projecto 2
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ENVOLVIMENTO DA SINTETASE DO MONÓXIDO DE
AZOTO NA CONTRACTILIDADE DO CANAL
DEFERENTE DE ROEDORES E MECANISMOS
ENVOLVIDOS.
ESTUDO COMPARATIVO EM RATO E RATINHO.
Marco Pinto-Filipe, Rui Pinto, Beatriz Silva-Lima
Unidade de Farmacologia e Farmacotoxicologia
Faculdade de Farmácia – Universidade de Lisboa
Av. das Forças Armadas ~ P-1649-019 Lisboa ~ Portugal
Lisboa, 2 de Abril de 2004
Projecto 3.3.1.03/04-1 (Disciplina de Projecto I)
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ENVOLVIMENTO DA SINTETASE DO MONÓXIDO DE AZOTO NA CONTRACTILIDADE DO CANAL DEFERENTE DE
ROEDORES E MECANISMOS ENVOLVIDOS.
ESTUDO COMPARATIVO EM RATO E RATINHO.
Abstract: We have previously observed that the Nitric Oxide Synthase (NOS) pathway is involved in the vas deferens contractility by a mechanism that seems to be related to local noradrenaline release in male rats. The aim of this study has been to confirm this hypothesis in the rat and to investigate whether it is specific for this species or occurs also in mice. In the rat, phenylephrine(Phe)concentration-response curves obtained in preparations from reserpine-treated rats in the absence and presence of the nitric oxide synthase inhibitor N-monomethyl- L –arginine (L-NMMA)have been analysed. For the vas deferens contractility analysis we used male Wistar rats and male Charles River mice, weighing 200-250g and 20-25g, respectively, anaesthetised with ether and then sacrificed by exsanguination. A portion of the vas deferens was removed, cleaned of surrounding tissue and placed in a Mg2+-free Krebs-Henselheit solution organ baths aired with carbogen and kept at 37ºC. The preparations were allowed to stabilize for 30 min before the addition of increasing concentrations of Phe(1-32µM) for construction of concentration-response curves. Isometric responses were recorded using a force transducer (TRI 201 – LETICA) connected to a LETICA 2006 polygraph. Each preparation was used for two successive curves, with 30 min. of stabilization between them, the first in absence (control curve) and the second in presence of a NOS inhibitor, NG-Nitro-L-Arginine Methyl Esther (L-NAME) (0,1µM). Concentration-response curve parameters, Emax and EC50%, were obtained by Michaelis-Menten Kinetics using the Enzfitter software. Results were compared by a t-student bilateral test with a significance level of 95%. Differences were considered statistically significant when p<0,05. There was no difference on the reserpine-treated rats on the preparations in which NOS was inhibited by L-NMMA when compared to the control group, suggesting the involvement of NE for the pro-contractile effect of NO. The reduction of the Phe-induced contractility obtained in consequence of the inhibition of the NOS/sGC pathway may suggest that, in the mice vas deferens, NO also potentiates the contractility induced by adrenergic stimulation. In conclusion, our results suggest that the same mechanisms may be present in both rats and mice, providing us a background for further studies on knock-out mice.
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2. Introdução e Objectivo
2.1 - Introdução 2.1.1 – O Monóxido de Azoto
Desde a descoberta do monóxido de azoto (NO) em 1980 como um potente
relaxante do músculo liso vascular e regulador da pressão sanguínea, o NO
tem sido encontrado nos mais variados tipos celulares e implicado numa
enorme variedade de processos biológicos. Foi identificado como uma
molécula major de transdução de sinal, sendo derivado da Arginina em dois
passos catalizados pela sintetase do NO (NOS) (Anggard, E., 1994). A NOS
cataliza a seguinte reacção:
Figura 1 – Reacção de formação do NO e cofactores envolvidos
Existem 3 isoformas da NOS: uma neuronal – nNOS -, uma endotelial – eNOS
-, e uma indutível – iNOS. Esta última só é expressa em determinadas
condições como regulação do sistema imunitário via citocinas ou indução
patológica na presença de endotoxinas e citotoxinas. A produção de NO é uma
resposta de stress e pode levar tanto a lesão tecidular pela sua química de
radical livre (Warren et al., 1987), como pode ser citoprotectora, protegendo as
células da lesão através da destruição de microorganismos patogénicos (lesão
do DNA) (Anggard,E. 1994).
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As formas neuronais e endoteliais da NOS são expressas constitutivamente e
reguladas pela concentração de cálcio pela interacção com a calmodulina
(CaM). O complexo cálcio-calmodulina estabiliza o homodímero. Cada
monómero contém uma subunidade reductase e outra oxigenase contendo os
cofactores FAD, NADPH e FMN ou heme e H4B (tetrahidrobiopterina). Esta é
essencial à formação dos dímeros da NOS (Forstermann et al, 1995).
A NOS é uma proteína membranar, podendo estar localizada do lado
citoplasmático do retículo endoplasmático, do aparelho de Golgi ou da
membrana plasmática (Middendorf et al,1997).
2.1.2 – Regulação da NOS e Bioquímica do NO
A actividade da eNOS e da nNOS é controlada pela H4B e pela disponibilidade
de cálcio/calmodulina, pois estes dois cofactores são essenciais à formação
dos dímeros de uma sintetase activa. A dependência da CaM tem sido usada
como modelo explicativo do papel do glutamato na neurotoxicidade no SNC.
Esta neurotoxicidade é um mecanismo de morte neuronal induzida pelo
glutamato. O efeito imediato do glutamato em neurónios é a activação do
receptor NMDA (N-methyl-D-aspartate). Estes receptores são selectivos para
os iões cálcio. Assim, activação prolongada dos receptores do glutamato
estimula a eNOS via ligação do complexo Ca/CaM à NOS. A formação de NO
está implicada na morte celular como já descrito acima: lesão do DNA,
supressão da respiração mitocondrial, com consequente depleção energética
(Wink et al,1993).
Contudo, o NO só pode ser sintetizado se o aminoácido arginina estiver
disponível. A nNOS depende deste substrato que é maioritariamente
sintetizado nas células gliais adjacentes e transportado para os neurónios. O
uptake da arginina é controlado por receptores não-NMDA. O papel fisiológico
da nNOS em determinados mecanismos tem demonstrado o envolvimento de
transporte do NO por difusão para as sinapses, onde estimula a guanilato
ciclase (GC) (fig.2) (Wink et al, 1993; Ravichandran et al,1995).
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Figura 2 – Elementos sinápticos e papel do NO na neurotransmissão como regulador da entrada de cálcio, activação da GCs e activação de receptores NMDA.
O NO é um neurotransmissor de semi-vida curta, que é livremente difundido
através das membranas. Possui um pequeno momento dipolar devido à
semelhança de electronegatividade entre o O e o N, tornando-o
essencialmente hidrofóbico. A sua reactividade é devida ao electrão de
valência desemparelhado no oxigénio. O NO é praticamente não reactivo como
radical livre quando comparado com outros. Apresenta uma grande
instabilidade se poucos segundos após a sua síntese não se ligar prontamente,
pois reage facilmente com o oxigénio molecular (formando dinitrotrioxido) e
com o anião superóxido (formando peroxinitrito) (Pryor et al, 1995).
2.1.3.- Mecanismos de Co-Transmissão
Vários autores propõem mecanismos de co-transmissão adrenérgica e
purinérgica envolvendo o NO. Tais mecanismos envolvem interacções entre o
NO e a Noradrenalina (NE), e o NO e o ATP.
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2.1.3.1. – Co-transmissão adrenérgica
No rato, estão descritos vários efeitos na contractilidade do canal deferente
modulada pelo NO, que sugerem a intervenção de componentes adrenérgicos
neste mecanismo. Pinto et al. e Lefebvre et al., sugerem um efeito pro-
contráctil para o NO, envolvendo também a guanilato ciclase e o GMPc.
Postorino et al. concluiu que o NO potenciava a contracção induzida por
estimulação eléctrica, provavelmente devido à promoção da libertação de
neurotransmissores (fig.3). Outros autores, como Santha et al., descrevem que
a Phe pode provocar a libertação de NE em preparações de canal deferente.
Apesar disto, ao contrário da grande quantidade de publicações que referem a
modulação da libertação de NE pelo NO, o efeito da Phe começa agora a
aparecer como relevante, sendo este mecanismo ainda desconhecido.
Figura 3 – Interacção NO / cGMP. (a) Estrutura da Guanilato Ciclase Solúvel. A ligação do NO ao grupo heme estimula a actividade catalítica da enzima, levando à formação de cGMP a partir de GTP. (b) Regulação da contractilidade do músculo liso arterial pelo NO e cGMP. O aumento do cGMP leva ao relaxamento do músculo e à vasodilatação.
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2.1.3.2. – Co-transmissão purinérgica
O ATP existe com outros neurotransmissores e mediadores em grânulos
específicos de exocitose em vários tipos celulares. É rapidamente degradado
no espaço extracelular por ecto-ATPases e ecto-ADPases em adenosina, que
por sua vez se liga a receptores específicos de membrana (receptores P1) ou
sofre re-uptake pela célula. A ligação do ATP aos receptores P2 desencadeia
uma variedade de respostas biológicas em diferentes tecidos, onde regula a
sinalização nervosa central e periférica, contracção de vasos sanguíneos e
secreção endócrina, entre outras funções. Estes receptores encontram-se
classificados em 2 famílias: P2Y (receptores acoplados a proteínas G) e P2X
(receptores acoplados a canais iónicos) (fig.4).
Figura 4 – Estrutura transmembranar dos receptores P2X e comparação com os receptores do glutamato e GABA
A ligação do ATP a um receptor P2X promove a abertura de um canal iónico
não selectivo para iões monovalentes e permeável ao cálcio, que é
indispensável à activação da NOS por ligação à CaM. (Soto et al., 1996).
Ostrom et al. (2000) referem que a Phe parece provocar a libertação de ATP
para o meio extracelular (fig.5).
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Figura 5 – Ciclo de vida e potenciais funções do ATP libertado para as sinapses
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2.2 - Objectivo
Em investigações prévias verificámos que a via da NOS contribui para a
modulação da contractilidade do canal deferente de rato, através de um
mecanismo potenciador que parece envolver a libertação de noradrenalina
(Pinto et al, 2002). Pretende-se continuar a investigar os mecanismos
envolvidos nesta potenciação e a sua relevância para o Homem. Irá ser
analisado o carácter de especificidade desta acção observada no rato
investigando se este efeito e o respectivo mecanismo se encontra também
presente no ratinho. Se tal for o caso, será, posteriormente, aprofundado o
mecanismo e as vias enzimáticas envolvidas na formação do NO no canal
deferente, através da utilização de animais geneticamente modificados,
tornados knock-out em cada uma das enzimas NOS.
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3. Materiais e Métodos – Parte Experimental
3.1. – Efeito da inibição da sintetase do NO na contractilidade do canal deferente de rato e de ratinho
Foi efectuado o estudo das consequências da inibição da NOS com L-NAME
na contractilidade do canal deferente de ratinho, estimulado com Fenilefrina
(Phe).
Na análise de contractilidade em rato foi efectuada a depleção de
catecolaminas com Reserpina, com intuito de avaliar o efeito da interacção NO-
NE (noradrenalina) e consequente inibição da NOS pelo L-NMMA.
3.2. - Animais
Este estudo foi conduzido em ratos Wistar machos, com pesos compreendidos
entre 250 e 350 gramas, e em ratinhos Charles River machos, com pesos
compreendidos entre 20 e 25g, provenientes da Harlan Ibérica. Os animais
foram mantidos durante um período nunca inferior a duas semanas no biotério
de manutenção da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa, para
aclimatação até obtenção do peso mínimo exigido para a experimentação, à
temperatura de 25ºC e com ciclos de luz de 14 horas diárias, com dieta de
manutenção, IPM-R20 (Letica). Tanto a dieta como a água foram fornecidas ad
libitum até ao dia da experiência.
3.3. - Preparações
Os ratos e ratinhos foram anestesiados com éter e sacrificados. Ambos os
canais deferentes foram removidos, limpos de tecido circundante e colocados
numa solução de Krebs-Henselheit, isenta de Mg2+ (pois este reduz a
magnitude das respostas contrácteis, por um mecanismo de antagonismo com
o Ca2+ - Macara & Gião T. Rico, 1989), arejada com 95% O2 e 5% CO2, a 37ºC.
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3.4. – Construção das curvas concentração-resposta
Os canais deferentes inteiros foram montados em banhos de 20 ml.
Seguidamente, foram submetidos a um período de estabilização de 30 min. sob
uma tensão base de 500mg, e lavados de 15 em 15 min., antes da adição de
Phe para a construção das curvas concentração-resposta. As respostas foram
registadas com um transdutor TRI 201 – LETICA ligado a um polígrafo LETICA
2006.
3.5. – Reagentes
Para as curvas concentração-resposta, foram utilizados os seguintes
reagentes: Reserpina, NG-Nitro-L-Arginina-Metil-Éster (L-NAME), NG-
MonoMetil-L-Arginina (L-NMMA) e Fenilefrina (Phe), da SIGMA ALDRICH. A
Phe foi dissolvida em água destilada e as soluções de trabalho feitas na
solução de Krebs-Henselheit (NaCl 113mM, NaHCO3 29mM, KCl 4.7mM,
KH2PO4 1.2mM, CaCl2 2.5mM e Glucose 11.5 mM). Foram tomadas as devidas
precauções para evitar a exposição à luz das soluções de Phe.
3.6. - Respostas Contrácteis induzidas pela Phe: validação do método em ratinho
Para garantir que as preparações de canal deferente estavam estabilizadas no
princípio de cada curva concentração-resposta, foi usada uma concentração
sub-máxima de Phe (1-2 µM) até se obter respostas contrácteis que fossem
reprodutíveis. Cada preparação foi usada para 2 curvas sucessivas, com 30
min. de estabilização entre elas, sendo a primeira (controlo) na ausência do
inibidor, e a segunda na sua presença (teste).
A reprodutibilidade deste modelo foi testada usando este protocolo na ausência
de inibidores em 2 curvas sucessivas.
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3.7 – Efeito da inibição da NOS na contractilidade induzida pela Phe, em ratos reserpinizados
Por forma a atingir a depleção de NE nas terminações nervosas, os ratos foram
tratados com reserpina (1mg/kg/dia) durante 5 dias. Ao 5º dia, foram recolhidas
amostras de sangue antes do sacrifício dos animais para doseamento de NE
sérica.
Curvas concentração-resposta foram obtidas usando concentrações isoladas e
crescentes de Phe (1 – 32µM), aplicadas a cada 10 min., primeiro na ausência
(controlo), depois na presença de L-NMMA (0,1 µM).
3.8. - Efeito da inibição da via NOS na contractilidade induzida pela Phe em ratinhos
Curvas concentração-resposta foram obtidas usando concentrações isoladas e
crescentes de Phe (1 – 32µM), aplicadas a cada 10 min., primeiro na ausência
(controlo), depois na presença de L-NAME (0,1 µM).
3.9. - Análise dos parâmetros
Os parâmetros que caracterizam as curvas concentração-resposta, Emax e
EC50%, foram calculados por uma regressão não-linear, usando o software
Enzfitter. Os resultados são dados como média ± erro padrão, onde n designa
o número de preparações provenientes de diferentes animais.
3.10. - Análise estatística
As comparações entre os parâmetros das curvas concentração-resposta
obtidas nas diferentes situações experimentais foram efectuadas pelo teste t de
student para amostras emparelhadas. As diferenças foram consideradas
significativas para valores de p ≤ 0,05.
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4. Resultados e Discussão
4.1. – Estudo em Rato 4.1.1. – Efeito da inibição da NOS na contractilidade induzida pela Phe, em
ratos reserpinizados
Para verificar a eficácia do tratamento com reserpina, os níveis de NE foram
doseados por HPLC, tendo-se obtido valores inferiores aos dos controlos (não
tratados) – 345,3±97,6 e 1824,5±297,3 ng/L, n=6, p<0,05.
Não foram observadas diferenças no Emax e na EC50% (fig.6) da Phe nas duas
curvas concentração-resposta(c.r.c) obtidas na ausência e na presença de L-
NMMA, sugerindo que, na ausência de NE, a acção pró-contráctil do NO não é
evidenciada.
Tabela 1 – Parâmetros das curvas concentração-resposta nas preparações de ratos tratados
com reserpina
N=7 Controlo L-NMMA
Emax (mg) 100%(831,3±119,6) 996,7±132,5
EC 50% (µM) 0,99±0,19 0,83±0,24
Figura 6 – Efeito da inibição da NOS na estimulação da contractilidade do canal deferente em ratos tratados com reserpina. C.r.c. na ausência e na presença de L-NMMA (0.1µM). Não se observam diferenças no Phe-Emax nem na EC50% (n=7).
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4.2. – Estudo em ratinho
4.2.1. - Respostas Contrácteis induzidas pela Phe no canal deferente de
ratinho: validação do método
Nas experiências para validação do método, não foram observadas diferenças
no Emax e na EC50% (fig.7) da Phe nas duas curvas concentração-resposta
sucessivas. Podemos então concluir que, neste modelo, as diferenças
observadas entre a curva controlo e a curva teste nos protocolos usados,
devem estar relacionadas com os reagentes testados.
Tabela 2 – Parâmetros das curvas concentração-resposta na validação do método
N=4 1ª Curva 2ª Curva
Emax (mg) 100%(494,25±118) 470,75±113
EC 50% (µM) 5,25±1,44 22,25±14,2
Figura 7 – Validação do método: não se verificam diferenças estatisticamente significativas no Emax nem na EC50% na estimulação com Phe, em duas curvas sucessivas.
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4.2.2. - Efeito da inibição da via NOS na contractilidade induzida pela Phe
A Phe (1-32µM) induziu contracções concentração-dependentes no canal
deferente de rato. A Fig. 8 mostra as curvas concentração resposta obtidas na
ausência (controlo) e na presença de L-NAME ( 0,1 µM).
Podemos observar que a inibição da NOS induziu uma diminuição da
contractilidade do canal deferente, existindo diferenças estatisticamente
significativas tanto a nível do Emax como a nível da EC 50%.
Tabela 3 – Parâmetros das curvas concentração-resposta nas preparações do canal deferente
de ratinho estimuladas com Phe.
N=8 Controlo L-NAME
Emax (mg) 100%(637,75±94) 465,13±81 *
EC 50% (µM) 2,92±0,52 5,14±1,23 *
* p<0,05 vs. controlo
Figura 8 – Efeito da inibição da NOS nas curvas concentração-resposta induzidas pela Phe: curvas na ausência e na presença de L-NAME (0,1 µM); *p<0,05 vs. Controlo
*
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4.3. – Conclusão Integrada
A contractilidade do canal deferente nos ratos reserpinizados diminui na
ausência de NE em comparação com os não reserpinizados, o que sugere o
envolvimento desta catecolamina na contractilidade estimulada pela Phe. Nos
animais reserpinizados, o L-NMMA não modifica as c.r.c., ao contrário do que
acontece nos não reserpinizados. Isto sugere que a presença de NE tem um
papel no efeito pró-contráctil do NO. Nas preparações de ratinhos não
reserpinizados, o L-NAME demonstrou um efeito na diminuição da
contractilidade, similar ao que acontece no rato.
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4.4. – Discussão Geral
No presente trabalho, foi estudado o envolvimento da NE e NO na
contractilidade do canal deferente de rato e ratinho, numa série de protocolos
farmacodinâmicos.
As NOS, são enzimas ubiquitárias responsáveis pela geração de NO. O NO
está implicado num enorme número de processos fisiológicos, incluindo a
neurotransmissão, controlo do tónus vascular, produção de hormonas,
apoptose, agregação plaquetária, etc (Radomski et al, 1990). Estes
acontecimentos fisiológicos ocorrem primariamente como resultado da
activação da GCs pela ligação do NO ao ferro do seu grupo heme, conduzindo
à acumulação do segundo mensageiro, o GMPc. Adicionalmente, estes
acontecimentos mediados pelo NO podem resultar nas suas conhecidas
propriedades oxidantes.
No canal deferente, a Phe foi capaz de induzir respostas contrácteis
concentração-dependente que diminuiram na presença do inibidor da NOS
utilizado, L-NAME.
O efeito inibitório do L-NMMA não foi contudo observado nos preparados de
animais reserpinizados aquando da depleção de catecolaminas,
nomeadamente NE. A ausência de diferenças entre as curvas controlo e curvas
com L-NMMA em ratos reserpinizados, sugere que o efeito pró-contráctil do NO
só se verifica na presença de NE.
Como já tinha sido referido em trabalhos anteriores, a estereoespecificidade da
acção do L-NAME e a semelhança qualitativa dos efeitos dos inibidores da
NOS, apontam fortemente para o envolvimento, no canal deferente de rato, da
via NOS/GCs e do NO na estimulação adrenérgica. Esta ideia é fortalecida com
os resultados destes trabalhos experimentais.
Este tipo de propriedades já foram também descritas por outros autores, mas
no intestino delgado de rato. Barthó & Lefebvre descreveram um efeito pró-
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contráctil para o NO. Mostraram que tal efeito poderia ser devido à libertação
de acetilcolina induzida pelo NO, a partir das terminações colinérgicas. (Barthó
& Lefebvre, 1997)
Para além destes resultados, existem outros que podem ajudar a compreender
este mecanismo, talvez por constituírem um caminho alternativo, concorrente
ou contribuinte para o mesmo efeito. Estes estudos envolvem moléculas como
o ATP ou a 6-NO2-NE (Mulryan et al., 2000; Li et al., 2000).
Uma componente substancial da resposta contráctil do canal deferente a um
estímulo nervoso simpático, que propulsiona o esperma para a ejaculação, é
mediada pelos receptores purinérgicos. Estudos demonstram que a fertilidade
masculina é reduzida em 90% em ratos knock-out do gene destes receptores.
Este efeito é contudo devido à redução da quantidade de esperma ejaculado e
não a disfunção espermática (Mulryan et al., 2000).
Ainda existe a possibilidade do envolvimento da 6-NO2-NE, formado por
nitração da NE em alguns órgãos, descritos por autores como Li, X. &
Eisenach, J., 2000, havendo uma posterior estimulação α2 e
consequentemente, aumento da libertação de NE.
Na figura seguinte apresentamos um esquema que propõe a intervenção
integrada dos neurotransmissores purinérgicos e adrenérgicos na
contractilidade do canal deferente e o eventual papel regulador do NO na
libertação dos mesmos.
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Figura 9 – Possível papel regulador do NO na interacção de neurotransmissores no canal deferente de roedores. (?) – supondo a existência de receptores α1 pré-sinápticos no canal deferente.
Dados estes resultados, e após se ter verificado que o comportamento no
ratinho é em todo semelhante ao que acontece no rato, propomo-nos agora
continuar este estudo em ratinhos knock-out em cada uma das enzimas NOS,
e verificar possíveis vias alternativas a este fenómeno, assim como quantificar
a importância das mesmas neste parâmetro de fertilidade.
?
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5. Referências Bibliográficas
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