. 1989. Turtles of the World, Washington D.C.:

Smithsonian Institution Press p. 29-30, 182-183, 209-210.

21ETCHENBERGER, C.R., e STOVALL, R.H. 1990. Seasonal variation in the

testicular cycle of the loggerhead musk turtle, Sternotherus minor minor, from

central Florida. Canadian Journal of Zoology 68:1071-1074.

FERREIRA, A.; LAURA, I. A.; DOLDER, H. 2002. Sperm ultrastructure and

spermatogenesis in lizard, Tropidurus itamberere. Biocel. 27(3): 353-362.

FLORES-VILELA, O.A.; ZUG, G.R. 1995. Reproductive Biology of the Chopontil,

Claudius augustatus (Testudines: Kinosternidae) in Southern Veracruz, México.

Chelonian Conservation and Biology, vol. I, N 3.

GEORGES, A. 1983. Reproduction of the australian freswather turtle Emydura krefftii

(Chelonia: Chelidae). Journal of Zoology London. 201: 331-350.

GIBBONS, J.W.1970. Reproductive Caracteristics of a Florida Population of Musk

Turtles (Sternothaerus adoratus). Herpetologica, 26(2): 268-270.

GIRONS, H. S. 1982. Reproductive Cycles Of Male Snakes And Their Relatonsships

With Climate and Femele Reproductive Cycles. Herpetologica. 38(1):5-16.

GIST, D.H. e JONES, J.M. 1987. Store of sper in reptilian oviduct. Scanning Microscopy. Vol. 1(4): 1839-1849

GOULART, C.E.S. 2004. Herpetologia, Herpetocultura e Medicina de Répteis. 1ª

ed. Rio de Janeiro. L.F. Livros de Veterinária. 37-56.

GRIBBINS, K.M.; GUIST, D.H.; CONDON, J.D. 2003. Cytological evaluation of

spermatogenesis and organization of the germinal epithelium in the male slider

turtle, Trachemys scripta. Journal of Morphology, 255(3): 337-347.

GRIBBINS, K.M. e GUIST, D.H. 2003. Cytological Evaluation of Spermatogenesis

Withn the Germinal Epithelium of the Male European Wall Lizard, Podarcis

muralis. Journal of Morphology. 258: 296-306.

GRIBBINS, K.M.; HAPP, C. S. e SEVER, D. M. 2005. Ultrastructure of the

reproductive system of the black swamp snake (Seninatrix pygaea).V. The

temporal germ cell development strategy of the testis. Acta Zoologica

(Stockholm) 86: 223-230.

GRIBBINS, K.M.; ELSEY, R. M. e GUIST, D.H. 2006. Cytological evaluation of the

germ cell development strategy within the testis of the American alligator,

Alligator mississippiensis. Acta Zoologica (Stockholm). 87:59-69.

GUIX, J.C.; SALVATTI, M.; PERONI, M.A.; LIMA-VERDE, J.S. 1989. Aspectos da

reprodução de Phrynops geoffroanus em cativeiro. [S.1.]: GGE.

22HICKMAN, C. P. Jr.; ROBERTS, L. S.; LARSONS, A. 2004. Princípios

Integrados de Zoologia. 11ª edição. Guanabara Koogan. R.J. p 531-538.

HILDEBRAND, M. 1995. Análise da estrutura dos vertebrados. Atheneu, SP.700.

HOPWOOD, D. 1990. Fixation e fixatives. Capitulo 2, 21-42. In: BANCROFT, J.D.;

STEVENS, A.; Foreword by DAVID, R.T. 1990. Theory and practice of

histological techniques. 3ª ed. Edimburgh London Melbourne and New York,

726p.

HOLMES, H.J.; GIST, D,H. 2004. Excurrent Duct System of the Male Turtle

Crysemys picta. Journal of Morphology. 261:312-322.

IBARGÜENGOYTÍA, N. R.; PASTOR, L. M. E PALLARES, J. 1999. A light

microscopy and ultrastructural study of the testes of tortoise Testudo graeca

(Testudinidae). Journal of Submicroscopy and Cytology and Pathology

31(2):221-229.

LICHT, P. 1982. Endocrine Patterns In The Reproductive Cycle Of Turtles.

Herpetologica. 38(1): 51-61.

LICHT, P.; BREITENBACH, G.L. e CONGDON, J. D. 1985. Seasonal Cycle in

Testicular Activity, Gonadotropin, and Thyroxine in the Painted Turtle,

Chrysemys picta, under Natural Conditions. General and Comparative Endocrinology. 59:130-139.

LOFTS. B. e TSUI, H. W. 1977. Histologial and histochemical changes in the gonads

and epididymides of the male Soft-shelled turtle, Trionyx sinensis. Journal of Zoology, London. 181: 57-68.

MAHMOUD, I. Y. e CYRUS, R.V. 1992. The Testicular Cycle Of The Common

Snapping Turtle, Chelydra serpentina, In Wisconsin. Herpetologica. 48(2): 193-

201.

MAHMOUD, I. Y. e KLICKA, J. 1972. Seasonal Gonadal Changes in Kinosternid

Turtles. Journal of Herpetology 6(3-4): 183-189.

MALVASIO, A. 1996. Identificação sexual através do estudo anatômico do sistema

urogenital em recém-eclodidos do Trachemys dorbigni. Congresso Latino

americano de Herpetologia. Santiago, Chile.

MARION, K.R.1982. Reproductive Cues For Gonadal Development In Temperate

Reptiles: Temperature and Photoperiod Efects On The Testicular Cycle Of The

Lizard Sceloporus undulatus. Herpetologica 38(1): 26-39.

23McALESTER, A.L. 1978. História Geológica da Vida. Ed. Edgard Blücher Ltda.

SP. 176p.

McPHERSON, R. J. e MARION, K. R. 1981. Seasonal Testicular Cycle Of The

Stinkpot Turtle (Sternotherus odoratus) In Central Alabama. Herpetologica. 37

(1): 33-40.

MEYLAN, P. A.; SCHULER, R.; MOLER, P. 2002. Spermatogenic Cycle of the

Florida Softshell Turtle, Apalone ferox. Copeia.3: 779-786.

MITTERMEIER, R.A.; RHODIN, A.G.J.; ROCHA e SILVA, R; ARAUJO DE

OLIVEIRA, N. 1980. Rare Brazilian sideneck turtle. Oryx, 15: 473-475.

MOLINA, F.B. 1992. Observações sobre o comportamento agonístico de cágados

Phrynops geoffroanus em cativeiro. Biotemas. 5(1): 80-84.

MOLINA, F.B. 1998. Comportamento e biologia reprodutiva dos cágados Phrynops

geoffroanus, Acanthochelis radiolata e Acanthochelis spixii (Testudines,

Chelidae) em cativeiro. Revista Brasileira de Etologia (nº especial): 25-40.

MOLINA, F.B.; GOMES, N. 1998. Incubação artificial e processos de eclosão em

Trachemis dorbinyi. Revista Brasileira de Zoologia, 15(1): 135-143.

OCHOTORENA, A.S., URIBE ARANZABAL, M.C. e GILLETE JR. L.J. 2005.

Seasonal Gametogenic Cycles in a Cuban Tropical Lyzard, Anolis porcatus.

Journal of Herpetology

OLIVEIRA, C.; ZENATONI, C. e ZIERI, R. 2002. Morphological Observations On The

Testes Of Physalaemus cuvieri (Amphibia, Anura). Revista Chilena de Anatomia. 20(3): 263-268.

OLIVEIRA, C. VICENTINI, C. A. e TABOGA, S. R. 2003. Structural characterization

of nuclear phenotypes during Scinax fuscovarius spermatogenesis (Anura,

Hylidae). Caryologia. 56 (1): 75-83.

ORR, R.T.1986. Biologia dos Vertebrados. 5ª edição. São Paulo: Livraria Rocca

Ltda., p 95, 508.

PRITCHARD, P. C. H.; TREBBAU, P. 1984. The Turtles of Venezuela. Fundación de Internados Rurales (Venezuela), Society for the study of Amphibians and

Reptiles, p.116-117.

POUGH, F.H.; ANDREWS, M.R.; SAVITKY, H.A.; WELLS, D.K. 2002. Herpetology.

2ª ed. Prentice Hall, Inc. New Jersey.

POUHG, F.H.; JANIS, M.C.; HEISER. B.J. 2003. A Vida dos Vertebrados. 3ª ed.

Atheneu SP. p 270-290.

24RAMÍRES-SANDOVAL, E.; RAMÍRES-BAUTISTA, A. e VITT, L.J. 2006.

Reproduction in the lizard Phyllodactitylus lanei (Squamata:Gekkonidae) from the

pacific cost of Mexico. Copeia. 1: 1-9. RIBAS, E. R. e MONTEIRO FILHO, E. L. A. 2002. Distribuição e Habitat das

Tartarugas de Água-Doce (Testudines, Chelidae) do Estado do Paraná, Brasil.

Biociencias. 10: 15-32.

RIEPPEL, O. 2004. Turtles as diapsid reptiles. Zoologica Scripta. 29 (3): 199-212.

ROMER, S.; PARSONS, T.S. 1985. Anatomia Comparada dos Vertebrados. 5ª ed.

Atheneu. SP. 599p

ROSTAL, D. C.; ROBECK, T.R.; GRUMBLES, J. S.; BURCHFIELD,P.M. e OWENS,

D. Wm. 1998. Seasonal Reproductive Cycle of the Galápagos Tortoise

(Geochelone nigra) in Captivity. Zoo Biology. 17: 505-517.

SHINE, R. 1977. Reproduction in Australian Elapid Snakes I. Testicular Cycles and

Mating Season. Australian Journal of Zoology 25: 647-653.

SPRANDO, R. I. e RUSSELL, L. D. 1988. Spermiogenesis in the Red-Ear Turtle

(Pseudemys scripta) and the Domestic Fowl (Gallus domesticus): A Study of

Cytoplasmic Events Including Cell Volume Changes and Cytoplasmic Elimination.

Journal of Morphology. 198: 95-118.

TORRES, M.L.C.; LANDA, P.A.; MORENO, M.N.; MARMOLEJO, V.A.; MERCHANT,

L.H. 2002. Expresión profiles of Dax 1, Dmrt 1, and sox 9 during temperature sex

determination in gonads of sea turtle Lepicochelys olivacea. General and Comparative Endocrinology. 129(1): 20-26.

VANZOLINI, P.E. 1977. A brief biometrical note on the reproductive biology of some

South American Podocnemis (Testudines, Pelomedusidae). Papeis avulsos de zoologia. SP. 31(5):74-102.

VENEZUELA, N.; BOTERO, R. e MARTINES, E. 1997. Field study of sex

determination in Podocnemis expansa from Colombian Amazonia.

Herpetologica. 53(3):339-398.

VOGT, R. C. e BULL, J. J. 1982. Temperature Controlled Sex-Determination in

Turtles: Ecological and Behavorial Aspects. Herpetologica. 38 (1): 156-164.

ZAR, J. 1999. Biostatistical analyses. Printice Hall, New Jersey, 663p.

255 TRABALHOS

O estudo possibilitou a elaboração de quatro manuscritos a serem

publicados em periódicos especializados indicados em cada trabalho:

• ANATOMIA DO SISTEMA REPRODUTOR MASCULINO E BIOMETRIA TESTICULAR DE Phrynops geoffroanus (TESTUDINES: CHELIDAE). Revista: South American Journal of Herpetology.

• HISTOLOGIA TESTICULAR DE Phrynops geoffroanus (TESTUDINES: CHELIDAE). Revista: Amphibia-Reptilia.

• MORFOLOGIA DA VIA SEMINÍFERA EXTRATESTICULAR DE Phrynops geoffroanus (TESTUDINES: CHELIDAE). Revista: Journal of Morphology.

• CICLO TESTICULAR DE Phrynops geoffroanus (TESTUDINES: CHELIDAE). Revista: Jourmal of Herpetology.

26• ANATOMIA DO SISTEMA REPRODUTOR MASCULINO E BIOMETRIA

TESTICULAR DE Phrynops geoffroanus (TESTUDINES: CHELIDAE)

SILVIA ROSANA PAGLIARINI CABRAL1, SEBASTIÃO ROBERTO TABOGA2.

CLASSIUS DE OLIVEIRA2.

1. Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal da UNESP- São José do Rio

Preto - São Paulo, Brasil.

2. Departamento de Biologia- Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas-

UNESP- São José do Rio Preto – São Paulo, Brasil.

Endereço para correspondência:

Departamento de Biologia – Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas –

IBILCE-UNESP.

CEP: 15.040.000, São José do Rio Preto-São Paulo, Brasil.

FAX: (55-17) 3221-2390

E-mail: [email protected]

27RESUMO

O sistema reprodutor de machos adultos de Phrynops geoffroanus é descrito

macroscopicamente e a variação da biometria testicular é avaliada. Um par de

testículos ovais, estão conectados pelos dúctulos eferentes aos epidídimos, que se

continuam como ductos deferentes, e que por sua vez desembocam no pênis. A

análise biométrica revelou que não há variação no peso e dimensões entre as

gônadas direita e esquerda. O IGS variou significativamente ao longo do ano, com

maiores médias observadas nos meses que correspondem ao final da primavera e

início do verão, quando ocorre a reprodução da espécie, e as menores médias

durante o inverno, sugerindo uma atividade testicular cíclica.

Palavra chave: Testudines, Phrynops geoffroanus, sistema genital, testículos,

dúctulos eferentes, epidídimos, ducto deferente, pênis.

ABSTRACT The reproductive system of male adults of Phrynops geoffroanus is

macroscopically described and the variation of the testicular biometry is evaluated. A

pair of oval testes is connected by efferent ductules to the epididymis that continue

as defferent ducts, which disembogue in the penis. The biometrical analysis revealed

that there is no variation in the weight and dimensions between the right and left

gonads. The IGS varied significantly throughout the year, having the highest

averages observed in the months that correspond to the end of spring and the

beginning of summer, when the reproduction of the species happens and the lowest

averages during winter, suggesting a cyclical testicular activity.

Key-words: Testudines, Phrynops geoffroanus, reproductive system, testes,

epididymis, efferent ductules, defferent ducts, penis.

28

INTRODUÇÃO

Os répteis foram os primeiros vertebrados a conquistar a independência da

água para a reprodução, com o desenvolvimento do ovo amniótico. Esta conquista

envolveu uma série de adaptações morfológicas, fisiológicas e comportamentais,

muitas delas, ligadas à reprodução, que passou a ter fertilização interna como

padrão entre todos os amniotas. O sistema reprodutor dos machos apresenta

estruturas para armazenamento temporário de espermatozóides e para a

transferência de gametas para o corpo das fêmeas. Os quelônios estão entre os

mais antigos amniotas e representam o primeiro grupo de vertebrados a utilizar os

epidídimos e órgãos copuladores para armazenamento e transferência de

espermatozóides respectivamente (McALESTER, 1978).

O sistema urogenital de quelônios adultos é constituído em ambos os sexos

por um par de rins e ureteres, uma bexiga urinária, um par de bexigas acessórias,

gônadas e cloaca (HILDEBRAND, 1995; MALVASIO, 1999). Nos machos as

estruturas sexuais são um par de testículos, os dúctulos eferentes, um par de

epidídimos, um par de ductos deferentes, um pênis, e em indivíduos jovens, ovidutos

remanescentes (MALVASIO, 1999; ASHLEY, 1969).

Estudos realizados sobre a biologia reprodutiva de Phrynops geoffroanus em

cativeiro (MOLINA, 1998; MOLINA e GOMES, 1998; GUIX et al., 1989), e em seu

ambiente natural (SOUSA e ABE, 2002) indicam que o período de atividade

reprodutiva (corte e acasalamento) ocorre de outubro a abril e a postura de ovos de

março a novembro.

Variações biométricas das gônadas ao longo do ano são comuns entre

vertebrados de clima temperado (MAHMOUD e KLICKA, 1972; CHRISTIANSEN e

DUNHAN, 1972; MAHMOUD e CYRUS, 1992), sendo observadas também em

répteis de ambientes tropicais.

Os indivíduos dessa espécie possuem ampla distribuição na região

Neotropical, sendo bastante comuns na região de São José do Rio Preto, noroeste

paulista, onde são vistos com freqüência nos rios. São facilmente reconhecidos

quando jovens, por apresentarem um padrão de coloração característico com

manchas pretas e laranja escuro no plastrão e na ponte. Possuem um par de

barbelas brancas com extremidades pretas no queixo, característica responsável

29pela denominação popular da espécie como cágados-de-barbelas (PRITCHARD e

TREBBAU, 1984).

Os estudos que investigam a biologia reprodutiva de quelônios brasileiros

retratam principalmente o comportamento reprodutivo e a interferência da

temperatura na determinação do sexo, entretanto, poucos trabalhos anatômicos com

ênfase na morfologia foram realizados, assim neste trabalho o sistema reprodutor

masculino de Phrynops geoffroanus é descrito macroscopicamente. Dados

biométricos do animal e dos testículos foram analisados para verificar a existência

de variações individuais e sazonais. As gônadas foram comparadas entre si e ao

longo do ano.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram capturados 16 machos adultos de Phrynops geoffroanus (Testudines:

Pleurodira, Chelidae), devidamente autorizada pela licença de captura nº 061/2005-

RAN/IBAMA. As coletas ocorreram mensalmente, durante o período de abril de 2005

a maio de 2006. Os animais foram coletados por meio de pesca manual com a

utilização de anzóis para fisga, em excursões durante o período vespertino ao

córrego Felicidade, (S 20º 46’ 20.6”, W 49º 21’ 18.0”), um afluente do Rio Preto, na

zona urbana de São José do Rio Preto, SP, Brasil. As coletas foram separadas de

acordo com as quatro estações do ano, quando foram capturados quatro animais

por estação.

Os pontos de coleta apresentam margem plana intercalada com barrancos,


predominantemente herbácea. O local é bastante degradado devido à atividade

antrópica e recebe esgoto de origem doméstica.

Os animais capturados foram transportados ao IBILCE/UNESP, mantidos

vivos em tanques por um período de até três dias, e então foram sacrificados de

acordo com as recomendações do COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação

Animal). Dosagens elevadas do anestésico Cloridrato de Ketamina injetável foram

realizadas, por conduzirem a uma morte calma e minimizar o sofrimento do animal

(AURICCHIO e SALOMÃO, 2002). Adicionalmente foram realizadas injeções de

etanol no encéfalo dos animais, pela introdução de 5ml com seringa pelo forame

30magno, garantindo que os animais estivessem realmente em óbito para a

dissecção.

Dados de natureza biométrica como o comprimento máximo da carapaça e do

plastrão, foram obtidos, segundo o método descrito por Cagle (1939) apud

(MOLINA, 1998). Para medir os comprimentos da carapaça e plastrão utilizou-se

uma fita métrica de precisão (1mm). O peso total foi obtido com uma balança de

precisão (1g).

Os animais foram abertos com auxílio de uma serra circular vibratória,


afastados para visualização das vísceras e fotodocumentação (câmera digital 8.0

megapixel) e, então, os órgãos do sistema reprodutor foram removidos e submetidos

aos demais procedimentos.

Os testículos foram pesados (g) com balança analítica de precisão (0,001g) e

medidos (cm) com paquímetro de metal com precisão de 0,05. Dados do

comprimento e da largura foram obtidos para se estimar o volume das gônadas

segundo a fórmula: V= ¾ x π x a x b2, onde a= eixo maior (comprimento) e b= eixo

menor (largura). A massa, dos testículos e do corpo, foram utilizadas para calcular o

índice gonadossomático (IGS= massa total dos testículos/ massa total do corpo x

100).

Os dados biométricos do animal foram analisados pela One-Way-ANOVA

quando paramétricos e por KrusKal-Wallis ANOVA quando não paramétricos, sendo

completados quando necessários, por testes para comparações múltiplas (Tukey).

Dados biométricos das gônadas foram analisados entre os meses pelo teste

Kruskal-Wallis e para cada mês (entre a gônada direita e esquerda) por meio do

teste Wilcoxon.

RESULTADOS

Tamanho corporal e maturidade sexual

O termo “adulto” foi utilizado neste trabalho para os espécimes que

apresentaram maturidade sexual. O critério adotado para determinar a maturidade

dos machos foi a presença de espermatozóides no epidídimo.

31 A massa corporal dos 16 machos utilizados variou de 600 a 1800g (X=

1.113 ± 360g). O comprimento máximo da carapaça (cmc) variou entre 22 e 29cm

(X= 25.6 ± 1.9cm) e o comprimento máximo do plastrão (cmp) variou de 18 a 24cm

(X=19.8 ± 1.6cm).

Constatou-se grande variação anatômica no tamanho dos indivíduos e

mesmo o menor espécime adulto capturado (peso=600g; cmc=22cm e cmp=18cm),

apresentou testículos com evidente atividade espermatogênica e grande quantidade

de espermatozóides armazenados nos epidídimos .

Sistema reprodutor masculino

O sistema reprodutor masculino de Phrynops geoffroanus é constituído de um

par de testículos conectados pelos dúctulos eferentes aos epidídimos que se

continuam como ductos deferentes, todos envolvidos pelo mesentério urogenital, e o

pênis (Figura 1).

O órgão copulador é uma massa de tecido ricamente vascularizada, com uma

intensa pigmentação escura, conferindo coloração preta ao pênis, que está presente

da raiz peniana à extremidade livre que é eversível através da cloaca, por ação de

músculos eretores e aporte sangüíneo. O pênis é um órgão bastante desenvolvido,

posicionado longitudinalmente à parede ventral da cloaca, e que apresenta um

estreitamento na sua porção final livre (Figura 1B,C). Na base do pênis encontram-

se duas estruturas bulbares de coloração enegrecidas, uma de cada lado. Estas

estruturas estão relacionadas com os processos de eversão e retração do pênis, são

denominadas bulbos do corpo cavernoso (Figura 1A,C). Posicionado entre os

bulbos, localiza-se a vesícula urinária e ao lado delas as vesículas urinárias

acessórias, órgãos exclusivos do sistema urinário.

Os testículos estão localizados na porção anterior da região pélvica (Figura

1A), ventralmente aos rins. Cada testículo é um órgão oval, de coloração branco-

amarelada, com vascularização testicular evidente. São revestidos pela albugínea e

mantidos em posição por uma membrana serosa denominada mesórquio. Para

análise do parênquima foram definidas 3 regiões: cranial, medial e caudal (Figura

2A), que não são anatomicamente individualizadas. A conexão dos testículos aos

epidídimos é feita pelos dúctulos eferentes, uma rede de pequenos dúctulos

levemente sinuosos que desembocam nos ductos epididimários (Figura 2D). Quanto

32à organização interna do parênquima testicular, não foi identificada a presença de

mediastino e de septos testiculares (Figura 2E), o que foi posteriormente confirmado

por análises histológicas.

O epidídimo localiza-se junto ao pólo testicular caudal (Figuras 1A e 2C,D). É

uma estrutura alongada e composta por um conspícuo ducto de arranjo enovelado

apresentando coloração esbranquiçada e que aumenta de calibre caudalmente

(Figura 2D). Associam-se aos testículos através do mesórquio, que prende os dois

órgãos à parede dorsal do corpo. O epidídimo foi dividido em três regiões: parte

cranial (cabeça), região intermediária (corpo) e parte caudal (Figura 2A). A conexão

dos epidídimos aos testículos não é contínua ao longo de toda a sua extensão,

ocorrendo, principalmente, da região média e caudal do testículo com a extremidade

cranial e intermediária do epidídimo. A extremidade anterior da parte cranial

apresenta o ducto epididimário com ápice em fundo cego (Figura 2D). Os dúctulos

eferentes e ductos epididimários são mantidos juntos pelo tecido conjuntivo que os

envolve. Na extremidade distal da cauda, o ducto epididimário torna-se menos

convoluto e seu calibre é nitidamente maior, prosseguindo como ducto deferente,

conectando-se ao canal peniano, por meio do qual é conduzido o espermatozóide.

(Figura 2D). Paralelamente aos ductos epididimários e aos ductos deferentes,

localizam-se os ureteres que desembocam na cloaca (Figura 2B).

Variação biométrica dos testículos

A massa testicular apresentou variação de 0.41g a 8.04g (X=1.48 ± 1.77g). O

comprimento testicular variou entre 1.35cm a 3.61cm (X=2.02 ± 58cm) e a largura

entre e 0.52cm a 2.43cm (X=1.19± 41cm).

Os parâmetros biométricos, como o comprimento e o peso das gônadas

direita e esquerda, não apresentaram diferença significativa entre si (teste Wilcoxon:

p>0,05).

O IGS apresentou diferença significativa nos meses de primavera (final de

setembro, outubro, novembro e dezembro) em relação às outras estações do ano,

médias altas também foram observadas durante o verão (final de dezembro, janeiro

e início de fevereiro), porém não houve diferença estatística em relação ao outono e

inverno (Figura 3). O volume das gônadas apresentou as maiores médias durante os

33meses de primavera e verão, entretanto, quando foram aplicados os testes

estatísticos não foi detectada diferença entre os meses analisados (Figura 4).

DISCUSSÃO

Nos répteis, como nos demais vertebrados amniotas a fertilização é sempre

interna e o sistema reprodutor masculino apresenta modificações relacionadas a

essa nova condição, com epidídimos para o armazenamento de esperma e órgãos

copuladores para a sua transferência, garantindo, assim, o sucesso da fertilização.

Como descrito para todos os grupos de répteis (ORR, 1985; HICKMAN et al., 2004;

RIEPPEL, 2000) o sistema reprodutor masculino de Phrynops geoffroanus mantém o

mesmo padrão anatômico.

Em Phrynops geoffroanus os testículos são ovais e de coloração

esbranquiçada. Segundo Aschley (1960) e Goulart (2004) os testículos dos

Testudines são esféricos e de coloração amarelada. Ferreira et al., (2002)

descrevem os testículos de Iguana iguana como órgãos arredondados e conectados

lateralmente aos epidídimos. As descrições anatômicas relatadas para os testículos

dos répteis de modo geral, são similares às observações em Phrynops geoffroanus,

quanto à localização e forma, que varia de esféricos a ovais entre as diferentes

espécies de répteis (ORR, 1986; POUGH et al., 2003; HILDEBRAND, 1995).

Quanto à biometria das gônadas, não foram detectadas diferenças

estatísticas nas dimensões e pesos entre os testículos direito e esquerdo. Apesar de

haver variação dos parâmetros considerados, não há razões para afirmar que a

gônada mais volumosa e mais pesada também é a mais ativa.

O IGS variou significativamente entre os meses analisados, sendo que as

maiores médias foram observadas durante os meses de primavera e início do verão,

coincidindo com o período reprodutivo descrito para a espécie (MOLINA, 1998;

SOUSA e ABE, 2001). Os menores índices foram observados nos meses de outono

e inverno.

Variações dos diâmetros testiculares são comuns entre quelônios de clima

temperado (MEYLAND et al., 2002). Estudos realizados com espécies de diferentes

famílias (MAHMOUD e KLICKA, 1972; ETCHEMBERG e STOVAL, 1990; GIST et

al., 2001; FLORES-VILELA e ZUG, 1995), relatam variações dos índices

testiculares, sendo que as menores médias foram observadas durante os períodos

34de menor atividade testicular (quiescência) e as maiores médias durante os

períodos de pico da espermatogênese.

O volume dos testículos apresentou médias mais altas durante o final da

primavera e início do verão, coincidindo com as maiores médias do IGS. As

variações no volume e nos índices testiculares permite-nos inferir que as gônadas

são mais ativas durante o período reprodutivo e que regridem nos meses de outono

e inverno, quando não são observados machos e também fêmeas em atividade

reprodutiva (animais em corte ou copulando). Estudos realizados por Georges

(1983) com Emydura kreffti, uma espécie australiana da família Chelidae de clima

subtropical, revelam que durante o período de atividade de cópula os testículos

apresentam os menores pesos (regressão) e no outono, quando não são

observados animais copulando, os testículos apresentam as maiores médias de

peso.

Os ductos condutores de espermatozóides, dúctulos eferentes, epidídimos e

ductos deferentes, são derivados do ducto arquinéfrico (ROMER e PARSONS, 1985;

ORR, 1986) que é utilizado como um órgão misto para transporte de urina e

esperma nos vertebrados anamniotas, pois durante o desenvolvimento embrionário

ele é invadido pelo sistema genital. Nos amniotas o ducto passou a ser utilizado

completamente para o transporte de gametas nos machos, surgindo novos tubos

para o transporte de urina, os ureteres. O ducto arquinéfrico torna-se o ducto

deferente, podendo apresentar modificações em vários aspectos nas suas diferentes

regiões, sendo a mais significativa, o enovelamento da extremidade cranial,

formando o epidídimo, uma estrutura compacta situada lateralmente aos testículos.

(HICKMAN et al., 2004).

Os dúctulos eferentes são uma rede de pequenos ductos que conduzem o

esperma dos testículos aos epidídimos (ASCHLEY, 1969; ROMER e PARSONS,

1985). Em Phrynops geoffroanus conectam-se aos epidídimos principalmente, na

região medial e extremidade caudal do órgão. Para mamíferos foram propostos dois

padrões de organização pelos quais os dúctulos eferentes conectam-se aos

epidídimos, a primeira apresenta uma convergência em forma de funil na qual os

dúctulos se anastomosam e formam um tubo simples. O segundo tipo envolve rolos

paralelos de dúctulos eferentes que formam múltiplas entradas junto à cabeça do

epidídimo (ILIO e HESS, 1994). Segundo considerações propostas por Yeung et al

(1991) apud (ILIO e HESS, 1994), em algumas espécies de mamíferos os dúctulos

35estão conectados uns aos outros formando uma espécie de rede que se liga ao

epidídimo. Em Phrynops geoffroanus e também em Crysemys picta, a conexão dos

dúctulos parece seguir o padrão descrito como rede de ductos (HOLMES e GIST,

2004).

Os epidídimos de Prynops geoffroanus são estruturas enoveladas e

esbranquiçadas presas aos testículos e aos rins. Em Trachemys scripta e Crysemys

picta, os epidídimos são também enovelados, entretanto, apresentam coloração

escura (ASHLEY, 1969; HOLMES e GIST, 2004), devido à presença de células

pigmentadas no tecido conjuntivo que os envolve. Ainda de acordo com Aschley

(1969), a conexão dos epidídimos aos testículos, ocorre por meio dos dúctulos

eferentes, que partem do pólo cranial dos testículos em direção ao epidídimo, já em

Crysemys picta a conexão não é contínua ao longo de todo o epidídimo e suas

extremidades cranial e caudal estão livres (HOLMES e GIST, 2004). Em Phrynops

geoffroanus, a conexão ocorre principalmente da região medial e extremidade

caudal dos testículos em direção aos epidídimos.

Durante todos os meses analisados foram observados espermatozóides

armazenados nos epidídimos e ductos deferentes, incluindo os meses de menor

atividade gonadal, o que sugere que os epidídimos de Phrynops geoffroanus, podem

armazenar espermatozóides por longos períodos, como também foi descrito para

outros Testudines (GIST et al., 2002; LOFTS e TSUI, 1977).

O desenvolvimento de um órgão copulador é comum entre os amniotas. Os

anamniotas que realizam fertilização interna não possuem um pênis típico e os

espermatozóides são transferidos para o corpo das fêmeas por gonopódios e

claspers (nadadeiras modificadas) como entre os peixes (ROMER e PARSONS,

1985). Nos anfíbios a cloaca é evertida num processo referido como “beijo cloacal”

de transferência de esperma (RIEPPEL, 2000)

Nos répteis um órgão intromitente é observado entre todas as espécies

viventes, com exceção de Sphenodon sp. Nas serpentes e lacertílios (Diapsida-

Lepidosauromorpha) desenvolveram-se estruturas pares exclusivas na parede

lateral da cloaca, os hemipênis, que são considerados como uma auto-apomorfia do

grupo (POUGH et al., 2003; RIEPPEL, 2000).

Quelônios, crocodilianos e alguns grupos basais de aves, possuem um pênis

simples na parede ventral da cloaca. Similaridades nos estádios iniciais de

desenvolvimento dos órgãos intromitentes dos machos de répteis e mamíferos

36(REINAND e PIEAU, 1998 apud RIPPEL, 2000), sugerem que o padrão de

diferenciação de um pênis simples é uma característica basal dos amniota. O

mesmo autor considera a estrutura do pênis como uma das características que une

os Testudines (Anapsida) e crocodilianos (Diapsida). Entre os Testudines e

crocodilianos os órgãos copuladores podem ser considerados os precursores

morfológicos dos pênis dos mamíferos (KELLY, 2004; HICKMAN et al., 2004).

Larson (1998) e Pough et al., (2003), consideram que a presença de um pênis

é uma condição primitiva, e que a ausência de órgãos intromitentes em Sphenodon

sp e na maioria das aves deve ser considerada secundária.

O pênis de Phrynops geoffroanus é um órgão de pigmentação escura,

grande, posicionado longitudinalmente à parede ventral da cloaca e com um

estreitamento na sua porção final. Na base do pênis encontram-se duas estruturas

de coloração enegrecidas, uma de cada lado. Estas estruturas estão relacionadas

com os processos de eversão e retração do pênis. A morfologia do pênis é similar a

descrita para os quelônios em geral por Ashley (1969) e Goulart (2004). Segundo

esses autores, os corpos cavernosos são constituídos de tecido fibroso-esponjoso.

Entre as cristas longitudinais dos corpos cavernosos está localizado um sulco e na

extremidade externa a glande do pênis. Durante a excitação os corpos cavernosos

enchem-se de sangue, o que provoca a distensão do pênis durante a cópula. Com a

expansão, o sulco entre os corpos cavernosos, forma um tubo ou uma espécie de

canaleta por onde o esperma é transportado durante a cópula.

As modificações morfológicas no sistema reprodutor, relacionadas ao sucesso

da fertilização interna persistiram na maioria dos machos de vertebrados amniotas.

Os Testudines representam um dos mais antigos grupos de répteis viventes e os

primeiros a utilizarem essas estruturas.

CONCLUSÕES

• O aparelho reprodutor masculino de Phrynops geoffroanus, é

anatomicamente similar aos demais Testudines, e é constituido por um

par de testículos, dúctulos eferentes, epidídimos, ductos deferentes e um

pênis.

• Não foram detectadas variações biométricas significativas entre o

testículo direito e esquerdo.

37• Ocorrem variações da biometria testicular ao longo do ano, com IGS e

volumes maiores nos meses de primavera e início do verão.

• Os epidídimos apresentaram espermatozóides armazenados ao longo do

ano, indicando função primária de armazenamento.

REFERÊNCIAS





CHRISTIANSEN, J.L. e DUNHAN, A.E. 1972. Reproduction of the Yellow Mud Turtle

(Kinosternon flavescens flavescens) in New Mexico. Herpetologica 28: 130-137.

ETCHEMBERGER, C.R. e STOVALL, R.H. 1990. Seasonal Variation in the

Testicular Cycle of the Loggerhead Musk Turtle, Sterotherus minor minor, from

Central Florida. Canadian Journal of Zoology 68. 1071-174.

FERREIRA, A.; LAURA, I. A .; DOLDER, H. 2002. Reproductive Cycle of Male Green

Iguanas, Iguana iguana (Reptilia: Sáuria: Iguanidae), in the Pantanal of Brasil.

Braz. Journal of morphology e Science 19(1), 23-28.




GEORGES, A. 1983. Reproduction of the Australian Freshwater Turtle Emydura

krefftii (Chelonia: Chelidae). Journal of Zoology of London 201: 331-350.

GIST, D.H.; DAWES, S.M.; TURNER, T.W.; SHELDON, S.: CONGDON, J.D.2002.

Sperm Storage in the turtle: a male perspective. Journal of Experimentation in Zoology. 292(2): 180-186.

GOULART, C.E.S. 2004. Herpetologia, Herpetocultura e Medicina de Répteis. 1ª

ed. Rio de Janeiro. L.F. Livros de Veterinária. 37-56.



38HICKMAN, C.P.Jr.; ROBERTS, L.S.; LARSONS, A. 2004. Princípios Integrados

de Zoologia. 11ª edição. Guanabara Koogan. R.J. p 531-538.

HILDEBRAND, M. 1995. Análise da estrutura dos vertebrados. Atheneu, SP.700p.



ILIO, K.Y. e HESS, R.A. 1994. Structure and Function of the Ductuli Efferentes: A

Review. Microscopy Research and Technique 29: 432-437.

KELLY, D.A. 2004. Turtles and Mammals Penis Designs are Anatomically

Convergent. Proc Royal Society London. 271: 93-95.

LARSON, P.L. 1998. The Theropod Reproductive System. Gaia 15: 389-397.

LOFTS, B. e TSUI, H.W. 1977. Histological and Histochemical Changes in the

Gonads and Epididymides of the male Soft- shelled Turtle, Trionyx sinensis.

Journal Zoology of London 181:57-68.


urogenital em recém-eclodidos de Trachemys dorbigni. Congresso Latino americano de Herpetologia. Santiago, Chile.

MAHMOUD, I.Y. e CYRUS, R.V. 1992. The Testicular Cycle Of The Common


201.

MAHMOUD, I.Y. e KLICKA, J. 1972. Seasonal Gonadal Changes in Kinosternid


McALESTER, A.L. 1978. História Geológica da Vida. Ed Edgard Blücher Ltda.

SP.176p

MEYLAN, P.A.; SCHULER, R.; MOLER, P. 2003. Spermatogenic Cycle of the Florida

Softshell Turtle, Apalone ferox. Copeia.3: 779-786.



Chelidae) em cativeiro. Revista Brasileira de Etologia (nº especial) p 25-40.

MOLINA, F.B.; GOMES, N. 1998. Incubação artificial e processos de eclosão em

Trachemis dorbinyi. Revista Brasileira de Zoologia, 15(1): 135-143


Ltda., p 95, 508.

39PRITCHARD, P.C.H.; TREBBAU, P. 1984. The Turtles of Venezuela. Fundación

de Internados Rurales (Venezuela), Society for the study of Amphibians and




RIEPPEL, O. 2000. Turtles as Diapsid Reptiles. Zoologica Scripta 29:199-212.


Atheneu. SP. 599p

SOUSA, F.L. e ABE, A.S. 2001. Population Structure and Reproductive Aspects of

the Freswater Turtle, Phrynops geoffroanus, Inhabiting an Urban River in

Souththeastern Brazil. Studies on Neotropical Fauna and Environment. 36(1):

57-62.

.

40

Figura 1: Sistema reprodutor masculino de Phrynops geoffroanus. A. Vista geral do sistema reprodutor: testículo (t); epidídimo (e); ducto deferente (dd), após a linha, e raiz peniana (rp). B. Pênis evertido, com extremidade livre e sulco peniano (cabeça de seta) C. Pênis removido: notar a intensa pigmentação; raiz peniana (rp) constituída pelos bulbos do corpo cavernoso e extremidade distal (seta).

A

B

C

t

rp

e

dd

rp

41

Figura 2. Aparelho reprodutor masculino de Phrynops geoffroanus. A. testículos definindo as regiões: extremidade cranial (ec), porção medial (md) e extremidade caudal (cd). B. Porção do epidídimo e ducto deferente e ducto urinário – ureter (u), que continua até a cloaca. C. Epidídimos onde estão indicados: a cabeça (cb), o corpo (cp), a cauda (cd) e a porção anterior do ducto deferente (cabeça de seta). D. Testículo e epidídimo revestidos pelo mesentério gonadal e conectando-os uma rede de dúctulos eferentes (def); ducto epididimário com aumento de calibre da região da cabeça em direção à cauda. E. Testículo seccionado mostrando a ausência de septos e de mediastino testicular confinando o parênquima testicular uniformenente.

ec

md

cd

u

cb

cp

cd

def A

B C

D

E

42

Figura 3. Variação do IGS de Phrynops geoffroanus durante o ciclo reprodutivo. As mesmas letras significam ausência de diferença estatística.

Figura 4. Variação do volume testicular de Phrynops geoffroanus durante o ciclo reprodutivo. Não houve diferença estatística.

0.000

0.200

0.400

0.600

INV PRI VER OUT

Índi

ce G

onad

osso

mát

ico

0

50

100

150

200

INV PRI VER OUTVolu

me

das

Gôn

adas

(cm

3)

a

b

bc ad

43• ESTRUTURA HISTOLÓGICA DE Phrynops geoffroanus (TESTUDINES:

CHELIDAE)

SILVIA ROSANA PAGLIARINI CABRAL1, SEBASTIÃO ROBERTO TABOGA2,








IBILCE-UNESP.


FAX: (55-17) 3221-2390


44RESUMO

Os testículos de Testudines são órgãos ovais pares, formados por túbulos

seminíferos, interconectados pelo tecido intersticial e revestidos pela túnica

albugínea. Este estudo descreve a histologia testicular e a organização das células

germinativas de Phrynops geoffroanus. Dezesseis machos adultos coletados em

São José do Rio Preto (estado de São Paulo, Brasil), foram utilizados. Fragmentos

dos testículos foram submetidos à rotina histológica, incluídos em resina e parafina,

e corados com Hematoxilina e Eosina. Os túbulos seminíferos são revestidos por

células mióides e apresentam um epitélio formado por duas populações celulares: as

células germinativas em diferentes estádios de diferenciação (espermatogônias,

espermatócitos I e II, espermátides redondas e alongadas e espermatozóides), e as

células de Sertoli. Mudanças na população das células germinativas e nas

dimensões (área e diâmetro) dos túbulos seminíferos foram observadas ao longo do

ano.

Palavra chave: Testículos, histologia, células germinativas, Phrynops geoffroanus.

ABSTRACT

The Testudines’ testes are pair oval organs, formed by seminiferous tubules,

interconnected by the interstitial tissue and coated by the tunica albuginea. This

study describes the testicular histology and the organization of the germinative cells

of Phrynops geoffroanus. Sixteen adult males collected in São José do Rio Preto

(state of São Paulo, Brazil), were used. Fragments of the testes were submitted to

histological routine, included in resin and paraffin and stained with Hematoxilin and

Eosin. The seminiferous tubules are coated by mioid cells and present an epithelium

formed by two cell populations: the germinative cells in different stages of

differentiation (spermatogony, spermatocits I and II, round and elongated spermatids

and spermatozoids), and the Sertoli cells. Changes in the population of the

germinative cells and in the dimensions (area and diameter) of the seminiferous

tubules were observed throughout the year.

Key-words: Testes, histology, germinative cells, Phrynops geoffroanus, Testudines.

45INTRODUÇÃO

Amniotas (répteis, aves e mamíferos) possuem testículos formados por

túbulos seminíferos, ao contrário da maioria dos vertebrados anamniotas (peixes e

anfíbios) onde a organização testicular é cística (OLIVEIRA et al., 2002; OLIVEIRA

et al., 2003). Esse padrão de organização testicular é considerado uma adaptação à

independência da água para a reprodução, contribuindo para a conquista do

ambiente terrestre (GRIBBINS et al., 2003).

Os cágados da espécie Phrynops geoffroanus, possuem uma ampla

distribuição na região Neotropical, sendo naturalmente encontrada nos rios e

córregos de vários biomas. São comuns em rios e córregos da zona urbana, sendo

facilmente reconhecidos quando jovens por apresentarem um padrão de coloração

característico com manchas pretas e laranja escuro no plastrão e ponte. Possuem

um par de barbelas brancas com extremidades pretas no queixo, característica

responsável pela denominação popular da espécie como cágados-de-barbelas

(PRITCHARD e TREBBAU, 1984).

A estrutura histológica dos testículos e o processo de espermatogênese foram

amplamente estudada em aves e mamíferos (AL-DOKHI et al., 2004), porém, entre

os répteis os estudos estão direcionados ao processo de espermiogênese e às

mudanças cíclicas nos níveis de hormônios androgênicos (GIST e JONES, 1987;

LOFTS e TSUI, 1977; CALLARD et al., 1976; DUBOIS et al, 1988). A histologia dos

testículos dos répteis, especialmente dos Testudines tem sido o foco de poucos

estudos (IBARGÜENGOYTÍA et al., 1999).

Este trabalho descreve a histologia geral e a caracterização celular dos

testículos do cágado-de-barbelas, Phrynops geoffroanus.

MATERIAL E MÉTODOS

Machos adultos de Phrynops geoffroanus (Testudines: Pleurodira, Chelidae)

(N=16), foram coletados mensalmente durante o período de maio de 2005 a maio de

2006. As coletas foram devidamente autorizadas pela licença de captura nº

061/2005-RAN/IBAMA. Os animais foram coletados por meio de pesca manual com

a utilização de anzóis para fisga, em excursões durante o período vespertino no


zona urbana de São José do Rio Preto, SP, Brasil. Os pontos de coleta recebem

46esgoto de origem doméstica sem tratamento, apresentam margens planas

intercalada com barrancos, que são predominantes na extensão da área de coleta. A

vegetação marginal é predominantemente herbácea, sendo o local bastante

degradado devido à atividade antrópica.

Os animais capturados foram transportados ao IBILCE/UNESP e mantidos

vivos em tanques contendo água corrente, por um período de até três dias. Os

animais foram sacrificados de acordo com as recomendações do COBEA (Colégio

Brasileiro de Experimentação Animal), utilizando-se dosagens elevadas do

anestésico Cloridrato de ketamina.

Para a remoção das gônadas, os animais foram abertos com auxílio de uma

serra circular vibratória adequada para osteotomia. Após a remoção do plastrão, os

órgãos foram afastados para melhor visualização das vísceras e, então, os testículos

foram removidos. Foi padronizado o testículo essquerdo para o processamento

histológico, obtendo-se fragmentos das regiões cranial, medial e caudal.

Fragmentos dos testículos foram fixados em solução Bouin por 24 horas e

depois desidratados em séries crescentes de álcool (Hopwood, 1990). Os testículos

foram incluídos em resina do tipo Methacrilato glicol, Historesin (Leica, Germany) e

Paraplast (Oxford, Labware, USA) seccionados a 3 µm e corados com

Hematoxilina-Eosina. Para análise morfológica, as lâminas montadas foram

observadas ao microscópio Olympus BX 60 e analisadas por meio do programa de

análise de imagens Image Pro-plus, no Centro de Microscopia e Microanálise,

IBILCE/UNESP-SJRP/SP. As fotomicrografias obtidas foram visualizadas e

manipuladas pelos programas Microsoft Photo Editor e Imaging para Windows

Kodack. Para a identificação dos tipos celulares foram utilizadas imagens

digitalizadas de secções de túbulos seminíferos com aumento de 40x (25µm).

Dez túbulos seminíferos em cortes transversais, aleatoriamente selecionados,

em 3 cortes histológicos diferentes foram analisados (n=30) por animal. Para a análise estatística, foi, primeiramente foi verificada a existência de

valores discrepantes (outliers), em seguida, a normalidade dos dados foi testada por

Shapiro-Wilk, e quando necessários, foram submetidos à normalização (raiz

quadrada). Todos os resultados obtidos foram comparados entre os meses de junho

de 2005 a maio de 2006. Os dados biométricos das gônadas foram analisados entre

as estações do ano pelo teste One-Way ANOVA. Dados morfométricos dos túbulos

47seminíferos (diâmetro, área e a altura do epitélio seminífero) foram analisado pelo

teste One-Way ANOVA e Kruskal-Wallis e quando necessário, completado pelo

Teste de Tukey.

RESULTADOS

Os testículos Phrynops geoffroanus são estruturas ovais e estão situadas na

região pélvica da cavidade abdominal. Externamente, cada testículo é revestido por

uma cápsula de tecido conjuntivo denso formando a túnica albugínea. Apresentam

dois compartimentos: os túbulos seminíferos e o interstício (Figura 1).

Tecido intersticial: os espaços entre os túbulos seminíferos são preenchidos

por um tecido intersticial extravascular, que é um tecido conjuntivo frouxo, rico em

matriz extracelular. As células intersticiais ou células de Leydig, estão localizadas no

interstício, geralmente, próximas aos vasos sangüíneos. Essas células constituem o

componente endócrino dos testículos. Além das células de Leydig ocorrem

fibroblastos, células mióides, pequenos feixes de fibras colágenas, macrófagos e

mastócitos ocasionais.

As células intersticiais de Leydig ocorrem em grupos ou isoladamente.

Aparentemente, apresentam tamanhos variados. Em geral, possuem formato

poliédrico irregular, podendo ser também alongadas ou fusiformes. Apresentam um

grande núcleo de formato esférico com um ou dois nucléolos proeminentes. São

observadas grandes áreas claras próximas ao núcleo e em outras regiões do

citoplasma (Figura 2D).

Túbulos seminíferos: são estruturas enoveladas, de diâmetros variados, e

que correspondem a maior proporção do tecido testicular. Não foram observados

septos que formam lóbulos envolvendo os túbulos seminíferos, nem mediastino

testicular. O epitélio seminífero de cada túbulo contém uma lâmina basal que

externamente, é revestida por tecido conjuntivo frouxo contendo uma ou mais

camadas de células mióides, semelhantes às células musculares lisas (Figura 2A,B).

Análises morfométricas dos túbulos seminíferos revelaram variações no

diâmetro e na área tubular durante os meses examinados. As maiores médias foram

observadas durante os meses de primavera e início do verão, coincidindo com as

maiores médias dos índices testiculares e os menores valores foram observados nos

48meses de inverno (Tabela 1). O aumento do diâmetro e da área dos túbulos

seminíferos, assim como do índice testicular (IGS) correspondem ao período de

maior atividade sexual.

Os tipos celulares presentes no epitélio seminífero constituem dois grupos: as

células da linhagem germinativa, que completam o ciclo espermatogênico realizando

um grande número de mudanças citológicas (Figura 2A,B) durante o seu

desenvolvimento e as células de Sertoli. Em cada túbulo seminífero, assentadas na

membrana basal, estão as células germinativas, organizadas em sucessivas

camadas de células em diferentes estádios de divisão celular (mitose e meiose) e

diferenciação (espermiogênese). Os diferentes estádios transicionais de células

germinativas podem ser identificados (linhagem espermatogênica), sucessivamente

da base ao lúmen tubular. As células espermatogênicas são morfologicamente

distintas e podem ser identificadas em fases de espermatogônia, espermatócitos

primários e secundários, espermátides primárias (redondas) e secundárias

(alongadas) e espermatozóides.

Nos túbulos seminíferos de Phrynops geoffroanus as células de Sertoli foram

observadas durante todos os meses analisados, consistindo em um componente

permanente do epitélio. Seu núcleo possui um contorno triangular com um ou mais

proeminentes nucléolos arredondados (Figura 3 O,P). Estão localizados na periferia

dos túbulos, geralmente em associação com a membrana basal, entretanto podem

ser observados em posições mais altas do epitélio em direção à luz do túbulo.

Espermatogônias: ocupam geralmente posição mais basal, e, à medida que

as células se diferenciam, vão ocupando camadas mais altas do epitélio em direção

ao lúmen do túbulo. Em Phrynops geoffroanus foram identificados três tipos de

espermatogônias: as residuais, que ficam sempre ligadas à face interna da

membrana basal; as espermatogônias do tipo A (espermatogônias claras) e as do

tipo B (escuras) que são as que entram em divisão meiótica. São observadas

também células hipertróficas (Figura 3D), que representam espermatogônias

produzidas em ciclos anteriores e que não se dividiram.

As espermatogônias residuais ou tronco (Figura 3A) são encontradas

próximas à membrana basal do epitélio seminífero. São células que raramente

entram em divisão. Apresentam tamanho menor que os outros tipos de

espermatogônias e seu núcleo possui formato oval e é mais intensamente corado,

bem como seu nucléolo.

49As espermatogônias do tipo A (Figura 3B) foram encontradas em todas as

lâminas examinadas neste estudo. Apresentam formato oval e uma de suas

superfícies está em contato direto com a membrana basal, e a superfície apical

voltada para o epitélio seminífero. Seu núcleo arredondado com proeminente

nucléolo e heterocromatina concentrada próxima à membrana nuclear. As

espermatogônias do tipo A dividem-se e são diferenciadas em espermatogônias do

tipo B.

As espermatogônias do tipo B (escuras) (Figura 3C) são aparentemente

menores e mais intensamente coradas que as espermatogônias do tipo A. Possuem

núcleo arredondado com largos corpos cromatínicos dispersos pelo nucleoplasma.

Um ou dois proeminentes nucléolos estão presentes. Durante o início da fase

proliferativa da espermatogênese há produção de uma larga população de

espermatogônias B, que se acumulam próximo à membrana basal.

Células meióticas: (espermatócitos primários e secundários) são

caracterizadas por aumento do citoplasma e do núcleo e gradual condensação da

cromatina. As espermatogônias do tipo B entram em Prófase I da meiose, sendo

observadas células em vários estádios da meiose I. As células que entram em

meiose I são levemente maiores e se coram mais intensamente que as células em

pré-leptóteno e as fibras cromatínicas formam grumos em seu núcleo. Os

espermatócitos primários foram identificados em fase de leptóteno e paquíteno.

Espermatócitos em leptóteno (Figura 3F) são levemente maiores e mais

intensamente corados que em pré-leptóteno, e as fibras dos filamentos cromatínicos

ocupam totalmente o núcleo. Células em paquíteno (Figura 3G) apresentam um

substancial aumento de tamanho e seu núcleo contém fibras cromatínicas

intercaladas com área de nucleoplasma aberto. Os estádios de leptóteno e

paquíteno foram observados com maior freqüência.

Os espermatócitos secundários (Figura 3H) são menores que os primários,

apresentando um tamanho aparentemente maior que as espermátides, suas

sucessoras. Estão aleatoriamente distribuídos entre os espermatócitos primários e

as espermátides. Possuem núcleo central, levemente corado, com corpos

cromatínicos dispersos, e aparentemente maiores que o núcleo das espermátides

iniciais. Sua freqüência de observação é baixa.

Espermátides: são resultantes da segunda divisão meiótica que ocorre nos

espermatócitos II. Durante sua diferenciação realizam transformações morfológicas

50básicas que incluem o desenvolvimento do acrossomo, formação do flagelo,

condensação nuclear e eliminação do excesso de citoplasma. Foram identificadas

espermátides esféricas e alongadas, tornando possível distinguir dois tipos

morfológicos básicos: espermátides redondas (I) e espermátides alongadas (II). As

espermátides redondas são levemente menores que os espermatócitos II. Possuem

núcleo esférico, centralmente localizado, com corpos cromatínícos de aspecto

heterogêneo, devido aos diferentes estádios de compactação do material e

desenvolvimento do capuz acrossômico (Figura I,J). As espermátides alongadas (II)

são células em que o núcleo sofre uma progressiva elongação, concomitante com

uma compactação nuclear. Nos estádios finais de elongação ocorre eliminação de

citoplasma e o flagelo torna-se evidente. Os núcleos são mais intensamente corados

que nos estádios prévios. São vistos em associação com o citoplasma das células

de Sertóli (Figura 3 K,N).

Espermatozóide: apresentam grande compactação nuclear e a porção apical

de cada núcleo torna-se levemente côncava na porção média da cabeça, resultando

em uma superfície côncava e outra convexa. Aparecem ligados ao citoplasma das

células de Sertoli, e são gradativamente liberados para o lúmen do túbulo seminífero

(espermiação) sendo, então, transportados para os epidídimos onde serão

armazenados (Figura 3 N).

DISCUSSÃO

Os testículos de Phrynops geoffroanus são compostos por túbulos

seminíferos, conectados pelo tecido intersticial que preenche a região intertubular.

Essa organização testicular é descrita para todos os grupos de vertebrados

amniotas, incluindo répteis, aves e mamíferos (ROMER e PARSONS, 1985),

contrastando com a maioria dos tetrapoda anamniotas onde a organização testicular

é cística. Entre os vertebrados anaminotas (peixes e anfíbios) os testículos estão

histologicamente organizados em cistos ou ampolas (HILDEBRAND, 1995; ROMER

e PARSONS, 1985). Nos anfíbios a espermatogênese é cística, e os eventos de

proliferação, meiose e espermiogênese, ocorrem em grupos bem definidos de

células germinativas, denominados cistos germinativos (GRIBBINS et al, 2003;

OLIVEIRA et al., 2003). A organização testicular dos anfíbios é considerada

51transicional entre anamniotas e amniotas, e presença de túbulos seminíferos, uma

adaptação à fertilização interna, assim como a presença de órgãos copuladores

(pênis e hemipênis) e epidídimos para armazenamento temporário de

espermatozóides (GRIBBINS et al., 2003; HOLMES e GIST, 2004; LOFTS e TSUI,

1977).

Durante as análises histológicas dos túbulos seminíferos de Phrynops

geoffroanus não foi verificada a presença de septos intratesticulares como ocorre em

mamíferos e aves (AIRE, 2002; CORMACK, 1991). Entre os répteis a presença de

septos foi reportada na serpente Eryx jaiakari (AL-DOHKI et al., 2004) onde os

túbulos seminíferos estão organizados em lóbulos contendo um ou mais túbulos.

Outros trabalhos que incluem dados da morfologia testicular de répteis não

mencionam a presença de septos envolvendo os túbulos seminíferos (GRIBBINS et

al.,2003; GRIBBINS e GIST, 2003;). Estudos sobre a organização testicular entre

anfíbios anuros (OLIVEIRA, 1996), reportam a ausência de septos nos testículos.

O diâmetro e a área dos túbulos variaram de acordo com o estádio de

atividade sexual, tornando-se maior durante o período reprodutivo. Estudos

realizados com outros grupos de répteis indicam que variações na massa dos

testículos (IGS) e nas dimensões dos túbulos seminíferos são comuns em répteis de

clima temperado, assim como em mamíferos e aves que se reproduzem

sazonalmente (GEORGES, 1983). Entre os Testudines, vários trabalhos sobre ciclo

reprodutivo masculino em espécies de clima temperado de diversas famílias, como

Apalone ferox (MEYLAND et al., 2002); espécies da família Kinosternidae

(MAHMOUD e KLICKA, 1972); Sterotherus minor minor (ETCHEMBERG e STOVAL,

1990); Kinosternon flavescens flavescens (CHRISTIANSEN e DUNHAM, 1972);

Claudius angustatus (FLORES-VILELA e ZUG, 1994); Trionyx sinensis (LOFTS e

TSUI, 1977) e Crysemys picta (GIST et al., 2001), mostraram maiores índices

durante as fases de maior atividade espermatogênica, e menores índices nas fases

de regressão e quiescência. Segundo Gans e Parsons 1977, apud (AL-DOKHI et al.,

2004), a capacidade de expansão do túbulo está sob controle nervoso, porém o

mesmo autor atribui a capacidade de contração e expansão dos túbulos à habilidade

autônoma das células mióides peritubulares. O aumento das dimensões dos túbulos

seminíferos e dos índices testiculares ocorre devido à intensa proliferação celular.

As células germinativas estão organizadas em camadas no epitélio seminífero

de Phrynops geoffroanus. Cerca de 3-6 camadas de diferentes células germinativas

52foram observadas, sendo que as espermatogônias estão sempre próximas à

membrana basal. Os espermatócitos ocupam posição mais alta que as

espermatogônias no epitélio, porém abaixo ou ao lado das espermátides, que ficam

geralmente mais próximas do à luz tubular. Essa organização do epitélio com

espermatogônias localizadas na base, e as células mais diferenciadas ocupando

posições sucessivamente mais altas é esperada, como já foi descrito para várias

espécies (BLOOM e FAWCETT, 1977; CORMACK, 1991).

Diversas células espermatogênicas foram reconhecidas, ocorrendo variação

dos tipos celulares ao longo dos meses analisados. De acordo com Bloom e

Fawcett (1977), a diversidade celular deve-se a uma alta atividade de divisão

(mitose e meiose) encontrada nos túbulos seminíferos. A variação dos tipos

celulares ao longo do ano, observadas no epitélio seminífero de Phrynops

geoffroanus, também foram relatadas para outras espécies de Testudines

(McPHERSON e MARION, 1981; ETCHEMBERG e STOVAL, 1990; MAHMOUD e

CYRUS, 1992;)

Os diferentes tipos de espermatogônias identificadas em Phrynops

geoffroanus, são similares às descrições propostas para outras espécies de répteis

(GRIBBINS et al., 2003; GRIBBINS e GIST et al., 2003; GRIBBINS et al., 2005).

Ocasionalmente, foram observadas células hipertróficas, que segundo Gribbins et

al., (2003) representam espermatogônias produzidas em ciclos anteriores e que não

se dividiram. A diferenciação dos tipos de espermatogônias baseou-se no tamanho e

forma nuclear, no grau de condensação da cromatina e reação aos corantes, e

posição do nucléolo. Volsoe (1944) e Fox (1952) apud (GRIBBINS et al., 2003)

consideram que a identificação de tipos diferentes de espermatogônias é difícil.

Vários estudos que reportam a espermatogênese em diferentes grupos de

répteis, revelaram uma similaridade na organização e na morfologia das células da

linhagem germinativa. Entre lacertílios (GRIBBINS e GIST, 2003; FERREIRA et al.,

2002) foram identificados dois tipos de espermatogônias, que diferem entre si no

tamanho e formato do núcleo e do citoplasma. Nas serpentes Seminatrix pygaa

(GRIBBINS et al., 2005) foram reconhecidos dois tipos de espermatogônias,

denominadas de A e B, e em Eryx jayakari (AL-DOKHI et al., 2004) três tipos

morfológicos de espermatogônias, denominadas de espermatogônia residual ou

intermediária, espermatogônia A e espermatogônia B. Em Aligator mississipiensis

(GRIBBINS et al., 2006) foram identificadas as espermatogônias A, residual e

53espermatogônia B, assim como em tartarugas da espécie Trachemis scripta

(GRIBBINS et al., 2003).

As espermatogônias residuais descritas neste estudo foram observadas

numa freqüência muito baixa, e sempre assentadas sobre à membrana basal. Elas

parecem ser similares às espermatogônias residuais descrita para Trachemys

scripta, sendo consideradas por Gribbins et al., (2003), como espermatogônias de

estoque ou tronco.

A descrição de diferentes tipos de espermatogônias é uma conseqüência da

alta atividade mitótica dessas células. As espermatogônias representam a fonte

original de células espermatogênicas e os espermatócitos primários são originários

de espermatogônias tipo B que se dividem.

Os espermatócitos primários (I) originam-se das espermatogônias B, que

iniciam a divisão meiótica. Foram geralmente encontradas em posição mais alta (em

direção ao lúmen do túbulo) do que as espermatogônias. São usualmente

observadas nas fases de prófase da primeira divisão meiótica, que é considerada a

fase mais longa da meiose (ALBERTS et al., 2002). O aspecto do núcleo, que

apresentou diferentes graus de condensação da cromatina, permitiu o

reconhecimento de distintas fases da prófase I. Conforme as descrições

apresentadas por Gribbins e colaboradores (2003, 2005 e 2006), e Gribbins e Gist

(2003), em seus trabalhos sobre espermatogênese em répteis, as subfases

descritas como leptóteno, paquíteno e diacinese são similares ao que foi observado

em Phrynops geoffroanus. Durante o leptóteno os núcleos são intensamente

corados e os finos filamentos de cromatina formam pacotes ou grumos. Esta parece

ser a fase mais longa, pois estes tipos celulares são encontrados em grande

quantidade e num período de tempo maior que as outras subfases identificadas. Na

fase de paquíteno, o aumento acentuado do núcleo e os filamentos cromossômicos

esparsos no nucleoplasma tornam o reconhecimento dessa fase relativamente fácil.

Espermatócitos em diacinese foram observados numa freqüência muito baixa.

Células em fase de zigóteno não foram identificadas neste estudo. Em Tracheys

scripta, espermatócitos em zigóteno são extremamente raros (Gribbins et al., 2003).

Os espermatócitos secundários foram as células que apresentaram a menor

freqüência de observação, quando comparada com os outros tipos celulares da

linhagem germinativa. São derivadas da divisão dos espermatócitos primários e

realizam meiose II originando as espermátides. Devido à grande quantidade de

54células precursoras e derivadas dos espermatócitos II, parece que sua divisão é

mais rápida que as outras fases, daí serem observados em baixa freqüência.

Gribbins e colaboradores (2003) sugerem em seus trabalhos que os espermatócitos

secundários apresentam núcleo 10-15% maiores que as espermátides e que

geralmente são encontradas junto com outros tipos transicionais de células, em fase

de diacinese, metáfase I e metáfase II. Reportam ainda que sua freqüência de

observação é muito baixa.

As células espermiogênicas originam-se da divisão dos espermatócitos

secundários, formando as espermátides que se diferenciarão em espermatozóides.

Várias alterações ocorrem no núcleo e no citoplasma dessas células, incluindo o

desenvolvimento do sistema acrossômico, elongação do núcleo e condensação do

material nuclear (FERREIRA e DOLDER, 2002; SPRANDO E RUSSEL, 1988). As

alterações nucleares, bem como a morfologia do grânulo acrossômico, permitiram a

descrição de oito estádios de diferenciação, segundo a terminologia de Russel

(1990), apud (GRIBBINS, 2003) para mamíferos. Não foi objetivo deste trabalho a

identificação dos diferentes estádios, e as espermátides foram classificadas em

redondas ou primárias e alongadas ou secundárias. Contudo, observou-se que há

uma ampla diversidade de espermátides, quanto ao aspecto morfológico do núcleo

que apresentou uma grande heterogeneidade. As espermátides são sempre

observadas em grupos, o que sugere a ocorrência de pontes citoplasmáticas entre

estas células, como tem sido sugerido em Trachemys scripta (GRIBBINS et al.,

2003).

Nos estádios finais de elongação das espermátides, ocorre progressiva

condensação nuclear e eliminação de citoplasma. Segundo Gribbins et al., (2003),

os espermatozóides são considerados maduros quando apresentam núcleo mais

intensamente corado que nos estádios prévios de elongação, completa eliminação

do citoplasma, e com a porção apical levemente curvada, resultando em uma

superfície côncava e convexa, terminando, assim, a espermiogênese. Com esse

aspecto os espermatozóides são denominados maduros. Esta descrição reportada

para Trachemys scrypta, Podarcis muralis, Seminatrix pygaea e Alligator

mississippiensis (GRIBBINS et al., 2003; GRIBBINS e GIST, 2003; GRIBBINS et al.,

2005; GRIBBINS et al., 2006) é similar à encontrada em Phrynops geoffroanus.

Outro tipo celular presente no epitélio seminífero de Phrynops geoffoanus, é a

célula de Sertoli ou de sustentação, que forma uma população fixa e não

55proliferativa. São contíguas entre si, entretanto isto não é evidente nas

preparações para observação em microscopia de luz, nos quais aparecem grandes

espaços entre as células adjacentes. Suas bordas lateral e face lumial apresentam

contorno irregular, o que torna muito difícil o seu discernimento ao microscópio de

luz. Segundo Cormack (1991), o aparente espaço entre essas células e seu

contorno irregular são uma consequência do fato de que as sucessivas gerações de

células germinativas passarem entre as células de Sertoli em direção à luz do

túbulo. Apresentam um grande núcleo geralmente localizado na porção basal e com

um ou mais proeminentes nucléolos, porém, em fases avançadas de proliferação,

foram observados núcleos em posição mais alta. Durante a fase de diferenciação

foram observados espermátides alongadas e espermatozóides abrigados no

citoplasma das células de Sertoli, formando colunas no epitélio seminífero. Este

arranjo peculiar também foi descrito para outras espécies (GRIBBINS et al., 2003;

GRIBBINS e GIST, 2003; GRIBBINS et al., 2005).

As células de sustentação desempenham importantes funções no processo

espermatogênico, dentre as quais a produção do fluido testicular. Auxiliam no

controle dos níveis de testosterona, fornecimento de microambiente adequado para

nutrição das células germinativas, translocação ativa das células germinativas,

liberação ativa de espermatozóides maduros para a luz do túbulo e controle

fagocitário das células germinativas em degeneração e do excesso de citoplasma

após a formação dos espermatozóides (CORMACK, 1991; BLOOM e FAWCETT,

1977). Trabalhos com técnicas histoquímicas e ultraestruturais e sobre concentração

de hormônios androgênicos em Testudines sugerem que tanto as células de Leydig

quanto as células de Sertoli podem sintetizar testosterona (DUBOIS et al., 1988).

A análise histológica do tecido intersticial de Phrynops geoffroanus revelou

uma similaridade com as demais espécies de quelônios estudadas, sendo que no

período em que os túbulos seminíferos apresentam as menores médias de área,

diâmetro e altura do epitélio, o interstício estava mais largo. Observou-se uma

relação inversa entre o desenvolvimento dos túbulos seminíferos e o tecido

intresticial. As células de Leydig apresentam aspecto semelhante, e a

heterogeneidade do núcleo e do citoplasma sugere que sua atividade é maior em

alguns períodos do ano. Em seus estudos sobre ciclos testiculares e hormonais de

quelônios, Callard et al., (1976); Lofts e Tsui (1977); Licht et al., (1982); Licht et al.,

(1985) e Dubois et al., (1988) reportam que as células de Leydig e as células de

56Sertoli apresentam atividade assincrônica, ou seja, enquanto o interstício

apresenta células de Leydig ativas o pico de andrógeno é alto e os túbulos

seminíferos estão reduzidos, ocorrendo o inverso durante a espermatogênese.

Podemos concluir que os testículos de Phrynops geoffroanus, são

histologicamente similares aos demais Testudines, apresentando uma variação

morfométrica dos túbulos seminíferos, e variações da população de células

germinativas ao longo do período amostrado, indicando uma espermatogênese com

eventos cíclicos.

REFERÊNCIAS AIRE, T.A. 2002. Morphological Changes in the Efferent Ducts During the Main

Phases of the reproductive Cycle of Birds. Journal of Morphology. 253:64-75. AL-DOKHI, O.A.; AL-ONAZEE, Y.Z. e MUBARAK, M. 2004. Ligth and Electrón

Microscopy of the Testicular Tissue of the Snake Eryx jayakari (Squamata,

Reptilia) with a Reference to the Dividing Germ Cells. Journal of Biological Sciences. 4(3): 345-351.

ALBERTS, B.; BRAY, D.; JHONSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; KEITH, R.; WALTER,

P. 2004. Fundamentos de Biologia Celular, Uma Introdução à Biologia Molecular da Célula. Artmed. RS. 562-581.

BLOOM, W.; FAWCETT. D.W. 1977. Tratado de Histologia. Interamericana. 10ª ed.

RJ. 509-527.

CALLARD,I.P.; CALLARD, G.V.; LANCE, V. e ECCLES, S. 1976. Seasonal Changes

in Testicular Structure and Function and Effects of Gonadotropins in the


30:347-356.

CORMACK, D.H.1991. Ham Histologia. Guanabara Koogan. 9ª ed. RJ.738-783.

CHRISTIANSEN, J.L. e DUNHAM, A.E. 1972. Reproduction of the Yellow Mud Turtle

(Kinosternon flavescens flavescens) in New Mexico. Herpetologica. 28:130-137.

DUBOIS, W. PUDNEY, J. e CALLARD, I. P. 1988. The Annual Testicular Cycle in the

Turtle, Crysemis picta: A Histochemical and Electron Microscopic Study. General and Comparative Endocrinology. 71: 191-204.

57ETCHEMBERGER, C.R., e STOVALL, R.H. 1990. Seasonal variation in the

testicular cycle of the loggerhead musk turtle, Sternotherus minor minor, from

central Florida. Canadian Journal of Zoology. 68:1071-1074.


Iguanas, Iguana iguana (Reptilia:Sáuria:Iguanidae), in the Pantanal of Brasil. Brazilian Journal of morphology Science. 19(1), 23-28.

FERREIRA, A.; LAURA, I.A .; DOLDER, H. 2002. Sperm ultrastructure and

spermatogenesis in lizard, Tropidurus itamberere. Biocel. 27(3): 353-362.




GEORGES, A. 1983. Reproduction of the Australian freswather turtle Emydyra krefftii

(Chelonia: Chelidae). Journal of Zoology London. 201: 331-350.

GIST, D.H. e JONES, J.M. 1987. Store of sper in reptilian oviduct. Scanning Microscopy. Vol. 1(4):

GRIBBINS, K.M.; GIST, D.H.; CONDON, J.D. 2003. Cytological evaluation of


turtle, Trachemis scripta. Journal of Morphology, 255(3): 337-347.

GRIBBINS, K.M. e GIST, D.H. 2003. Cytological Evaluation of Spermatogenesis






(Stockholm) 86: 223-230.





STEVENS, A.; Foreword by DAVID, R.T. 1990. Theory and practice of histological techniques. 3ª ed. Edimburgh London Melbourne and New York,

726p.

HOLMES, H.J.; GIST, D.H. 2004. Excurrent Duct System of the Male Turtle


58HILDEBRAND, M. 1985. Análise da Estrutura dos Vertebrados. Atheneu. SP.

700p.

IBARGÜENGOYTÍA, N.R.; PASTOR, L.M. E PALLARES, J. 1999. A light microscopy

and ultrastructural study of the testes of tortoise Testudo graeca (Testudinidae).

Journal of Submicroscopy, Cytology and Pathology. 31 (2): 221-229.

LICHT, P. 1982. Endocrine Patterns In The Reproductive Cycle of Turtles.


LICHT, P.; BREITENBACH, G.L. e CONGDON, J.D. 1985. Seasonal Cycle in



LOFTS. B. e TSUI, H.W. 1977. Histologial and histochemical changes in the gonads




201.



McPHERSON, R.J. e MARION, K.R. 1981. Seasonal Testicular Cycle Of The


(1): 33-40.

MEYLAN, P.A.; SCHULER, R.; MOLER, P. 2002. Spermatogenic Cycle of the Florida

Softshell Turtle, Apalone ferox. Copeia.3: 779-786.

OLIVEIRA, C.; ZENATONI, C. e ZIERI, R. 2002. Morphological Observations On The

Testes Of Physalaemus cuvieri (Amphibia, Anura). Revista Chilena de Anatomia. 20(3): 263-268.

OLIVEIRA, C. VICENTINI, C.A. e TABOGA, S.R. 2003. Structural characterization of

nuclear phenotypes during Scinax fuscovarius spermatogenesis (Anura,

Hylidae). Caryologia. 56 (1): 75-83.

OLIVEIRA, 1986,

PRITCHARD, P.C.H.; TREBBAU, P. 1984. The Turtles of Venezuela. Fundación de Internados Rurales (Venezuela), Society for the study of Amphibians and


59ROMER, S.; PARSONS, T.S. 1985. Anatomia Comparada dos Vertebrados. 5ª

ed. Atheneu. SP. 599p

SOUZA, F.L. e ABE, A.S. 2001. Population Structure and Reproductive Aspects of



57-62.

SPRANDO, R.I. e RUSSELL, L. D. 1988. Spermiogenesis in the Red-Ear Turtle

(Pseudemys scripta) and the Domestic Fowl (Gallus domesticus): A Study of

Cytoplasmic Events Including Cell Volume Changes and Cytoplasmic Elimination.

Journal of Morphology. 198: 95-118.

60

C

ta

ts

ti

l

ep

A

B

C

Figura 1. Testículo de Phrynops geoffroanus (HE). A. Secção do testículo onde estão indicados: túnica albugínea (ta); túbulo seminífero (ts) e tecido intersticial (ti). B. Túbulo seminífero onde são indicados o epitélio seminífero (es) e o lúmen (l). C. Detalhe do túbulo seminífero durante o pico da espermatogênese.

61

mb

ti

cL v

A

cm es

A

C

B

D

Figura 2. Testículo de Phrynops geoffroanus (HE). A. Túbulo seminífero apresentando diâmetro aumentado, durante a fase reprodutiva com epitélio seminífero (es) apresentando células germinativas em diferentes estádios; células mióides (cm) próximas à membrana basal. B. Túbulo seminífero com diâmetro reduzido (período não-reprodutivo) mostrando membrana basal (mb); tecido intersticial (ti). C. Epitélio germinativo com diversidade de células transicionais e espermatogônia durante a metáfase (seta). D. Detalhes do tecido intersticial: célula de Leydig (cL) e vaso sanguíneo (v).

62

A B

E

C D

F H G

I J K L

M N O

E

P

Figura 3. Tipos celulares encontrados no epitélio seminífero de Phrynops geoffroanus (H-E). Escala= 25µm. A. Espermatogônia residual (cabeça de seta). B. Espermatogônia A (seta). C. Espermatogônia B (seta). D. Espermatogônia hipertrófica (seta). E. Mitose espermatogonial (seta). F. Espermatócitos primários - leptóteno (seta). G. Espermatócitos primários –paquíteno (cabeças de seta). H. Espermatócito secundário (seta). I-J. Espermátides redondas em diferentes estádios de condensação cromatínica. K-M. Espermátides alongadas em diferentes estádios. N. Espermátide alongada –estádio avançado (seta) e espermatozóide (cabeça de seta). O. Célula de Sertoli. P. Célula de Sertoli de indivíduo imaturo.

63

Tabela 1. Variações dos dados morfométricos e biométricos dos testículos de adultos de Phrynops geoffroanus.

Túbulos Seminíferos Testículos Animal (estação) Área (µm2) e Dv Diâmetro (µm) e Dv IGS e Dv

Inverno

Primavera

Verão

Outono

65703.4 9599.1 273.4 47.3 0.103 0.01

153360.6 4437.9 429.1 77.9 0.493 0.02

103815.1 21340.1 340.8 53.6 0.243 0.06

82541.3 19531.5 320.6 62.9 0.154 0.1

64• MORFOLOGIA DA VIA SEMINÍFERA EXTRATESTICULAR DE Phrynops

geoffroanus (TESTUDINES:CHELIDAE)









IBILCE-UNESP.


FAX: (55-17) 3221-2390


65RESUMO

As vias seminíferas extratesticulares (dúctulos eferentes, epidídimos e ductos

deferentes) de adultos de Phrynops geoffroanus, foram examinadas por microscopia

de luz. Uma série de túbulos (dúctulos eferentes) conectam os testículos aos

epidídimos. Os dúctulos eferentes são formados por um conjunto de pequenos

túbulos de diâmetros variados, com epitélio colunar simples, formado pelas células

ciliadas, células não-ciliadas e poucas células basais. O epidídimo é um tubo

simples, longo e altamente convoluto, que recebe os dúctulos eferentes ao longo de

sua extensão. É revestido por um epitélio pseudoestratificado colunar com três tipos

celulares: as células principais, que são as mais abundantes, células basais e uma

pequena célula estreita (“narrow cell). As diferenças histológicas entre a região da

cabeça, corpo e cauda do epidídimo, bem como as diferenças do epitélio ao longo

do ciclo reprodutivo são discutidas. O ducto ou vaso deferente é constituído de

epitélio de aspecto pseudoestratificado baixo com dois tipos celulares: as células

principais e basais. Durante todos os meses analisados foram observados

espermatozóides armazenados nos epidídimos e ductos deferentes.

Palavras-chave: Testudines, Phrynops geoffroanus, ducto deferente, histologia,

ducto eferente, epidídimo.

ABSTRACT

The estratesticular seminiferous ducts (efferent ductules, epididims and

defferent ducts) of adults of Phrynops geoffroanus were examined by light

microscopy. A series of tubules (efferent ductules) connect the testes to the

epididymis. The efferent ductules are formed by a rete of small tubules of varied

diameters, with simple columnar epithelium, formed by the ciliated cells, non-ciliated

cells and few basal cells. The epididim is a simple, long and highly convolute tubule

that receives the efferent ductules throughout its extension. It is coated by a pseudo-

stratified columnar epithelium with three cellular types: the principal cells, which are

the most abundant, basal cells and a small narrow cell. The histological differences

between the head region, body and tail of the epididymis, as well as the differences

of the epithelium throughout the reproductive cycle are discussed. The duct, or

defferent vase, is constituted of epithelium of low pseudo-stratified aspect with two

66cellular types: the principal and basal cells. During all the analyzed months

spermatozoa stored in the epididims and defferent ducts were observed.

Key-Words: Testudines, Phrynops geoffroanus, deferent duct, histology, efferent

ductules, epididymis.

INTRODUÇÃO

As vias seminíferas extratesticulares são constituídas pelos dúctulos

eferentes, epidídimos e ductos deferentes. É geralmente aceito que estas estruturas

originam-se dos ´ductos arquinéfricos, que nos vertebrados anamniotas é utilizado

como um órgão misto, com função de transporte de urina e de espermatozóides

(ROMER e PARSONS, 1989; ORR, 1985; HICKMAN et al., 2004). Nos amniota o

ducto passou a ser utilizado exclusivamente para o transporte de espermatozóides,

ocorrendo outros tubos para a condução de urina, os ureteres.

Os epidídimos e os demais ductos do sistema seminífero extratesticular são

considerados órgãos adaptativos implicados na transição dos vertebrados do

ambiente aquático para o terrestre, e relacionados com a fertilização interna (ORR,

1985; POUGH et al., 2003).

Os ductos condutores de espermatozóides são comumente implicados nos

processos de maturação e transporte dos gametas produzidos nos testículos. Vários

trabalhos têm tratado da estrutura, da função e da regulação dos ductos

epididimários de mamíferos e aves (AIRE e STOLEY, 2000; AIRE, 2002), entre os

répteis, entretanto, poucos estudos enfatizam sua morfologia, considerando o grupo

dos Testudines, os trabalhos são bastante escassos, e foram realizados com

espécies de regiões de clima temperado (HOLMES e GIST, 2004).

Os Testudines representam um dos mais antigos grupos de répteis viventes e

estão entre os primeiros a utilizar os epidídimos para armazenamento de

espermatozóides. Tendo em vista a escassez de dados sobre a morfologia da vias

seminíferas extratesticulares de répteis, este trabalho descreve a histologia dos

dúctulos eferentes, epidídimos e ductos deferentes de Phrynops geoffroanus,

conhecidos popularmente como cágados-de-barbelas, espécie de ampla ocorrência

na região Neotropical, sendo encontrados em vários biomas do Brasil. São comuns

67em córregos e rios da zona urbana, onde são observados com bastante

freqüência, parecendo estarem bem adaptados a ambientes poluídos.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram coletados 16 machos adultos de Phrynops geoffroanus (Testudines:

Pleurodira, Chelidae), (licença de captura nº 061/2005-RAN/IBAMA). As coletas

ocorreram mensalmente, durante o período de abril de 2005 a maio de 2006. Os

animais foram capturados por meio de pesca manual com a utilização de anzóis

para fisga, em excursões durante o período vespertino ao córrego Felicidade, (S 20º

46’ 20.6”, W 49º 21’ 18.0”), um afluente do Rio Preto, na zona urbana de São José

do Rio Preto, SP, Brasil. Os pontos de coleta apresentam margem plana intercalada

com barrancos, que são predominantes na extensão da área de coleta. A vegetação

marginal é predominantemente herbácea. O local é bastante degradado devido à

atividade antrópica e recebe esgoto de origem doméstica.




Animal). Dosagens elevadas do anestésico Cloridrato de Ketamina injetável foram

realizadas, por conduzirem a uma morte calma e minimizar o sofrimento do animal

(AURICCHIO e SALOMÃO, 2002). Adicionalmente foram realizadas injeções de

etanol no encéfalo dos animais, pela introdução de 5ml com seringa pelo forame

magno, garantindo que os animais estivessem realmente em óbito para a dissecção.

Os animais foram abertos com auxilio de uma serra circular vibratória

adequada para osteotomia. Após a remoção do plastrão, os órgãos foram afastados

para melhor visualização das vísceras e então os testículos, epidídimos e ductos

deferentes foram removidos.

Por conveniência foram utilizados os epidídimos e ductos deferentes

esquerdos para o processamento histológico. Fragmentos (aproximadamente 3mm)

foram retirados da extremidade cranial (cabeça), da porção média (corpo) e da

extremidade caudal (cauda) do epidídimo, e do terço médio do ducto deferente.

Foram fixados em solução Bouin por 24 horas e depois desidratados em série

crescentes de álcool (Hopwood, 1990). Os epidídimos e ductos deferentes foram

incluídos em resina do tipo Methacrilato glicol, Historesin (Leica, Germany) e

68Paraplast (Oxford, Labware, USA), seccionados à 3 µm e corados com

Hematoxilina-Eosina e PAS. Para análise morfológica, as lâminas montadas foram

observadas ao microscópio Olympus BX 60 e analisadas através do programa de

análise de imagens Image Pro-plus, no Centro de Microscopia e microanálise do

IBILCE/UNESP- SJRP/SP. As fotomicrografias obtidas foram visualizadas e

manipuladas pelos programas Microsoft Photo Editor e Imaging para Windows

Kodack.

Secções dos epidídimos em cortes transversais, aleatoriamente selecionados

e em três cortes histológicos diferentes (cabeça, corpo e cauda) foram medidos (8

medidas por região), totalizando em 24 por animal.

Para verificar a existência de diferenças histológicas entre as regiões da

cabeça, corpo e da cauda do epidídimo, a altura do epitélio e a espessura da túnica

muscular foram medidas, padronizando-se a objetiva com aumento de 20X (50µm).

Para averiguar a ocorrência de diferenças morfométricas no epitélio dos epidídimos

ao longo do ano, foram analisados cinco animais da estação ou período reprodutivo

e cinco da não reprodutiva.

Análise estatística

Após verificada a existência de valores discrepantes (outliers), a normalidade

dos dados foi testada por Shapiro-Wilk, e quando necessário, foram submetidos à

normalização (raiz quadrada). Os dados morfométricos (altura do epitélio do

epidídimo e diâmetro da túnica muscular) foram analisados pelo teste One-Way

ANOVA e Kruskal-Wallis e quando necessário, complementados pelo Teste de

Tukey. Para verificar a ocorrência de variações dos parâmetros considerados ao

longo do ano, aplicou-se o teste de Mann-Whitney.

RESULTADOS

Dúctulos Eferentes

Da face mediana-lateral de cada testículo emergem pequenos túbulos

levemente sinuosos, que desembocam num tubo único, o ducto epididimário,

formando um emaranhado de túbulos, que são mantidos juntos pelo tecido

conjuntivo que os envolve (Figura 1A,B).

69O epitélio é circundado por uma camada fina de tecido muscular liso. O

lúmen dos dúctulos apresenta diâmetro variado e contorno irregular. Em sua

maioria, apresentam-se vazios, entretanto, em determinadas épocas do ano foram

observados espermatozóides e líquido no seu interior (Figura 1C,D).

A maioria dos túbulos dos dúctulos eferentes foi observada desembocando na

região do corpo e cauda do epidídimo, porém todas as regiões do epidídimo estão

associadas aos dúctulos, inclusive no ducto deferente.

Os dúctulos eferentes apresentam um epitélio pseudoestratificado colunar,

alternando células ciliadas e células não ciliadas. Possuem poucas células basais.

As células ciliadas possuem longos cílios que se projetam para dentro do lúmen,

ficando em contato com o conteúdo luminal. Apresentam núcleo geralmente

esférico, localizado na base ou na região central da célula. Possui nucléolo evidente,

citoplasma sem a presença de granulações evidentes. As células não ciliadas são

um pouco menores que as células ciliadas, seu núcleo é esférico e se cora menos

intensamente (Figura 1E,F).

Epidídimo

Histologicamente os epidídimos são formados por um epitélio

pseudoestratificado envolto por camadas de tecido muscular liso. Externamente à

camada muscular há uma camada de tecido conjuntivo (Figura 2A,C).

A vascularização do órgão é observada por uma conspícua presença de

vasos sangüíneos localizados no tecido conjuntivo (Figura 2D).

Foram identificados três tipos celulares no epitélio pseudoestratificado do

epidídimo de Phrynops geoffroanus. As células principais ou células vesiculares são

as mais abundantes, seguidas das células basais e das células estreitas (Figura 3).

As células principais possuem aspecto colunar, exibem citoplasma

abundante, núcleo oval, geralmente localizado no pólo basal e nucléolo proeminente

(Figura 3B). A porção apical das células principais apresentou reação positiva ao

PAS (Figura 3A). As células basais são pequenas, quando comparadas com as

vesiculares, apresentam forma arredondada ou piramidal e seu núcleo é geralmente

alongado. Estão localizadas entre a base das células vesiculares e a membrana

basal (Figura 3C).

70Outro tipo celular que ocorre em baixa freqüência, é uma estreita célula

colunar, que ocorre entre as células principais. Seu núcleo alongado, apresenta-se

fortemente corado, em contraste com o núcleo das células principais (Figura 3D).

A altura do epitélio do epidídimo apresentou variação significativa (Kruskal-

Wallis: H= 28.69 e p=0,0001; One Way Anova: F=16,24 e p=0.0001) entre as

regiões da cabeça, corpo e cauda, tornando-se progressivamente mais baixo.

Apesar das médias mostrarem que o epitélio torna-se mais baixo, não há diferença

estatística entre as regiões do corpo e cauda do epidídimo (> 0.05). Quando os

animais foram agrupados em estação não reprodutiva e reprodutiva, e a altura do

epitélio dos epidídimos foi comparada, verificou-se diferenças estatisticamente

significativas entre as regiões da cabeça, corpo e cauda (Mann-Whitney: U=125

p=0.0003; U=121 p=0.0002; U=119 p=0.0002, respectivamente), sendo que durante

o período não reprodutivo o epitélio apresentou médias mais baixas nas três regiões

do epidídimo (X= cabeça: 39.07µm ± 20.60; corpo: 28.78µm ± 5.60 e cauda:

20.48µm ± 5.26), e que durante a estação reprodutiva há um aumento da altura do

epitélio do epidídimo em todas as regiões (X= cabeça: 58.19µm ± 15.71; corpo:

39.07µm ± 11.02 e cauda: 37.93µm ± 15) (Figuras 2E,F; 4; 5).

A camada de músculo liso que envolve os ductos epididimários apresenta

uma disposição principalmente longitudinal, e sua espessura aumenta

progressivamente da região da cabeça em direção à cauda, apresentando diferença

significativa entre as regiões da cabeça e corpo em relação à cauda (Kruskal-Wallis:

H=31.68 e p=0.0001; Anova: F=7.69 e p=0.0013). As análises revelaram não haver

diferenças na espessura da camada muscular entre as estações reprodutiva e não

reprodutiva (Mann-whitney: cabeça: U=239.5 e p=0.15; corpo: U=260 e p=0.31 e

cauda: U=231 e p=0.11) (Figuras 2E,F; 6;7).

Durante todos os meses analisados, foi detectada a presença de grande

quantidade de espermatozóides armazenados nos epidídimos.

Ducto Deferente

Partindo da região caudal de cada epidídimo, em continuidade aos ductos

epididimários e, à medida que estes tornam-se menos convolutos, estão os ductos

deferentes, que desembocam no pênis.

71 A parede do ducto é histologicamente estruturada em três camadas

distintas que são uma mucosa, uma túnica muscular intermediária e uma adventícia

externa (Figura 8A,B).

A mucosa é formada por um epitélio de aspecto pseudoestratificado que é

mais baixo que no epidídimo, aparentemente similar à região caudal. A população

celular consiste de células principais e células basais. As células principais possuem

aspecto colunar, extendem-se da base ao lúmen. O núcleo é basalmente localizado

e geralmente, com formato alongado ou esférico, com um ou dois nucléolos (Figura

8C). As células basais estão localizadas próximas à membrana basal, nunca

alcançando o lúmen tubular. Seu núcleo possui formato oval, com orientação

paralela à membrana basal (Figura 8D).

A lâmina própria subjacente ao epitélio é fina e contém fibras elásticas, bem

como em toda a camada muscular circundante.

A espessa túnica muscular que circunda o epitélio é constituída de três

camadas de musculatura lisa com diferentes configurações espaciais: uma camada

longitudinal interna, camada circular média, que é a mais larga, e uma camada

longitudinal externa (Figura 8B). Estas fibras podem entrelaçar-se em algumas

extensões do tubo. Fibras nervosas autônomas podem estar associadas à camada

muscular.

Em Phrynops geoffroanus o lúmen apresentou contorno uniforme, sem

invaginações na mucosa. Em todos os exemplares analisados havia

espermatozóides no interior do ducto.

Na adventícia externa foram observados vasos sanguíneos e plexos

nervosos. Foram identificados vários túbulos morfologicamente semelhantes aos

dúctulos eferentes, porém menores.

DISCUSSÃO

As vias extratesticulares de condução de espermatozóides em Phrynops

geoffroanus são formadas pelos dúctulos eferentes, epidídimos e ductos deferentes.

Este padrão básico de organização é encontrado entre os grupos de répteis

estudados (AKBARSHA et al., 2006; HOLMES e GIST, 2004; ÍLIO e HESS, 1994),

assim como em aves (AIRE e STOLEY, 2000; SIMÕES et al., 2004) e em mamíferos

(ÍLIO e HESS, 1994). Holmes e Gist (2004), consideram que há uma grande

72diversidade morfológica das vias seminíferas, o que reflete uma certa confusão na

sua nomenclatura. Quanto à origem embrionária, é geralmente aceito que os ductos

condutores de esperma originam-se dos ductos arquinéfricos (ÍLIO e HESS, 1994;

ROMER e PARSONS, 1985).

A presença de uma rede testicular ou rede testis foi confirmada para várias

espécies. Ela pode estar localizada na região central dos testículos como observado

em cães, já em humanos, camundongos, ratos, hamsters e aves a rede é

encontrada junto à margem do testículo (ÍLIO e HESS, 1994). Entre os répteis foi

descrita a presença de uma rede testicular em Sitana ponticeriana (AKBARSHA et

al., 2006), em Chrysemys picta (HOLMES e GIST, 2004) e Caimam crocodilus

(GUERRERO et al., 2004). Nas análises histológicas dos testículos e epidídimos de

Phrynops geoffroanus não foram identificadas regiões que correspondessem à

descrição histológica da rede testicular. Holmes e Gist, (2004) descrevem a rede

testicular de Crysemys picta, como túbulos formados por uma camada simples de

tecido epitelial cúbico, revestidas por duas a três camadas de tecido muscular.

Dúctulos eferentes- correspondem à rede de túbulos que conduzem o

esperma dos testículos aos epidídimos. São peculiares por serem a única região do

trato reprodutor masculino que apresenta epitélio ciliado (ÍLIO e HESS, 1994;

BLOOM e FAWCETT, 1977). A conexão dos dúctulos eferentes de Phrynops

geoffroanus aos epidídimos ocorre entre a região medial e caudal do testículo com,

principalmente, a região média e extremidade caudal do epidídimo, porém, foram

encontrados dúctulos nos cortes histológicos da extremidade cranial dos epidídimos,

assim como no tecido conjuntivo que recobre os ductos deferentes.

Histologicamente os dúctulos de Phrynops geoffroanus são semelhantes às

descrições propostas para outras espécies (ÍLIO e HESS, 1994) sendo formados por

um epitélio colunar, onde foram encontradas poucas células basais, células ciliadas

e células não-ciliadas e revestido por uma fina camada de tecido muscular liso, e

externamente, um tecido conjuntivo, onde se localizam os vasos sanguíneos.

Segundo Ílio e Hess (1994), há relativamente poucas diferenças histológicas na

aparência dos dúctulos eferentes, quando observados em microscopia de luz, entre

as espécies estudadas, e o epitélio é classificado como pseudoestratificado colunar

ou cúbico, dependendo da espécie e do ponto de vista do autor.

A população celular identificada neste estudo (células ciliadas, células não-

ciliadas, e células basais), é referida em todos os vertebrados amniotas, sendo que

73as principais diferenças celulares entre as espécies estão na presença de

vacúolos e granulações (AKBARSHA et al., 2006; HOLMES e GIST, 2004; ÍLIO e

HESS, 1994).

A presença de granulações foi um dos critérios utilizados para classificar os

dúctulos em regiões distintas (HOLMES e GIST, 2004; SIMÕES et al., 2004) tais

granulações, entretanto, não foram identificadas em Phrynops geoffroanus, já o

diâmetro do túbulo apresentou grande vairação. Diferenças histológicas ao longo da

extensão dos dúctulos têm sido descritas no homem, e em outras espécies de

mamíferos, tais como camundongos, boi, ratos, hamsters, coelhos e elefantes (ÍLIO

e HESS, 1994), em aves (SIMÕES et al., 2004; AIRE, 2002) e em répteis

(AKBARSHA et al., 2006; HOLMES e GIST, 2004).

As células ciliadas de Phrynops geoffroanus são peculiares pelo comprimento

dos cílios que se projetam para dentro do lúmen, ficando em contato com o

conteúdo luminal. A presença de longos cílios foi também descrita para Chrysemys

picta e Caiman crocodilus (GUERRERO et al, 2004; HOLMES e GIST, 2004). As

observações histológicas mostram que há uma relativa heterogeneidade morfológica

no que se refere ao formato e ao tamanho aparente das células, e também, a forma,

o tamanho, a posição, e o grau de afinidade dos núcleos aos corantes. Essas

diferenças podem inferir a possibilidade de haver subtipos de células ciliadas e não-

ciliadas, como foi reportado por Ílio e Hess em sua revisão sobre dúctulos eferentes

(1994). Entre as aves foram identificados outros tipos celulares: na espécie Columba

livia (STEFANINI et al., 1999) as células ciliadas, células não-ciliadas claras, escuras

e angular e célula halo. Na região apical das células não-ciliadas de Struthio

camelus (AIRE e STOLEY, 2000), e Anas plathyrynchos (SIMÕES et al., 2004)

foram identificadas microvilosidades.

Em seus estudos sobre mudanças morfológicas nos dúctulos deferentes de

aves, Aire (2002, 2002), sugere que ocorrem alterações histológicas nos dúctulos ao

longo do ciclo reprodutivo, como também foi indicado por Guerrrero et al., (2004).

Durante nossas análises, não foi observada a presença de espermatozóides

no lúmen dos dúctulos eferentes, ao longo da maior parte do ano, porém nos meses

de maior atividade reprodutiva (MOLINA, 1998; GUIX et al.,1989) essas células

foram vistas com freqüência. Considerando que os epidídimos armazenam

espermatozóides por longos períodos de tempo, podemos supor que a rede de

74dúctulos eferentes está mais relacionada com o transporte de esperma e não

desempenham função de armazenamento.

Várias funções têm sido atribuídas aos dúctulos eferentes, dentre as quais

destacam-se o transporte de espermatozóide e fluido dos testículos para os

epidídimos, reabsorção de grande quantidade de líquido, síntese e metabolismo de

esteróides e outros compostos e fagocitose de espermatozóides, particularmente em

epitélios perturbados (BLOOM e FAWCETT, 1977; CORMACK, 1991; ÍLIO e HESS,

1994; HOLMES e GIST, 2004).

Epidídimo- a análise histológica dos ductos epididimários de Phrynops

geoffroanus, revelaram uma considerável analogia morfológica com as demais

espécies estudadas. O revestimento interno, formado por um epitélio de aspecto

pseudoestratificado colunar, circundado por uma delgada lâmina própria e revestido

externamente por tecido muscular liso é descrito para répteis, aves e mamíferos

(HOLMES e GIST, 2004; GUERRERO et al., 2004; AKBARSHA et al., 2006).

Vários estudos têm proposto a regionalização do epidídimo em porções

histológicamente distintas (HOLMES e GIST, 2004; GUERRERO et al., 2004;

AKBARSHA et al., 2006). Os critérios utilizados observam o aumento do diâmetro do

ducto do segmento inicial em direção ao caudal, a altura do epitélio, que diminui da

região da cabeça para a cauda, o aumento do diâmetro do lúmen, espessura da

camada de músculo liso, diferenças na distribuição e organização ultraestrutural das

células do epitélio e aumento do conteúdo lumial. Quatro regiões foram definidas por

Holmes e Gist (2004) em Crysemys picta, que correspondem ao segmento inicial,

cabeça, corpo e cauda. Em Sitona ponticelaria (AKBARSHA et al., 2006) foram

identificadas as mesmas regiões, como em hamster (CALVO et al., 1997). No cão

doméstico o epidídimo foi dividido em três regiões morfofuncionalmente distintas,

que correspondem ao segmento inicial, médio e terminal (SCHMMING e VICENTINI,

2001).

Neste trabalho, foram consideradas a altura do epitélio do epidídimo, e a

espessura da camada muscular, entre os segmentos da cabeça, corpo e cauda,

para verificar a ocorrência de diferenças histológicas. As análises morfométricas dos

ductos epididimários de Phrynops geoffroanus mostraram que há aumento da

espessura da camada de músculo liso da região cranial para a caudal, e que quando

os animais foram separados entre estação reprodutiva e não reprodutiva, não houve

variação significativa das médias, indicando que a altura da musculatura permanece

75inalterada durante o ciclo reprodutivo. Nossas observações confirmam que a

organização da musculatura parece ser semelhante ao que é geralmente proposto

para os mamíferos (BLOOM e FAWCETT, 1977; CORMACK, 1991).

Quanto à altura do epitélio do epidídimo, as análises mostraram que há uma

variação das regiões da cabeça e corpo, onde o epitélio é mais alto, em relação à

cauda com epitélio mais baixo. Apesar de não ter sido a proposta deste trabalho

observar a ocorrência de variações histológicas do epidídimo ao longo do ciclo

reprodutivo, verificamos que o epitélio é significativamente mais alto, durante o

período de maior atividade reprodutiva.

Os ductos epididimários, assim como os demais ductos do sistema seminífero

extratesticular, sofrem alterações cíclicas influenciadas pelos níveis de hormônios

sexuais. Alterações foram observadas em outras espécies de répteis (MESURE et

al., 1991; FERREIRA et al., 2002; GUERRERO et al., 2004;). Dados de natureza

biométrica obtidos com outras espécies de Testudines, mostraram que apesar de

haver forte variação dos pesos testiculares durante o período reprodutivo, poucas

mudanças ocorrem nos pesos dos epidídimos (LOFTS e TSUI, 1977). Gist et al.,

(2002), considera que a retenção de espermatozóides nos epidídimos seja a razão

da ausência de variação dos pesos.

Os tipos celulares do epitélio do epidídimo de Phrynops geoffroanus,

identificados por microscopia de luz, correspondem às células principais que são as

mais abundantes, as células basais e as células estreitas, que foram observadas

numa freqüência muito baixa. A diversidade e a quantidade de células que compõe o

epitélio do epidídimo varia entre os vertebrados. Em lacertílios foram identificadas as

células principais e basais em Lacerta vivípara (MESURE et al., 2004), Tropidurus

itamberere (FERREIRA et al., 2002), em P. siculeta (DESANTES, 2002 apud

AKBARRSHA et al., 2006). No lagarto Sitana ponticeriana (AKBARSHA et al., 2006),

foram identificadas seis diferentes células: principais, basais, estreitas, caras, apicais

e leucócitos intraepiteliais. No testudine de água doce Crysemys picta (HOLMES e

GIST, 2004), foram identificadas quatro células: as células vesiculares, basais,

estreitas e células ricas em mitocôndrias. Entretanto, segundo Holmes e Gist (2004),

as células que são conclusivamente identificadas por microscopia de luz são as

células principais, basais e células estreitas, sendo os outros tipos diferenciados

efetivamente apenas por análise ultraestrutural.

76As células principais são as mais abundantes, e foram observadas em

todas as regiões do epidídimo. Possuem núcleos geralmente arredondados, porém,

podem apresentar formatos variados. Estes tipos celulares são freqüentemente

descritos entre os vertebrados e as análises ultra-estruturais indicam atividade

secretora e absortiva (GUERRERO et al., 2004; HOLMES e GIST, 2004). Em

Crysemys picta, (HOLMES e GIST, 2004) as células vesiculares são estruturalmente

comparáveis as células principais observadas em Phrynops geoffroanus. O mesmo

autor reporta que as células são desprovidas de cílios ou estereocílios, e que

apresentam complexos juncionais (“tight junction”) e desmossomos. Considera

ainda, que sua principal função seja de absorção e que os indícios sugerem

atividade secretória. As células colunares descritas em Caiman crocodilus

(GUERRERO et al., 2004) parecem ser similares às células vesiculares e principais.

Devido às similaridades estruturais das células vesiculares e colunares com as

células principais de P. geoffroanus, podemos inferir que são os mesmos tipos

celulares com diferente denominação. Ocasionalmente, foram observados

espermatozóides ou seus fragmentos ligados à superfície apical da célula, e largos

vacúolos ocupando geralmente a porção supranuclear, como também foi

demostrado por Holmes e Gist (2004) em Crysemys picta.

As células basais foram observadas em maior freqüência na região caudal do

epidídimo, e sempre ligadas à membrana basal. De acordo com Holmes e Gist

(2004), as células basais apresentam interdigitações com as células vesiculares,

principalmente na região caudal e que o seu número varia de acordo com o estádio

do ciclo reprodutivo, tornando-se mais numerosas durante a espermiogênese.

Reportam, ainda, que são mais numerosas na região caudal. Durante nossas

análises sua distribuição ao longo do ciclo reprodutivo não foi avaliada. Estudos

recentes (YEUNG et al., 1994; VERI et al.,1993 e SIELER et al., 1998 apud

AKBARSHA et al., 2006), apontam três importantes papéis às células basais:

suporte, neuralização de eletrófilos nocivos e vigilância imunológica de esperma e

outros antígenos testiculares.

A ocorrência de células estreitas (“narrow cell”) no epidídimo de répteis foi

reportada inicialmente apenas em Crysemys picta (HOLMES e GIST, 2004) e

posteriormente em Sitana ponticeriana (AKBARSHA et al., 2006). Os dois autores

consideram a célula rara (aproximadamente 1-2% em S. ponticeriana e 0.1%¨em C.

picta). Assim como nas espécies supramencionadas, as células estreitas de

77Phrynops geoffroanus, possuem núcleo alongado e estreito e mais intensamente

corados, sendo também extremamente raras.

Além das células vesiculares, basais e estreitas, Holmes e Gist (2004),

identificaram outro tipo celular denominado célula rica em mitocôndria. Tais células

podem ser diferenciadas apenas por microscopia eletrônica, devido a sua

similaridade com as células vesiculares, quanto ao tamanho e morfologia nuclear.

Em S. ponticeriana, Akbarsha et al., refere-se a essas células como células apicais,

e reporta que sua ocorrência é limitada ao segmento inicial do epidídimo. Segundo o

mesmo autor, estas células estão envolvidas no transporte de água no lúmen, na

endocitose e, devido à agregação de mitocôndrias no citoplasma apical, possuem

papel importante na geração de ATP. As células ricas em mitocôndrias não foram

identificadas em Phrynops geoffroanus, contudo, sugerimos que uma análise

ultraestrutural possa revelar a ocorrência destas células.

Quanto aos aspectos funcionais as evidências indicam que o papel do

epidídimo na reprodução dos machos é, em linhas gerais, o transporte,

armazenamento e maturação de espermatozóides. Entretanto, um dos

questionamentos acerca da morfofisiologia dos epidídimos é sobre sua função

primária. O epidídimo é um órgão adaptativo que se desenvolveu cedo durante a

evolução dos vertebrados, coincidente com a fertilização interna, que se tornou regra

entre os vertebrados amniotas. A fertilização interna ocorre também entre alguns

peixes (e.g. Chondrycthyes) e alguns anfíbios, mas somente entre os peixes

condricties ocorreu o desenvolvimento de ductos extratesticulares, denominados de

dúctulos eferentes e ductos epididimários (ROMER e PARSONS, 1985;

JONES,1999; CHAN e ZHANG, 2005). Evidências histológicas mostram haver uma

similaridade entre os ductos extratesticulares dos peixes com o de vertebrados

amniotas (PIERCY et al., 2003).

Espermatozóides foram encontrados nas três regiões dos epidídimos de

Phrynops geoffroanus ao longo do ano, embora nossos estudos indicarem que o

pico da produção de gametas ocorre entre o final da primavera e início do verão.

Observações sobre a biologia reprodutiva da espécie realizada em cativeiro

apontam que a atividade reprodutiva dos machos (corte e cópula) ocorre entre

outubro e abril (GUIX et al., 1989; MOLINA, 1992). Em seu ambiente natural, os

indivíduos raramente são vistos copulando, contudo, durante o período de coleta,

entre os meses de outubro até janeiro os animais foram observados em maior

78concentração e atividade e em um local mais plano do rio, onde em outras épocas

do ano não eram vistos com tanta freqüência. Durante este período casais foram

observados copulando e alguns machos foram capturados com o órgão copulador

evertido.

Existem poucas informações sobre os sistemas de acasalamento entre

quelônios, mas dados moleculares indicam que em algumas espécies ocorrem

múltiplos acasalamentos e pode haver múltipla paternidade em ovos depositados

por uma mesma fêmea (POUGH et al., 2003). Como na maioria das espécies a

espermatogênese ocorre dentro de um determinado intervalo (geralmente no verão),

(CHRISTIANSEN e DUNHAN, 1972; ETCHEMBERG e STOVAL, 1990; GRIBBINS

et al., 2003; MAHMOUD e CYRUS, 1992), haveria uma vantagem em armazenar

espermatozóides após o final da espermatogênese, para ser utilizado

posteriormente, durante a primavera, quando os testículos estão

espermatogênicamente inativos. Gist et al., (2001), considera que a relativa

independência dos epidídimos de quelônios da flutuação dos níveis de hormônios

sexuais seja um reflexo de sua função de armazenamento.

Segundo Gist e Jones (1987), o armazenamento de espermatozóides ocorre

em alguns vertebrados e é particularmente comum entre répteis e aves e os

quelônios representam o mais antigi grupo de amniotas a utilizar os epidídimos para

armazenamento de esperma. Para Gribbins et al., (2003), nos quelônios que se

reproduzem sazonalmente, os gametas masculinos produzidos no verão são

armazenados nos epidídimos e usados para reprodução que ocorre ao longo do

ano.

Estudos realizados sobre as características fisiológicas dos espermatozóides

obtidos dos epidídimos de testudines (GIST et al., 2001; GIST et al., 2000),

revelaram que a motilidade e sua velocidade de natação é menor que em outras

espécies. Os mesmos autores consideram, ainda, que as células sexuais

deterioram-se pouco com o tempo e que continuam estáveis por longos períodos, e

que as características fisiológicas (motilidade, velocidade de natação e resposta a

estimuladores químicos) dos espermatozóides estocados no epidídimo por cinco

meses é semelhante aos produzidos durante o pico da espermatogênese. Sugerem

que os espermatozóides apresentam baixo metabolismo e que esta característica é

vantajosa para o armazenamento de esperma por períodos prolongados.

79 Considerando que o período reprodutivo de Phrynops geoffroanus ocorre

simultaneamente aos eventos maturacionais da espermatogênese, qual seria o

papel biológico do armazenamento de espermatozóides ao longo do ano? Segundo

Meyland et al., (2003) entre os Testudines de clima tropical os mesmos sinais

hormonais que estimulam a reprodução nos macho, iniciam a espermatogênese e os

machos poderiam, então, utilizar na reprodução, espermatozóides produzidos no

ciclo anterior, como também os do ciclo atual, garantindo o sucesso da fertilização

em múltiplos acasalamentos.

Apesar das evidências indicarem que os epidídimos de quelônios apresentam

um papel primário de armazenamento, e não de maturação ou ativação de

espermatozóides, as evidências histológicas sugerem que há uma grande

similaridade estrutural entre os epidídimos dos vertebrados, o que também foi

observado durante as análises dos epidídimos de Phrynos geoffroanus. A

composição celular identificada em microscopia de luz é semelhante, sugerindo a

existência de analogias fisiológicas e utra-estruturais. Portanto, os epidídimos são

mais que simples órgãos de armazenamento de esperma. Estudos futuros podem

revelar o mecanismo pelo qual os espermatozóides armazenados continuam viáveis

e estáveis durante longos períodos e suas possíveis implicações evolutivas na

transição da fertilização externa para a interna.

Ducto Deferente- corresponde à porção distal e menos contorcida do ducto

epididimário. O resultado de nossas investigações confirma as impressões de

estudos prévios sobre a organização histológica geral do ducto ou vaso deferente.

Em Phrynops geoffroanus o ducto deferente é histologicamente caracterizado

por apresentar três camadas de tecido que são uma mucosa interna, uma túnica

muscular intermediária e uma adventícia de tecido conjuntivo externa. Este mesmo

padrão de organização é descrito para outros vertebrados (SCHIMMING, 2001;

HAMILTOM e COOPER, 1978; BLOOM e FAWCETT, 1977).

Em seus estudos Hamilton e Cooper, (1978) propuseram duas regiões

histologicamente distintas dos ductos deferentes em hamster. Em Cebus apella,

Scimming, et al., (2001) divide em região proximal e distal, assim como em Caiman

crocodilus (GUERRERO et al., 2004), contudo não foram reportadas diferenças

histológicas entre as regiões, no crocodiliano.

O envelope muscular que reveste a mucosa dos ductos deferentes, é formado

por três camadas de tecido muscular liso, com disposição espacial das fibras

80semelhante ao que foi descrito para outras espécies (BLOOM e FAWCETT, 1977).

Contrações peristálticas da musculatura são responsáveis pela eliminação do

esperma (AIRES, 1989).

Os dúctulos paralelos identificados na adventícia dos ductos deferentes são

similares aos dúctulos eferentes. Em Caiman crocodilus (GUERRERO et al., 2004)

foram identificados ductos paralelos semelhantes, entretanto, sua conecção aos

testículos não é evidente.

O aspecto crenulado ou fenestrado característico, geralmente encontrado na

mucosa da mucosa dos ductos deferentes de mamíferos, não foi observado, porém,

todos os segmentos de ductos analisados apresentaram esperma armazenado.

O epitélio do ducto deferente mostrado neste estudo apresenta aspecto

pseudoestratificado colunar não-ciliado, onde são observados dois tipos celulares,

as células principais e as células basais. Estes mesmos tipos celulares foram

observados em outros grupos de vertebrados (SCHIMMING, 2001; HAMILTOM e

COOPER, 1978; BLOOM e FAWCETT, 1977). Em macacos da espécie Cebus

apella, foram identificados subtipos das células principais, denominadas de células

apicais e células escuras. Estas células não foram identificadas em Phrynops

geoffroanus, e nem foram reportadas em Caiman crocolidus, mas foram identificadas

em mamíferos (GUERRERO et al., 2004; SCHIMMING, 2001).

As células basais apresentam morfologia semelhante às de outras espécies.

Em seu trabalho Shimming (2001) pondera que as células basais são células

indiferenciadas, capazes de diferenciação, originando os outros tipos celulares do

epitélio do ducto, sendo consideradas células tronco.

Os poucos estudos que foram realizados sobre os ductos deferentes

envolvem principalmente espécies de mamíferos. Algumas das informações que

existem na literatura são fragmentadas, superficiais e até contraditórias, tornando o

conhecimento sobre o órgão rudimentar. Contudo, a utilização de técnicas

sofisticadas (histoquímica, fisiologia e ultra-estrutura), confirma que o órgão é mais

que um simples condutor de espermatozóides.

81REFERÊNCIAS

AIRE, T.A. e STOLEY, J.T. 2000. The Surface of the Epithelial Lining of the Ducts of

the Epididymis of the Ostrich (Struthio camelus). Anatomy, Histology and Embryology. 29: 119-126.

AIRE, T.A. 2002. Cyclical Reproductive Changes in the Non-ciliated Epithelia of the

Epididymis of Birds. Anatatomy, Histology and Embryology. 31: 113-118.

AIRE, T.A. 2002. Morphological Changes in the Efferent Ducts During the Main

Phases of the Reproductive Cycle of Birds. Journal of Morphology. 253:64-75.

AIRES, M. M. 1989. Fisiologia. Editora Guanabara Koogan. 2ª ed. p 939.

AKBARSHA, M.A.; KADALMANI, B. e TAMILARASAN, V. 2006. Histological variation

along and ultrastructural organization of the epithelium of the ducts epididymidis

of the fan-throated lizard Sitana ponticeriana Cuvier. Acta Zoologica

(Stockholm). 87: 181-196.





BLOOM, W.; FAWCETT. D.W. 1977. Tratado de Histologia. Interamericana. 10ª ed.

RJ. 509-527.

CALVO, A.; BASTOS-OREGON, E; PASTOR, L.M. 1987. Morphological and

histochemicalchanges in the epididymis of hamsters (Mesocricetus auratus)

subjected to short photoperiod. Journal of Anatomy. 191: 77-88.

CHAN, H.C. e ZHANG, Y.L. 2005. Epididymial defensis and sperm maturation.

Andrologia. 37:200-201.

CHRISTIANSEN, J. L. e DUNHAM, A. E. 1972. Reproduction of the Yellow Mud

Turtle (Kinosternon flavescens flavescens) in New Mexico. Herpetologica.

28:130-137.

CORMACK, D.H.1991. Ham Histologia. Guanabara Koogan. 9ª ed. RJ.738-783.

ETCHENBER, C.R., e STOVALL, R.H. 1990. Seasonal variation in the testicular

cycle of the loggerhead musk turtle, Sternotherus minor minor, from central

Florida. Canadian Journal of Zoology. 68:1071-1074.

82FERREIRA, A.; LAURA, I. A .; DOLDER, H. 2002. Reproductive Cycle of Male

Green Iguanas, Iguana iguana (Reptilia:Sáuria:Iguanidae), in the Pantanal of

Brasil. Brazilian Journal of morphology and Science. 19(1), 23-28.

GIST, D.H.; DAWES, S.M.; TURNER, T.W.; SHELDON, S. e CONGDON, J.D. 2001.

Sperm Storage in the turtle: a male perspective. Journal of Experimental Zoology. 292: 180-186.

GIST, D.H. e JONES, J.M. 1987. Store of sper in reptilian oviduct. Scanning

Microscopy. Vol. 1(4):

GIST, D.H.; TURNER, T.W. e CONGDON, J.D. 2000. Chemical and thermal effects

on the viability and motility of spermatozoa from the turtle epididymis. Journal of Reproduction and Fertility. 119:271-277.

GRIBBINS, K.M.; GIST, D.H.; CONDON, J.D. 2003. Cytological evaluation of


turtle, Trachemis scripta. Journal of Morphology, 255(3): 337-347.

GUERRERO, S.M.; CALDERÓN, M.L.; PÉREZ, G.R. e RAMÍREZ PINILA, M.P.

2004. Morphology of the male reproductive duct system of Caiman crocodiles

(Crocodylia, Alligatoridae). Annals of Anatomy. 186: 235-245.



HAMILTON, D.W. e COOPER, T.G. 1978. Gross and Histological Variation Along the

Length of the Rat Vas Deferens. Anatatomical Records. 190:795-810.

HICKMAN, C.P.Jr.; ROBERTS, L.S.; LARSONS, A. 2004. Princípios Integrados de Zoologia. 11ª edição. Guanabara Koogan. R.J. p 531-538.


STEVENS, A.; Foreword by DAVID, R.T. 1990. Theory and practice of histological techniques. 3ª ed. Edimburgh London Melbourne and New York,

726p.



ILIO, K.E HESS, R.A. 1994. Structure and Function of the Ductuli Efferentes: A

Reviw. Microscopy Research and Technique. 29: 432-467.

JONES. R.C. 1999. To store or mature spermatozoa? The primary role of the

epididymis. International Journal of Andrology. 22: 57-67.

83LOFTS. B. e TSUI, H.W. 1977. Histologial and histochemical changes in the

gonads and epididymides of the male Soft-shelled turtle, Trionyx sinensis.

Journal of Zoology, London. 181: 57-68.



201.

MESURE, M.; CHEVALIER, A. DEPEIGES, A.; FAURE, J. e DUFAURE, J.P. 1991.

Stucture and ultrastructure of the Epididymis of the Viviparous Lizard During the

Annual Hormonal Cycle: Changes of the Ephitelium Related to Secretory Activity.

Journal of Morphology. 210:133-145.

MEYLAND, P.A.; SCHULER, R.; MOLER, P. 2002. Spermatogenic Cycle of the

Florida Softshell Turtle, Apalone ferox. Copeia. 3: 779-786.



Chelidae) em cativeiro. Revista Brasileira de Etologia (nº especial) p 25-40.


Phrynops geoffroanus, em cativeiro. Biotemas. 5(1):


Ltda., p 95, 508.

PIERCY, A.; GELSLEICHTER, J. E SNELSON JR, F.F. 2003. Morphological and

histological changes in genital ducts of the male Atlantic stingray, Dasyatis

sabina, during the seasonal reproductive cycle. Fish Physiology and Biochemistry. 29:23-35.



RAMÍRES-SANDOVAL, E.; RAMÍRES-BAUTISTA, A. e VITT, L.J. 2006.

Reproduction in the Lizard Phyllodactylus lanei (Squamata: Gekkonidae) from

the Pacific Coast of México. Copeia. 1: 1-9.


Atheneu. SP. 599p

RUND, C.R.; CHRISTIANSEN, J.L.; JHONSON, J.C. 1998. In Vitro Culture of

Melanomacrophages From the Spleen and Liver of Turtles: Comments on

Melanomacrophage Morphology. Pigment Cell Research. 11: 114-119.

84SHIMMING, B.C. e VICENTINI, C.A. 2001. Ultrastructural Features in the

Epididymis of the Dog (Canis familiaris, L.). Anatomy, Histology and Embryol. 30:327-332.

SHIMMING, B.C. e ABREU, M.A.F. 2001. Sobre a Morfologia dos dúctulos eferentes

epidimários no cão (Canis familiaris, L.). Brasilian Journal of Veterinary Research and Animal Science. 38(3): 110-113.

SHIMMING, B.C. 2001. Morphological Study of the Vas Deferens in the Tuffed

Capuchin Monkeys, Cebus apella. Revista Chilena de Anatomia. 19(3):

SIMÕES, K.; ORSI, A.M.; ARTONI, S. M. B.; CRUZ, C.; SCHIMMING, B. C. E

PINHEIRO, P.F.F. 2004. Structural features of the epididymal region of the

domestic duck (Anas plathyrynchos). Brasilian Journal of Veterinary Research and Animal Science. 41(2):92-97.

STEFANINI, M.A.; ORSI, A.M.; GROGÓRIO, E.A .; VIOTTO. M.J.S. e BARALDI-

ARTONI, S.M. 1999. Morphologic Study of the Efferent Ductules of the Pigeon

(Columba livia). Journal of Morphology. 242:247-255.

85

.

A

C D

dE

de

tc Sz

dE

dE

ep ep

E F

cb

cc

cnc

*

B

D

Figura 1. Aspecto geral dos dúctulos eferentes de Phrynops geoffroanus (HE). A. Ducto do epidídimo (dE) com espermatozóides (Sz); rede de dúctulos eferentes (de) localizados no tecido conjuntivo (tc) que os envolve. B. Dúctulos eferentes evidenciando a diferença de diâmetros. C. Dúctulos eferentes onde são indicados o epitélio (ep) e o lúmen (asterísco). D. Detalhe dos dúctulos eferentes com fina camada de tecido muscular (seta) que os circunda e longos cílios que protundem da superfície apical de algumas células do epitélio para dentro do lúmen. E. Detalhe do epitélio colunar com os núcleos das células de formato esférico e basalmente localizados. F. Epitélio onde são indicadas as células basais(cb), as células ciliadas (cc), as células não-ciliadas (cnc) e os cílios (setas).

86

ep

ml

tc

Sz

B

ml cp

tc

C

E F

Sz

l

ep

tc

de

ep

ep Sz

Sz

vs

cb

D

A

Figura 2. Aspecto geral do ducto epididimário de Phrynops geoffroanus (HE). A. Ducto epididimário com espermatozóides (Sz) no lúmen (l); epitélio (ep) envolto por tecido conjuntivo (tc) com dúctulos eferentes (de) na periferia. B. Secção do epidídimo com epitélio (ep); camada de músculo liso (ml); tecido conjuntivo (tc) e espermatozóides (Sz) na luz do túbulo. C. Epitélio contendo as células principais (cp); camada de músculo liso (ml) com arranjo longitudinal das fibras e tecido conjuntivo (tc). D. Epitélio com células basais (cb); vaso sanguíneo (vs). E-F. Secção do segmento caudal do epidídimo durante a estação reprodutiva (E) e estação não-reprodutiva (F) com diferenças na altura do epitélio (ep), presença de vacuolização e células basais.

87

A

C D

*

ce

B

Figura 3. Epitélio epididimário de Phrynops geoffroanus. A. Epitélio do epidídimo com reação positiva ao PAS na região apical das células principais (asterísco). B. Detalhe das células principais com núcleos de forma heterogênea e nucléolo evidente (seta). C. Epitélio com células basais (cabeça de seta) e seus núcleos ovais dispostos paralelamente à membrana basal. D. Secção do epitélio com célula estreita (ce) e núcleo alongado e mais corado que as células principais.

88

0

25

50

75

Cabeça Corpo CaudaAltu

ra d

o Ep

itélio

do

Epid

ídim

o (m

m) Estação não

reprodutiva

Figura 4. Altura do epitélio do epidídimo de Phrynops geoffroanus. A. Estação Reprodutiva. B. Estação não reprodutiva. As mesmas letras indicam ausência de diferença estatística.

0

20

40

60

80

Cabeça Corpo CaudaAltu

ra d

o Ep

itélio

do

Epid

ídim

o (m

m)

EstaçãoreprodutivaEstação nãoreprodutiva

Figura 5. Comparação da altura do epitélio do epidídimo de Phrynops geoffroanus entre as estações reprodutiva e não reprodutiva. Os asteríscos (*) indicam diferenças estatísticas nas médias

0

25

50

75

100

Cabeça Corpo Cauda

Altu

ra d

o Ep

itélio

(mm

)

EstaçãoReprodutiva

A

B

a

b bc

a

ab c

*

* *

89

0

10

20

30

40

50

60

Cabeça Corpo CaudaEspe

ssur

a da

cam

ada

mus

cula

r (m

m) Estação Não

Reprodutiva

Figura 6. Espessura da túnica muscular do epidídimo de Phrynops geoffroanus. A. Estação reprodutiva. B. Estação não reprodutiva. As mesmas letras indicam ausência de diferença estatística.

0

15

30

45

60

Cabeça Corpo Cauda

Espe

ssur

a da

cam

ada

mus

cula

r

Estaçãoreprodutiva

Estação nãoreprodutiva

Figura 7. Comparação da espessura da túnica muscular do epidídimo de Phrynops geoffroanus entre as estações reprodutiva e não reprodutiva. Não há diferença estatística.

0

10

20

30

40

50

Cabeça Corpo CaudaEspe

ssur

a da

cam

ada

mus

cula

r (m

m) Estação

Rerprodutiva

A

B

a ab

c

a ab

c

90

Figura 8. Ducto deferente de Phrynops geoffroanus (H-E). A .Aspecto geral do ducto com lúmen (l) contendo espermatozóides (asterísco); epitélio (e) e camada de músculo liso (cm). B.Secção do ducto deferente evidenciando a camada muscular: camada longitudinal interna (cmi); camada circular média (mcm) e camada longitudinal externa (mle); tecido conjuntivo (tc) com a presença de dúctulos semelhantes aos eferentes (setas). C. Epitélio contendo as células principais (P), com núcleo no pólo basal, e células basais (seta). D. Detalhes das células principais (P) com núcleos ovais e arredondados e nucléolo evidente; células basais (b) com núcleo ligado à membrana basal.

B A

l

∗

cm

∗ mli

mcm

mle

tc

D

P P b

C

91CICLO TESTICULAR DE Phrynops geoffroanus (TESTUDINES: CHELIDAE)


CLASSIUS DE OLIBEIRA2.







IBILCE-UNESP.


FAX: (55-17) 3221-2390


92RESUMO

Mudanças anuais na biometria e histologia dos testículos de Phrynops

geoffroanus, coletados na região noroeste do estado de São Paulo-Brasil, foram

estudadas. O peso dos testículos (IGS) variou ao longo do ano, com maiores médias

nos meses de novembro a janeiro, e menores médias em junho e julho. O aumento

do IGS coincidiu com o aumento da atividade espermatogênica. A espermatogênese

foi dividida em cinco fases: recrudescência, espermiogênica, reprodução completa,

regressão e quiescência. O padrão espermatogênico da espécie é do tipo pré-

nupcial, com o desenvolvimento dos espermatozóides ocorrendo imediatamente

antes, e durante os meses de reprodução (outubro-março). Os testículos estão

reduzidos num curto período de quiescência (junho). A recrudescêcia começa em

julho e a proliferação e meiose prosseguem, sendo mais intensas em agosto e

setembro. A espermiogênese é intensa em outubro, e prossegue até março, com

clímax em dezembro, quando há grande aumento dos túbulos seminíferos e muitos

espermatozóides no lúmen. Redução dos túbulos seminíferos e desorganização do

epitélio ocorrem entre abril e junho. O gradual aumento das médias de temperatura

na primavera e verão estão correlacionados com o aumento do IGS, dos túbulos

seminíferos e com a espermiogênese. A diminuição da temperatura no final do

outono e início do inverno está correlacionada com a regressão e quiescência

testicular. A temperatura parece ser um importante fator na regulação da atividade

espermatogênica de Phrynops geoffroanus.

Palavras-chave: Testudines, Chelidae, ciclo testicular, histologia, temperatura,

espermatogênese.

ABSTRACT

Annual changes in the biometry and histology of the testes of Phrynops

geoffroanus, collected in the northwest region of the state of São Paulo-Brazil, were

studied. The weight of the testes (IGS) varied throughout the year, with highest

averages in the months from November to January, and lowest averages in June and

July. The increase of the IGS coincided with the increase of the spermatogenic

activity. The spermatogenesis was divided into five phases: recrudescence,

93spermiogenic, complete reproduction, regression and quiescence. The

spermatogenic pattern of the species is of the prenuptial type, with spermatozoa

development happening immediately before and during the reproduction months

(October - March). The testes are reduced in a short period of quiescence (June).

The recrudescence starts in July and the proliferation and meiosis proceed, being

more intense in August and September. The spermiogenesis is intense in October

and proceeds until March, with climax in December, when there is a great increase in

the seminiferous tubules and many spermatozoa in the lumen. The reduction of the

seminiferous tubules and disorganization of the epithelium happen between April and

June. The gradual increase of the temperature averages in spring and summer are

correlated to the IGS increase of the seminiferous tubules and to the spermiogenesis.

The temperature decrease in the end of autumn and beginning of winter is correlated

to the testicular regression and quiescence. The temperature seems to be an

important factor in the regulation of the spermatogenic activity of Phrynops

geoffroanus.

Key-words: Testudines, Chelidae, testicular cycle, histology, temperature,

spermatogenesis.

INTRODUÇÃO

Dos peixes aos mamíferos a reprodução é usualmente uma atividade

estacional ou cíclica, principalmente quando se considera as espécies de clima

temperado. O processo reprodutivo é controlado por hormônios que são regulados

pelos fatoras ambientais. (ORR, 1985: HICKMAN et al., 2004). Nos répteis os

padrões de atividade reprodutiva estão geralmente associados aos fatores

ambientais, mais marcantes nas espécies de zonas temperadas que exibem ciclos

reprodutivos com fases de atividade reprodutiva e quiescência evidentes

(GEORGES, 1983).

Entre os Testudines, a reprodução tem recebido mais atenção do que

qualquer outro aspecto de sua biologia, entretanto, a maioria dos estudos tem

focado o comportamento reprodutivo em cativeiro (MOLINA, 1992; 1998) e a

influência da temperatura na determinação do sexo (TORRES et al., 2002). Os

estudos que abordam o ciclo testicular nos quelônios foram realizados, na sua

94maioria com espécies de Cryptodira do hemisfério norte, e as espécies de

Pleurodira, grupo melhor representado no hemisfério sul, tem recebido pouca

atenção.

Existem três padrões de espermatogênese entre os quelônios: o pré-nupcial,

o pós-nupcial e a espermatogênese acíclica. No pré-nupcial a espermatogênese

precede a reprodução; no padrão pós-nupcial os espermatozóides utilizados na

estação reprodutiva (geralmente na primavera) são produzidos em ciclos

reprodutivos do ano anterior e que foram armazenados nos epidídimos (LOFTS e

TSUI, 1977). Na espermatogênese acíclica há uma contínua produção de

espermatozóides, sem uma fase definida de pico ou quiêscencia testicular

(MEYLAND et al., 2002; GRIBBINS et al., 2003).

De acordo com Crew (1987) apud (MEYLAND et al., 2002), a

espermatogênese pré-nupcial de recrudescência gonadal é esperada em ambientes

tropicais, e também tem sido descrita para aves e mamíferos de regiões temperadas

(GEORGES, 1983). Entre os Testudines 9 das 13 famílias foram estudadas e

apenas os Trionichidae, os Testudinidae e os Chelidae possuem padrão pré e

pósnupcial (MEYLAND et al., 2002)

A família Chelidae apresenta uma distribuição geográfica peculiar, ocorrendo

na região Neotropical e Australiana. No Brasil é a família que apresenta maior

diversidade local, entretanto dados sobre o ciclo testicular das espécies sul

americanas não foram descritos.

Os cágados da espécie Phrynops geoffroanus são amplamente distribuídos

na região Neotropical (Amazônia colombiana, Venezuela, Guianas, Uruguai, norte

da Argentina e Brasil de norte a sul) (GUIX et al., 1989; DUELLMAN, 1979;

PRITCARD e TREBBAU, 1984). Apresentam porte médio, com fêmeas maiores que

os machos. São facilmente reconhecidos por apresentarem carapaça achatada e

larga com coloração marrom escura ou cinza esverdeada. O plastrão possui

manchas laranjadas e pretas irregulares. A característica mais marcante é a

presença de um par de barbelas brancas com extremidades pretas no queixo,

característica responsável pela denominação popular da espécie como cágado de

barbicha (PRITCARD e TREBBAU, 1984).

Este trabalho visa caracterizar as alterações macroscópicas dos testículos e

as mudanças no epitélio seminífero de Phrynops geoffroanus durante o ciclo

reprodutivo, procurando estabelecer qual o padrão espermatogênico. Os dados

95obtidos poderão contribuir para o desenvolvimento de hipóteses sobre a evolução

dos ciclos espermatogênicos entre os Testudines de forma geral, e suas possíveis

implicações filogenéticas.

MATERIAL E MÉTODOS

Machos adultos de Phrynops geoffroanus (N=16) foram coletados

mensalmente no período de junho de 2005 à maio de 2006 (licença de captura nº

061/2005-RAN/IBAMA). Os animais foram coletados por meio de pesca manual com

a utilização de anzóis para fisga, em excursões durante o período vespertino ao


zona urbana de São José do Rio Preto, SP, Brasil. As coletas foram separadas de

acordo com as quatro estações do ano, quando foram capturados quatro animais

por estação.

Os pontos de coleta apresentam margem plana intercalada com barrancos,


predominantemente herbácea. O local é bastante degradado devido à atividade

antrópica e recebe esgoto de origem doméstica.




Animal). Dosagens elevadas do anestésico Cloridrato de Ketamina foram realizadas,

por conduzirem a uma morte calma e minimizar o sofrimento do animal (AURICCHIO

e SALOMÃO, 2002). Adicionalmente foram realizadas injeções de etanol no encéfalo

dos animais, pela introdução de 5ml com seringa pelo forame magno, garantindo

que os animais estivessem realmente em óbito para a dissecção.

Dados de natureza biométrica como o comprimento máximo da carapaça

(cmc), e comprimento máximo do plastrão (cmp) foram obtidos, segundo o método

descrito por Cagle (1939) apud (Molina, 1998). Para medir o comprimento máximo

da carapaça e do plastrão, utilizou-se uma fita métrica de precisão (1mm). O peso

total foi obtido com uma balança de precisão de 1g.

Os animais foram abertos com auxílio de uma serra circular vibratória


96afastados para melhor visualização das vísceras e então o sistema reprodutor foi

removido e submetido aos demais procedimentos.

Os testículos foram pesados (g) por uma balança analítica de precisão

(0,001g) e medidos (cm) com paquímetro de metal com precisão de 0,05 (mm).

Dados do comprimento e da largura foram obtidos para se estimar o volume das

gônadas segundo a fórmula: V= ¾ x π x a x b2, onde a= eixo maior (comprimento) e

b= eixo menor (largura). A massa (peso em gramas), dos testículos e do corpo foram

utilizadas para calcular o índice gonadossomático (IGS= massa total dos testículos/

massa total do corpo x 100).

Preparação do tecido para microscopia

Por conveniência foram utilizados os testículos esquerdos para o

processamento histológico. Foram retirados fragmentos do testículo na extremidade

cranial, porção medial e extremidade caudal. Após serem fixados em solução Bouin

por 24 horas, e desidratados em série crescentes de álcool (Hopwood, 1990) foram

incluídos em resina do tipo Methacrilato glicol, Historesin® (Leica, Germany) e

Paraplast®, (Oxford, Labware, USA). Secções de 3 µm foram cortadas e

posteriormente coradas com Hematoxilina-Eosina e PAS (Periodic Acid Schiff’s).

Análise Histológica

Para análise morfológica, as lâminas montadas foram observadas ao

microscópio Olympus BX 60 e analisadas por meio do programa de análise de

imagens, Image Pro-plus, no Centro de Microscopia e Microanálise - IBILCE/UNESP

de São José do Rio Preto-SP/BR. Para a identificação dos tipos celulares foram

utilizadas imagens digitalizadas de secções de túbulos seminíferos com aumento de

20x.

Dez túbulos seminíferos em cortes transversais por animal, aleatoriamente

selecionados, em 3 cortes histológicos diferentes foram analisados (N=30 por

animal).

Dados morfométricos, como o diâmetro dos túbulos seminíferos (largura

maior e largura menor), área e altura do epitélio seminífero foram obtidos, utilizando

a objetiva de 5x para o cálculo do diâmetro e área, e 20x para a altura do epitélio.

97Análise das variáveis biométricas, morfométricas e climáticas

Primeiramente foi verificada a existência de valores discrepantes (outliers),

em seguida, a normalidade dos dados foi testada por Shapiro-Wilk, e quando

necessários, foram submetidos à normalização (raiz quadrada). Todos os resultados

obtidos foram comparados entre os meses de junho de 2005 à maio de 2006. Os

dados biométricos das gônadas foram analisados entre as estações do ano pelo

teste One-Way ANOVA e para cada mês (entre a gônada direita e esquerda), por

meio do teste de Wilcoxon. Os dados morfométricos dos túbulos seminíferos

(diâmetro, área e a altura do epitélio seminífero), foram analisado pelo teste One-

Way ANOVA e Kruskal-Wallis e quando necessário, completado pelo Teste de

Tukey.

Os dados biométricos e morfométricos das gônadas foram relacionados com

a temperatura atmosférica por meio do teste de Regressão Linear Simples,

utilizando correlação de Pearson para dados paramétricos e de Spearman para

dados não paramétricos.

Dados meteorológicos mensais da temperatura do ar (ºC) foram obtidos junto

ao CATI - Coordenadoria de Assistência Técnica Integral.

RESULTADOS

Maturidade sexual e variação na massa testicular

O termo “adulto” foi utilizado neste trabalho para os espécimes que

apresentam maturidade sexual. O critério adotado para determinar a maturidade dos

machos foi a presença de espermatozóides no epidídimo.

A massa corporal dos machos capturados variou entre 600g à 1800g (X=

1.113g ± 360). O menor macho adulto capturado (peso=600g), apresentou testículos

com evidente atividade espermatogênica e epidídimos com espermatozóides

armazenados. Um macho juvenil capturado (peso=350g), apresentou testículos e

epidídimos reduzidos e as análises histológicas revelaram inatividade (Figura 1D).

Os testículos direito e esquerdo não apresentaram diferença significativa em

suas dimensões (peso, volume, comprimento e largura) (teste de Wilcoxon: peso

T=61, p=0.71; volume T=34, p=0.33; largura T=31 p=0.5; comprimento T=41,

p=0.75; IGS T=63 p=0.79). Quando as gônadas foram comparadas ao longo do ano,

98as dimensões apresentaram variação ao longo dos meses. O índice

gonadossomático (IGS) apresentou uma variação significativa entre as estações do

ano (ANOVA F=3.76 e p=0.04) sendo que durante a primavera e o verão o IGS é

mais alto com médias de X= 0.49 ± 0.38 e X=0.25 ± 0.06 respectivamente, quando

comparado com os meses de outono (X=0.15 ± 0.1) e inverno (X=0.10 ± 0.01). O

volume testicular não apresentou variação significativa entre as diferentes estações

do ano, apesar das médias serem mais altas durante a primavera e verão. (Figura 5

e 6).

O IGS e o volume dos testículos foram correlacionados entre si (Correlação

de Spearman) obtendo-se correlação positiva, ou seja, o aumento do volume é

acompanhado pelo aumento do IGS (p= 0.001; r= 0.94). O volume e o IGS foram

correlacionados com a temperatura atmosférica (regressão linear simples),

mostrando que o aumento das médias de temperatura é acompanhado pelo

aumento das médias dos índices e do volume dos testículos.

As análises biométricas das gônadas, associadas às evidências histológicas,

mostram que o aumento do volume e do IGS durante as estações mais quentes

coincide com o período de maior atividade espermatogênica.

Morfologia e Desenvolvimento das Células germinativas

Os testículos de Phrynops geoffroanus são revestidos pela túnica albugínea,

e internamente apresentam túbulos seminíferos. O epitélio que reveste os túbulos é

constituído de células de Sertoli, que correspondem à linhagem não proliferativa, e

pelas células germinativas. Cada túbulo é revestido por uma camada de células

mióides. O espaço entre os túbulos é preenchido pelo tecido intersticial, onde se

encontram as células intersticiais de Leydig (Figura 1).

As células que compõem a linhagem germinativa desenvolvem-se através de

divisões celulares em fases de espermatogônias até se diferenciarem em

espermatozóides ao longo do ano, junto ao epitélio seminífero. As espermatogônias

são observadas próximas à membrana basal, durante todo o ano, contudo, sua

população varia dependendo do estádio do epitélio seminífero.

O início da espermatogênese ocorre com a proliferação das espermatogônias

e com o início da atividade meiótica na porção basal do epitélio durante os meses de

99junho e julho. A proliferação prossegue até outubro. A maioria das

espermatogônias inicia a meiose em setembro e outubro.

A espermiogênese é a fase mais longa. Espermátides redondas são

observadas em agosto até maio. Após completa a espermiogênese e espermiação,

os espermatozóides são transportados para os epidídimos onde serão armazenados

e os testículos entram num curto período de quiescência (maio a junho). A

recrudescência da espermatogênese começa em julho e prossegue nos meses

subsequêntes.

Células Proliferativas (células pré-meióticas)

Foram identificados três tipos de espermatogônias: as residuais, que ficam

sempre associadas à face interna da membrana basal; as espermatogônias do tipo

A (espermatogônias claras) e as do tipo B (escuras) que são as que entram em

divisão meiótica. São observadas também células hipertróficas, que representam

espermatogônias produzidas em ciclos anteriores e que não se dividiram.

As espermatogônias do tipo A (Figura 2A) foram encontradas em todas as

lâminas examinadas neste estudo. Representam uma grande proporção da

população celular nos meses de junho a setembro, quando são observadas em

divisão. Apresentam formato oval e uma de suas superfícies repousa sobre a

membrana basal, e a superfície apical voltada para o epitélio seminífero. As

espermatogônias do tipo B (escuras) são aparentemente menores e mais

intensamente coradas que as espermatogônias do tipo A, das quais se originaram.

Durante o início da fase proliferativa da espermatogênese há produção de uma larga

população de espermatogônias B, que se acumulam próximo à membrana basal

(Figura 2A).

Células meióticas

Os espermatócitos primários originam-se de espermatogônias B. As células

que entram em meiose I são levemente maiores e se coram mais intensamente que

as células em pré-leptóteno e as fibras cromatínicas formam pacotes em seu núcleo.

Vários estádios da prófase I são observados juntos, e constituem uma larga

proporção da população de células do epitélio seminífero nos meses de setembro e

outubro (Figura 2A).

100Os espermatócitos secundários são menores que os primários,

apresentando um tamanho aparentemente maior que as espermátides, suas

sucessoras. Estão aleatoriamente distribuídos entre os espermatócitos primários e

as espermátides. Possuem núcleo central, levemente corado e aparentemente maior

que o núcleo das espermátides iniciais. Sua frequênciade observação é baixa

(Figura 2B).

Células espermiogênicas

A espermiogênese é a fase mais longa da espermatogênese e inclui o

desenvolvimento do sistema acrossômico, elongação do núcleo e condensação da

cromatina.

Neste trabalho classificamos as células espermiogênicas de Phrynops

geoffroanus em três categorias: espermátides redondas, espermátides alongadas e

espermatozóide (Figura 2). Esses tipos celulares são encontrados em grande

quantidade nos meses outubro, novembro, dezembro e início de janeiro.

Espermátides redondas são encontradas durante todos os meses analisados, porém

sua população aumenta gradualmente a partir do mês de agosto, atingindo o

máximo nos meses de novembro. Espermatozóides são encontrados em grande

quantidade nos meses de dezembro e janeiro (Figuras 2B,D e 3E e F).

Outro tipo celular sempre presente no epitélio dos túbulos seminíferos de

Phrynops geoffroanus é a célula de Sertoli (figura 2D). Seu núcleo possui um

contorno triangular com um ou mais proeminentes nucléolos arredondados. Estão

localizados na periferia dos túbulos, geralmente em contato com a membrana basal,

entretanto seus núcleos podem ser observados em posição mais alta, em direção à

luz do túbulo.

Ciclo do Epitélio seminífero

O período reprodutivo da espécie vai do final de outubro até abril. Diversas

fases do desenvolvimento das células germinativas são encontradas em níveis

diferentes no epitélio germinativo de Phrynops geoffroanus. As espermatogônias

mais primitivas estão localizadas na base, e as células mais diferenciadas dispõem-

se em níveis sucessivamente mais altos, em direção ao centro do túbulo seminífero

(Figuras 1,2).

101 Análises realizadas durante o período de um ano, indicam que em

Phrynops geoffroanus a espermatogênese apresenta um padrão do tipo pré-nupcial,

com pico de produção de espermatozóides no mês de novembro até fevereiro

(clímax em dezembro) (Figura 4A). Dados histológicos e morfométricos do epitélio

seminífero, bem como dos túbulos seminíferos mostraram a ocorrência de

alterações cíclicas ao longo do ano.

A altura do epitélio seminífero variou mensalmente e quando agrupados entre

as estações do ano (Kruska-Wallis H=281.86 p=0.00 e ANOVA F= 153.32 p=0.00,

respectivamente) (Figura 7). A área tubular apresentou variação significativa ao

longo dos meses (ANOVA F= 30.85 e p=0.00), e também quando agrupados entre

as estações do ano (ANOVA F= 44.80 e p= 0.00). O diâmetro apresentou variação

ao longo do ano e também quando agrupados entre as estações: diâmetro maior

(Kruskal-Wallis H=91.91 e p=0.00 entre os meses, e Kruska-Wallis H=60.07 p=0.00

entre as estações); e diâmetro menor (Anova F=16.59 p=0.00 ao longo dos meses, e

F=33.66 p=0.00 entre as estações do ano) (Figuras 8,9).

Testes de correlação foram aplicados, verificando-se a existência de

correlação positiva entre os parâmetros analisados, ou seja, o aumento dos

diâmetros dos túbulos seminíferos é acompanhado pelo aumento da área e altura do

epitélio seminífero (Figura 10). O teste de regressão linear simples mostrou haver

uma relação significativa entre a temperatura e os dados morfométricos obtidos.

Os resultados das análises morfométricas mostram que durante o período de

maior atividade espermatogênica ocorre aumento dos túbulos seminíferos em todos

os parâmetros considerados.

Assim, o ciclo do epitélio seminífero pode ser dividido em fases ou etapas,

considerando os tipos predominantes de células germinativas, associados aos

parâmetros morfométricos (área, diâmetro e altura do epitélio tubular).

Fase I (quiescência, início da reorganização do epitélio) (Figuras 3A; 7; 8

e 9). Durante o mês de junho os túbulos seminíferos apresentam pequeno diâmetro

(diâmetro maior X= 345.09µm ± 33.07; diâmetro menor X=261.79µm ± 23.99). A

área dos túbulos também é menor, quando comparada aos meses subseqüentes

(X= 74914.8 µm2 ± 13050.39). O epitélio apresentou uma altura média de X=

75.65µm ± 14.57µm e é constituído principalmente de espermatogônias A e células

102de Sertoli. Mitoses de espermatogônias são vistas com freqüência. Poucos

túbulos apresentaram espermatócitos I, espermátides e espermatozóides.

A maioria dos túbulos seminíferos apresenta um desarranjo no epitélio, que

parece desprender-se, devido à presença de numerosas áreas claras (material

hialino) entre as células. São freqüentes os túbulos com lúmen obstruído por células

que se desprenderam do epitélio (espermatócitos I, espermátides iniciais e

alongadas e espermatozóides) e que representam restos celulares produzidos no

ciclo anterior.

Fase II (Recrudescência ou multiplicacional) (Figuras 3B, D; 7; 8 e 9).

Em julho prossegue a proliferação das espermatogônias. As dimensões dos

túbulos continuam baixas. O epitélio seminífero é mais uniforme, com menor

quantidade de material hialino entre as células. Os tipos celulares predominantes

são as espermatogônias (A, B e residual) e as células de Sertoli. Poucos

espermatócitos I e espermátides iniciais são observados. Não há espermatozóides

típicos. Na maioria dos túbulos seminíferos o lúmen não é observado. Há poucos

túbulos com o lúmen ocupado por restos celulares.

Em agosto o epitélio seminífero está mais uniforme e mais alto (X= 88.54µm ±

22.49). Na maioria dos túbulos seminíferos o lúmen é preenchido por células em

proliferação. A área e o diâmetro continuam baixos. A população celular é composta

principalmente de espermatogônias B e células de Sertoli. A quantidade de

espermatócitos I aumenta mas ainda é baixo. Ocorrem células espermiogênicas em

alguns túbulos.

No início de setembro os túbulos seminíferos apresentam um aumento em

suas dimensões. O lúmen torna-se evidente e é facilmente observado no centro do

túbulo. A proliferação celular (mitose e meiose) prossegue e o epitélio apresenta-se

mais alto (X= 92.25µm ± 27.52). As células que ocorrem em maior quantidade são

os espermatócitos I. Ainda é grande a quantidade de espermatogônias.

Espermátides redondas são vistas em maior número em relação aos meses

anteriores. Poucos espermatozóides são observados.

Fase III (Espermiogênese ou predomínio de espermátides primárias) (Figuras 3E, F; 7; 8 e 9). No mês de outubro os túbulos seminíferos apresentam um

aumento acentuado em suas dimensões. A área média dos túbulos neste período é

de X=123122.7µm2 ±25305.3. O diâmetro também apresenta um aumento em suas

103médias. O epitélio seminífero recobre quase totalmente os túbulos e tem início

sua organização em colunas de células, e o lúmen é preenchido por líquido ou

células. A altura média é de X=145.31µm ± 19.16µm. O número de espermatogônias

diminui, mas ainda são observadas várias mitoses. Ocorre aumento da quantidade

de espermatócitos I em relação aos meses anteriores e alguns espermatócitos II são

vistos em divisão. Há aumento na quantidade de espermátides redondas e

alongadas e os espermatozóides maduros continuam em pequeno número. Algumas

células hipertróficas são vistas (Figura 8).

As espermátides avançam a espermiogênese durante o mês de novembro e o

número de espermatogônias decresce, formando camadas simples nos túbulos. São

observadas poucas mitoses. Os espermatócitos I diminuem em quantidade,

enquanto as espermátides redondas e alongadas aumentam quantitativamente.

Vários estádios de elongação de espermátides são vistos juntos formando grupos

que se estendem das porções mais basais em direção ao lúmen do túbulo,

organizados em colunas e criptas nos túbulos seminíferos. Os espermatozóides são

vistos ligados ao citoplasma das células de Sertoli e alguns podem ocupar o lúmen.

O diâmetro e a área tubular aumentam e o espaço luminal apresenta grandes áreas

claras. A altura do epitélio apresenta média semelhante às observadas no mês de

outubro.

Fase IV (reprodução completa ou pico da espermiogênese) (Figura 4A-C;

7; 8 e 9).

O clímax da espermatogênese ocorre em dezembro. A área tubular

praticamente triplicou em relação ao mês de junho, alcançando 214193.6µm2 ±

44382.38 em dezembro. A altura do epitélio atingiu a maior média observada

durante as análises (X= 162.55µm ± 27.75), assim como os diâmetros (diâmetro

maior X= 600.02µm ± 69.57; diâmetro menor X= 435.68µm ± 87.44).

A organização das células espermiogênicas em colunas é bastante evidente.

A população de espermatogônias (residual e espermatogônia A) é reduzida a uma

camada simples de células em associação à lâmina basal. Os estoques de

espermatogônia B estão praticamente esgotados. Poucas células em prófase I são

observadas (espermatócitos I). Os espermatócitos II avançam a espermiogênese.

Os espermatozóides e espermátides formam a maior população de células

104germinativas durante este período. Espermatozóides são vistos livres na luz dos

túbulos seminíferos.

Nos meses de janeiro e fevereiro as dimensões dos túbulos seminíferos

diminuem em relação ao mês de dezembro, porém ainda permanecem bastante

aumentados. A espermiogênese prossegue e o aspecto geral do epitélio tubular é

semelhante ao observado em dezembro, entretanto, a quantidade de espermatócitos

I é maior e o número de espermatozóides livres é menor.

Fase V (regressão) (Figuras 4D,E; 7; 8 e 9). A organização do epitélio

seminífero em colunas não é tão evidente no mês de março. Em alguns túbulos

seminíferos há um aparente desarranjo do epitélio, onde as células são

entremeadas por áreas claras (material hialino). O epitélio parece desprender-se, e

em alguns túbulos há restos celulares obstruindo o lúmen que é mais reduzido.

Próximo à membrana basal são observados vários núcleos de células de

Sertoli e espermatogônias. Há mais espermatócitos I do que em janeiro e fevereiro,

mas as espermátides alongadas são predominantes. O epitélio continua alto

(X=113.70µm ± 22.140), porém a área e o diâmetro diminuíram (área

X=75368.24µm2 ± 19397.18); diâmetro maior X=333.1µm ± 25.19 e menor X=270.49

± 49.85, sendo as médias semelhantes ao observado nos meses de junho.

Em abril prossegue o desarranjo do epitélio seminífero, com o aumento das

áreas claras entre as células e é maior o número de túbulos com restos celulares. A

freqüência da população celular e as dimensões dos túbulos são semelhantes ao

mês de março.

Aumenta a proporção de túbulos seminíferos com restos celulares ocupando

o lúmen, durante o mês de maio (Figura 4F). O epitélio é mais alto com média de

X=123.51µm ± 29.28. A área e o diâmetro apresentam um aumento das médias em

relação ao mês anterior.

Em muitos túbulos o epitélio apresenta material hialino entre as células,

contudo, em vários túbulos seu aspecto é mais organizado. As células

predominantes são as espermátides redondas e alongadas e os espermatócitos I

são vistos mais freqüentemente. Muitas espermatogônias A e B são vistas próximas

à membrana basal, bem como as células de Sertoli. Algumas espermatogônias em

divisão mitótica foram observadas.

105DISCUSSÃO

Variações do peso e do tamanho dos testículos são comuns entre

vertebrados de clima temperado, ocorrendo também em espécies tropicais

(GEORGES, 1983).

O peso dos testículos (expresso como porcentagem do peso corporal –IGS)

de Phrynops geoffroanus variou ao longo do ano, sendo que os menores índices

foram observados durante os meses de outono (final) e inverno, coincidindo com as

fases de regressão e quiescência; os maiores índices foram observados no final da

primavera e início do verão (fases de recrudescência e espermiogênese

respectivamente).

Estudos realizados com o Emydura kreffti, (Chelidae) (GEORGES, 1983)

relatam a variação dos índices testiculares, com menores médias observadas

durante o período de quiescência e início da recrudescência (primavera e verão) e

maiores índices no outono. Em outras espécies Testudines de clima temperado de

diversas famílias, como Apalone ferox (MEYLAND et al., 2002); espécies da família

Kinosternidae (MAHMOUD e KLICKA, 1972); Sterotherus minor minor

(ETCHEMBERG e STOVAL, 1990); Kinosternon flavescens flavescens

(CHRISTIANSEN e DUNHAN, 1972); Claudius angustatus (FLORES-VILELA e ZUG,

1994); Trionyx sinensis (LOFTS e TSUI, 1977) e Crysemys picta (GIST et al., 2001)

foram observados maiores índices durante as fases de maior atividade

espermatogênica, e menores índices nas fases de regressão e quiescência.

As variações dos pesos dos testículos coincidiram com as maiores médias do

diâmetro e da área dos túbulos seminíferos, assim como as maiores médias da

altura do epitélio seminífero, indicando que em Phrynops geoffroanus as variações

cíclicas da massa testicular estão associadas à maior atividade espermiogênica,

quando os testículos tornam-se maiores e mais pesados devido à intensa

proliferação e diferenciação celular. As mudanças nos padrões dos pesos dos

testículos podem ser usados como uma indicação confiável de pico e de quiescência

da atividade espermatogênica, quando a análise histológica não é viável, como

também foi indicado por Georges (1983), para os cágados da família Chelidae.

Entretanto, quando o volume das gônadas foi avaliado, as maiores médias

observadas ocorreram durante o pico da espermatogênese, porém, não houve

106diferença estatística. O volume testicular, então, não deve ser utilizado, como

único critério para determinar a ciclicidade testicular para Phrynops geoffroanus.

Os machos capturados e considerados sexualmente maduros, apresentaram

pesos e tamanhos variados. A presença de espermatozóides armazenados nos

epidídimos foi o critério adotado para determinar a maturidade sexual, como tem

sido comunente indicado para outras espécies de Testudines (MALVASIO, 1996). A

maturação ocorre em indivíduos de pequeno porte (0.6 kg), permitindo que machos

jovens possam contribuir para o sucesso reprodutivo da população. O tamanho dos

animais está, obviamente, relacionado com a idade, disponibilidade de alimentos e

diferenças individuais, porém estes parâmetros não interferiram na análise do ciclo

reprodutivo da espécie.

Os testículos de Phrynops geoffroanus possuem uma organização interna

similar ao observado entre os demais répteis, sendo formados por túbulos

seminíferos entremeados pelo tecido intersticial (AL-DOKHI et al., 2004;

IBARGÜENGOYTÍA et al., 1999). O epitélio seminífero é formado pelas células

germinativas, cuja população varia de acordo com o estádio do ciclo reprodutivo e

pelas células de Sertoli, que formam uma população fixa e não proliferativa.

Mudanças citológicas cíclicas no epitélio seminífero durante a

espermatogênese são comuns entre os vertebrados (GRIBBINS e GIST, 2003) de

ambientes temperados e tropicais. As células que compõe a linhagem germinativa

desenvolvem-se através de estádios transicionais de espermatogônias até

espermatozóides. Os diferentes estádios das células germinativas identificadas nos

túbulos seminíferos de Phrynops geoffroanus são morfologicamente similares as

células identificadas em outros grupos de répteis (GRIBBINS et al., 2003; GRIBBINS

e GIST, 2003; GRIBBINS et al., 2006).

As espermatogônias identificadas (espermatogônia residual, espermatogônia

A e B) são similaras às descritas para Trachemys scripta (GRIBBINS et al., 2003).

Segundo Volsoe, (1944) e Fox (1952) apud (GRIBBINS et al., 2003), a identificação

de diferentes tipos de espermatogônias é uma conseqüência do grande número de

divisões mitóticas. Os mesmos autores comentam a dificuldade de reconhecer os

tipos intermediários de espermatogônias.

Os espermatócitos primários resultam da divisão das espermatogônias B e

são característicos por apresentarem aumento do núcleo e citoplasma. São

reconhecidas diferentes fases transicionais, similares às descrições propostas para

107outros grupos de répteis (GRIBBINS et al., 2003; GRIBBINS e GIST, 2003;

GRIBBINS et al., 2006). Foram observados em grande quantidade nos meses de

setembro, outubro e novembro.

Os espermatócitos secundários apresentaram menor freqüência de

observação. São levemente maiores que as espermátides redondas (10 a 15%)

como é sugerido por Gribbins e colaboradores (2003, 2006) em seus trabalhos sobre

espermiogênese em répteis. Sua baixa freqüência de observação é provavelmente

resultante de sua rápida divisão, como tem sido proposto para outras espécies

(ALBERTS et al., 2004).

As células espermiogênicas constituem a maiora da população do epitélio

germinativo de Phrynops geoffroanus nos meses de novembro até abril, consistindo

a fase mais longa do desenvolvimento do epitélio germinativo, como tem sido

proposto para outras espécies (GIBBONS, 1970; GRIBBINS et al., 2003; GRIBBINS

e GIST, 2003; GRIBBINS et al., 2005). O pico da espermatogênese ocorre em

dezembro, pois durante este período havia maior quantidade de espermátides em

estádios finais de elongação, espermatozóides ocupando o lúmen e as dimensões

dos túbulos atigiram as maiores médias, declinando nos meses seguintes.

As evidências sugerem que o ciclo testicular de Phrynops geoffroanus

apresenta um padrão do tipo pré-nupcial, onde a espermatogênese ocorre

imediatamente antes do período de reprodução. Os dados obtidos sobre o

comportamento reprodutivo da espécie em cativeiro, indicam que o período de

cópula ocorre de outubro a março (MOLINA, 1992; 1998; Molina e Gomes, 1998) e

que a postura de ovos entre abril e novembro (GUIX et al., 1989). Em seu ambiente

natural os animais raramente são vistos em atividade de corte e cópula, porém um

estudo realizado por Souza e Abe (2001), sobre aspectos reprodutivos da espécie

indicam uma maior atividade reprodutiva entre outubro e abril. Durante nossas

coletas observamos que nos meses de outubro até janeiro, os animais foram vistos

em maior concentração e atividade em determinados locais do rio, onde não eram

vistos com tanta freqüência em outros períodos do ano. Neste período, casais foram

observados em atividade de corte e cópula, e alguns machos foram capturados com

o órgão copulador evertido. As análises histológicas mostram uma maior atividade

espermatogênica entre outubro e janeiro com pico da espermiogênese em

dezembro. As observações sobre o comportamento reprodutivo, juntamente com o

108resultado das análises histológicas, sugerem que a espermatogênese antecede

ou ocorre simultaneamente ao período reprodutivo.

A distinção entre a espermatogênese pré e pós-nupcial pode não ser tão clara

e exige exame cuidadoso. O padrão pré-nupcial de recrudescência gonadal é

esperado em quelônios de ambientes tropicais de acordo com Crew (1987) apud

(MEYLAND et al., 2002), e segundo o mesmo autor foi definido para várias espécies.

Espermatogênese pré-nupcial ocorre, também, em espécies de lagartos (GRIBBINS

e GIST, 2003); serpentes (SHINE, 1977) e crocodilianos (GRIBBINS et al., 2006). O

padrão pós-nupcial é considerado comum entre Testudines de clima temperado

(GEORGES, 1983). Meyland e colaboradores (2002), consideram o padrão pós-

nupcial como uma característica derivada e que o padrão pré-nupcial deve ser

primitivo para a ordem, ocorrendo em clados basais, incluindo outros grupos de

Pleurodira.

Cinco distintos estádios de atividade testicular foram observados durante o

ciclo reprodutivo de Phrynops geoffroanus, que são similares aos estádios definidos

por Litcht (1967), apud (MEYLAND et al., 2002), para lagartos do gênero Anolis e

adotado para Apalone ferox. Descrições de estádios ou fases dos ciclos testiculares

são comuns e foram propostas para diferentes espécies de vertebrados amniotas,

incluindo Testudines (MAHMOUD e KLICKA, 1972; GEORGES, 1983; MAHMOUD e

CYRUS, 1992; McPHERSON e MARION, 1981; DUBOIS et al., 1988; LOFTS e

TSUI, 1977). Os estádios variam de acordo com as considerações do pesquisador e

a duração de cada fase. O estádio não observado durante as nossas análises,

corresponde à fase onde havia predomínio (abundância) de espermatócitos

secundários. Considerando que as espécies em que esta fase é evidente são de

clima temperado, podemos inferir que fatores climáticos (temperatura) podem afetar

a velocidade de transição de espermatócitos II para espermátides iniciais, já que em

Phrynops geoffroanus, tais células foram observadas sempre em pequena

quantidade, indicando, também, que sua divisão é mais rápida que a dos outros

tipos celulares do epitélio germinativo.

A fase de quiescência é descrita como o período em que há diminuição da

atividade testicular, com predomínio de espermatogônias e células de Sertoli, pouca

atividade mitótica, bem como área e diâmetros tubulares reduzidos (MEYLAND et

al., JHONSON, 1961). De acordo com Mahmoud e Cyrus (1992), em Chelidra

serpentina, foram encontrados espermatozóides, espermátides, espermatócitos e

109detritos celulares ocupando o lúmen dos túbulos seminíferos, e as células de

Sertoli afastadas da região central do lúmen, confinadas á região da lâmina basal.

Detritos celulares e presença de grandes áreas claras, entre as células do epitélio

seminífero, denominadas de material hialino, foram observadas no lagarto Anolis

porcatus (OCHOTERENA et al., 2005). Uma grande quantidade de túbulos

seminíferos apresentando aspecto semelhante à estas descrições, foram

observados em Phrynops geoffroanus, principalmente nos meses de junho e julho.

O período de quiescência da espermatogênese, e a regressão testicular,

ocorrem durante os meses que correspondem ao final do outono e início do inverno,

enquanto que a recrudescência e eventos subseqüentes ocorrem durante os meses

mais quentes (primavera e verão).

Comparando as modificações seqüenciais das células germinativas ao longo

do ciclo testicular de Phrynops geoffroanus com Testudines do Hemisfério Norte

(CHRISTIANSEN e DUNHAN, 1972; MAHMOUD e KLICKA, 1972; McPHERSON e

MARION, 1981) e com a espécie de Chelidae australiana Emydura krefftii

(GEORGES, 1983) (clima subtropical), alguns aspectos interessantes podem ser

ressaltados: Em P. geoffroanus a proliferação das células germinativas inicia em

junho e prossegue concomitantemente com os eventos meióticos e maturacionais,

que são completados em abril, quando inicia a regressão. Segundo Gribbins et al.,

(2003) na espécie de clima temperado, Trachemys scripta, o tempo requerido para a

realização de um ciclo completo da espermatogênese é mais curto (± cinco meses),

o que segundo o mesmo autor, resulta em menor gasto de energia pelos machos.

Nos trópicos, como as condições climáticas (temperaturas mais altas) são

mais favoráveis para a espermatogênese, os machos investem recursos energéticos

para a reprodução por um período muito maior de tempo, no entanto, não há

subsídios para estimar quais animais tem um efetivo gasto energético maior com a

espermatogênese. Em contrapartida, os períodos de inatividade dos testículos são

longos, enquanto que em Phrynops geoffroanus o período de quiescência testicular

é curto. Outro ponto interessante é o fato de que nas espécies de clima temperado,

com espermatogênese pós-nupcial, a reprodução ocorre em geral, na primavera,

quando os testículos atingem os tamanhos mínimos e os túbulos seminíferos estão

regredidos e espermatogeneticamente inativos (quiescência). Os machos utilizam,

então, os espermatozóides que foram produzidos nos ciclos reprodutivos anteriores,

e que estavam armazenados nos epidídimos (LOFTS e TSUI, 1977). Em Phrynops

110geoffroanus, o período reprodutivo coincide com a maior atividade gonadal, e os

epidídimos continham espermatozóides armazenados durante todos os meses

analisados, o que nos permite deduzir que os machos podem utilizar tanto os

gametas produzidos no ciclo anterior como os do ciclo atual.

Nossas investigações mostraram que o aumento do IGS, das dimensões e

atividade celular dos túbulos seminíferos de Phrynops geoffroanus, apresentaram

correlação com o aumento da temperatura. Resultados semelhantes foram

observados em outras espécies de Testudines de clima temperado: Sternotherus

odoratus (McPHERSON e MARION, 1981); Chelidra serpentina (MAHMOUD e

CYRUS, 1992); Trachemys scripta (GRIBBINS et al., 2003); Emydyra krefftii

(GEORGES, 1983); Kinosternon flavescens flavescens (CHRISTIANSEN e

DUNHAN, 1972); Kinosternidae (MAHMOUD e KLICKA); Sterotherus minor minor

(ETCHEMBERG e STOVAL, 1990); Trionyx sinensis (LOFTS e TSUI, 1977);

Terrapene Carolina Carolina e também em demais grupos de répteis (BULL et al.,

1997; SHINE, 1977; GIRONS, 1982; FERREIRA et al., 2002; RAMÍRES-SANDOVAL

et al., 2006).

A região onde Phrynops geoffroanus foi coletado, não apresenta fortes

variações climáticas entre as estações do ano, porém, ocorrem duas estações

distintas: seca e fria e quente e chuvosa. Observamos que o aumento da atividade

espermatogênica coincidiu com o aumento da precipitação. Entretanto, parece que o

efeito do aumento das chuvas é indireto na reprodução dos machos, pois estes

raramente saem da água, a não ser para se aquecerem em rochas e troncos

submersos. É provável, então, que o aumento das chuvas influencie mais a postura

dos ovos pelas fêmeas e, principalmente, sua eclosão, como foi confirmado por Guix

et al., (1989) e Molina (1998).

A natureza cíclica da atividade gonadal é mais marcante nos vertebrados de

regiões não-equatoriais, e muitas vezes mais notável nas fêmeas que nos machos

(ORR, 1986). Embora a atividade reprodutiva em muitas espécies de clima tropical

seja considerada contínua, muitas espécies exibem atividade reprodutiva cíclica,

com um curto período de inatividade, e com espermatogênese mais longa

(OCHOTORENA et al., 2005).

Os processos reprodutivos dos vertebrados são controlodos basicamente por

hormônios, no entanto, em muitas espécies a periodicidade sazonal é tão definida,

que sugere que os fatores ambientais, tais como a temperatura e o fotoperíodo,

111influenciam na regulação da reprodução. A maioria dos trabalhos sobre as ações

de fatores ambientais nos ciclos reprodutivos, foram realizados com aves (AIRE,

2002; ORR, 1985) e mamíferos (CALVO et al., 1997), sendo poucos trabalhos com

vertebrados ectotérmicos (McPHERSON e MARION, 1981; MARION, 1992).

Assim como os demais répteis os Testudines necessitam de uma temperatura

corporal ótima para a realização das atividades fisiológicas como digestão,

crescimento e reprodução (POUGH et al., 2003). Poucas espécies lacustres são

grandes o suficiente para manter a temperatura corporal mais alta que a da água, e

necessitam trocar energia com o ambiente para manterem um certo grau de

estabilidade térmica. A temperatura deve exercer uma influência importante no

processo gametogênico.

Estudos conduzidos por Mendonça e Litch (1986) apud (MAHMOUD e

CYRUS, 1992) sobre os efeitos da luz, da temperatura e níveis de hormônios

androgênicos sobre a recrudescência e a regressão testicular, concluíram que a

temperatura é um dos principais fatores estimuladores das gônadas. McPherson e

Marion (1981), em seus trabalhos sobre os efeitos da temperatura e do fotoperíodo

no ciclo testicular de lagartos, apontam a temperatura como maior fator climático que

controla o ciclo reprodutivo dos répteis de clima temperado. Outros fatores abióticos

podem exercer influencia importante na atividade gonadal, tais como a precipitação

pluviométrica e o suprimento alimentar, pois períodos de seca e escassez de

alimentos podem afetar a reprodução, mas esses fatores não foram avaliados neste

trabalho.

Apesar dos fatores ambientais influenciarem no ciclo reprodutivo, o principal

agente regulador da atividade gonadal é a ação dos hormônios gonadotrópicos (FSH

e LH) e gonadais (Testosterona). Na espermatogênese prénupcial, os processos

espermatogênicos e reprodutivos, são iniciados pelo mesmo sinal hormonal –

padrão associado (MEYLAND et al., 2002), descrito para lagartos, serpentes,

aligátor (LICHT, 1982), no qual todas as atividades testiculares coincidem e os

tamanhos máximos das gônadas são atingidos quando os níveis de testosterona

estão mais altos. Os dados histológicos sugerem que Phrynops geoffroanus suguem

o padrão associado, contrastando com as espécies de clima temperado, em que a

reprodução coincide com a regressão testicular (GEORGES, 1983).

Vários trabalhos envolvendo a análise histológica, a histoquímica e a

ultraestrutura das células de Leydig e células de Sertoli, e também dos níveis de

112hormônios sexuais (testosterona) na circulação sanguínea, concluíram que as

concentrações dos hormônios androgênicos nos quelônios é temporariamente

dissociada da espermatogênese (LICHT, 1982; LOFTS e TSUI, 1977). Callard et al.,

(1976) constatou que em Chrysemys picta, os níveis de testosterona são mais altos

quando os túbulos seminíferos estavam inativos, e que a recrudescência começa no

verão, quando os níveis de testosterona diminuem. Observou ainda, que as células

de Leydig apresentam aspecto hipertofiado, indicando alta atividade durante o pico

de testosterona. Situação semelhante foi verificada em outros trabalhos (LOFTS e

TSUI, 1977; LICHT, 1982; LICHT et al., 1985; DUBOIS et al., 1988) que concluíram

que as células de Leydig e de Sertoli apresentam atividade assincronica e que

ambas podem secretar andrógenos.

Embora não tenha sido objetivo deste estudo analisar os níveis séricos do

hormônio masculino durante o ciclo testicular, podemos concluir que o aumento das

médias dos parâmetros biométricos das gônadas (IGS e volume) e morfométricos

dos túbulos seminíferos (área, diâmetro e altura do epitélio) ocorrem durante o

período reprodutivo da espécie, e estão correlacionados com o aumento da

temperatura atmosférica. Como é sabido, o comportamento reprodutivo está

diretamente associado à presença de altas taxas de hormônios sexuais, podemos,

então, inferir que em Phrynops geoffroanus, tanto os eventos proliferativos e

maturacionais das células germinativas, quanto à reprodução, são desencadeadas

por um único sinal hormonal, resultando numa espermatogênese pré-nupcial, como

é esperado para as espécies da família Chelidae de ambientes tropicais.

Estudos futuros sobre a estrutura e o funcionamento das células de Leydig e

de Sertoli, níveis de hormônios androgênicos e gonadotrópicos, e também, o estudo

do ciclo reprodutivo feminino da espécie, poderão enriquecer as informações sobre a

biologia de Phrynops geoffroanus, espécie tão amplamente distribuída,

aparentemente bem adaptada, e pouco estudada, assim como os demais quelônios

brasileiros.

REFERÊNCIAS

AIRE, T.A. 2002. Morphological Changes in the Efferent Ducts During the Main

Phases of the Reproductive Cycle of Birds. Journal of Morphology. 253:64-75.

113ALBERTS, B.; BRAY, D.; JHONSON, A. 2004. Fundamentos de Biologia

Celular, Uma Introdução à Biologia Molecular da Célula. Artmed. RS. 562-

581.

AL-DOKHI, O.A.; AL-ONAZEE, Y.Z. e MUBARAK, M. 2004. Ligth and Electrón

Microscopy of the Testicular Tissue of the Snake Eryx jayakari (Squamata,

Reptilia) with a Reference to the Dividing Germ Cells. Journal of Biological Sciences. 4(3): 345-351.



BULL, K.H.; MASON, R.T.; WHITTIER, J. 1997. Seasonal Testicular and Sperm

Storage in Tropical and Subtropical Populations of the Brown Tree Snakes

(Boiga irregularis). Australian Journal of Zoology. 45: 479-488.

CALLARD, I.P.; CALLARD, G.V.; LANCE, V. e ECCLES, S. 1976. Seasonal

Changes in Testicular Structure and Function and Effects of Gonadotropins in the


30:347-356.

CALVO, A.; BASTOS-OREGON, E; PASTOR, L.M. 1987. Morphological and

histochemicalchanges in the epididymis of hamsters (Mesocricetus auratus)

subjected to short photoperiod. Journal of Anatomy. 191: 77-88.

CHRISTIANSEN, J.L. e DUNHAM, A.E. 1972. Reproduction of the Yellow Mud Turtle

(Kinosternon flavescens flavescens) in New Mexico. Herpetologica. 28:130-137.

DUBOIS, W. PUDNEY, J. e CALLARD, I. P. 1988. The Annual Testicular Cycle in the

Turtle, Crysemis picta: A Histochemical and Electron Microscopic Study. General and Comparative Endocrinology. 71: 191-204.

DUELLMAN, W.E. 1979. The South American Herpetofauna: Its Origin, Evolution and Dispersal. Monograph of the Museum of Natural History, the University of

Kansas nº7.

ETCHBERGER, C. R., e STOVALL, R. H. 1990. Seasonal variation in the testicular

cycle of the loggerhead musk turtle, Sternotherus minor minor, from central

Florida. Canadian Journal of Zoology. 68:1071-1074.


Iguanas, Iguana iguana (Reptilia:Sáuria:Iguanidae), in the Pantanal of Brasil. Brazilian Journal of morphology and Science. 19(1), 23-28.

114FLORES-VILELA, O.A.; ZUG, G.R. 1995. Reproductive Biology of the Chopontil,


Chelonian Conservation and Biology, vol. I, N 3:180-183.

GEORGES, A. 1983. Reproduction of the Australian freswather turtle Emydyra krefftii

(Chelonia: Chelidae). Journal of Zoology of London. 201: 331-350.

GIBBONS, J.W.1970. Reproductive Caracteristics of a Florida Population of Musk

Turtles (Sternothaerus adoratus). Herpetologica, vol 26 nº 2 p 268-270.

GIBBONS, J.W. 1982. Reproductive Patterns In Freshwater Turtles. Herpetologica 38(1): 222-227.

GIRONS, H. S. 1982. Reproductive Cycles Of Male Snakes And Their Relatonsships

With Climate and Femele Reproductive Cycles. Herpetologica. 38(1):5-16.

GIST, D.H.; DAWES, S.M.; TURNER, T.W.; SHELDON, S.e CONGDON, J.D. 2001.

Sperm Storage in the turtle: a male perspective. Journal of Experimental Zoology. 292(2): 180-186.

GRIBBINS, K.M.; GUIST, D.H.; CONDON, J.D. 2003. Cytological evaluation of


turtle, Trachemys scripta. Journal of Morphology, 255(3): 337-347.

GRIBBINS, K.M. e GUIST, D.H. 2003. Cytological Evaluation of Spermatogenesis






(Stockholm) 86: 223-230.





reprodução de Phrynops geoffroanus em cativeiro. [S.1.]: GGE. 19p.


STEVENS, A.; Foreword by DAVID, R.T. 1990. Theory and practice of histological

techniques. 3ª ed. Edimburgh London Melbourne and New York, 726p.

HICKMAN, C.P.Jr.; ROBERTS, L.S.; LARSONS, A. 2004. Princípios Integrados de Zoologia. 11ª edição. Guanabara Koogan. R.J. 531-538.

115IBARGÜENGOYTÍA, N. R.; PASTOR, L. M. E PALLARES, J. 1999. A light

microscopy and ultrastructural study of the testes of tortoise Testudo graeca

(Testudinidae). J. Submicrosc. Cytology and Pathology. 31 (2):221-229.

JOHNSON, O.W.1961. Reproductive Cycle of the Mallard Duck. The Condor. 26:351-364.

LICHT, P. 1982. Endocrine Patterns In The Reproductive Cycle Of Turtles.


LICHT, P.; BREITENBACH, G. L. e CONGDON, J. D. 1985. Seasonal Cycle in



LOFTS. B. e TSUI, H. W. 1977. Histologial and histochemical changes in the gonads




201.




urogenital em recém-eclodidos do Trachemys dorbigni. Congresso Latino Americano de Herpetologia. Santiago, Chile.

MARION, K.R.1982. Reproductive Cues For Gonadal Development In Temperate

Reptiles: Temperature and Photoperiod Efects On The Testicular Cycle Of The

Lizard Sceloporus undulatus. Herpetologica. 38(1): 26-39.

McPHERSON, R.J. e MARION, K.R. 1981. Seasonal Testicular Cycle Of The


(1): 33-40.

MEYLAND, P. A.; SCHULER, R.; MOLER, P. 2002. Spermatogenic Cycle of the

Florida Softshell Turtle, Apalone ferox. Copeia. 3: 779-786.


Phrynops geoffroanus em cativeiro. Biotemas. 5(1): 79-84.

116MOLINA, F.B. 1998. Comportamento e biologia reprodutiva dos cágados

Phrynops geoffroanus, Acanthochelis radiolata e Acanthochelis spixii

(Testudines, Chelidae) em cativeiro. Revista Brasileira de Etologia (nº

especial): 25-40.

MOLINA, F.B. e GOMES, N. 1998. Incubação artificial e processo de eclosão em

Trachemis dorbignyi. Revista Brasileira de Zoologia. 15(1):135-141.

OCHOTORENA, A.S., URIBE ARANZÁBAL, M.C. E GILLETTE JR. L.J. 2005.

Seasonal Gametogenic Cycles in a Cuban Tropical Lizard, Anolis porcatus.

Journal of Herpetology. 39 (3): 443-454.


Ltda., p 95, 508.

PRITCHARD, P.C.H.; TREBBAU, P. 1984. The Turtles of Venezuela. Fundación de Internados Rurales (Venezuela), Society for the study of Amphibians and




RAMÍRES-SANDOVAL, E.; RAMÍRES-BAUTISTA, A. e VITT, L.J. 2006.

Reproduction in the Lizard Phyllodactylus lanei (Squamata: Gekkonidae) from

the Pacific Coast of México. Copeia. ROSTAL, D.C.; ROBECK, T.R.; GRUMBLES, J. S.; BURCHFIELD, P.M. e OWENS,

D. Wm. 1998. Seasonal Reproductive Cycle of the Galápagos Tortoise

(Geochelone nigra) in Captivity. Zoo Biology. 17: 505-517.

SHINE, R. 1977. Reproduction in Australian Elapid Snakes I. Testicular Cycles and

Mating Season. Australian Journal of Zoology. 25: 647-653.

SOUZA, F.L. e ABE, A.S. 2001. Population Structure and Reproductive Aspects of



57-62.

TORRES, M.L.C.; LANDA, P.A.; MORENO, M.N.; MARMOLEJO, V.A.; MERCHANT,

L.H. 2002. Expresión profiles of Dax 1, Dmrt 1, and sox 9 during temperature sex

determination in gonads of sea turtle Lepicochelys olivacea. General Comparative and Endocrinology. 129(1): 20-26.

117

ti

ta ts

ts ti

cm

A

h

B

D

l

es

C

Figura 1. Histologia geral do testículo de Phrynops geoffroanus (H-E). A. Secção do testículo onde são indicados a túnica albugínea (ta) e os túbulos seminíferos (ts), com diferentes diâmetros. B.Túbulos seminíferos (ts) envoltos pelo tecido intersticial (ti). C. Túbulo seminífero onde estão indicadas as células mióides (cabeça de seta); o epitélio seminífero (es); o lúmen do túbulo (l); e tecido intersticial (setas). D. Túbulo seminífero de um testículo imaturo com grande quantidade de células de Sertoli (setas) e espermatogônias (cabeça de seta).

118

ab

S

SpA

cS

SpB

cS

SpR

C

A

D

B

Sc 2

Sph

Figura 2. Secções do epitélio seminífero de Phrynops geoffroanus, onde são indicados os tipos celulares (H-E; escala 25µm). A. Espermatogônias do tipo a (SpA); grupo de espermatogônias do tipo B (SpB); espermatogônia residual (SpR); espermatócitos primários em leptóteno (seta) e célula de Sertoli (cS). B. Espermatócitos secundários (Sc); espermátides alongadas em estádio final de elongação e compactação nuclear (setas). C. Espermátides em diferentes estádios de compactação e elongação do núcleo (setas); espermatócito primário (cabeça de seta). D. Espermatogônia A (SpA); espermatogônia hipertrófica (Sph); célula de Sertoli (cS); espermátides redondas em diferentes estádios (St1) e espermatozóide (seta).

SpA

St1

119

D

A B

C D

E F

St

Figura 3. Mudanças do epitélio seminífero de Phrynops geoffroanus durante o ciclo reprodutivo (H-E). A. Junho - quiêscencia: reorganização do epitélio, espermatogônias e células de Sertoli próximas à membrana basal; detritos celulares ocluindo o lúmen. B-D. Julho, agosto e setembro - Proliferação de espermatogônias e de espermatócitos I; lúmen evidente. E. Outubro- fase espermiogênica: diâmetro tubular aumentado; grande quantidade de espermátides redondas (st). F. Novembro- aumenta a quantidade de espermátides redondas e alongadas, ligadas ao citoplasma das células de Sertoli.

120

A B

D

E

C

F

Sz

h

h

Figura 4. Mudanças do epitélio seminífero de Phrynops geoffroanus durante o ciclo reprodutivo (H-E). A. Dezembro: pico da espermiogênese- epitélio organizado em colunas e criptas (setas); grande quantidade de espermátides redondas e alongadas (cabeças de seta) e espermatozóides (Sz). B-C. Janeiro e fevereiro: menor quantidade de espermatozóides livres. D-E. Março e abril- regressão: menor diâmetro tubular; grande quantidade de áreas claras (material hialino) entre as células (h). F. Maio – início da quiescência: começa a proliferação de espermatogônias; restos celulares ocupando o lúmen (seta).

121

Figura 5. Variação do índice gonadossomático (IGS) de Phrynops geoffroanus durante o ciclo reprodutivo. As mesmas letras indicam ausência de diferença estatística.

0

50

100

150

200

INV PRI VER OUTVolu

me

das

Gôn

adas

(cm

3)

Figura 6. Variação do volume testicular de Phrynops geoffroanus durante o ciclo reprodutivo. Não houve diferença estatística.

0.000

0.200

0.400

0.600

INV PRI VER OUT

Índi

ce G

onad

osso

mát

ico

a

b

bc ad

122

Figura 7. Variação da altura do epitélio seminífero de Phrynops geoffroanus durante o ciclo reprodutivo. Letras diferentes indicam diferença estatística. As letras diferentes indicam diferença estatística.

0

150000

300000

INV PRI VER OUT

Áre

a do

s tú

bulo

s (µ

m2)

a

b

c ad

Figura 8. Variação da área dos túbulos seminíferos de Phrynops geoffroanus durante o ciclo reprodutivo. Letras diferentes indicam diferença estatística.

0

60

120

180

INV PRI VER OUT

Altu

ra d

o ep

itélio

sem

inífe

ro (µ

m)

a

b

c

d

123

Figura 9. Variação do diâmetro dos túbulos seminíferos de Phrynops geoffroanus durante o ciclo reprodutivo anual. A. Diâmetro maior. B. Diâmetro menor. Letras diferentes indicam diferença estatística.

0

200

400

600

800

INV PRI VER OUTDiâ

met

ro m

aior

dos

Túb

ulos

(µm

)

0

200

400

600

INV PRI VER OUTDiâ

met

ro m

enor

dos

Túb

ulos

(µ

m)

A

B

a

b

c cd

a

b c

cd

124

Figura 10. Correlações entre os parâmetros morfométricos dos túbulos seminíferos de Phrynops geoffroanus observados durante o ciclo reprodutivo anual.

rs= 0.83

rs= 0.86

125CONCLUSÕES

• O aparelho reprodutor masculine de Phrynops geoffroanus, é, de modo

geral, similar ao de outros Testudines, e é constituído de um par de

testículos, dúctulos eferentes, epidídimos, ductos deferentes e pênis.

• Não ocorrem variações biométricas entre as gônadas direita e esquerda.

• O IGS variou ao longo do ano, com maiores médias verificadas nos meses

que correspondem ao final da primavera e início do verão, e as menores

médias foram observadas durante o inverno.

• Os epidídimos apresentaram espermatozóides armazenados durante todos

os meses analisados, incluindo os períodos de menor atividade testicular

(regressão e quiescência), indicando sua provável função primária de

armazenamento de espermatozóide.

• Os testículos são histologicamente similares aos demais vertebrados

amniotas, e são constituídos de túbulos seminíferos entremeados pelo

tecido intersticial.

• Ocorrem variações nas dimensões dos túbulos seminíferos (diâmetro e

área) e da altura do seu epitélio, com maiores médias durante o pico da

atividade espermatogênica (dezembro).

• A espermatogênese apresenta muitas semelhanças com o processo

descrito para os demais répteis, ocorrendo variação da população celular.

• A espermatogênese é mais longa do que nas espécies de clima

temperado, e com períodos de quiescência mais curtos.

• O ciclo espermatogênico é do tipo pré-nupcial, com espermatogênese

ocorrendo antes e prosseguindo durante a reprodução, ao contrário do que

é comumente descrito para espécies de Testudines de clima temperado,

em que o padrão é pós-nupcial. Porém, os machos podem utilizar também

os espermatozóides produzidos em ciclos anteriores e que estavam

armazenados nos epidídimos.

• Reprodução e espermiogênese ocorrem no mesmo período, sugerindo que

o mesmo sinal hormonal que inicia a espermatogênese, promove a

reprodução. Nas espécies de clima temperado, a reprodução ocorre

quando os testículos estão inativos, e a espermatogênese inicia após o

período reprodutivo.

126• O aumento do IGS e os eventos espermatogênicos estão associados ao

aumento da temperatura.

• As vias seminíferas extratesticulares são, de modo geral, similares às

descrições histológicas propostas para outras espécies de répteis e são

constituídas por:

- dúctulos eferentes: epitélio formado por epitélio colunar com células

basais, células ciliadas e não-ciliadas envoltas por tecido conjuntivo.

- epidídimos: apresentam variação histológica na altura do epitélio e

da túnica muscular entre as regiões da cabeça, do corpo e da

cauda. O epitélio é mais alto durante o período reprodutivo.

- Ducto deferente: apresenta epitélio mais baixo que no epidídimo,

constituído por células basais e principais, e espessa túnica

muscular.

Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )

Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas










http://www.livrosgratis.com.br/cat_1/administracao/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_2/agronomia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_3/arquitetura/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_4/artes/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_5/astronomia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_6/biologia_geral/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_8/ciencia_da_computacao/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_9/ciencia_da_informacao/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_7/ciencia_politica/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_10/ciencias_da_saude/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_11/comunicacao/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_12/conselho_nacional_de_educacao_-_cne/1















http://www.livrosgratis.com.br/cat_13/defesa_civil/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_14/direito/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_15/direitos_humanos/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_16/economia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_17/economia_domestica/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_18/educacao/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_19/educacao_-_transito/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_20/educacao_fisica/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_21/engenharia_aeroespacial/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_22/farmacia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_23/filosofia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_24/fisica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_25/geociencias/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_26/geografia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_27/historia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_31/linguas/1







Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo

http://www.livrosgratis.com.br/cat_28/literatura/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_30/literatura_de_cordel/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_29/literatura_infantil/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_32/matematica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_33/medicina/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_34/medicina_veterinaria/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_35/meio_ambiente/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_36/meteorologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_45/monografias_e_tcc/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_37/multidisciplinar/1





http://www.livrosgratis.com.br/cat_38/musica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_39/psicologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_40/quimica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_41/saude_coletiva/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_42/servico_social/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_43/sociologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_44/teologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_46/trabalho/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_47/turismo/1







programa de pÓs-graduaÇÃo em biologia animallivros01.livrosgratis.com.br/cp032309.pdfos animais...

Documents