UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRONOMICE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ, FACULTATEA DE ZOOTEHNIE

STUDII UNIVERSITARE DE MASTERSPECIALIZAREA : Biosecuritatea Produselor Alimentare

Calitatea igienica a laptelui materie prima

MASTERAND:Peptine Tudorel Alin

Februarie 2013

1

CuprinsINTRODUCERE…………………………………………………………………...…pg. 3CAPITOLUL I……………………………………………………………..…………pg. 3I. Caracterele organoleptice…………………………………………………………..pg. 3I.1. Culoarea…………………………………………………………………………....pg. 3I.2. Mirosul şi gustul…………………………………………………………………...pg. 3CAPITOLUL II……………………………………………………………………..…pg. 4II. Calitatea nutritiva……………………………………………………………….....pg. 4II.1. Stadiul lactaţiei…………………………………………………………………...pg. 5II.2. Numărul de lactaţii…………………………………………………………...….pg. 5II.3. Alimentaţia şi sezonul............................................................................................pg. 5CAPITOLUL III………………………………………………………………………pg. 6III. Calitatea igienica…………………………………………………………………..pg. 6III.1. Indicatorii calităţii laptelui……………………………………………….…….pg. 6III.2. Germenii (bacteriile) din lapte……………………………………………...….pg. 6III.2.1 Germenii patogeni……………………………………………………………...pg. 6III.2.2. Germenii nepatogeni…………………………………………………………..pg. 9 A). Microorganime care actioneaza in principal asupra lactozei din lapte………..pg. 9 B). Microorganisme care actioneaza puternic asupra proteinelor din lapte……...pg. 11 C). Microorganisme care actioneaza asupra lipidelor din lapte………………….pg. 12III.3. Celule somatice din lapte...................................................................................pg. 12III.3.1. Studii privind citomorfologia laptelui in corelatie cu celulele somatice si relevanta pentru sanatatea si calitatea acestuia (conform tezei de doctorat a prof. univ. Dr. Ovidiu Rotaru si a prof. univ Dr. Marian Mihaiu)………………………………...pg. 13III.3.1.1. Determinarea numărului de celule somatice la loturile de vaci luate în anul 2008…………………………………………………………………………………....pg. 15III.3.1.2. Determinarea numărului de celule somatice la loturile de vaci luate în anul 2009…………………………………………………………………………………....pg. 16III.3.1.3. Evaluarea în dinamică a numărului de celule somatice în functie de stadiul si numărul de lactatii…………………………………………………………………….pg. 16III.3.1.4. Distribuţia NCS în funcţie de stadiul şi numărul de lactaţii……………...…pg. 17III.3.1.5. Rezultate şi discuţii privind evaluarea în dinamică a citomorfologiei populatiei celulare din lapte in functie de stadiul şi numărul de lactaţii…………….pg. 18III.3.1.6. Evaluarea configuraţiei populaţiei celulare din laptele de vacă………...….pg. 18 III.3.1.7. Evaluarea în dinamică a populaţiei celulare din laptele de vacă în funcţie de stadiul şi numărul de lactaţii………………………………………………………..…pg. 19III.3.1.8. Aprecierea citomorfologiei populaţiei celulare din lapte folosind metoda coloraţiei vitale………………………………………………………………………..pg. 20III.3.1.9. Rezultate şi discuţii privind studiul citomorfologic al laptelui corelat cu numarul de celule somatice si relevanta pentru calitatea şi sănătatea igienică a acestuia…….pg. 20 III.3.1.10. Concluzii generale şi recomandări……………………………………...…pg. 20 CAPITOLUL IV………………………………………………………………..…….pg. 23IV. Principalele masuri pentru prevenirea contaminarii laptelui cu microorganisme……………………………………………………………...……….pg. 23BIBLIOGRAFIE……………………………………………………………...……..pg. 24

2

INTRODUCERE

Laptele, aşa cum a fost definit la Congresul Internaţional pentru CombatereaFraudelor de la Geneva din 1908, este produsul de secreţie al glandei mamare, obţinut de la vaci sănătoase în stare bună de întreţinere şi furajare, prin mulgere completă neîntreruptă şi igienică şi care nu conţine colostru.

Laptele este unul dintre cele mai complete alimente. El conţine aproape toate substanţele necesare organismului uman şi animal într-o formă foarte uşor asimilabilă. Este la fel de adevărat că laptele constituie un mediu la fel de nutritiv şi pentru microorganismele care contaminează laptele. Ca urmare, pentru a putea satisface toate cerinţele, laptele trebuie să fie de calitate..

Din punct de vedere al producătorului, calitatea laptelui este reprezentată de un ansamblu de caracteristici necesare pentru ca produsul sa fie acceptat pentru prelucrare sau pentru vânzare directă.

Din punct de vedere al consumatorului, laptele trebuie să corespundă organoleptic, adică sa aibă aspect, culoare, miros şi gust caracteristic şi să fie proaspăt. În ultima perioadă însă, consumatorul este tot mai mult interesat si de calitatea igienică a laptelui (adică produsul să fie proaspăt şi sigur pentru a fi consumat).

Din punct de vedere sanitar veterinar, calitatea laptelui reuneşte toate caracteristicile pe care trebuie să le întrunească un produs alimentar, astfel încât să dovedească calitatea de propriu pentru consum uman ( să fie conform cu reglementările legale în vigoare).

CAPITOLUL I

I. Caracterele organoleptice

Caracterele organoleptice ale laptelui sunt reprezentate de aspect, culoare, consistenţă, miros şi gust. Laptele este un lichid cu aspect omogen, opac, lipsit de impurităţi vizibile în suspensie şi lipsit de sediment, de culoarea alb gălbuie cu gust plăcut, dulceag, caracteristic de lapte, fără să prezinte miros şi gust străin.

I.1. Culoarea

Culoarea laptelui este alb - gălbuie la vacă şi capră şi este albă la oaie şi bivoliţă. Nuanţa gălbuie se datorează pigmenţilor liposolubili care provin din furaje, în special a celor din grupa carotenoizilor. În anumite situaţii, culoarea laptelui se poate modifica, apărând defecte de culoare.

I.2. Mirosul şi gustul

Laptele de vacă prezintă un prezintă un miros plăcut, caracteristic, slab exprimat. Laptele vechi are un miros uşor acrişor, iar laptele fiert are un miros particular, dar de asemenea plăcut. Consumul unor plante aromate poate imprima laptelui un miros şi un gust caracteristic. Gustul de furaje se percepe mai uşor în lapte dacă mulsul se execută la

3

1 – 2 ore după furajare. Dintre plantele care pot imprima mirosul şi gustul neplăcut al laptelui enumerăm: muşeţelul, cimbrul, anasonul, usturoiul, pelinul.

Atunci când furajarea vacilor se face cu furaje conservate, laptele poate avea un miros acetic, iar când furajarea se face cu borhoturi fermentate, mirosul laptelui capătă o nuanţă alcoolică. În cazul administrării în hrana vacilor de lapte a turtelor de oleaginoase sau a făinii de peşte, laptele poate căpăta un miros de rânced. De asemenea, trebuie să se ţină cont şi de faptul că laptele împrumută foarte uşor mirosurile din mediul în care este păstrat, de aceea este indicat ca, imediat după muls, laptele să fie transportat din grajd.

Laptele provenit de la diferite specii prezintă un gust diferit, în funcţie de calitatea grăsimii pe care o conţine. Gustul caracteristic al laptelui se datorează gustului dulce al lactozei, asociat cu gustul sărat al clorurilor. Pe măsură ce lactaţia avansează, proporţia de lactoză scade şi creşte proporţia clorurilor în lapte, ca urmare, acesta capătă un gust uşor sărat.

In anumite situaţii pot apărea diverse modificări de miros şi gust ale laptelui crud. Gustul amar apare atunci când animalele au consumat plante care conţin principii amare (pelin, anghinare) sau în cazul contaminării cu diverse microorganisme.

Gustul sărat apare în cazul laptelui provenit de la vaci cu mamită (datorită creşterii conţinutului în cloruri al laptelui), în cazul laptelui de sfârşit de lactaţie sau al laptelui de retenţie. Gustul fenolic se datorează contaminării cu diferite specii de microorganisme

Gustul de rânced poate apărea in cazul în care loc o agitare excesivă a laptelui în timpul colectării şi a transportului (datorită eliberării de acizi graşi liberi).

CAPITOLUL II

II. Calitatea nutritiva

Laptele, pentru a putea să îşi îndeplinească rolul nutritiv pentru care este utilizat, trebuie să conţină anumite substanţe (nutritive) reprezentate de proteine, glucide, lipide, vitamine, minerale etc.

Compoziţia chimică a laptelui variază mai mult sau mai puţin, în funcţie de componentul luat în considerare. Dacă pentru lactoză, substanţele minerale şi vitaminele hidrosolubile, variaţiile sunt reduse, pentru grăsime, vitaminele liposolubile şi oligoelemente, variaţiile pot deveni foarte largi. Pentru conţinutul în proteine variaţiile sunt limitate, dar nu neglijabile. Compoziţia chimică a laptelui este influenţată de o serie de factori printre care: stadiul lactaţiei, vârsta animalului, rasa, starea fiziologică (gestaţia), inflamaţiile glandei mamare, alimentaţia, sezonul etc.

Referitor la proteinele din laptele, sunt de facut o serie de precizari si anume:- proteinele laptelui contin toti aminoacizii esentiali; proteinele serice sunt cele mai

complete, unele avand rol imunoprotector (imunoglobinele), effect bactericid (lizozim) sau sunt sunt purtatoare de grupari fosfat (cazeinele), respective grupari SH (lactalbuminele)

Grăsimea este componentul cu cea mai mare variabilitate între rase, astfel că grăsimea din laptele de vacă din rasa Jersey este în medie de 5,5%, iar în laptele de vacă de la rasa Holstein procentul de grăsime este în medie de numai 3,5%. De asemenea grasimea din lapte este usor asimilabila si este transportatoare pentru vitaminele

4

liposolubile. Fosfolipidele din lapte sunt bogate in fosfor, iar sterolii contribuie la formarea vitaminei D.

Glucidele din lapte si in special lactoza intervinin absorbtia Ca si P, au insusiri diuretice si laxative si contribuie la gustul dulce din lapte.

Laptele este bogat in saruri minerale (Ca, P, Na, K) si contine aproape toate vitaminele liposolubile si hidrosolubile.

Laptele este considerat un aliment complet, cu o valoare energetica de cca 650 kcal/100 ml si, tinand cont si de insuririle sale senzoriale, atat el cat si produsele fabricate din lapte sunt indicate in alimentatia omului sanatos, precum si a celui cu diferite afectiuni.

II.1. Stadiul lactaţiei.

În a doua parte a gestaţiei, datorită modificărilor hormonale care au loc, se poate observa o scădere a cantităţii de lapte şi ca urmare, acesta este mai bogat în substanţă uscată.

Conţinutul laptelui în materie grasă şi în proteine evoluează invers proporţional cu cantitatea de lapte produs. Astfel, conţinutul în proteină şi grăsime al laptelui este crescut la începutul lactaţiei, pentru ca apoi să scadă în cursul celei de a doua – a treia lună de lactaţie şi din nou să crească spre finalul lactaţiei, în special în ultimele două săptămâni (dependent de individ). În ceea ce priveşte proporţia cazeinei din compoziţia proteinelor, ea este destul de constantă în cursul lactaţiei. /Remond, 1987/.

Conţinutul în calciu, fosfor şi vitamină A al laptelui este crescut imediat după fătare, pentru ca să scadă apoi rapid (să varieze foarte puţin în cursul lactaţiei) şi apoi să înceapă să crească din nou cu câteva săptămâni înainte de fătare. II.2. Numărul de lactaţii.

În primele patru lactaţii, compoziţia laptelui variază foarte puţin (conţinutul de grăsime scade cu 0,5%, iar cel de proteină cu 0,6% (scade cantitatea de cazeină, dar creşte cantitatea de proteine solubile, datorită vârstei care determină modificări la nivelul glandei mamare, mai ales în caz de mamite) /Remond, 1987/.

Vârsta vacilor poate să influenţeze cantitatea de săruri minerale din lapte. O diminuare cu 7% a conţinutului în fosfor al laptelui se poate observa la vacile cu vârstă mai mare de 10 ani. Nu se constată aceleaşi modificări şi în ce priveşte conţinutul de calciu din lapte /Remond, 1987/.

II.3. Alimentaţia şi sezonul

Există o anumită variaţie lunară şi sezonieră (adesea subestimate), a compoziţiei laptelui de care trebuie ţinut cont. Laptele are un conţinut mai sărac în grăsime, proteină, SUD şi SUT în sezonul de vară şi mai crescut în sezonul de iarnă. Astfel, conţinutul de grăsime al laptelui este mai scăzut în lunile iunie – iulie şi este maxim în septembrie – noiembrie, iar conţinutul de proteine este mai scăzut la sfârşitul iernii şi la mijlocul verii şi este mai crescut la ieşirea la păşune şi la sfârşitul perioadei de păşunat. De fapt, această evoluţie a conţinutului laptelui în grăsime şi substanţe proteice este rezultatul acţiunii

5

numeroşilor factori şi mai ales a stadiului lactaţiei, alimentaţiei, factorilor climatici şi sezonieri. Lactoza este singurul component care nu prezintă variaţii sezoniere. Variaţiile lunare şi sezoniere ale cantităţii de proteină din lapte influenţează direct conţinutul de SUT din lapte .

CAPITOLUL III

III. Calitatea igienica

III.1. Indicatorii calităţii laptelui pentru:

a) laptele crud de vaca sunt: numărul de germeni dintr-un ml de lapte ( conținutul de germeni la 30 °/ ml ≤ 100

000); numărul de celule somatice dintr-un ml de lapte ( conținutul de celule somatice/

ml ≤ 400 000);b) laptele crud de la alte specii sunt: conținutul de germeni la 30 ° / ml ≤ 1 500 000;

c) Cu toate acestea, în cazul în care laptele crud care provine de la alte specii decât vacile este destinat fabricării de produse fabricate cu lapte crud printr-un procedeu care nu implică nici un tratament termic, este necesar ca operatorii din sectorul alimentar să facă tot ce este necesar pentru ca laptele crud să întrunească următoarele criterii:

conținutul de germeni la 30 °C ≤ 500 000. III.2. Germenii (bacteriile) din lapte

Calitatea igienică este reprezentată de:a) - prezenţa sau absenţa germenilor patogeni: b) - alteraţie (nepatogene), care pot contamina laptele ca materie primă.Prezenţa germenilor patogeni în lapte poate avea consecinţe grave asupra

consumatorului şi care exclud laptele de la consum.

III.2.1 Germenii patogeni

Sunt reprezentaţi de: salmonele, E. Coli, Staphylococcus aureus, Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenes etc. Provenienţa lor este diferită; unii provin de la animalul producător de lapte (ex inflamaţii ale glandei mamare – stafilococii), alţii provin de pe suprafaţa ustensilelor folosite la muls, din aerul încăperilor în care se face mulsul, de la personalul mulgător.

Este la fel de adevărat că laptele constituie un mediu nutritiv şi pentru microorganismele care contaminează laptele. Sursa primară de microorganisme este mediul: aerul, praful, echipamentele murdare, mulgătorii etc. De aceea este necesară respectarea unor reguli de igienă în fermele de obţinere.

6

Cele mai importante cauze ale creşterii numărului de microorganisme din laptele crud sunt următoarele: spălarea necorespunzătoare a echipamentelor folosite la muls (acest lucru poate contribui la contaminarea laptelui cu sute de mii, până la milioane de germeni.), răcirea insuficientă a laptelui poate determina creşterea încărcăturii microbiene a laptelui, mamitele pot contribui la contaminarea laptelui cu milioane de germeni, iar personalul poate contribui şi el prin practicele igienice necorespunzătoare, la creşterea încărcăturii laptelui.

Indicatorii microbiologici din lapte a principalelor microoorganisme sunt indicati in tabelul urmator:

Tab. 3.2.1.

Denumireaprodusului

Nr.

tot

al d

e ge

rmen

i m

ezof

ili

Bac

teri

i col

ifor

me

Esc

her

ich

ia e

coli

Sal

mon

ella

/ 25

g

Sta

filo

coci

coa

gula

zo

– p

ozit

ivi

Bac

iliu

s ce

reu

s

Vib

rio

par

ahae

mol

ytic

us

Bac

teri

i su

lfit

o -

red

uct

oare

Dro

jdii

si m

uce

gaiu

ri

Lapte crud materie prima pentru:lapte praf, lapte condensat si lapte praf pentru copii

500000 100 10 -2) - - - - -

Lapte crud1000000

1000

100 Abs Abs 10 - - -

Lapte pentru consum

300000 10 1 - - - - - -

Lapte UHT 3) - - - - - - - -Lapte praf 100000 10 1 Abs 1 10 - 100 -Lapte concentrat cu zahar

50000 Abs - Abs Abs - - - -

Germenii patogeni sunt de mai multe feluri cum ar fi: virusurile, printre care amintim: virusul encefalitei transimisibile prin artropode,

virusul Coxsackie, virusul poliomielitei, virusul febrei aftoase, virusul hapatitei infectioase;

bacterii si toxine bacteriene cum ar fi:o Stafilococii: - S. aureus;

- S. agalactiae;

7

- S. uberis.

Pentru limitarea contaminarii laptelui cu S. aureus se impun urmatoarele masuri principale:

a). Ingrijitorii de animale, mulgatorii si lucratorii din intreprinderile de industrializare a laptelui cu leziuni – in special pe maini – produse sau contaminate cu stafilococi, nu trebuie lasati sa vina in contact cu laptele si produsele lactate.

b). Impidicarea multiplicarii stafilococilor in laptele contaminat prin racirea lui cat mai repede dupa mulgere, la temperatura de cel putin 10°C si mentinerea la aceasta temperatura pana in momentul tratarii termice. Daca tratarea termica se face in primele 2-3 ore dela mulgere, racirea nu mai este necesara.

c). Evitarea contaminarii laptelui dupa tratarea termica. Aceasta recontaminare este mult mai periculoasa, deoarece in laptele tratat termic, in care nu mai exista bacterii acido-lactice si nici alta microflora concurenta in numar mare, stafilococii gasescconditiide multiplicare mai favorabile.

o Streptococii: - Streptococii hemolitici din grupa A (S.pyogenes) produc la om mai multe afectiuni clinice acute: angina, otita medie, scarlatina, afectiuni purelente, erizipel.

- Streptococii din grupa B afecteza tesuturile foarte sensibile ale uterului post-partum si ale noilor nascuti. Din acesta categorie amintim S. agalactiae (mastiditis) care produce la vaca mastite.

o Diplococcus pneumoniae de tip III produce mastita la vaci.

Prevenirea infectiilor streptococice la om prin consumul de lapte si produse lactate presupune luarea unor masuri cum ar fi:

a). Contrloul sanitar al muncitorilor din fermele cu animale de lapte si din intreprinderile prelucratoare;

b). Excluderea din consum a laptelui din sectoarele contaminate ale ugerului si a oricarui lapte cu aspect anormal;

c). Racirea laptelui de la obtinere pana la tratarea termica;d). Tratarea termica convenabila a laptelului, indiferent de destinatia care i se da;e). Eviatarea contaminarii laptelui dupa aplicarea tratamentelor termice.

o Salmonella: - agentii febrelor tifoide si paratifoide printre care amintim: Salmonella schottmulleri, S. typhosa, S. paratyphi, S. hirschfeldi.

- agentii altor salmoneze, de exemplu S.typhimurium.In general, lupta contra salmonezelor transimise prin lapte comporta urmatoarele

masuri principale:- ameliorarea conditiilor de igiena in adaposturi, deoarece decelarea si eliminarea

animalelor purtatatoare de germeni nu este inca posibila;- controlul sanitar al manipulatorilor;- pasteurizarea corecta a laptelui;

8

- prelucrarea igienica a laptelui si conservarea produselor rezultate la temperature joase;

- respectarea masurilor sanitare la nivelul intreprinderilor de colectare, prelucrare si desfacerea a laptelui.

o Shigella: produce dizenterie bacilara. Pentru a evita contaminarea laptelui su Shigella, trebuie impuse o disciplina

saniatara si masuri de igiena riguroase pentru lucratorii din intreprinderile de prelucrare a laptelui, mai ales in conditiile de pasteurizare si imbuteliere lapte consum, ca si la nivelul comertului, mai ales acolo unde laptele se vinde in vrac.

o E. coli enteropatogenao Yersinia enterocoliticao Campylobacter jejuini produce gastroenterita acuta.o Brucella: - Br. melitensis;

- Br. suis;- Br. abortus.

o Mycobacterium bovis produce tiberculoza la bovine.o Bacillus anthraciso Clostridium perfringenso Clostrdium botulinumo Corynecbacterium diphtariaeo Listeria monocytogeneso Lesptospireleo Coxiella ((Rickettsia) burnetiio Alte microoorganisme cum ar fi: Nocordia asteroids, Nocordia

brasillians, Candida tropicalis, Candidan albicans, Candida krusei, Criptococcus, etc.

III.2.2. Germenii nepatogeni

Nu trebuie însă neglijată nici cea de a doua categorie a germenilor de alteraţie ce pot determina apariţia unor modificări (de culoare, consistenţă, miros şi gust, prezentate anterior) şi pot face produsul impropriu pentru consum.

Imediat după obţinere, numărul de microorganisme din lapte rămâne constant sau chiar descreşte datorită existenţei unor mecanisme care au rolul de a proteja glanda mamară de agresiunea microorganismelor. Această perioadă se poate prelungi de la 2 la 10 ore, dacă laptele este răcit imediat după muls, la temperaturi mai mici de 8 C. Cele mai importante sisteme sunt: imunoglobulinele, fagocitoza, lactoferina, sistemul lactoperoxidaza-tiocianat-peroxid de hidrogen.

A). Microorganime care actioneaza in principal asupra lactozei din lapte

o Bacteriile lactice sau fermentii lactici adevarati, fac parte din doua familii diferite: familia Lactobacillaceae si din familia Sterptococcaceae.

9

Streptococii lactici sunt germeni lactici dominanti in lapte, la temperatura ambianta, producand o acidifiere moderata cu 0,5-1%acid lactic, determinand scaderea pH-ului decat cu putin sub punctual izoelectric al cazeinei (pH 4,6).

Lactobacilii se deosebesc de streptococci prin morfologie si prin doua caracteristici importante: - acidifiere mai lenta, dar mai puternica, ei pot produce pana la 2,8% acid lactic si coboara pH-ul pana la 3,5; - au o activitate cazeolitica mai insemnata, posedand proteinase active.

In functie de produsii rezultati in urma fermentarii lactozei, bacteriile lactice se impart in bacterii lactice homofermentative si bacteriile lactice heterofermentative. a). Bacterii lactice homofermentative in urma actiunii asupra lactozei produce pana la 95% acid lactic si cantitati foarte mici de CO2 si acid acetic.

Aceasta grupa se imparte in doua subgrupe termofile si mezofile.- bacteriile lactice homofermentative termofile reprezentate de specii din genurile

Lactobacillus si Streptococcus care: au temperature optima de inmultire de 37-45°C; in general nu se

inmultescla 20°C si la 15°C; acidifica puternic laptele, producand cca. 2,7% acid lactic; au activitate cazeolitica pronuntate.

- bacteriile lactice homofermentative mezofile reprezentatede specii din genurile Lactobacillus si Streptococcus care:

au temperature optima de inmultire de 20-30°C si nu se dezvolta la temperature mai mari de 40°C

acidifica lent laptele, formand cca 1% acid lactic prin fermentarea lactozei; au o oarecare activitate cazeolitica.

b). Bacteriile lactice heterofermentative produc in urma actiunii asupra lactozei cca 50% acid lactic, 20-25% CO2, 20-25% alcooli si acid acetic. Principalele specii din aceasta grupa, care au importanta pentru tehnologia laptelui sunt: Bifidobacterium bifidum, L. desidiosus, L.brevis, Leuc. mesenteroides, Leuc. cremoris.

o Bacteriile pseudolactice sau fermentii lactici falsi. In aceasta grupa sunt incluse bacteriile coliforme si unele bacterii anaerobe sporulate, cum sunt: Clostridium butyricum ,C tyrobutyricum, C.thermasaccharolyticum.

- bacteriile coliforme sunt reprezentate de speciile genurilor Escherichia, Enterobacter, Klebsiella fermenteaza lactoza cu producer de gaze.

- speciile de clostridia puternic zaharolitice cum sunt C.butyricum, C. tyrobutyricum si C. thermosaccharolyticum fermenteaza tumultos lactoza cu producer de gaze, acid acetic, acid butyric si butanol.

- bacteriile propionice sunt cuprinse in doua genuri: Propionibacterium cu specii care fermenteza substantele

hidrocarbonatesi descompun lactatii, producand acid propionic volatile, acid aceticsi CO2;

Eubacterium, cu specii care fermenteaza substantele hidrocarbonate so descompun lactatii, producand acid butiric volatile, acid acetic si

10

CO2.

B). Microorganisme care actioneaza puternic asupra proteinelor din lapte

Aceste microorganisme actioneaza in primul rand asupra cazeinei, cu ajutorul enzimelor, in mai multe faze. La inceput, cazeina e transformata in paracazeina, printr-o enzima bacteriana asemanatoare labfermentului; o alta enzima – cazeaza – asemanatoare tripsinei, descompune paracazeina in albumoze si peptone, iar o a treia enzima continua procesul degradare pana la aminoacizi, ammoniac, etc.

In aceasta mare grupa intra specii de microorganism din aproape toate diviziunile taxonomice: coci Gram pozitivi, bacilli Grem negative nesporogeni, bacilli Gram pozotivi sporogeni, aerobi sau anaerobi (Bacillus si Clostridium), actinomiceti, levuri si mucegaiuri.

Micrococii, S.fecelis, subsp. Liquefaciens, M. luteus si alti coci pot produce la inceput coagularea laptelui cu ajutorul unei enzyme asemanatoare reninei, apoi acidifiere urmata de proteoliza si aparitia gustului amar.

Bacili gram negative nesporogeni. In acesata mare grupa, cu semnificatie pentru microbiologia laptelui intalnim numeroase specii din genul Pseudomonas (Ps. fluorescenes, Ps. alcaligenes, Ps. syncyanea), Proteus (Pr. vulgaris), Serratia marcescens. Acestea bacterii sunt strict aerobe, sunt peptonizate si alcalinizate, transformarile suferite de lapte in urma actiunii lor netrecand prin fazele de acidifiere si coagulare.

Bacillaciae. Numerosi reprezentanti din acesta familie polueaza laptele materie prima, laptele pasteurizat, ca si diferipe produse lactate. Bacteriile din aceasta familie, fac parte din doua genuri: Bacillus si Clostridium. Numarul lor in laptele de consum, provenit din lapte crud obtinut in conditii igienice si dupa pasteurizare eficienta, are valori in jur de 1000 bacterii/ml lapte.

Speciile din genul Bacillus intalnite in laptele materie prima, in ordinea frecventei, sunt: B. subtilis, B. firmus, B. pumilus, B. cereus v. mycoides, B. circulans, B. macerans, etc. Aceste bacterii produc coagularea dulce (cazeoasa) a laptelui, fenomen intalnit la laptele pasteurizat in care nu mai exista microflora acidolactica, distrusa prin pasteurizare si deci, concurenta bacteriana pentru speciile de Bacillus a disparut. Coagul dulce este peptonizat in scurt timp, desfacandu-se intr-o masa lichida, cu reactie alcalina si o masa peptonizata de culoare galbena-cafenie, care contine cantitati insemnate de aminoacizi (tirozina, leucina), uree si saruri minerale.

Speciile din genul Clostridium, fiind microorganism telurice ca si cele din genul Bacillus, ajung in lapte in timpul mulgerii si manipularii, odata cu praful atmospheric, murdaria de pe corpul animalelor sau prin contactul cu vasele de muls, cu mainile operatorilor sau cu diferite ustensile neigienizate.

Speciile de Clostridium care pot polua laptele se pot divide in mai multe grupe:

a). Clostridii cu activitate zaharolitica puternica:C. butyricum

11

C. paraperfringensb). Clostridii cu activitate proteulitica puternica:

C. hystolyticumC. sporogenes

c). Clostridii cu activitate zaharolitica si proteolitica:C. perfringensC. acetobutyricumC.aurantibutyricumC. chauveiC. septicum

Clostridiile cu activitate zaharolitica puternica pot determina balonarea tarzie a branzeturilor, fenomen care are loc in conditiile in care activitatea bacteriilor acidolactice este deficitara. In asemenea conditii, clostridiile se pot dezvolta fara concurenta, fermenteaza cu producer de gaze lactoza nedescompusa de microflora lactica si determina balonarea.

Clostridiile sunt foarte raspandite in natura, gasindu-se in special in sol. Ele se intalnesc in lapte in tot cursul anului, dar sunt mai frecvente si mai numeroase in cel provenit de la animalele in stabulatie.

Alte microorganisme. S-a demostrat ca unii actinomiceti pot produce proteoliza cazeinei, alcalinizarea laptelui, ca si gustul amar: A. griseus, A. violaceus; de asemenea, anulite levuri si mucegaiuri, cum sunt unele specii din genurile Torula, Saccharomyces, Mucor, Aspergellius, Penicillium, Cladosporium, Oidium etc, pot actiona supra proteinelor din lapte.

C). Microorganisme care actioneaza asupra lipidelor din lapte

Microorganismele lipolitice care pot polua laptele apartin celor mai diverse grupe: Pseudomonas, Micrococcus, Staphylococcus, Serratia, Bacillus, Cladosporium, Penicillium, Oidium, etc.

Aceste microorganisme elaboreaza lipaze, care determina hidroliza grasimi, cu formare de acizi grasi si glicerina. Consecinta activitatii lipolitice a microorganismelor asupra laptelui si produselor lactate este aparitia diferitelor modificari de miros si de gust, din care mentionam pe cele de butiric, iute, intepator, picant si de ranced.

De mentionat ca numeroase microorganisme lipolitice care polueaza laptele sunt psihotrofe, dezvoltandu-se bine si actionand asupra lipidelor si cand produsele in care se afla se pastreaza la temperature joase.

III.3. Celule somatice din lapte

Un alt indicator al calităţii igienice a laptelui este reprezentat de numărul de celule somatice din lapte care ne dă indicaţii, în principal, asupra stării de sănătate al glandei mamare.

Numărul de celule somatice din lapte reprezintă un parametru important pentru calitatea igienică a acestuia. Pe de o parte, ne furnizează informaţii despre sănătatea mamelei, iar pe de altă parte, laptele cu un număr mare de celule somatice are un conţinut crescut de enzime proteolitice şi lipolitice care pot conduce la defecte de miros şi gust în brânza care se obţine din acest lapte.

12

În lapte sunt trei tipuri de celule: celule epiteliale; macrofage; leucocite polimorfonucleare.

Laptele provenit din glanda mamară sănătoasă conţine mai ales celule epiteliale şi macrofage; deci, laptele conţine un anumit număr de celule somatice, chiar dacă provine din glanda mamară sănătoasă.

În cazul în care apar afecţiuni ale glandei mamare numărul de celule somatice din lapte, creşte mai ales prin mărirea numărului de polimorfonucleare. Numărul total de celule somatice din lapte este cuprins între 50 000 şi 100 000 celule/ml, în cazul laptelui provenit din glanda mamară sănătoasă şi poate să ajungă la 5 – 7 milioane celule/ml în colostru, sau chiar 5 – 10 milioane în laptele provenit de la vaci cu infecţii ale glandei mamare. In cazul vacilor sănătoase, numărul de celule somatic este de cel mult 100 000 celule /ml lapte.

III.3.1 Studii privind citomorfologia laptelui in corelatie cu celulele somatice si relevanta pentru sanatatea si calitatea acestuia (conform tezei de doctorat a prof. univ. Dr. Ovidiu Rotaru si prof. univ Dr. Marian Mihaiu)

Nivelul celulelor din lapte este un indicator de calitate igienică, care oferă informatii asupra stării de sănătate a glandei mamare la nivel de individ sau de efectiv, numărul celulelor somatice din lapte impunându-se cu o largă recunoastere în normele C.E., ca indicator de apreciere a calitătii laptelui. De asemenea, numărul de celule somatice (SCC) este un indicator cantitativ al stării de sănătate a laptelui de vacă sau pentru gradele de iritare glandulară din glandele mamare bovine (Poutrele i Lerondelle, 1983; Park i Humphrey, 1986).

Cercetările din ultimii ani referitoare la calitatea igienică a laptelui, au proliferat mai ales în domeniul monitorizării numărului de celule din lapte, stabilindu-se grile de calitate pentru laptele de consum în functie de numărul de celule pe mililitru. Aceste cercetări au influentat deciziile factorilor economici din domeniul prelucrării si valorificării laptelui, astfel încât regulamentele Comunitătii Europene elaborate după aprilie 2004 (Reg. CE 853/2004), au ajuns să interzică colectarea laptelui de vacă care depăseste 400.000 de celule/ml.

În cazul probelor care depăsesc această valoare, indiferent dacă laptele prezintă sau nu, modificări senzoriale sau biochimice, laptele este considerat neconform fiind valorificat numai pentru piata internă a României (până la sfârsitului anului 2011), nefiind admis pentru valorificare pe piata comunitară.

Trebuie totusi atrasa atentia asupra faptului că o conduită corectă în activitatea de supraveghere si diagnostic asupra calitătii igienice a laptelui trebuie să se sprijine pe un examen complex al produsului, în care investigatiile morfologice ale populatiei celulare, examinate prin lactocitogramă, nu trebuie în nici un caz neglijate.

În contextul argumentatiei de mai sus, în prezenta cercetare s-a propus realizarea unui studiu care să determină nivelul celulelor somatice, corelat cu examenul cito-morfologic în vederea supravegherii calitătii igienice a laptelui de vacă. Obiectivele majore urmărite în aceasta cercetare sunt următoarele:

evaluarea nivelului celular somatic din lapte la exploatatii de vaci destinate

13

productiei de lapte; dinamica citomorfologiei populatiei celulare din lapte în functie de stadiul

si numărul de lactatii; studiul citomorfologic al laptelui corelat cu numărul de celule somatice si

relevanta pentru calitatea si sănătatea igienică a acestuia. Prin analiza obiectivă a rezultatelor obtinute în urma cercetărilor, s-a permis

conturarea concluziilor finale si elaborarea recomandărilor, cu scopul aducerii unor contributii la îmbunătătirea metodelor de laborator în vederea supravegherii sănătătii glandei mamare si implicit a laptelui destinat consumului public, în vederea obtinerii unor produse lactate de o calitate igienică crescută, sigure pentru consumatori.

Numărul total de germeni existenti în lapte nu trebuie să depăsească 100.000 de germeni/ml, iar numărul de celule somatice trebuie să fie sub 400.000 de celule/ml. Pentru a se alinia la standardele de calitate UE, tara noastră trebuie sa indeplineasca toate criteriile de calitate UE pentru materia prima – laptele – pe tot parcusul procesului de productie, sa se asigure ca toate materiile prime sunt conforme, sa respecte in totalitate legislatia în vigoare, si să se asigure ca produsele finite sunt sigure pentru consum uman.

Acest proces începe de la ferma care oferă laptele, ce trebuie si ea să respecte standarde de calitate stricte, si culminează cu produsele finite care ajung la consumatori (lapte si produse lactate).

Piata de lactate din Romania nu este incă aliniată 100% la standardele europene de calitate, deoarece procesul este complex si de lungă durată, solicitănd investitii si eforturi mari din partea fermierilor si a producătorilor de lactate.

Având în vedere aceste considerente, în prima etapă a cercetării s-a încercat să se efectueze o evaluare a nivelul celular individual din lapte provenit din ferme cu vaci aflate în diferite stadii de lactatie, din judetul Covasna, având ca si obiective specifice:

- determinarea numărului de celule somatice la loturile de vaci de lapte luate în studiu în perioada 2008-2009;

- evaluarea în dinamică a numărului de celule somatice în functie de stadiul si numărul de lactatii.

- distributia numărului de celule somatice în functie de satdiul si numărul de lactatii.

Materialul supus cercetării a fost reprezentat de 1200 probe individuale de lapte, recoltate în intervalul ianuarie 2008 – decembrie 2009 din ferme de vaci cu lapte localizate pe raza judetului Covasna. Probele au fost prelevate pe loturi, luându-se în studiu 6 loturi de animale omogene, a câte 10 vaci, fiecare lot aflându-se în stadii diferite ale lactatie, cu vârste cuprinse între 3-9 ani, după cum urmează:

o lotul I – 10 vaci de lapte aflate în lactatia I; o lotul II – 10 vaci de lapte aflate în lactatia II; o lotul III – 10 vaci de lapte aflate în lactatia III; o lotul IV – 10 vaci de lapte aflate în lactatia IV; o lotul V – 10 vaci de lapte aflate în lactatia V; o lotul VI – 10 vaci de lapte aflate în lactatia VI.

Pentru evaluarea numărului de celule somatice au fost prelevate în intervalul ianuarie-octombrie 600 probe anual, cu respectarea normelor prevăzute de legislatia în vigoare, (SR EN ISO 13366-1/2008; SR ISO 13366-3/2001). Recoltarea probelor a fost

14

precedată de pregătirea glandei mamare prin spălare cu apă caldă si săpun, urmată de dezinfectarea acestuia, mulgerea separată a primelor jeturi de lapte în vederea evitării răspândirii agentilor patogeni. Sa se mentioneze că în fermele din care s-au prelevat probele, mulsul a fost efectuat mecanic, în sala de muls, urmat de răcirea imediată a laptelui la temperatura de 2-4°C.

După recoltare, probele au fost identificate după numărul matricol al animalului, fiind transportate în flacoane sterile de 100 ml, uscate la temperatura de 4-6ºC în cadrul Laboratorului DSVSA Covasna, unde au fost prelucrate.

Dinamica si nivelul individual al numărului de celule pentru fiecare individ monitorizat s-au coroborat cu rezultatele cercetărilor citomorfologice ale celulelor obtinute prin lactocentrifugare pe probe individuale de lapte. Numărul de celule somatice din probele de lapte a fost analizat prin prezentare grafică si interpretare individuală.

În vederea obtinerii unor rezultate care să reflecte cât mai fidel nivelul de celule somatice din probele de lapte prelevate de la vacile aflate în diferite perioade de lactatie, intrerpretarea rezultatelor s-a efectuat prin determinarea mediilor lunare, exprimate în functie de deviatia standard (10 probe/lună).

III.3.1.1. Determinarea numărului de celule somatice la loturile de vaci luate în anul 2008

În intervalul de timp luat în studiu, au fost examinate conform protocolului descris anterior un număr anual de 600 de probe lapte crud de vacă destinat procesării, câte 10 probe pentru fiecare lună, din ianuari-octombrie. Din analiza datelor obtinute se poate constata că valorile obtinute se încadrează în categorie lapte conform, în procent de 99%, o probă depăsind valoare maximă de 400.000 cel/ml în cursul lunii martie.

În cadrul lotului 2, lactatia 2, numărul celulelor somatice din laptele de vacă a fost cuprins între 12.000 cel/ml în luna octombrie si 576.000 cel/ml în aceeasi lună. Din analiza rezultatelor individuale obtinute s-a putut aprecia că din totalul probelor prelevate, 89% au fost reprezentate de probe conforme, iar 11% s-au încadrat în categoria lapte neconform standardelor EU.

În cadrul lotului 3, lactatia 3, numărul celulelor somatice din laptele de vacă a fost cuprins între 15.000 cel/ml în luna octombrie si 479.000 cel/ml în aceeasi lună. Din analiza rezultatelor individuale obtinute s-a putut aprecia că din totalul probelor prelevate, 90% au fost reprezentate de probe conforme, iar 10% s-au încadrat în categoria lapte neconform standardelor EU.

În cadrul lotului 4, lactatia 4, numărul celulelor somatice din laptele de vacă a fost cuprins între 37.000 cel/ml în luna martie si 467.000 cel/ml în aceeasi lună. Din analiza rezultatelor individuale obtinute s-a putut aprecia că din totalul probelor prelevate, 96% au fost reprezentate de probe conforme, iar 4% s-au încadrat în categoria lapte neconform standardelor EU.

În cadrul lotului 6, lactatia 6, numărul celulelor somatice din laptele de vacă a fost cuprins între 267.000 cel/ml în luna aprilie si 3.114.200 în luna iunie. Din analiza rezultatelor individuale obtinute s-a putut aprecia că din totalul probelor prelevate, 55% au fost reprezentate de probe conforme, iar 45% s-au încadrat în categoria lapte neconform standardelor EU.

15

III.3.1.2. Determinarea numărului de celule somatice la loturile de vaci luate în anul 2009

Din analiza rezultatele individuale obtinute pentru parametrul NCS la lotul nr. I se poate constata că valorile obtinute se încadrează în categorie lapte conform, în procent de 96%, 4 probe depăsind valoare maximă de 400.00 cel/ml în cursul lunilor iunie-ocombrie.

În urma prelucrării statistice a valorilor individuale ale NCS ale probelor de lapte prelevate de la lotul I, s-a constat că cea mai scăzută valoare medie a fost obtinută în cursul lunii ianuarie, de 28000 ± 14445 cel/ml, iar cea mai crescută a fost evidentiată în cursul lunii octombrie, respectiv 209000 ± 285383 cel/ml.

În cadrul lotului 2, lactatia 2, numărul celulelor somatice din laptele de vacă a fost cuprins între 7.000 cel/ml în luna mai si 1.111.600 cel/ml în luna septembrie . Din analiza rezultatelor individuale obtinute s-a putut aprecia că din totalul probelor prelevate, 88% au fost reprezentate de probe conforme, iar 12% s-au încadrat în categoria lapte neconform standardelor EU.

În cadrul lotului 3, lactatia 3, numărul celulelor somatice din laptele de vacă a fost cuprins între 97.000 cel/ml în luna iulie si 2.456.000 cel/ml în luna octombrie. Din analiza rezultatelor individuale obtinute s-a putut aprecia că din totalul probelor prelevate, 73% au fost reprezentate de probe conforme, iar 27% s-au încadrat în categoria lapte neconform standardelor EU.

În cadrul lotului 4, lactatia 4, numărul celulelor somatice din laptele de vacă a fost cuprins între 212.000 cel/ml în luna aprilie si 3.173.000 cel/ml în luna octombrie (tab. 18). Din analiza rezultatelor individuale obtinute s-a putut aprecia că din totalul probelor prelevate, 69% au fost reprezentate de probe conforme, iar 31% s-au încadrat în categoria lapte neconform standardelor EU.

În cadrul lotului 5, lactatia 5, numărul celulelor somatice din laptele de vacă a fost cuprins între 328.000 cel/ml în luna martie si 3.173.000 cel/ml în luna octombrie. Din analiza rezultatelor individuale obtinute s-a putut aprecia că din totalul probelor prelevate, 61% au fost reprezentate de probe conforme, iar 39% s-au încadrat în categoria lapte neconform standardelor EU.

În cadrul lotului 6, lactatia 6, numărul celulelor somatice din laptele de vacă a fost cuprins între 194.000 cel/ml în luna iunie si 5.141.000 în luna octombrie. Din analiza rezultatelor individuale obtinute s-a putut aprecia că din totalul probelor prelevate, 42% au fost reprezentate de probe conforme, restul încadrându-se în categoria lapte neconform standardelor EU.

III.3.1.3. Evaluarea în dinamică a numărului de celule somatice în functie de stadiul si numărul de lactatii

Studiul a fost efectuat pe un număr de 6 loturi vaci de lapte, aflate în diferite stadii de lactatie, de la I la VI, prelevând 1200 probe individuale în intervalul ianuarie – octombrie, în perioada 2008-2009. În vederea aprecierii în dinamică a evolutiei NCS, rezultatele s-au exprimat ca mediile pentru fiecare lactatie pentru cei doi ani luati în

16

studiu.În urma prelucrării statistice a valorilor medii lunare a NCS pentru fiecare lactatie

în parte a anului 2008, s-a constatat că cele mai scăzute valori medii ale numărului lui de celule somatice s-au obtinut în cazul probelor prelevate de la vacile aflate în prima lactatie, respectiv 46.830±16752 cel/ml, iar cele mai crescute s-au evidentiat în lactatia a 6-a, cu o valoare medie de 441.830±84579 cel/ml. Astfel, s-a observat o crestere progresivă a mediei geometrice a numărului de celule de la prima lactatie (140.000 celule/ml) la a cincea lactatie (600.000 celule/ ml).

În ceea ce priveste evolutia în dinamică a parametrului NCS, s-a constatat că acesta prezintă o crestere uniformă, începând cu lactatia I, până la lactatia VI-a. S-a observat că valorile medii ale NCS se încadrează în limita maximă de 400.000 cel/ml pentru laptele conform doar în cazul primelor 5 lactatii, ceea de sugerează că pentru valorificarea în consum a laptelui conform, fermierii ar trebui să folosească vaci de lapte până la lactatia V-a.

Rezultatele valorilor medii ale NCS pentru fiecare lactatie a anului 2009 prezintă valori mai crescute, cuprinse între 119.490±65907 cel/ml în lactatia I si 752.040±457909 cel/ml în lactatia a 6-a. Aceste valori sunt datorate în mare parte existentei în cadrul vacilor de lapte a proceselor inflamatorii acute la un număr mare de animale, cu precădere în cazul loturilor 4, 5 si 6 care au influenţat atât nivelul celular somatic mediu lunar, respectiv al lactaţiei, precum şi valoarea coeficientului de variaţie.

Evoluţia în dinamică a parametrului NCS pentru cele 6 lactaţii în perioada 2009, a prezentat o creştere uniformă, începând cu lactaţia I, până la lactaţia IV-a, urmată de o uşoară scădere în lactaţia a V-a, şi apoi o creştere accentuată în lactaţia VI-a. (fig. 32). Se poate observa în graficul din fig. 32 că valorile medii ale NCS se încadrează în limita maximă de 400.000 cel/ml pentru laptele conform doar în cazul primelor 2 lactaţii, spre deosebire de rezultatele obţinute în anul 2008.

III.3.1.4. Distribuţia NCS în funcţie de stadiul şi numărul de lactaţii

În privinţa distribuţiei NCS în funcţie de stadiul şi numărul de lactaţii s-a constatat că 99% din vacile aflate la prima lactaţie în anul 2008 se încadrează în categoria cu până la200.000 cel/ml lapte, şi doar 1% s-au încadrat în clasa II-a de calitate.

Pe parcursul vieţii productive procentul vacilor aflate în clasa I de calitate prezintă o reală tendinţă de scădere astfel că numai 51% din vacile aflate în lactaţia a II-a se mai încadrează în grupa mai sus menţionată. În acealşi timp creşte proporţional numărul vacilor de lapte aflate în categoria II-a, la 40%, respectiv în a III-a la 9%, care corespunde laptelui neconform, provenit de la cu vaci cu mamită cronică. Se poate observa că în categoria IV, nu s-a încadrat nici una din probele analizate.

În ceea ce priveşte rezultatele obţinute pentru vacile din lactaţia III-a, s-a constatat o scădere a numărului de vaci aflate în categoria I la 1.1%, o creştere a celor aflate în categoria II la 83.52%, respectiv a III-a, la 15.38%. Nici în acest lot nu s-au încadrat animale în categoria IV-a.

La vacile aflate în lactaţia IV s-a constatat o distribuţie a NCS oarecum asemănătoare cu cea anterioară, respectiv creşterea procentului de vaci aflate în categoria II-a la 95%, respectiv scăderea la 4% a celor aflate în categoria III, de lapte neconform, provenit de la vaci cu mamită cronică.

17

Pentru vacile aflate în lactaţia V s-a constatat o distribuţie a NCS oarecum asemănătoare cu cea anterioară, respectiv scăderea procentului de vaci aflate în categoria II-a la 91%, respectiv creşterea la 5% a celor aflate în categoria III, de lapte neconform, provenit de la vaci cu mamită cronică, fără a se evidenţia valori ale NCS încadrate în categoria IV-a de calitate.

În cazul vacilor aflate în lactaţia VI s-a constatat o distribuţie a NCS diferită de cele din lactaţiile III-V, caracterizată de o scădere a ponderii NCS din categoria II-a de calitate

la 54% şi o valorile NCS încadrate în categoria III-a, lapte neconform, la 45%, ceea ce denotă o pondere crescută a mamitelor subclinice în cazul vacilor din lotul nr. VI.

III.3.1.5. Rezultate şi discuţii privind evaluarea în dinamică a citomorfologiei populatiei celulare din lapte in functie de stadiul şi numărul de lactaţii

Obiectivele urmărite au fost reprezentate de:− evaluarea configuraţiei populaţiei celulare din laptele de vacă şi eventual a

tipului de mamită;− evaluarea în dinamică a populaţiei celulare din laptele de vacă în funcţie de

stadiul şi numărul de lactaţii;− aprecierea citomorfologiei populaţiei celulare din lapte din preparate native,

folosind metode de coloraţii vitale.În vederea evaluării configuraţiei populaţiei celulare din probele de lapte s-au

efectuat frotiuri colorate prin metoda May Grunwald Giemsa şi cu albastru de metilen. Pentru realizarea acestui obiectiv, au fost prelucrate 60 de probe individuale de lapte, în anul 2010, de la cele 6 loturi de animale, de la care iniţial s-a determinat numărul de celule somatice, prin realizarealactocitogramei.

III.3.1.6. Evaluarea configuraţiei populaţiei celulare din laptele de vacă

În ceea ce priveşte rezultatele obţinute în urma studiului nostru trebuie să precizăm că cele 60 probe de lapte (cazurile) examinate au avut însuşiri senzoriale şi fizico- chimice, caracteristice pentru laptele fără modificări senzoriale, de lapte normal, sănătos, care se admite în consum fără restricţie, sub rezerva tratamentului termic (pasteurizare, fierbere), înainte de a fi consumat.

Pe baza examenului citomorfologic s-a stabilit că cele 60 de probe analizate se clasifică din punct de vedere al calităţii igienice în următoarele categorii:

- lapte provenit de la vaci cu afecţiuni inflamatorii exsudative (mamită acute) la nivelul glandei mamare, exprimate clinic;

- lapte provenit de la vaci sănătoase, care prezintă procese inflamatorii exsudative la nivelul glandei mamare neexprimate clinic (mamite cronice);

- lapte provenit de la vaci clinic sănătoase, fără procese inflamatorii ale glandei mamare, dar intens poluat microbiologic;

- lapte provenit de la vaci clinic sănătoase, fără procese inflamatorii ale glandei mamare, obţinut şi valorificat în condiţii igienice.

Argumentele citomorfologice care au permis identificarea celor patru categorii de lapte menţionate, au fost următoarele:

Laptele mastitic a format după centrifugare un sediment mai abundent, vâscos, cu

18

aspect filant, aspect evidenţiat mai ales la obţinerea frotiului prin disociere cu ansa. Examenul citologic constată un frotiu mai încărcat cu celule în care predomină polimorfonucleare şi prezenţa de microparticule de exudat purulent. Aceste structuri pe care le considerăm caracteristice, sunt grupuri de polimorfonucleare neutrofile, monocite macrofage, celule somatice (epiteliale) şi microbi, totul consolidat de exudat fibrinos în cantitate variabilă, prezentate în imaginile anterioare.

În citoplasma multor polimorfonucleare şi macrofage sunt prezenţi microbi fagocitaţi, uşurând astfel stabilirea şi a unui diagnostic etiologic al procesului inflamator. Alături de polimorfonucleare neutrofile aflate în faze diferite de necrobioză, ca dominantă citologică, se poate menţiona la aceste cazuri şi prezenţa monocitelor hiperactivate.

Lapte provenit de la vaci clinic sănătoase, fără procese inflamatorii ale glandei mamare, dar intens poluat microbiologic a format o cantitatea de sediment nesemnificativă iar la etalare, acesta s-a dispersat uniform.

Examenul citologic a constatat o prezenţă redusă de celule reprezentate în principal de monocite macrofage activate, dar erau prezenţi în schimb grupuri masive de bacterii şi chiar levuri şi miceţi. Multe din monocitele macrofage au citoplasma saturată de microbi fagocitaţi şi de asemeni, în jurul acestor celule concentrarea de bacterii este mai intensă.

În cazul laptelui sănătos şi procesat în condiţii igienice lactosedimentul a fost în cantităţi foarte reduse, uneori abia vizibil, care s-a etalat cu uşurinţă dând un frotiu omogen, fără aglomerări şi precipitate. La examenul citologic, frotiul conţine celule dispersate, rar în grupuri de 2-3 elemente, reprezentate în ordine, de monocite macrofage activate, polimorfonucleare forme bătrâne sau în diferite faze de apoptoză, celule mamareîn apoptoză, limfocite, chiar euzinofile şi mici grupuri de microorganism (streptococci, bacilli lactici).

În ce priveşte laptele obţinut de la vaci cu procese inflamatorii ale glandei mamare neexprimate clinic, citosedimentul obţinut a fost semnificativ crescut ca şi în cazul mamitelor acute, de consistenţă cremoasă, dând un frotiu bogat cu aspect omogen.

Examenul citologic a evidenţiat un număr mare şi foarte mare de celule pe frotiu, distribuite uniform. În populaţia de celule domină în ordine descrescătoare celulele mamare mai ales cele din acini, urmează monocitele macrofage, limfocitele şi rare polimorfonucleare.

Pe baza interpretării rezultatelor examenului citologic la cele 60 probe prelucrate în anul 2010, s-a constatat că 16.7% din probe au provenit de la vaci cu mamite acute,26.76% au provenit de la vaci cu mamite cronice, 20% au fost reprezentat de lapte poluat microbiologic, dar fără afecţiuni inflamatorii ale glandei mamare şi 36.7% au reprezentat probele de lapte sănătos, provenite de la vaci fără afecţiuni ale glandei mamare, obţinut în condiţii igienice.

III.3.1.7. Evaluarea în dinamică a populaţiei celulare din laptele de vacă în funcţie de stadiul şi numărul de lactaţii

Din analiza rezultatelor examenului citomorfologic, s-a constatat că în dinamică, pe durata celor 6 lactaţii, configuraţiei celulelor somatice la vacile sănătoase, fără afecţiuni inflamatorii ale glandei mamare, a prezentat variaţii în funcţie de tipul de celule, precum şi de perioada şi numărul de lactaţii. Astfel, s-a constatatat că macrofagele şi celulele epiteliale au prezentat o creştere uniformă, de la lactaţia I spre lactaţia VI, în timp

19

ce polimorfonuclearele au prezentat o evoluţie dependentă în principal de prezenţa proceselor inflamatorii ale glandei mamare. De asemenea, s-a evidenţiat o creştere a macrofagelor şi polimorfonuclearelor spre sfârşitul perioadei de lactaţie.

Având în vedere că de configuraţia populaţiei celulare din lapte este dependentă calitatea igienică a acestuia, s-a pus în evidenţă o descreştere semnificativă a sănătăţii laptelui odată cu creşterea numărului de lactaţii. Astfel, procentul de probe de lapte sănătos prezintă un trend descrescător, de la 40% în lactaţia I, la 30% în lactaţiile a V-a, respective a VI-a. În ceea ce priveşte laptele mamitic se constată o creştere procentualăsemnificativă, de la 10% în lactaţia I la 40% în lactaţia VI-a (mamite acute), respectiv70% în cazul laptelui provenit de la vaci cu mamite cornice.

III.3.1.8. Aprecierea citomorfologiei populaţiei celulare din lapte folosind metoda coloraţiei vitale

Metoda coloraţiei vitale prezintă câteva avantaje comparativ cu metoda clasică de examinare citologică a celulelor din lapte: dotări minime, timp mai redus pentru realizarea preparatelor citologice, fără a fi afectată posibilitatea de identificare a tipurilor de celule, posibilitatea de examina celule viabile.

Pe lângă identificarea aspectelor citomorfologice ale populaţie celulare din lapte, am urmărit şi identificarea unui protocol privind coloraţia vitală, care să evidenţieze cel mai fidel caracteristicile morfologice şi funcţionale ale celulelor somatice din laptele crud de vacă. In urma cercetărilor efectuate, pe baza efectuării examenelor native, cele mai bune rezultate le-am obţinut folosind soluţia de albastru de toluidin 1%, lasată în contact cu proba de lapte pentru 30 min. la 37°C. Deşi rezultatele obţinute sunt comparabile cu cele obţinute prin metoda May Grunwald Giemsa, metoda nu este încă utilizată curent în laboratoarele de evaluarea a calităţii igienice a laptelui.

III.3.1.9. Rezultate şi discuţii privind studiul citomorfologic al laptelui corelat cu numarul de celule somatice si relevanta pentru calitatea şi sănătatea igienică a acestuia

Cercetările citomorfologice ale lactocitogramelor realizate la cele 60 de probe au demonstrat însă că doar 33.4% probe au prezentat argumente citomorfologice incontestabile că la nivelul glandei mamare de la care s-a prelevat probele de lapte evoluează un proces inflamator exudativ fibrino-leucocitar (purulent) acut sau/şi cronic. Restul lactocitogramelor au arătat că numărul de celule a fost crescut mai mult sau mai puţin semnificativ pe baza creşterii numerice a celulelor somatice aflate în apoptoză şi/sau necrobioză, stadii în care procesul de cariorexă a fost evident şi semnificativ demonstrat de aspectele citomorfologice ale lactocitogramelor.

Coroborând rezultatele determinării numărului total de celule din probele de lapte cu cele ale examenului citologic (analiza lactocitogramei), am constatat că în cazul a 8dintre probele analizate, respectiv 13.33%, au existat corelaţii negative (p<0.05). Astfel din cele 16 probe, încadrate în categoria lapte poluat microbiologic, dar fără afecţiuni ale glandei mamare, la 3 probe, determinarea NTC a relevat depăsirea limitei de 400.000 cel/ml. Similar, în cazul celor 22 probe de lapte sănătos, au existat 5 probe, la care NCS a prezentat depăşiri ale limitei maxime admise pentru laptele conform.

20

III.3.1.10. Concluzii generale şi recomandări

Obiectivele luate în studiu au avut scopul de a evidenţia şi evalua în dinamică nivelul celular somatic, obţinut prin metode validate şi automatizate, corelat cu examenul citomorfologic (lactocitograma) pentru laptele crud materie primă destinat procesării în vederea optimizării modalităţilor de supraveghere a calităţii laptelui. Realizarea cu succes a obiectivelor propuse ne-au permis formularea următoarelor concluzii:

1. evoluţia în dinamică a parametrului NCS a prezentat o creştere uniformă, începând cu lactaţia I, până la lactaţia VI-a, valorile medii ale NCS încadrându-se în limita maximă de 400.000 cel/ml pentru laptele conform doar în cazul primelor 5 lactaţii, a anului 2008.

2. din totalul probelor de lapte individuale prelucrate în cursul anului 2009, un număr de 171, respectiv 28.5% au reprezintat probe de lapte neconform cu standardele EU;

3. evoluţia în dinamică a parametrului NCS pentru cele 6 lactaţii în perioada 2008, a prezentat o creştere uniformă, începând cu lactaţia I, până în lactaţia VI-a, valorile medii ale NCS încadrându-se în categoria lapte conform doar în cazul primelor 2 lactaţii, spre deosebire de rezultatele obţinute în anul 2008.

4. pe parcursul vieţii productive s-a observat că procentul probelor de lapte încadrate în clasa I (<200.000 cel/ml) şi a II-a (200.001-400.000 cel/ml) de calitate prezintă o reală tendinţă de scădere, asociată cu o creştere semnificativă a celor din clasa III-a (sub 1.000.000 cel/ml) şi a IV-a (peste 1.000.000 cel/ml) de calitate;

5. cea mai mare influenţă asupra populaţiei celulare din laptele de amestec o are laptele provenit de la vacile cu mamite cronice, datorită faptului că acesta nu prezintă modificări senzoriale, respectiv cel provenit de la vacile aflate în lactaţii

avansate (> 5), când numărul de celule somatice prezintă valori mai mari decât limita maximă stabilită de legislaţia în vigoare;

6. studiul citomorfologic realizat pe 60 probe de lapte prospăt de vacă, a demonstrat posibilitatea de a identifica cu multă precizie starea de sănătate (calitatea igienă) a produsului destinat pentru consumul public;

7. examenul citomorfologic reuşeşte să diferenţieze în proporţie de 80 % originea celulelor mai ales în cazul în care la nivelul mamelei evoluează un proces inflamator cronic sau acut;

8. configuraţia populaţiei celulare din laptele de vacă a fost reprezentată de pe de o parte de celule de filtraţie, reprezentate de polimorfonucleare, limfocite, monocitemacrofage în diferite stadii de activare, precum şi de celule somatice, respective celule epiteliale;

9. în cazul laptelui provenit de la vaci cu mamită acută, examenul citologic a evidenţiat predominarea polimorfonuclearelor (48-78%), monocitelor macrofage (41-48%), a limfocitelor (2-12%) şi a celulelor somatice (2-13%);

10. în cazul laptelui provenit de la vaci cu mamită cronică, examenul citologic a evidenţiat predominarea monocitelor macrofage (48-88%), polimorfonuclearelor, (25-41%), a limfocitelor (2-9%) şi a celulelor somatice (2-11%);

11. pentru lapte poluat microbiologic, examenul citologic a constatat o prezenţă redusă de celule reprezentate în principal de monocite macrofage activate (32-38%), şi numeroase microorganisme;

12. starea de apoptoză-necrobioză în care ajung la un moment dat celulele somatice şi unele celule de filtraţie fac imposibilă diferenţierea în cazul în care la nivelul mamelei

21

creşterea NCS are alte cauze decât cele inflamatorii;13. studiul citomorfologic al lactocitogramelor a demonstrat că atât în cazul

mamitelor dar şi în laptele sănătos, celula cu cea mai semnificativă individualitate morfologică s-a dovedit a fi monocitul macrofag;

14. în cazul laptelui sănătos şi procesat în condiţii igienice, examenul citologic, a evidenţiat o prezenţă redusă a celulelor, reprezentate de monocite macrofage (31-38%), polimorfonucleare forme bătrâne sau în diferite faze de apoptoză (21-28%, celule epiteliale în apoptoză (17-23%), limfocite (17-22%);

15. examenul citomorfologic pe frotiuri, realizate din lactosediment, prelucrate printr- o metodă citologică simplă (coloraţia May Grünwald Giemsa) reuşeşte să identifice cu certitudine, cel puţin patru categorii de lapte: lapte mastitic (acut/cronic), lapte contaminat (poluat) microbiologic, lapte curat obţinut în condiţii igienice;

16. utilizarea coloraţiei vitale, pentru aprecierea calităţii igienice a laptelui, a evidenţiat prezenţa diferitelor categorii de celule din lapte, făcând posibil diferenţierea laptelui provenit de la vaci sănătoase de cel de la vaci cu afecţiuni ale glandei mamare;

17. cele mai bune rezultate s-au obţinut folosind soluţia de albastru de toluidin 1%, lasată în contact cu proba de lapte pentru 30 min. la 37°C.

18. calitatea igienică a laptelui prezintă în dinamică o evoluţie descendentă, odată cu creşterea numărului de lactaţii;

În urma studiului s-au desprins următoarele recomandări, în vederea îmbunătăţirii calităţii laptelui:

monitorizarea periodică a stării de sănătate a glandei mamare, prin efectuarea examenelor clinice de către medicul veterinar;

monitorizarea periodică a calităţii igienice a laptelui prin determinarea NCS nu numai pentru laptele de amestec, ci şi pe probe individuale;

utilizarea coloraţiei vitale folosind soluţia de albastru de toluidin 1%, ca metodă rapidă de diagnostic al afecţiunilor inflamatorii ale glandei mamare;

exploatarea pentru producţia de lapte a vacilor pentru cel mult 4-5 lactaţii, având în vedere valorile crescute ale NCS din lactaţia a IV-a, în vederea valorificării pe piaţă a laptelui de calitate igienică corespunzătoare;

respectarea cu stricteţe a bunelor practici de lucru şi de igienă în ceea ce priveşte mulgerea vacilor: modul de utilizare a aparatelor de muls, efectuarea masajului glandei mamare, în vederea reducerii la minim a traumatismelor ugerului, care se repercutează prin creştere NCS. termenul de celule somatice din lapte ca şi sintagma număr de celule somatice NCS ar trebui înlocuit cu NTC – număr total de celule din lapte deoarece lactocitograma evidenţiază că în lapte se găsesc două tipuri de celule cu origine diferită : celule cu origine mamară (somatice) şi celule de filtraţie reprezentate de leucocite.

22

CAPITOLUL IV

IV. Principalele masuri pentru prevenirea contaminarii laptelui cu microorganisme

Este necesar ca inaintea cu 20-30 minute de muls sau in timpul mulsului sa nu se administreze animalelor furaje care produc praf si sa nu se efectueze curatirea adapostului sau primenirea asternului. Inainte de muls, animalele se supun curateniei corporale, coada se leaga de picior, ugerul se spala cu apa calda si sapun si se sterge cu un prosop curat. Mulgatorul isi va spala mainile cu apa calda si sapun si va imbraca echipament de protective curat.

Utilajele folosite la muls trebuie sa fie din metal inoxidabil sau emailate, spalate in prealabil cu apa fierbinte, cu detergent si dezinfectate cu soda calcinata 2%, apoi clatite cu apa potabila. La aceste operatiuni sunt supuse si instalatiile de muls mecanic, inclusive conductele prin care circula laptele. Primele jeturi de lapte se recolteaza intr-un vas separat, fiind interzisa folosirea acestui lapte pentru consum uman.

Cantitatea si calitatea florei microbiene din lapte depinde si de temperatura si de durata de conservare a laptelui. Perioada de oprire a multiplicarii germenilor, in primele ore dupa muls poate fi influentata in mod pozitiv. Cu cat laptele este racit mai repede dupa muls si pastrat la o temperatura mai joasa, cu atat aceasta perioada bactericida este mai lunga.

De aceea, este necesar ca mulgerea laptelui sa aiba loc in conditii cat mai igienice, iar racirea si pastrarea sa se faca la o temperatura cat mai scazuta, pentru a ridica durata de conservare a produsului.

Dupa muls, laptele va fi scos din adapostul animalelor si dus la laptaria fermei sau la camera de lapte. Bidoanele nu vor fi acoperite imediat cu capace, ci numai cu tifon curat, pentru a se asigura aerisirea laptelui.

Apoi laptele va fi strecurat prin sita metalica, prevazuta cu tifon in 4 straturi sau rondele de vata presata. Utilajele folosite la filtrare vor fi spalate si oparite dupa fiecare utilizare.

Racirea sa va face imediat, fie introducand bidoanele in bazine cu apa curenta rece, fie cu instalatii speciale de racire. Laptele crud integral se poate livra numai la temperaturi sub 14°C.

Pentru transportul laptelui catre unitatile de prelucrare se vor folosi cisterne speciale cu inscriptie vizibila (“Lapte”), care trebuie sa indeplineasca toate conditiile tehnice si igienice impuse de normele oficiale.

Spatiile in care se obtin, se colecteaza, se prelucreaza sau se desfac laptele si produsele lactate trebuie sa corespunda normeleor igienico-sanitare de constructive, organizare, dotare, amplasare si functionare.

Persoanele folosite la muls sau manipulare trebuie sa fie sanatoase, supuse examenelor sanitare periodice obligatorii si sa respecte normele de igiene personala.

Producatorii individuali sunt obligati sa posede carnete de sanatate pentru animalele de la care provine laptele, vizate trimestrial de medicul veterinar din teritoriul de origine.

23

BIBLIOGRAFIE

1. Apostu, S. – “Managementul calitatii alimentelor”, Editura Risoprint, Cluj-Napoca, 2004;

2. Apostu, S., Stanescu, V. – “Igiena, inspectia si siguranta alimentelor de origine animala”, Volumul I, Editura Risoprint, Cluj-Napoca, 2010;

3. Barzoi, D. – “Microboilogia produselor alimentare”, Editura Ceres, Bucuresti, 1985;

4. Banu, C. – “Calitatea si analiza senzoriala a produselor alimentare”, Editura Agir, Bucuresti, 2007;

5. Savu, C., Georgescu, N. – “Siguranta alimentelor - riscuri si beneficii”, Editura Semne, Bucuresti, 2004;

6. Rotaru, O., Mihaiu, M. – rezumat al tezei de doctorat: “Studii privind citomorfolofia laptelui in corelatie cu numarul de celule somatice si relevanta pentru sanatatea si calitatea igienica”, Universitatea de Stiinte Agricole si Medicina Veterinara, Facultatea de Medicina Veterinara, Cluj-Napoca, 2011;

7. Regulamentul CE Nr. 853/2004 al Parlamentului European si al Consiliului European din 29 aprilie 2004 – “Stabilirea normelor de igiena care se aplica alimentelor de origine animala”.

24

25

26

27

28