Proteinsekretion & Membranproteinsynthese in Bakterien"

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Proteinsekretion & Membranprotein-synthese in Bakterien, Brock Kap 6:"

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Membranproteinbiogenese

und Proteinsekretion in Bakterien"

1.  Insertion in die Innere Membrane (IM)"

2.  Transport ins Periplasma"3.  Insertion in die äussere

Membran"4.  Export aus der Zelle"

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E. coli: Proteinexport ins Periplasma"Faktoren für gerichteten Transport und Translokation"

P"

Vorraussetzung für Proteintransport über die innere Membran

Signalsequenz!zytosolische Chaperone (SecB, SRP)"Translokationsmotor (SecA, Ribosom)!Translokationskanal (SecYEG)"Energiequelle ![Chaperone und modifizierende Enzyme im"Periplasma]!

Signalsequenzen

•  in sekretorischen Proteinen"•  durchschnittlich15 - 30 aa; hydrophober Kern & " netto-positive Ladung am N-Terminus"•  i. A. am N-Terminus von Proteinen"•  meist während oder nach der Translokation abgespalten durch

Signal-Peptidase"•  Spaltstelle bestimmt durch aa an Positionen -3 and -1

kein "Glu, Asp,"Lys, Arg."

kein Pro " "

aa mit kurzen"Seitenketten" "

kein Pro " "

Consensus"

+ + Signalsequenz"

Sec-abhängiger Proteintransport durch die innere Membran von Bakterien

1.  Schritt: Targeting (gerichteter Transport zur !! ! Membran)"

Signalsequenz!!2 Formen der Translokation!!1. Sec B /SecA/ATP, posttranslational, für lösliche sekretorische Proteine!! SecB “targeting“ Chaperon"

SecA Translokationsmotor (ATPase)!2. SRP/SRP receptor (SR), cotranslational, für Membranproteine"

E.coli SRP besteht aus !Ffh: fifty four homolog (GTPase) / 4.5S RNA"FtsY = SRP Rezeptor!

Hydrophobizität der Signalsequenz bestimmt targeting durch SecB oder SRP

Chaperon Definition:"

Ein Molekül (muss kein Protein sein), das unerwünschte Interaktionen zwischen Proteinen und dadurch Aggregation verhindert und Proteinfaltung vorantreibt."

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Posttranslationale Translokation von sekretorischen Proteinen

•  SecB: homotetrameres zytoplasmatisches Chaperon; erhält sekretorische Proteine translokationskompetent"

•  sekretorische Protein/Sec B-Komplexe induzieren ATP-Bindung an Sec A"

•  SecA/ATP bindet an Translokationskanal (SecYEG), ändert dessen Konformation"

•  bei ATP-Hydrolyse ändert sich SecA Konformation" noch einmal, ADP dissoziiert, Zyklus beginnt von vorn"

"SecB und SecA gibt es nur in Bakterien"

SecA Zyklus – power stroke (alt) "

Pollard and Earnshaw, Cell Biology "

SPase

Modell beruht auf Analyse der SecA-Konformation mit "biochemischen Methoden

Reale SecA Konformationsänderung(Kristallstrukturanalyse + EM)"

Ruhezustand"

an SecYEG"gebunden"

Collinson et al., 2015"

SecA Konformationsänderung"- SecA-ATP mit sekretorischem Protein" (blau) bindet an SecYEG""- PPXD Domäne (braun) faltet sich " das sekretorische Protein und klemmt" es fest""-  die HF-Domäne schiebt sich in den " Eingang des SecYEG Kanals""-  die Bewegung der PPXD Domäne löst" ATP-Hydrolyse durch die Nukleotid-" bindedomänen aus"

Collinson et al., 2015"

Collinson et al., 2015"

Zwei Modelle des SecA-getriebenen Proteintransports:"

Collinson et al., 2015"

Zwei Modelle des SecA-getriebenen Proteintransports:Powerstroke"

die Bewegung der kleinen HF-Domäne "ins Vestibül des SecYEG Kanals ist zu"gering, um die Bewegung von 25-50 aa"pro ATP-Hydrolyse durch den Kanal zu"erklären""späte Phase der Translokation ist"PMF-abhängig; mit diesem Modell"schwer zu erklären"

ursprünglich wurde angenommen, dass sich ein wesentlich "grösserer Teil von SecA in den Kanal schiebt, weil ein grosser"Teil des Proteins bei Kanalbindung protease-resistent wird"

Collinson et al., 2015"

Zwei Modelle des SecA-getriebenen Proteintransports:ratcheted diffusion"

- Diffusion ist schneller als powerstroke"- braucht keine spezifische Sequenz"- kann die PMF-Abhängigkeit besser " erklären"

Geschwindigkeit passt besser zu den zellulären Anforderungen:"ca 1 Protein pro SecYEG Kanal pro Sekunde""Zurückrutschen im Kanal verhindert durch PPXD-Klemme in SecA?"

P" : für Membranproteine"

Cotranslationale Integration von Membranproteinen

Beispiel: SRP-abhängige Insertion der Lac Permease in die innere Membran

Cytosol"

Periplasm"

E. coli SRP & SRP receptor

SRP= signal recognition particle""benötigt für targeting der meisten Membranproteine"

!SRP besteht aus Ffh (fifty four homolog) & 4.5S RNA!

"SRP receptor FtsY = Andockstelle für E.coli SRP/

Ribosom/Polypeptidekette-Komplexe an der Zytoplasmamembran"

SRP Targeting Systeme... Mammalian Bacterial

Mammalian Archaeal & Bacterial

Archaeal

14 9

54

72 68

19 54 19 48

SRα SRβ

FtsY

SRP

SR

Entscheidung fällt am Ribosom: co- oder posttranslationaler Transport

Gloge et al. Curr Opinion Struct Biology., 2014"

SRP – signal recognition particle"MAP – methionine aminopeptidase"PDF – peptide deformylase

hydrophobe Signalsequenz/transmembrane Domäne"

weniger hydrophobe Signalsequenz "

Proteine ohne Signalsequenz bleiben im Zytosol und falten dort

Gloge et al. Curr Opinion Struct Biology., 2014"

SRP – signal recognition particle"MAP – methionine aminopeptidase"PDF – peptide deformylase

Der Proteintranslokationskomplex oder das ʻTransloconʼ

•  der bakterielle Proteintranslokationskanal besteht aus 3 Proteinen: SecY, SecE, SecG"

•  SecYEG bildet eine Pore, die sich lateral zur Lipiddoppelschicht und transversal (durch die Membran öffnen kann"

•  die Translocon-Untereinheiten sind hochkonserviert und bilden in Säugern einen Kanal in der Membran des endoplasmatischen Retikulums (Sec61 α,β,γ in Metazoa; Sec61 Kanal)"

Rapoport et al. TICB, 2004

SecYEG(αβγ)

Translocon"Struktur & Öffnung

Collinson et al. Royal Soc Trans., 2015"

Translocon opening

Translocon opening

Collinson et al. Royal Soc Trans., 2015"

zu

offen

SecA-Bindung öffnet den SecYEG Kanal

Translokation löslicher Proteine M

BOC

4th

ed.

Membranproteinintegration

Collinson et al. Royal Soc Trans., 2015"

Membrandomänen verlassen SecYEG lateral und integrieren in die Lipiddoppelschicht

Insertion von Proteinen mit mehreren Transmembrandomänen"

Ladungsverteilung (positiv im Zytosol!) um die erste "Transmembrandomäne bestimmt Orientierung des gesamten Proteins!"

Beispiel: SRP-abhängige Insertion der Lac Permease in die innere Membran

Cytosol"

Periplasm"

Vergleich von Sec and Tat Proteinsekretionswegen in E. coli

Robinson, Nat. Rev. 2001"

E. coli twin arginine translocation (Tat) System"

-  das E. coli Tat-System besteht aus den Membranproteinen " TatA, TatB und TatC ""-  der TatBC-Komplex erkennt das twin-arginine Signalpeptid " und bindet Substrate an die Membran""-  TatA Oligomere bilden einen sehr grossen Ring in der " Membran, der vermutlich den Proteintransportkanal darstellt" "-  Transport ist abhängig von der PMF und der Faltung der" Substratproteine!"

- nicht essentiell in den meisten Organismen; nicht ubiquitär"

Tat-abhängige Translokation

•  Tat-Signalpeptide vermitteln Transport gefalteter Proteine ins Periplasma"

•  ähneln Sec-Signalpeptiden"•  wichtig: RR, XFLK"•  weniger hydrophob als Sec-Signalpeptide

Der Tat-Translokationszyklus"

Berks et al. Curr. Op. Mic. 2005"

TatA" TatB, TatC!

Leader!peptidase"

Strukturen der Tat Proteine sind bekannt"

Collinson et al., 2015"

Leader!peptidase"

... Funktionsmechanismus noch nicht

Proteintranslokation über die IM in Bakterien"

Collinson et al., 2015"

PM of the host cell

OM

IM

SecY and Secretin-dep. e.g. Typ II Typ I

Periplasmic space

Signalsequenz-abhängige Translokation über die innere Membran spezielles

Export signal

Proteintranslokationssysteme in Pro- und Eukaryoten"

Trans-location

Eukaryotes Bacteria Archaea Eury Cren

Organelles Mito Chlo

YidC - + + - + +

SRP / SecYEG

+ + + + - +

Tat - + + + - +

Brock Kap 6: Was ist hier falsch?"

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Proteinsekretion & Membranproteinsynthese in Bakterien"

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Literatur:""-  Channel crossing: how are proteins shipped across the "bacterial plasma membrane. 2015. "Collinson et al., Philophical Transactions Royal Society B, 370""-  Cotranslational mechanisms of protein maturation. 2014."Gloge et al., Curr. Opinion Struct. Biol. 24:24-33"

Seminar, Do 16.05, hier um 17:15"

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Prof. Elke Deuerling""

“Protein folding and transport in the cell”""