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Proteómica y sus aplicaciones
Conceptos básicos en proteómica
aplicaciones
metodologías
Electroforésis en dos dimensiones
MALDI-TOF/ Esi LC-MS/MS
Aplicaciones de la proteómica al estudio de la tuberculosis y la
paratuberculosis
Genómica Funcional: Utilización de aproximaciones experimentales
globales para el entendimiento de las funciones de genes y/o proteínas, que permiten establecer vías genéticas integradas que gobiernan la fisiología de un organismo
Ofrece una imagen completa de las interacciones entre miles de genes o productos génicos simultáneamente en función de una situación particular
Variación del
genoma Polimorfismos SNPs
Transcriptómica
Proteómica
Interacción de proteínas
Sistemas de Doble hibrido
Organización en redes interconectadas
Organismos modelo
Manipulación génica
Knockout, RNAi
Nuevos fenotipos
Biología estructural
Expresión de proteínas
Cristalización, X-ray
Función de proteínas
Salud y Sanidad
Medio Ambiente
Producción
Bioinformática
Metabolómica
Porque estudiar las proteínas ?
Las modificaciones postraduccionales tales como la
fosforilación y el clivaje proteolítico frecuentemente regulan la
actividad de las proteínas.
El genoma y los transcriptomas no son suficientes para modelar
y predecir sistemas biológicos.
La cantidad de proteína en una célula no siempre es regulada
por la expresión del RNA mensajero. En vez, la traducción y la
degradación pueden determinar la abundancia de las proteínas.
Principales aplicaciones de la proteómica
Perfil de proteínas (identificación de proteínas a gran
escala)
Proteómica comparativa
Proteómica funcional (interacción proteína-proteína)
Proteómica
Gran rango dinámico (posibilita identificar proteínas de abundancia
muy baja en presencia de proteínas de abundancia muy alta)
Amplio rango de pesos moleculares (750 kDa to 350 Da)
• de pI (3 to 12)
• de hidrofobicidad
• Las tecnologías proteómicas no han sido tan desarrolladas
como las genómicas principalmente debido a la falta de
esquemas de amplificación como la PCR.
• Solo se pueden analizar proteínas de su fuente natural.
• La complejidad de los proteomas se debe a que muchas
proteínas son procesadas y modificadas de forma compleja y
pueden ser producto de splicing diferencial.
Algunas limitaciones en los estudios
proteómicos….
Perfiles proteómicos comparativos
Geles de 2D
Shotgun Análisis Muestra (células, tejidos, fluidos)
LC2D
Electroforésis de proteínas
en dos dimensiones (2-DE)
Purificar las proteínas del
tejido o células
Separar las proteínas en 1
dimensión por su PI
Separar las proteínas en 2
dimensiones por su peso
molecular
Tinción de las proteínas, análisis
de los spots
Identificación de las proteínas por
MS
No hay un protocolo de solubilización
universal.
Las mezclas de urea-reductores-
detergentes generalmente logran
romper los puentes disulfuro y las
interacciones no-covalentes.
Objetivos
Romper las inteacciones
moleculares (puestes di-
sulfuro).
prevenir cualquier
modificación artificial de las
proteínas en el medio.
Remover cualquier
sustancia que pueda interferir
con las 2D.
Mantener las proteínas en
solución durante el proceso
de 2D.
Solubilización de las proteínas para geles de 2D
Solubilización de las proteínas para geles de 2D
Agentes caotrópicos (Estos agentes interfieren con los
enlaces no covalentes )
8-7M UREA
2M TIOUREA
Surfactantes (Bajan la tensión superficial)
4-2% CHAPS
Agentes Reductores (Reduce a un agente oxidante traspasándole
electrones a este último)
65 -100mM DDT
Anfolitos 2%
Tiras para isoelectroenfoque
individuales comerciales
1.Re hidratación de la tiras (12hs)
2.Se aplica la muestra de proteínas
3.Se separan la proteínas en las tiras
por corrida electroforética a alto V
Isoelectroenfoque (1ª dimensión)
SDS PAGE (2ª dimensión)
Procedimiento:
1.Preparado de los geles
(12%)
2. Equilibrado de las tiras de
la primera dimensión
3. Cargado de la tira en el SDS
PAGE
4. Sellado con agarosa
5. Separación de las proteínas
por electroforésis según su
peso molecular
6. Tinción de los geles
7. Toma de la imagen
8. Análisis de spots
(manualmente o con
programas informáticos)
Métodos Generales de Tinción
Tinción con nitrato de plata
Tinción con Coomassie blue (R and G)
Métodos de marcado radioactivo
Métodos fluorescentes
Aislado de las proteínas del gel 2D
Manual
Automático
Digestión en gel:
• Lavado
• Deshidratación y secado
• Digestión enzimática
• Extracción
• Desalado y concentración de los
péptidos
Identificación de proteínas por 2-DG
Espectrometría de masas
Digestión en gel
Base de datos de
secuencias de proteínas/ADN
www.us.expasy.org
Espectrometría de masas
Fuente de iones
+
Acelerador
Analizador de masas Detector
Electron impact (EI)
Chemical Ionization (CI)
Fast Atom Bombardment (FAB)
Matrix Assisted Laser Desorption/
Ionization (MALDI)
Electropsray Ionization (ESI)
Magnetic Sector
Fourier Transform Ion Cyclotron
Resonance (FTICR)
Quadrupole
Ion Trap
Time-of-Flight (TOF)
MALDI es uno de los métodos para
ionizar péptidos y otras moléculas
En MALDI las
muestras son
depositadas en una
matriz que absorbe
UV, la cual capta la
energía láser, ioniza y
protona las moléculas
de la muestra
+ + +
Field free drift region Detector Sample
probe
Matrix Assisted Laser Desorption Time-of-Flight
Mass spectrometer (MALDI-TOF-MS)
335 nm nitrogen
m/z
Rela
tive
In
ten
sit
y
MH+
MH+
MH+
Gel 2DE
Proteína
intacta
Proteólisis
experimental
MS Experimental
MS Teórico
Proteólisis
teórica Base de
datos de
ADN
Base de
datos de
proteínas
Análisis informático
Identificación de proteínas por el mapa peptídico (datos del
MALDI-TOF)
SELDI – Surface-Enhanced Laser Desorption
and Ionization
Es una extensión de:
MALDI – Matrix-assisted laser desorption/ionization
Como en MALDT TOF, en SELDI TOF;
• Las proteínas son co cristalizadas con una matriz que
absorve UV
• Son vaporizadas por un pulso de UV laser
• Las proteína ionizadas son aceleradas en un campo
eléctrico
• Se mide la relación carga/masa de las proteínas
Metodología alternativa a 2D MALDI-TOF es Esi LC
MS/MS
Proteínas de membrana
Baja abundancia de la proteína
Resolución de la proteína blanco poco satisfactoria
Que hacer cuando no la tecnología de geles de 2D no
es aplicable?
Baja homología con secuencias depositadas en
bases de datos
Perfiles proteómicos comparativos
Geles de 2D
Shotgun Análisis Muestra (células, tejidos, fluidos)
LC2D
Secuenciación de proteínas Usa Tandem MS: dos
analizadores de masa en series con una celda de colisión entre ellos
Celdas de Colisión: región donde los iones colisionan con un gas (He, Ne, Ar) resultando en la fragmentación del ion
La fragmentación de los pétidos ocurre de forma predecible, principalmente en la unión peptídica
Los iones hijos resultante poseen masas que son consistentes con pesos moleculares conocidos de dipéptidos, tripéptidos, etc.
Ser-Glu-Leu-Ile-Arg-Trp
Celda de colisión
Ser-Glu-Leu-Ile-Arg
Ser-Glu-Leu
Ser-Glu-Leu-Ile
Etc…
Comparación entre MALDI-TOF y ESI-MS-
MS para la identificación de proteínas
MALDI-TOF MS
Muestra en un soporte
(matriz cristalina).
Los espectros indican masas
de los péptidos.
La identificación de la
proteína es por MS es por
huella peptídica.
Requiere la secuencia del
proteoma.
ESI-MS-MS
Muestra en solución (HPLC).
Los espectros MS-MS
revelan patrones de
fragmentación.
Se identifica la proteína por
algoritmos de correlación
cruzada.
Síntesis de novo.
Ejemplo de un reactivo ICAT
SO
INH
**
**
O
O
ONH
O
ONH
NH
Biotin Affinity tag:
Se une a la resina
de estreptavidina-
agarosa
Linker: La versión pesada
tiene deuterio en*
La versión liviana tiene
hidrógeno en*
Reactive group: Grupo tiol
reactivo que se une a la
cisteína
Como funciona ICAT?
Proteolisis
(eg tripsina)
Lisado y
marcado
MIX
Aislamiento por
afinidad a bolitas de
estreptavidina
Quantificación
MS
Identificación
MS/MS
100
m/z
200 400 600 0
100
550 570 590 0
m/z
liviano
pesado
NH2-EACDPLR-COOH
Ventajas vs. desventajas Estima los niveles
relativos de una proteína entre muestras con bastante presición (10%)
Se puede usar en mezclas complejas de proteínas
Si se usa MS-MS los péptidos se pueden identificar directamente
• Caro
• Fragmentación de los Tag
• Solo para péptidos con cisteína.
HERRAMIENTAS EXPASY
http://expasy.org/tools/#proteome
Similarity searches
ExPASy BLAST
Pattern and profile searches
translational modification prediction
Topology prediction
Primary structure analysis
Secondary structure prediction
Tertiary structure analysis and prediction
Molecular modeling and visualization
ExPASy Proteomics tools
Protein identification and characterization
Identification and characterization with peptide mass fingerprinting data
Aldente - Identify proteins with peptide mass fingerprinting data. A new, fast and powerful tool that takes advantage of Ho ugh transformation for spectra recalibration and outlier exclusion. Download the stand - alone version
FindMod - Predict potential protein post - translational modifications and potential single amino acid substitutions in peptides. Experimentally measured peptide masses are compared with the theoretical pept ides calculated from a specified Swiss - Prot entry or from a user - entered sequence, and mass differences are used to better characterize the protein of interest.
FindPept - Identify peptides that result from unspecific cleavage of proteins from their experimental masses, taking into account artefactual chemical modifications, post - translational modifications (PTM) and pr otease autolytic cleavage
Mascot - Peptide mass fingerprint from Matrix Science Ltd., London PepMAPPER - Peptide mass fingerprin ting tool from UMIST, UK ProFound - Search known protein sequences with peptide mass information
from Rockefeller and NY Universities [or from Genomic Solutions ] ProteinProspector - UCSF tools for peptide masses data (MS - Fit, MS - Pattern,
MS - Digest, etc.)
http://expasy.org/swiss-2dpage/viewer&map=ecoli&ac=all
Base de datos con proteomas de diferentes células y
organismos
Proteómica funcional
Una proteína puede ser identificada pero aun así no
conocemos:
Detalles estructurales
Localización
Interacción- pequeñas moléculas
Interacción con otras proteínas
Modificaciones postraduccionales
Vida media
MAPAS DE INTERACCIÓN-BIOLOGÍA DE SISTEMAS
• Convergencia entre ciencia del descubrimiento y ciencia conducida por hipótesis.
• La biología de sistemas puede detectar conexiones entre muchas funciones celulares que no son aparentes ni predecibles.
• Puede colectar datos más allá de nuestras habilidades, validarlos, integrarlos e interpretarlos.
Trabajos del grupo de tuberculosis y
paratuberculosis bovina en proteómica aplicada
Búsqueda de antígenos candidatos en
diferentes especies de bacterias
Identificación de las proteínas reguladas por el
represor Mce3R (un regulador transcripcional)
Identificación de glicoproteínas de M.
tuberculosis
Caracterización de la unión del antígeno P27 de
M. bovis a receptor celular
Biomarcadores de TB bovina
• La tuberculosis (TBC) es una enfermedad
infectocontagiosa crónica causada por bacterias del
género Mycobacterium, que afecta tanto a hombres como
a animales desde tiempos remotos.
• En 1882, Robert Koch descubrió el agente causal de la
TBC, al encontrar un bacilo constantemente asociado
con la enfermedad clínica.
El agente etiológico de la tuberculosis en humanos es
Mycobacterium tuberculosis.
• Entre el 5 % y el 10 % de los infectados desarrollarán la
enfermedad en algún período de sus vidas.
• 9 millones de personas por año contraen la enfermedad activa,
mientras que otros 2 millones mueren por consecuencia de ello.
(WHO, 2007)
• Un tercio de la población mundial está infectada.
La tuberculosis bovina es causada por Mycobacterium bovis
ocasionando a nivel productivo:
• Disminución de hasta un 6% en la fertilidad.
• Disminución de un 10% en la producción láctea.
• Pérdida del 15% en promedio del peso del animal, disminuyendo la
producción de carne.
• Aumento de la susceptibilidad a otras enfermedades.
(SENASA, 2006).
1. Mycobacterium tuberculosis glycoproteomics
based on ConA-lectin affinity capture of
mannosylated proteins
Margarita González-Zamorano1, Guillermo Mendoza-Hernandez2, Wendy
Xolalpa1,Cristina Parada1, Antonio J Vallecillo1, Fabiana Bigi3, and Clara
Espitia
Instituto de Investigaciones
Biomédicas Nacional Autónoma de México,
Departamento de Bioquímica
Instituto de Investigaciones Biomédicas.,
Instituto de Biotecnología, CICVyA-INTA
Objetivo: Identificar las glicoproteínas de
Mycobacterium tuberculosis
Las glicoproteínas juegan son importantes
inmunoduladores ya que muchas de ellas une
receptores Toll-like
Existen dos tipos de glicosilaciones: O-glicosilación y N-
gliosilación
En micobacterias: O-glicosilación por residuos de
manosa (o-manosilación)
Estrategia experimental:
1. Purificar las glicoproteínas presentes en el
sobrenadante de cultivo de M. tuberculosis mediante
pasaje por una columna de ConA
2. Separar las proteínas por electroforésis en dos
dimensiones
3. Identificar las proteínas presentes en el gel por
Tandem Mass spectrometry (LC/ESI-MS/MS)
4. Confirmar la identidad de las proteínas mediante
western blot con anticuerpos específicos
Cromatografía de afinidad por unión a ConA
Concanavalina A Proteínas
totales
libres
Proteínas pegadas
específica e
inespecificamente
1. Cargado
de las
muestras
2. Unión de las
proteínas a la
matriz-ConA
Unión específica de
glicoproteínas
Proteínas inespecíficas
liberadas con los lavados
glicoproteínas
3. lavados 4. eluído
1. Proteínas de SC totales
2. Proteínas eluídas de
columna ConA
3. Western blot con ConA
4. WB con Con A en
presencia de metil-α-D-
mannopiranosido
coomasie ConA ConA+ metil-α-D-
mannopiranosido
Se identificaron 41
proteína, 34
posibles manosil
glicoproteínas
LprG/P27 es un importante factor de virulencia de las
micobacterias patógenas ya que la eliminación de su gen produce
una severa atenuación de la bacteria en el modelo de ratón
Se demostró que esta proteína forma junto con otra un sistema de
eflujo de compuesto
Ejerce un efecto inmunomodulador en ratones cuando es
administrada como proteína o como gen
Conclusión: El factor de virulencia P27/LprG de
las micobacterias patógenas es una manosil
glicolipoproteina capaz de unir el receptor DC-
SING en células dendríticas
Estos hallazgos pueden explicar porque esta
proteína es tan relevante para la virulencia de M.
tuberculosis y M. bovis
UNAM (O-manosilación)
University of Oxford, England (unión a DC-SING)
IB-INTA
2. Identificación de antígenos proteicos en
aislamientos clínicos de alta prevalencia de
Mycobacterium tuberculosis
Dos cepas de brotes de TB en Argentina
Inducen respuesta inmune diferencial en
pacientes tuberculosos
Objetivo: Identificar las proteínas responsables
de esa respuesta diferencial
IB-INTA
Academia Nacional de Medicina
Inst. Malbrán
H: aquellas proteínas presentes en una cepa pero ausentes en la otra son las
responsables de inducir la respuesta inmune diferencial observada
Table 1. Rates of malachite green decolorization by M. tuberculosis ΔP27 strains
Proteínas pared cepa 10
1
2
3 4
5 6
7
8
Nombre Cepa Fracción Proteína Comentario
10P 2 10 pared hypothetical protein
MtubT1_15527
function unknown
10P 4 10 pared orotate phosphoribosyltransferase
pyrE
involved in pyrimidine
biosynthesis
10P 5 10 pared iron-regulated peptidyl-prolyl-cis-
trans-isomerase A ppiA
ppiases accelerate the
folding of proteins [
10P 7 10 pared F420-dependent glucose-6-
phosphate dehydrogenase
catalyzes oxidation of
glucose-6-phosphate to 6-
phosphogluconolactone
using coenzyme f420
12P 6 12 pared short-chain type
dehydrogenase/reductase
function unknown;
supposed involved in
cellular metabolism
10C 6 10 citoplasma heat shock protein HtrA possibly hydrolyzes
peptides and/or proteins
10SN 10 sobrenadant
e
pyruvate dehydrogenase subunit
E1 aceE
Involved in energy
metabolism; contributes
to acetyl-CoA production
as part of pyruvate
dehydrogenase complex
PR
OT
EIN
AS
DIF
ER
EN
CIA
LE
S
Validación de la expresión diferencial de proteínas
por qRT-PCR
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Rv0
009
Rv0
382
Rv0
407
Rv1
144
Rv2
624
Rv1
223
Rv2
241
Lo
g 2
Rati
o
Genes
3. Identificación de nuevos antígenos para el
diagnóstico serológico de M. paratuberculosis
Estrategia experimental:
1. Extracción de proteínas de pared de M.
paratuberculosis
2. Separación de las proteínas en geles de 2D
3. Transferencia de los geles a filtros de nitrocelulosa
4. Análisis por inmunoblot de los filtros con sueros negativos y
positivos (de bovinos con paraTB)
5. Identificación de los spots diferenciales (positivos-
negativos)
6. Aislamiento del spot correspondiente e identificación por
MALDI-TOF y Mascot
Objetivo:
Extraer y Resolver por medio de electroforesis en 2D las proteínas
de la pared de Mycobacterium spp.
Identificar las proteínas de la pared de M. avium y M. avium subsp.
paratuberculosis reconocidas por sueros provenientes de bovinos con
paratuberculosis.
Comparar el perfil de proteínas de pared de las dos especies,
reconocidas por los sueros de los bovinos.
Electroforésis en 2D de proteínas de pared
de micobacterias para la identificación de
antígenos humorales.
Resultados
M. paratuberculosis
97
66
45
31
21
14
7 4
M. avium
97
66
45
31
21
14
7 4
M. tuberculosis
97
66
45
31
21
14
7 4
M. smegmatis
97
66
45
31
21
14
7 4
El procedimiento descrito permitió la extracción, resolución y separación de proteínas
de la pared de varias especies micobacterianas, inclusive M. tuberculosis
Reconocimiento de proteínas
(sueros de animales con paratuberculosis)
97
66
45
31
21
14
97
66
45
31
21
14
Western blot de proteínas de pared de Mycobacterium avium. Western blot de proteínas de pared de Mycobacterium
avium subsp paratuberculosis.
(confirmados por ELISA y aislamiento del patógeno)
4 7 4 7
7 4
97
66
45
31
21
14
97
66
45
31
21
14
4 7 4 7
M. avium subsp paratuberculosis M. avium
Óvalos negros: proteínas reconocidas por animales con paratuberculosis luego de adsorción y no reconocidas por negativos.
Óvalos verdes: proteínas reconocidas por animales positivos y negativos.
Óvalos naranja: proteínas reconocidas solo por animales positivos, no se encuentran luego de la adsorción.
Rectangulos y cuadrados rosas: proteínas diferenciales reconocidas por animales positivos y / o reconocidas por animales positivos que
desaparecen luego de la adsorción.
* En esta diapositiva la membrana correspondiente a M. avium subsp paratuberculosis fue girada en sentido horizontal (espejo).
Análisis comparativo de proteínas Inmunoreactivas presentes en pared
micobacteriana de las especies M. avium subsp paratuberculosis y M. avium
4. Identificación del regulón Mce3R de
Mycobacterium tuberculosis
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA CICVyA INTA.
Las proteínas Mce del género Mycobacterium se encuentran
codificadas en varios operones (cuatro en M. tuberculosis/bovis)
Son importantes para la replicación del bacilo en el hospedador
Se cree que constituyen sistemas de transporte, pero no se conoce
aún la función
0
20
40
60
80
100
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Weeks post infection
H37Rv
MCE1
MCE2
MCE3 D1
Sobrevida de ratones incoulados por via intratraqueal
Trabajo realizado en colaboracion con el Dr. R Hernandez-Pando del Inst. Nac. de la Nutricion Mexico DF
Posibles funciones de los operones mce
Transporte y Invasión
dominios de transportadores ABC
ABC transporter permeases and substrate-binding proteins
Arruda S, Bonfim G, Knights R, Huima-Byron T, Riley L W: Cloning of an M. tuberculosis DNA fragment associated with entry and survival inside cells. Science 1993, 261:1454-1457.
Kumar A, et al.Comparison of mammalian cell entry operons of mycobacteria: in silico analysis and expression profiling. FEMS Immunol Med Microbiol 2005, 43: 185-195.
Rv1963c
mce3
yrbEA mceA mceC lprM Rv1974 Rv1972
Rv1975 Rv1973
Hyg
Knockout de Rv1963c en M. tuberculosis
Rv1963c codifica para un regulador transcripcional de la familia
Tet
Rv1963c (Mce3R) reprime completamente la expresión del operón
mce3 de M. tuberculosis
Basados en la premisa que todos los genes regulados por un mismo
regulador trascripcional cumplen funciones asociadas, se buscaron
todos aquellos genes cuya expresión este regulada por Mce3R con el
objeto de descifrar la función del operón mce3
Se comparó el proteoma de la cepa mutante (Dmce3R) con la cepa
salvaje (H37Rv)
Objetivo general: descifrar la función de los genes mce
de M. tuberculosis
Mediante búsqueda en bases de datos se investigó en la función de los
genes regulados por Mce3R
Comparación de los proteomas de la pared celular
de la cepa mutante Dmce3R y la salvaje H37RV
MUTANTE SALVAJE
MONOXIGENASA
Probable sintetasa de riboflavina subunidad β
Probable metiltransferasa
Probable
metiltransfe-
rasa
Rv1498c
Proteína
conservada
hipotética
Rv2315c
Probable
succinato
semialdehido
deshidroge-
nasa
Rv0234c
(gabD1)
Probable
acetil-CoA
acetiltransfe-
rasa FadA4
Rv1323
(fadA4)
Myo-inositol-1-
fosfato-sintetasa
Ino1
Rv0046c
(ino1)
WT Mut WT Mut
Extracto Sobrenadante
EphB
EphB
Mono oxigenasa
SDS-PAGE (1D), tinción con
nitrato de plata
Conclusión: El operón mce3 podría codificar para
un transportador cuyo sustratos son lípidos
Se identificaron posibles miembros del regulón Mce3R
Dos de las proteínas identificadas en pared y
sobrenadante de cultivo de la cepa mutante (Rv1936 y
EphB) también fueron detectadas como
sobreexpresadas en experimentos de microarreglos
Muchas de las proteínas sobreexpresadas en la cepa
mutante están involucradas en el metabolismo de
lípidos
5. PROTEINAS DIFERENCIALES DE Salmonella
gallinarum
CEPA VACUNAL-AISLAMIENTO DE CAMPO
OBJ: Identificar proteínas marcadoras de los aislamientos de campo para
determinar si los brotes son debidos a la cepa vacunal.
6. PROTEOMA DE CELULAS MONONUCLEARES DE SANGRE
PERIFERICA DE BOVINOS
Obj. Identificar proteínas biomarcadoras de tuberculosis bovina en sangre
periférica
Proteómica comparativa en muestras de animales infectados y controles sanos
1D 2D
Conclusiones
Aplicaciones de las tecnologías
proteomicas a:
1. Identificación de proteínas bacterianas con
expresión diferencial (Laura Klepp)
4 y 5 Estudios inmunológicos-Inmuno proteomica
para la identificación de antígenos candidatos
(Gabriela Echeverria y M Romano, L. Klepp)
2. Identificación de proteínas con modificaciones
postraduccionales (Lab C. Espitia e IB-INTA)
3. Identificación de interacciones proteína-proteína
Unión a receptores celulares (María Carrol Univ of Oxford e IB-INTA)
6. Biomarcadore de TB bovina (F. Blanco)