Proteomsignatur mittels MS-Serumprofiling

zur Detektion der Early-onset Präeklampsie

Von der Medizinischen Fakultät

der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen

zur Erlangung des akademischen Grades

einer Doktorin der Medizin

genehmigte Dissertation

vorgelegt

von

Franka Nadine Seidenspinner

aus Rostock

Berichter: Herr Universitätsprofessor

Dr. med. Werner Rath

Herr Universitätsprofessor

Dr. med. Thorsten Orlikowsky

Tag der mündlichen Prüfung: 23. Januar 2012

Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.

Gewidmet

Meiner Familie

1

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 4

1.1. Präeklampsie 4

1.1.1. Klassifizierung hypertensiver Erkrankungen in der Schwangerschaft 4

1.1.2. Epidemiologie 5

1.1.3. Definition und Symptomatik 6

1.1.4. Risikofaktoren und Diagnostik 7

1.1.5. Ätiologie und Pathogenese 8

1.1.6. Therapie und Prognose 11

1.2. Massenspektrometrische Proteinanalytik 13

1.2.1. MALDI-ToF-MS 13

2 Zielsetzung 15

3 Material und Methoden 16

3.1. Material 16

3.1.1. Probengewinnung 16

3.1.2. Chemikalien 17

3.1.3. Geräte und Zubehör 18

3.1.4. Software 19

3.2. Methoden 20

3.2.1. Proteinseparation mittels magnetischer Beads 20

3.2.2. Proteinseparation mittels fraktionierter Fällung 21

3.2.3. Massenspektrometrie 22

3.2.4. SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese 24

3.2.5. Proteinidentifizierung 25

3.2.6. Nephelometrie 26

3.2.7. Software-unterstützte Quantifizierungsmethode 27

3.2.8. Statistische Poweranalyse 29

2

4 Ergebnisse 30

4.1. Charakterisierung von Präeklampsie-und Kontrollpatientinnen 30

4.2. Anwendung der Massenspektrometrie zur differentiellen Analytik

von Präeklampsie- und Kontrollpatientinnen 32

4.2.1. Monoparametrische Analyse 34

4.2.2. Multiparametrische Analyse 41

4.2.3. Verifizierung der Ergebnisse mittels SDS-PAGE 46

4.3. Identifizierung von Serumproteinen 48

4.4. Nephelometrische Analyse von Transthyretin 51

4.5. Statistische Poweranalyse 52

5 Diskussion 53

5.1. Diskussion der Methodik und Fehleranalyse 53

5.2. Bedeutung von Transthyretin 55

5.3. Massenspektrometrie in der klinischen Forschung 56

5.4. Klinische Relevanz dieser Arbeit und Ausblick 57

6 Zusammenfassung 59

7 Literaturverzeichnis 60

8 Anhang

8.1. Abbildungsverzeichnis I

8.2. Tabellenverzeichnis II

8.3. Publikationen und Kongressteilnahmen III

8.4. Danksagung IV

3

Abkürzungsverzeichnis

CAN Acetonitril

ACE Angiotensin Converting Enzym

ACOG American Congress of Obstetricians and Gynecologists

AWMF Arbeitsgesellschaft der wissenschaftlichen medizinischen

Fachgesellschaften

BMI Body-Mass-Index

CHCA Alpha-cyano-4hydroxy-zimtsäure

CTG Cardiotokogramm

Da Dalton

DHB 2,5 Dihydroxybenzoesäure

H Stunde

KO Kontrolle

MALDI Matrix-assistierte Laser Desorption/ Ionisation

MBS Magnetischer Bead Separator

M Messreihe

Mr Relative molekulare Masse

MS Massenspektrometrie

MS/ MS Tandem-Massenspektrometrie

n-OGP n-Octyl-ß-D-Glucopyranoside

PAGE Polyacrylamid Gel-Elektrophorese

PE Präeklampsie

Ppm parts per minute

RDS Respiratory Distress Syndrom-Prophylaxe

RWTH Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule

SA Standardabweichung

SDS Natriumdodecylsulfat (sodium dodecylsulfate)

SELDI Surface Enhanced Laser Desorption Ionization

SIH Schwangerschaftsinduzierte Hypertension

SS Schwangerschaft

SSW Schwangerschaftswoche

TFA Trifluoressigsäure

TIC Total Ion Count

ToF Time-of-Flight (Massenanalysator)

Tris 2-Amino-2(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol

1 Einleitung

4

1 Einleitung

1.1. Präeklampsie

1.1.1. Klassifizierung hypertensiver Erkrankungen in der Schwangerschaft

Der Begriff „Hypertensive Schwangerschaftserkrankungen“ umfasst all jene

Erkrankungen in der Schwangerschaft, deren gemeinsames Merkmal ein arterieller

Hypertonus ist. Je nach zeitlichem Auftreten des arteriellen Hypertonus und der

zusätzlichen Symptomatik unterscheidet man die Gestationshypertonie, die

Präeklampsie, welche auch als Gestose bezeichnet wird, und die Propfgestose.

Besonders schwere Verlaufsformen der Präeklampsie mit lebensbedrohlichen

Komplikationen stellen die Eklampsie und das HELLP-Syndrom dar. Die folgende

Einteilung für „hypertensive Erkrankungen in Schwangerschaft und Wochenbett“

orientiert sich an den Leitlinien der Arbeitsgemeinschaft Schwangerschaftshochdruck/

Gestose der Deutschen Gesellschaft für Gynäkologie und Geburtshilfe e.V. (DGGG)

[AWMF-Leitlinie 2009] und an den Definitionen der Internationalen Gesellschaft für

Hypertensive Erkrankungen in der Schwangerschaft (ISSHP) [Brown et al. 2001].

Tabelle 1: Klassifizierung hypertensiver Erkrankungen in der Schwangerschaft [Rath,

Gembruch, Schmidt, 2010]

Gestationshypertonie De novo Hypertension mit Blutdruckwerten von ≥ 140/90 mmHg ohne

Proteinurie nach vollendeter 20. SSW bei zuvor normotensiven Werten

und normalen Blutdruckwerten 12 Wochen nach der Geburt.

Präeklampsie De novo Hypertension mit Blutdruckwerten von ≥ 140/90 mmHg und

Proteinurie >300 mg/24h nach der vollendeten 20. SSW.

Propfpräeklampsie

(Propfgestose)

Chronische Hypertonie und Gestationsproteinurie oder chronische

Hypertonie und vor der 20. SSW bestehende Proteinurie mit nach der 20.

SSW zusätzlicher Entwicklung eines plötzlichen Anstieges der

Proteinurie oder eines plötzlichen Anstieges des Blutdruckes oder

Auftreten eines klinischen oder laborchemischen Merkmales einer

schweren Präeklampsie (Definition siehe Seite 6).

1 Einleitung

5

Eklampsie Komplikation einer Präeklampsie mit Entwicklung tonisch-klonischer

Krämpfe, die keiner anderen Ursache zuzuordnen sind.

HELLP-Syndrom Schwere Verlaufsform einer Präeklampsie mit Hämolyse (hemolysis),

pathologisch erhöhten Leberenzyme (elevated liver enzyme levels) sowie

erniedrigter Thrombozytenzahl < 100G/l (low platelet counts).

1.1.2. Epidemiologie

Die Präeklampsie zählt zu den hypertensiven Schwangerschaftserkrankungen. Ihre

Inzidenz liegt bei ca. 5 bis 7% [Report of the National High Blood Pressure Education

program 2008]. Jährlich sind etwa 8,4 Millionen Frauen betroffen [Chappell et al.

2008].

Die Präeklampsie steht in den Industrieländern an zweiter Stelle der mütterlichen

Todesursachen. Nicht zu vernachlässigen ist außerdem ihr Anteil an der perinatalen

Mortalität mit etwa 20 bis 25% [Report of the National High Blood Pressure Education

program 2008]. So verstirbt eines von 100 Kindern an den Folgen einer Präeklampsie

der Mutter [Habli & Sibai 2008]. Eine besonders schwere Verlaufsform der

Präeklampsie und Eklampsie stellt das HELLP-Syndrom dar. Es tritt in 4 bis 12% aller

Präeklampsien sowie Eklampsien auf und kann Komplikationen verschiedener

Organsysteme bis hin zum Multiorganversagen verursachen. Die mütterliche Letalität

beim HELLP-Syndrom liegt weltweit zwischen 3 und 3,5% [Rath et al. 1992]. Vor der

Geburt sind ca. 70% der Fälle betroffen, postnatal hingegen lediglich 30% [Dreyfus et

al. 1992].

Die Mehrheit aller Präeklampsien kommt bei Erstgebärenden vor. So sind 5,8% aller

Primiparae, jedoch nur 0,4% aller Multiparae von dieser Form der hypertensiven

Schwangerschaftserkrankung betroffen [Bancher-Todesca et al. 1998].

Desweiteren scheint das Auftreten einer Präeklampsie abhängig von der ethnischen

Herkunft zu sein. Demnach sind Frauen ethnischer Gruppen (Afrika, Amerika,

Philippinen) stärker gefährdet. Studien zufolge konnte in den Vereinigten Staaten von

Amerika ein Anstieg der Inzidenz der Präeklampsie über die letzten Jahre beobachtet

werden, was nicht zuletzt in engem Zusammenhang mit der steigenden Rate an

1 Einleitung

6

chronisch hypertensiven Erkrankungen, Diabetes sowie Adipositas steht [Berg et al.

2009; Wallis et al, 2008].

Auch scheint der sozialökonomische Hintergrund eine Rolle zu spielen. So sind

Schwangere von niedrigem sozialen Status stärker gefährdet [Silva et al. 2008]. Auch

tritt die Präeklampsie bis zu 30mal häufiger in Entwicklungs- als in Industrieländern auf

[Duley 2009].

1.1.3. Definition und Symptomatik

Die Präeklampsie wird definiert als de novo Hypertension und Proteinurie nach der

vollendeten 20. SSW. Die unteren Grenzwerte für den Blutdruck betragen systolisch

140 mmHg und diastolisch 90 mmHg. Der Grenzwert für Eiweiß im Urin liegt bei 300

mg/Tag oder unter Verwendung eines Urin-Teststreifens bei +2 (Dipstick) [Davey &

MacGillivray 1988]. Nach Brown [Brown et al. 2000] kann auch bei Fehlen einer

Proteinurie die Diagnose Präeklampsie gestellt werden, wenn erstmals nach der 20.

SSW alternativ eine fetale Wachstumsrestriktion auftritt, es zu einer Beteiligung der

Leber kommt oder aber Nierenfunktionsstörungen, neurologische Probleme oder

hämatologische Störungen vorliegen. Häufig treten Ödeme auf. Neben den drei

Leitsymptomen Bluthochdruck, Proteinurie und Ödemen klagen die Patientinnen

oftmals über Oberbauchschmerzen, Schwindel, Kopfschmerzen, Benommenheit,

Sehstörungen (vor allem Augenflimmern) sowie Übelkeit und Erbrechen.

Eine Präeklampsie wird als schwere Präeklampsie bezeichnet, wenn zusätzlich

mindestens eines der folgenden Kriterien erfüllt ist [Brown et al. 2001; ACOG Practice

Bulletin No. 33 2002]:

Nierenfunktionseinschränkung (Kreatinin ≥ 0,9 g/l oder Oligurie < 500 ml/24 h)

Leberbeteiligung (Transaminasenanstieg, schwere Oberbauchschmerzen)

Lungenödem oder Zyanose

hämatologische Störungen (Thrombozytopenie, Hämolyse)

neurologische Symptome (schwere Kopfschmerzen, Sehstörungen)

fetale Wachstumsrestriktion

Blutdruck ≥ 170/110 mmHg

1 Einleitung

7

Proteinurie ≥ 5 g/24 h.

Je nach zeitlichem Auftreten der Leitsymptome unterscheidet man eine frühe Form (<

34. +0 SSW) sowie eine späte Form (> 34. +0 SSW) der Präeklampsie, welche auch als

early-onset- und late-onset-Präeklampsie bezeichnet werden [Dadelszen et al. 2003].

Vor allem die frühe Form der Präeklampsie kann schwere Komplikationen für Mutter

und Kind zur Folge haben [Churchill & Duley 2003].

1.1.4. Risikofaktoren und Diagnostik

Derzeit existiert noch kein aussagekräftiger Test, der die frühe und sichere Diagnose

einer Präeklampsie ermöglicht [Conde-Agudelo et al. 2004]. Es kann allerdings eine

Risikoabschätzung anhand der Anamnese erfolgen. Im Falle einer positiven Eigen- oder

Familienanamnese, bei bestehendem Diabetes mellitus Typ I, chronischer Hypertonie,

Erstparität oder einem Lebensalter von über 40 Jahren ist das relative Risiko für eine

Präeklampsie deutlich erhöht [Dekker & Sibai 2001]. Auch bei vorbestehender

Nierenerkrankung [Murakami et al. 2000] oder der Autoimmunerkrankung Lupus

erythematodes mit Nierenbeteiligung [Julkunen 1998] kommt es zu einer

Risikosteigerung. Weiterhin gilt: Je früher die Präeklampsie auftritt, desto höher ist die

Gefahr für ein Wiederauftreten in einer folgenden Schwangerschaft. Bei einer

Manifestation vor der 28. SSW liegt das Wiederholungsrisiko bei über 60% [Steinhard

& Klockenbusch 1999]. Abzugrenzen von diesen generellen Faktoren sind

schwangerschaftsbedingte Risikofaktoren. So erhöht sich laut einer Studie von Dekker

und Sibai das Risiko für die Entwicklung einer Präeklampsie bei Vorliegen einer

Mehrlingsschwangerschaft oder Gestationsdiabetes. Ebenso kann eine Blasenmole oder

eine Hydrops fetalis für die Entstehung einer Präeklampsie verantwortlich sein [Dekker

& Sibai 2001]. Auch ein, in der Dopplersonographie über die 24. vollendete SSW

hinaus, persistierendes bilaterales Notching der Aa. uterinae kann auf die Entwicklung

einer Präeklampsie hindeuten. Dabei versteht man unter einem Notch eine Veränderung

in der Flusskurve der A. uterina in Form einer postsystolischen Inzisur mit

vermindertem enddiastolischem Fluss beziehungsweise erhöhtem Widerstand. Bei

1 Einleitung

8

deutlichen Notches und/oder stark reduziertem diastolischem Blutstrom tritt in über

60% der Fälle eine Präeklampsie auf [Yu et al. 2005].

Neben Erhebung der Anamnese und dopplersonographischer Untersuchung im zweiten

Trimenon sind die regelmäßige Blutdruck- sowie Gewichtskontrolle von entscheidender

Bedeutung. Um einen Bluthochdruck differentialdiagnostisch in der Schwangerschaft

weiter abzuklären, sollte eine 24-Stunden-Blutdruckmessung erfolgen, welche ebenso

der Überprüfung des Erfolges therapeutischer Maßnahmen dient [Shennan et al. 1993].

Eine deutliche Gewichtszunahme von > 1 kg pro Woche ist Ausdruck sich rasch

entwickelnder Ödeme und gilt im 3. Trimenon als prognostisch ungünstiges Zeichen.

Als weitere Maßnahme zur Früherkennung einer Präeklampsie kommt die

Labordiagnostik zum Einsatz. Im Vordergrund steht hierbei die Bestimmung des

Gesamtproteins im 24-Stunden-Sammelurin. Diese Untersuchung sollte bei allen

Patientinnen mit de novo Hypertension in der Schwangerschaft erfolgen [Gangaram et

al. 2005]. Des Weiteren sollte neben der Untersuchung von Blutbild und Gerinnung die

Bestimmung von Harnsäure, Kreatinin sowie Leberwerten erfolgen. Charakteristisch für

die Entwicklung eines HELLP-Syndroms ist ein Abfall der Thrombozytenzahl (<

100.000/µl), ein Anstieg der Leberenzyme sowie pathologisch veränderte

Hämolyseparameter mit einem Abfall des Haptoglobin-Wertes unter den Normbereich.

Ferner kann eine augenärztliche Untersuchung helfen, die bei schwerer Präeklampsie

auftretenden retinalen Einblutungen oder ein Papillenödem frühzeitig zu erkennen.

Die Leitsymptome Hypertonie und Proteinurie dienen als wichtigster Anhalt bei der

Diagnose einer Präeklampsie, doch können sie ebenso fehlen. So liegt bei der

Maximalvariante der Präeklampsie, dem HELLP-Syndrom, in etwa 5 bis 15% der Fälle

keine signifikante Proteinurie und in bis zu 20% der Fälle keine Hypertonie vor. Bei

15% lassen sich weder Proteinurie noch Hypertonie nachweisen [Rath 1994].

1.1.5. Ätiologie und Pathogenese

Die Pathogenese der Präeklampsie ist noch weitestgehend unklar, doch scheint eine

Störung bei der Trophoblasteninvasion vorzuliegen, was eine plazentare

Minderperfusion zur Folge hat. In einer normalen Schwangerschaft läuft die

Plazentation in zwei Phasen ab. Zunächst infiltriert der Trophoblast die mütterliche

1 Einleitung

9

Dezidua und das benachbarte Myometrium bis zum Ende des ersten Trimenons. Nach

einer anschließenden vierwöchigen Ruhephase beginnt eine zweite Invasionsphase. Die

Spiralarterien werden durch die kindlichen Zellen eröffnet und die Endothelschicht bis

in das innere Myometriumdrittel ersetzt. Es kommt zur Dilatation der tieferen Radial-

und oberflächlichen Spiralarterien, um den Blutfluss an den erhöhten Bedarf des Fetus

anzupassen.

Abbildung 1: a) Uteroplazentares Gefäßsystem mit physiologischer Dilatation der Spiralarterien.

b) Pathologisches uteroplazentares Gefäßsystem mit teilweise fehlender Dilatation der Spiralarterien bei

Präeklampsie (aus „Sonographische Diagnostik in Gynäkologie und Geburtshilfe“, Band 2, Hrsg.: E.

Merz).

Als Grundlage für die Entstehung einer Präeklampsie wird eine Störung in der

Frühphase der Plazentation angenommen. Durch noch unbekannte Mechanismen

kommt es zu einer mangelnden Invasion des Trophoblasten in die mütterliche Dezidua

und das Myometrium mit unzureichendem Umbau mütterlicher myometraler

Spiralarterien. Hieraus resultiert eine Minderperfusion der Plazenta mit nachfolgenden

nekrotischen und apoptotischen Prozessen im plazentaren Gewebe [Reister et al. 2001;

Kadryrov et al. 2006]. Im Folgenden werden von der ischämischen Plazenta

Zellfragmente sowie Proteine freigesetzt, welche in den mütterlichen Kreislauf

gelangen. So konnte eine erhöhte Konzentration von Trophoblastzellen und zellfreier

fetaler DNA im maternalen Plasma nachgewiesen werden [Holzgreve et al. 1998; Lo et

al. 1999]. Letztlich kommt es zu einer Aktivierung des mütterlichen Immunsystems

sowie zu einer Endothelzellaktivierung mit der Folge der bekannten Symptomatik einer

Präeklampsie [Redman & Sargent 2003].

1 Einleitung

10

Serumfaktoren bei der Präeklampsie

TNF-alpha

Verschiedene Studien zeigten, dass TNF-alpha im Serum schwangerer Frauen mit

Präeklampsie [Visser et al. 1994; Vince et al. 1995] oder HELLP-Syndrom

[Kupferminc et al. 1994] erhöht ist. TNF-alpha ist neben Interleukin-1ß in der Lage,

Endothelzellen in vitro zu stimulieren und so die Bildung der Adhäsionsmoleküle

VCAM-1, ICAM-1, E-Selektin sowie P-Selektin anzuregen [Mantovani et al. 1992;

Introna et al. 1993]. Doch konnte gezeigt werden, dass diese Zytokine die Aktivierung

der Endothelzellen nicht erklären und ihre Bestimmung weniger sinnvoll für den

Nachweis einer Präeklampsie ist [Heyl et al. 1999]. Eindeutig hingegen scheint zu sein,

dass die durch Plazentazellen dysregulierte Zytokin-Expression eine wesentliche Rolle

bei der Entstehung „toxischer“ Faktoren spielt und so die Symptomatik einer

Präeklampsie provoziert [Rusterholz et al. 2007].

sFlt1, VEGF, PIGF, sENg

Bei der löslichen fms-like Tyrosinkinase (sFlt1) handelt es sich um ein anti-

angiogenetisches Protein, welches in der Lage ist, die Proteine vascular endothelial

growth factor (VEGF) und placental growth factor (PIGF) zu binden. Bei Patientinnen

mit Präeklampsie konnte ein Anstieg der Konzentration von zirkulierendem sFlt1 fünf

Wochen vor Beginn der Symptomatik beobachtet werden, begleitet von einem Abfall

der Konzentration an frei zirkulierendem VEGF und PIGF [Levine et al. 2004]. Des

Weiteren zeigte sich neben dem Anstieg von sFlt1 eine Erhöhung der Konzentration

von löslichem Endoglin, ein weiteres anti-angiogenetischen Protein, welches ebenfalls

zur Pathogenese der Präeklampsie beizutragen scheint [Levine et al. 2006].

Letztendlich wird deutlich, dass die Präeklampsie ein multifaktoriell bedingtes

Krankheitsbild darstellt, dessen Ursache noch nicht eindeutig geklärt ist [Chen et al.

2010]. Fakt ist, dass die Plazenta die Grundlage der Präeklampsie bildet [Redman &

Sargent 2003]. Denn hierbei handelt es sich um eine schwangerschaftsspezifische

Erkrankung, welche auch ohne Fet bei Vorliegen einer Blasenmole auftreten kann

[Dekker & Sibai 2001] und deren Symptome durch Entbindung, das heißt durch die

Entfernung der Plazenta, verschwinden.

1 Einleitung

11

1.1.6. Therapie und Prognose

Die Einleitung einer medikamentösen Therapie sollte erst bei anhaltenden

Blutdruckwerten von > 170 mmHg systolisch und/oder > 110 mmHg diastolisch

erfolgen, bei vorbestehendem Hochdruck oder anderer Propfkonstellation bereits ab

Werten von > 160/100 mmHg [Redman 1976; Sibai 1996; Leveno & Cunningham

1999; Report of the National High Blood Pressure Education program 2000]. Dies hat

zum Ziel, maternalen zerebro- sowie kardiovaskulären Komplikationen vorzubeugen,

wobei die Prävention zerebraler Blutungen im Vordergrund steht. Insbesondere bei

Patientinnen mit schwerer de novo Hypertension, mit noch nicht an die hohen

Blutdruckwerte adaptiertem zerebralem Gefäßsystem, kann es zu Störungen der

zerebrovaskulären Autoregulation mit nachfolgender Hyperperfusion kommen

[Strandgaard & Paulson 1990], woraus ein erhöhtes Risiko für zerebrale Blutung

resultiert.

Antihypertensivum der Wahl ist in der Schwangerschaft Alpha-Methyldopa. Alternativ

kann eingeschränkt auch Nifedipin, Metoprolol oder Dihydralazin verabreicht werden.

Nicht geeignet hingegen sind aufgrund einer embryo-/ fetotoxischer Wirkung unter

anderem Diuretika, ACE-Hemmer und Angiotensin-II-Rezeptorblocker [AWMF-

Leitlinien 2007]. Trotz Fehlens randomisierter Studien besteht heute eine generelle

Übereinstimmung hinsichtlich der Notwendigkeit einer antihypertensiven Therapie für

die Mutter in der Schwangerschaft bei Blutdruckwerten von > 170/110 mmHg [Brown

et al. 2001; Duley et al. 2006]. Im Gegensatz dazu zeigten Studien, dass eine

medikamentöse Therapie bei milder bis mittelschwerer Hypertonie lediglich von

geringem mütterlichem Nutzen ist [Abalos et al. 2007], jedoch die Rate

wachstumsrestriktierter Kinder mit vermindertem Geburtsgewicht ansteigt [Von

Dadelszen et al. 2000; Magee & Duley 2003].

Hinsichtlich der antikonvulsiven Therapie ist bei Patientinnen mit Präeklampsie das

Mittel der ersten Wahl zur Prophylaxe einer Eklampsie Magnesiumsulfat, welches das

Risiko einer Eklampsie um mehr als die Hälfte senkt [Duley et al. 2006]. Auch bei

manifester Eklampsie stellt Magnesiumsulfat das Mittel der Wahl dar. Weiterhin konnte

eine Überlegenheit dieses Medikamentes gegenüber anderen Antikonvulsiva wie

Phenytoin oder Diazepam hinsichtlich der Prävention erneuter eklamptischer Anfälle

und neonataler Ereignisse gezeigt werden [The Eclampsia Trial Collaborative Group

1995].

1 Einleitung

12

Letztendlich stellt die einzige kausale Therapie der Präeklampsie die Entbindung dar

[Schoonjans 1995]. Ein „Hinauszögern“ der Schwangerschaft dient in erster Linie der

Vermeidung einer Frühgeburt. Der Zeitpunkt der Entbindung ist im Wesentlichen vom

Gestationsalter abhängig und in der Regel nach der vollendeten 37. SSW indiziert

[Brown et al. 2000; Sibai 2003]. Bei schwerer Präeklampsie sollte die Entbindung ab

der vollendeten 34. SSW möglichst zeitnah erfolgen [ACOG Practice Bulletin No. 33

2002]. Dies gilt insbesondere bei Vorliegen schwerer Komplikationen wie fetaler

Wachstumsrestriktion (< 5. Perzentil) und pathologischem Dopplerbefund [Alfirevic &

Neilson 1995; Westergaard et al. 2001]. Bei drohender Frühgeburt (SSW 24+0 bis

33+6) ist die einmalige Verabreichung von zweimal 12 mg Betamethason intramuskulär

im Abstand von 24 Stunden zur Förderung der kindlichen Lungenreife indiziert

[Crowley 2000]. Nach Möglichkeit sollte die Entbindung nach Abschluss der RDS-

Prophylaxe erfolgen, wobei die Dringlichkeit der Schwangerschaftsbeendigung

abgewogen werden muss [Report of the National High Blood Pressure Education

program 2000]. Die Entscheidung bezüglich des Geburtsmodus ist in Abhängigkeit vom

Schweregrad und Verlauf der Erkrankung sowie von den Erfolgsaussichten auf eine

vaginale Entbindung zu stellen [Rath 2005].

Tritt eine Präeklampsie bereits vor Erreichen der 24. SSW auf, ist mit einer gesteigerten

maternalen Morbidität sowie Mortalität zu rechnen [Sibai 1990; Gaugler-Senden et al.

2006]. Die Entscheidung über die Fortführung einer Schwangerschaft ist individuell zu

treffen, wobei die Vermeidung mütterlicher Komplikationen im Vordergrund steht. In

der Vergangenheit haben verschiedene Studien gezeigt, dass für Patientinnen mit bereits

in früheren Schwangerschaften aufgetretener Präeklampsie ein erhöhtes

Wiederholungsrisiko besteht [Dukler et al. 2001, Sibai et al. 1991]. Es zeigte sich, dass

die frühe Gabe von Acetylsalicylsäure in der Schwangerschaft das Risiko für eine

Präeklampsie und die perinatale Mortalität senken kann [Coomarasamy et al. 2003;

Bujold et al. 2009].

Auch besteht für das höhere Lebensalter die Gefahr der Entwicklung von

Langzeitfolgen. So ist das Risiko für kardiovaskuläre Erkrankungen im höheren

Lebensalter im Vergleich zu einer unkompliziert verlaufenden Schwangerschaft

gesteigert. Weiterhin zeigte sich für Kinder erkrankter Mütter ein gesteigertes Risiko,

im Erwachsenenalter an Diabetes mellitus oder Bluthochdruck zu erkranken [Wilson et

al. 2003].

1 Einleitung

13

1.2. Massenspektrometrische Proteinanalytik

1.2.1. MALDI-ToF-MS

Der Begriff Massenspektrometrie (MS) bezeichnet ein Verfahren zur Bestimmung der

Molekülmassen freier Ionen im Hochvakuum und ist ein wichtiges Verfahren zur

Charakterisierung von Proteinen. Das Grundprinzip besteht in der Ionisierung der

Bestandteile einer Probe und Auftrennung dieser nach ihren molekularen Massen. Das

erste moderne Massenspektrometer ist der von F. W. Aston im Jahre 1919 gebaute

Massenspektrograph. Ziel von Aston war es, mit Hilfe dieses Gerätes die Massen

verschiedener Isotope bestimmen und unterscheiden zu können.

Ein modernes Massenspektrometer ist aus einer Ionenquelle, einem Massenanalysator

und einem Detektor aufgebaut. Eine Möglichkeit der Ionisierung von Proteinmolekülen

ist die Matrix-assistierte Laser Desorption/Ionisation (MALDI). Die Probe wird dabei

mit einer Matrixsubstanz vermischt und der Analyt so auf die Probe präpariert. Die

Matrix erfüllt hierbei mehrere Funktionen: Zum einen absorbiert sie den Hauptteil der

Energie aus dem Laserimpuls und schützt die Probe so vor photolytischer Zersetzung,

zum anderen überträgt sie die für die Desorption notwendige Energie auf die

Probenmoleküle, welche dadurch in einen gasförmigen Zustand übergehen. Des

Weiteren kommt es zum Protonentransfer zwischen Matrix und Analyt, wodurch dieser

schließlich positiv geladen wird. Schließlich bewirkt die Matrix eine Reduktion der

Wechselwirkungen der Probenmoleküle untereinander sowie mit der Metalloberfläche

des Probenträgers, wodurch die Desorption erleichtert wird [Kienbaum et al. 2009]. Die

Entscheidung für eine entsprechende Matrix ergibt sich aus der Einstrahlwellenlänge

des Lasers und den Präparationsbedingungen für die Analytmoleküle.

Die Freisetzung der ionisierten Matrix- sowie Proteinmoleküle erfolgt explosionsartig

während des Prozesses der Ionisierung. Bei einem Flugzeit-Massenspektrometer, dem

sogenannten Time-of-Flight-Massenspektrometer (ToF-MS) erfahren sie anschließend

eine starke elektrostatische Beschleunigung, ehe sie in einer feldfreien Flugröhre

(Analysator) in Richtung Detektor wandern, wobei die Ionen hinsichtlich ihres

Verhältnisses von Masse zu Ladung getrennt werden. Beim Flugzeit-

Massenspektrometer verfügen alle Ionen bei Eintritt in den Analysator über die gleiche

Energie und die Geschwindigkeit der einzelnen Ionen hängt letztlich von ihrer

jeweiligen Masse und Ladung ab, mathematisch ausgedrückt von dem Quotienten aus

Masse und Ladung (m/z). Folglich sind leichte Ionen schneller als schwere und

1 Einleitung

14

erreichen den Detektor früher. Unter Berücksichtigung der Ladung werden

zweifachgeladene Ionen stärker beschleunigt als einfachgeladene Ionen und erreichen

demzufolge den Detektor in der Hälfte, der sonst von dem Molekül benötigten Zeit. Die

sich ergebenden Zeitdifferenzen werden exakt gemessen und ermöglichen so eine

Berechnung der entsprechenden molekularen Massen [Bantscheff & Glocker 2001]. Das

Ergebnis kommt in Form eines Spektrums zur Darstellung. In diesem sind die einzelnen

Proteine als Ionensignale abgebildet, welche jeweils einen definierten m/z- Wert

aufweisen.

Abbildung 2: Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs eines Massenspektrometer.

2 Zielsetzung

15

2 Zielsetzung

Ziel dieser Arbeit ist es, mit Hilfe der Massenspektrometrie proteomische

Biomarkersignaturen im Serum schwangerer Frauen zu identifizieren, anhand derer es

möglich ist, ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung einer Präeklampsie frühzeitig zu

erkennen. Im wesentlichen Kontext dieser Arbeit steht die Frage danach, ob im

Vergleich zu einer normalen Schwangerschaft, bei der Präeklampsie ein auffälliges

Proteinprofil im Blutserum nachweisbar ist. Diese Studie dient damit der Vorbereitung

auf die Identifzierung prognostischer Marker der Präeklampsie. Derzeit existiert noch

kein aussagekräftiger Test zur sicheren Früherkennung der Erkrankung [Conde-Agudelo

et al. 2004]. Eine spezifische Protein-Signatur könnte helfen, die Präeklampsie noch vor

Auftreten der klinischen Symptomatik und der damit verbundenen Komplikationen zu

demaskieren, und folglich die Möglichkeit schaffen, zeitnah entsprechende

therapeutische Maßnahmen einzuleiten. Die Vielzahl biochemischer Prozesse, welche

zur Entstehung einer Präeklampsie beitragen, erschwert die Diagnose dieses komplexen

Krankheitsbildes mittels eines einzelnen Markers [Cone-Agudelo et al. 2004]. Eine

entsprechende Proteomsignatur würde folglich ein entscheidendes diagnostisches Mittel

darstellen, wodurch sich letztlich fetale sowie maternale Morbidität und Mortalität

senken ließen. Darüber hinaus ließen sich so Frauen für präventive Studien rekrutieren.

3 Material und Methoden

16

3 Material und Methoden

Diese Studie wurde an der Universitätsfrauenklinik Aachen konzipiert. Insgesamt

wurden 24 schwangere Frauen untersucht, die sich zwischen Oktober 2006 und

Dezember 2009 in stationärer Behandlung der Universitätsfrauenklinik befanden. Alle

Experimente wurden im Proteom-Zentrum Rostock durchgeführt. Die erhobenen Daten

wurden in der hausinternen Datenbank (Proteobase) gespeichert.

3.1. Material

3.1.1. Probengewinnung

Zu Beginn der Studie erfolgte deren Prüfung durch die Ethikkommission der RWTH

Aachen (EK 138/06). Jede, an der Studie teilnehmende Patientin hatte nach einem

ausführlichen Aufklärungsgespräch ihr schriftliches Einverständnis erteilt.

In dem Zeitraum von Oktober 2006 bis Dezember 2008 wurde Blut nach dem unten

angegebenem Protokoll abgenommen. Es wurden Probandinnen mit unkompliziertem

Schwangerschaftsverlauf nach dem matched-pairs-Prinzip ausgesucht: Jeder gesunden

Kontroll-Probe (KO) wurde jeweils eine Präeklampsie-Probe (PE) zugeordnet, wobei

darauf geachtet wurde, dass Gestationsalter, maternales Alter sowie der präpartale

Body-Mass-Index (BMI) einander weitestgehend entsprachen. Auch

Rauchgewohnheiten sowie die Gabe von Betamethason (RDS-Prophylaxe) wurden

berücksichtigt.

Die Präeklampsie wurde durch folgende Kriterien definiert:

1. Arterieller Bluthochdruck mit Werten von > 140/90 mmHg zu zwei oder

mehreren Zeitpunkten bzw. in der 24-Stunden-Blutdruckmessung während der

Schwangerschaft bei gleichzeitig normotensiven Werten vor Eintritt der

Schwangerschaft

2. Proteinurie > 300 mg im 24-Stunden-Sammelurin oder in der Urin-

Teststreifenanalyse (Urin-Dipsticks) ein Nachweis von mindestens 2+

Diese Kriterien beziehen sich auf die Definition der Internationalen Gesellschaft zum

Studium für Hypertension in der Schwangerschaft und den Bericht des US National

3 Material und Methoden

17

High Blood Pressure Education program [Report of the National High Blood Pressure

Education program 2000; Brown et al. 2000]. Bei den PE-Proben handelt es sich

ausschließlich um early-onset-Präeklampsien mit Beginn der Symptomatik vor der 34.

+ 0 SSW ohne bekannte Wachstumsrestriktion des Kindes [Dadelszen et al. 2003, Villar

et al. 2006]. Das Gestationsalter wurde anhand des ersten Tages der letzten Periode

ermittelt und durch eine Ultraschalluntersuchung zwischen der 10. und 14. SSW

bestätigt. Das Perzentil für das Geburtsgewicht des Neugeborenen wurde mit Hilfe der

Wachstumsskalen für Neugeborene der Bundesrepublik Deutschland von 1996

bestimmt [Voigt et al. 1996]. Neben fetaler Wachstumsrestriktion galten als weitere

Ausschlusskriterien Infektionen, Diabetes mellitus, Gestationsdiabetes sowie das

Vorliegen eines HELLP-Syndroms.

Zum Zeitpunkt der Blutentnahme erfolgte die Dokumentation von Blutdruck,

Proteinurie sowie Gestationsalter. Keine der Patientinnen wies zu dieser Zeit

Wehentätigkeit auf. Die Blutentnahme erfolgte bei Aufnahme der Patientin nach 10

minütiger Ruhephase im Liegen, pränatal aus der rechten oder linken Kubitalvene unter

Verwendung weißer Serummonovetten (Serum Z/9 ml, Monovette). Nach 15- bis 30-

minütiger Inkubation wurden die Proben bei 2000g und Raumtemperatur für 15

Minuten zentrifugiert. Die Sedimentation der zellulären Blutbestandteile ermöglichte

die Aspiration des Serums, welches schließlich in Eppendorf Tubes zu je 100 µl

aliquotiert und bei –80 °C eingelagert wurde. Alles in allem erfolgte die Bearbeitung

der Proben nach einem standardisierten Protokoll und umfasste von der Blutentnahme

bis zur endgültigen Lagerung maximal 60 Minuten.

3.1.2. Chemikalien

Chemikalien Firma Produktnr.

1,5 Diaminoaphthalene 97% Sigma-Aldrich, Taufkirchen, D D212000-256

2,5 Dihydroxybenzösäure (DHB) Laser Biolabs, Sophia-Antipolis

Cedex, F

M103

4-Hydroxy-3methoxy-zimtsäure

(Ferulasäure)

Sigma-Aldrich, Taufkirchen, D W518301

3 Material und Methoden

18

Acetonitril Merck, Darmstadt, D 990

Alpha-cyano-4hydroxy-

zimtsäure

Bruker Daltonik, Bremen, D 201344

Bromophenol Blau Sigma-Aldrich, Taufkirchen, D B- 0126

Broad Range Marker Kit New England BioLabs Inc.,

Frankfurt am Main, D

P7702S

Coomassi-Brillant-Blau G-250 Serva, Heidelberg, D 17524.02

Ethanol, LiChrosolv Merck, Darmstadt, D 1.117.271.00

0

Glycerol Serva, Heidelberg, D 26710

Isopropanol J. T. Baker, Deventer, NL 8067

n-Octyl ß-D-glucopyranoside Sigma-Aldrich, Taufkirchen, D O9882

Profiling Kit 100 MB-HIC8 Bruker Daltonik, Bremen, D 219041

Peptide Kalibrant Standard Bruker Daltonik, Bremen, D 206195

Protein Kalibrant Standard I Bruker Daltonik, Bremen, D 206355

Protein Kalibrant Standard II Bruker Daltonik, Bremen, D 207234

SDS Serva, Heidelberg, D 20765

SDS-Polyacrylamid Gel 10% T Invitrogen, Carlsbad, CA, USA NPO341BOX

SDS Polyacrylamid Gel 12% T Invitrogen, Carlsbad, CA, USA NPO301BOX

Trifluoroacetic acid (TFA) Fluka, Buchs, CH 91699

Tris HCl Roth, Karlsruhe, D 5429.2

Trypsin Promega, Madison, WI, USA V5111

3.1.3. Geräte und Zubehör

Hardware Firma

AnchorChip 600/384 target plate Bruker Daltonik, Bremen, D

Dade Behring Nephelometer II Dade Behring, Marburg, D

Eppendorf Tubes Eppendorf AG, Hamburg, D

Magnetischer Bead Separator Dynal AS, Oslo, N

MTP 384 target plate ground steel TF Bruker Daltonik, Bremen, D

3 Material und Methoden

19

Mini spin, Zentrifuge Eppendorf AG, Hamburg, D

Novex Mini-Cell Vertical Elektrophorese

System

Invitrogen, Carlsbad, CA, USA

ReflexIII MALDI-ToF-Massenspektrometer Bruker Daltonik, Bremen, D

Serummonovette Serum Z/9 ml Monovette Sarstedt, D

Speed Vac SPD 111V Eppendorf AG, Hamburg, D

Ultraschallbad Transsonic T460 Hettich, Tuttlingen, D

Umax Mirage II Scanner Biostep GmbH, Jahnsdorf, D

Vortex-Genie 2 Scientific Industries Inc., New York,

USA

3.1.4. Software

Software Firma

Bruker Daltonics FlexAnalysis, Version 2.4 Bruker Daltonik, Bremen, D

BioTools, Version 3.0 Bruker Daltonik, Bremen, D

ClinProTools 2.2 Bruker Daltonik, Bremen, D

in-Haus Datenbank SWALL (Swiss-Prot release

56.8, TrEMBL release 39.8)

Matrix Science, London, UK

Mascot search engine Version 2.2.03 Matrix Science, London, UK

MedCalc statistical software, Version 9.4.2.0 MedCalc Software bvba,

Mariakerke, B

Origin software, Version 6.1G OriginLabCorporation,

Northampton, MA, USA

Phoretix 2D Advance, Version 6.01 Nonlinear Dynamics Ltd.,

Newcastle upon Tyne, UK

3 Material und Methoden

20

3.2. Methoden

Alle experimentellen Schritte wurden in kontinuierlich klimatisierten Räumlichkeiten

durchgeführt, in denen stets die selben Bedingungen vorlagen (Raumtemperatur 21 +/-

0,5 °C, Luftfeuchtigkeit 40 +/-1%). Für die einzelnen Reaktionsschritte wurden generell

nur hochreine Chemikalien verwendet.

3.2.1. Proteinseparation mittels magnetischer Beads

Bevor mit den Messungen begonnen wurde, erfolgte zunächst die Aufarbeitung der

einzelnen Serumproben mit Hilfe des Profiling Kits 100 MB-HIC8 der Firma Bruker

Daltonik. Das war erforderlich, um Proteine wie beispielsweise Albumin oder auch

Salze aus den Serumproben zu entfernen. Diese lagen im Serum in einem hohen

Quantum vor und machten eine Auswertung der Spektren infolge einer Vielzahl von

Signalen, welche sich gegenseitig störten und überlagerten, unmöglich.

Das Profiling Kit 100 MB-HIC8 enthielt alle, für die Fraktionierung nötigen Lösungen.

Nach Durchführung der entsprechender Trenn- und Waschschritte erhielt man eine

durch die verwendete Bead-Oberfläche definierte Fraktion der Proteine im organischen

Lösungsmittelgemisch. Die Fraktionierung mit Hilfe des Profiling Kits 100 MB-HIC8

basiert auf dem Umkehrphase-Prinzip (reversed phase interaction). Das bedeutet, dass

eine unpolare stationäre Phase sowie eine polare mobile Phase vorliegen, wodurch

polare Stoffe leicht und lipophile Stoffe schwer eluiert werden. Die Bearbeitung der

Proben erfolgte nach einem standardisierten Protokoll (Product Information: Profiling

Kit MB-HIC8, Bruker Daltonik) und gestaltete sich wie folgt: Zu Beginn der

Fraktionierung wurden die magnetischen Beads leicht geschüttelt, um eine möglichst

homogene Suspension zu erhalten. Im Anschluss wurden jeweils 5 µl Serumprobe mit 5

µl der MB-HIC8 beads und 10 µl Bindungspuffer in einem 1 ml Eppendorf Tube

inkubiert und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gut vermischt. Nach einer

weiteren Minute Inkubation wurden die Beads mit Hilfe eines magnetischen Bead

Separators (MBS), einem Gestell mit einseitigem Magneten, vom Überstand getrennt,

so dass dieser abpipettiert und verworfen werden konnte. Als Nächstes wurden 100 µl

Waschpuffer hinzugefügt, das Reaktionsgefäß erneut im MBS platziert und 20-mal

vorsichtig vor- und zurückgedreht. Der Überstand wurde wiederum abpipettiert und

verworfen. Dieser Schritt wurde zweimal wiederholt und diente der Auswaschung

solcher Proteine, die nicht durch die Beads gebunden worden waren. Im letzten Schritt

3 Material und Methoden

21

wurden schließlich alle über die Beads gebundenen Proteine von deren Oberfläche

mittels eines Elutionspuffers, bestehend aus 50% Acetonitril (ACN) und Reinstwasser,

gelöst. Nach etwa einer Minute wurde das Tube erneut für 30 Sekunden im MBS

platziert, wodurch sich die Beads an einer Seite des Tubes sammelten. Anschließend

konnte der Überstand abpipettiert und in ein frisches Reaktionsgefäß überführt werden.

Das gewonnene Eluat stand nun für die Messung zur Verfügung.

In der folgenden Abbildung sind die einzelnen Arbeitsschritte der Aufarbeitung der

Serumproben mittels des Profiling Kits 100 MB-HIC8 nochmals vereinfacht dargestellt.

Abbildung 3: Schematische Darstellung der einzelnen Arbeitsschritte bei Aufarbeitung der Serumproben

mittels magnetischer Beads.

3.2.2. Proteinseparation mittels fraktionierter Fällung

Das Fällen von Proteinen ist eine weitverbreitete Möglichkeit der Trennung von

Proteinen von einer Lösung. Dies kann zur Aufreinigung oder Aufkonzentrierung von

Proteinen genutzt werden sowie zur Entfernung von Proteinen aus einer Lösung.

In dieser Studie wurden die Serum-Proben nach einem Standardverfahren fraktioniert

gefällt [Cohn et al. 1944]. Zunächst wurden jeweils 10 µl Serumprobe mit eisgekühlten

7 µl Ethanol (-20 °C; 40% Ethanol, vol/vol) versetzt und für 10 Minuten auf Eis gelegt.

Im Anschluss erfolgte die Zentrifugation bei 13.000 g und 4 °C. Das dadurch

gewonnene Proteinpellet entsprach der Fraktion I. In einem zweiten Schritt wurden die

in dem Überstand (17 µl) gelösten Proteine durch Zugabe von 3 µl Ethanol (50%

3 Material und Methoden

22

Ethanol, vol/vol.) ausgefällt. Es erfolgte erneut die Inkubation für 10 Minuten bei -20

°C sowie die anschließende Zentrifugation bei 13.000 g und 4 °C. Das so entstandene

Proteinpellet entsprach nun der Fraktion II. Bevor allerdings die Messung des Pellets

erfolgen konnte, musste dieses erneut in 10 µl einer Suspension, bestehend aus 50%

Acetonitril (ACN), 0,3% Trifluoressigsäure (TFA) und 5 mM n-OGP gelöst und mit

einem Vortexer für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 400 Runden pro Minute

geschüttelt werden.

3.2.3. Massenspektrometrie

Targetpräparation

Im Anschluss an die Probenfraktionierung mittels des Profiling Kits 100 MB-HIC8

wurden zunächst 0,5 µl des Eluats auf einen Probenträger, das sogenannte Target (MTP

384 target plate ground steel T F, Bruker Daltonik), präpariert. Anschließend wurden,

ohne den Spot zu berühren, 0,5 µl einer Matrixlösung hinzupipettiert. Als Matrix diente

eine gesättigte Ferulasäure-Lösung (4-Hydroxy-3methoxy-zimtsäure), gelöst in 33%

ACN und 0,1% TFA. Für die Aufbereitung von 4-Hydroxy-3methoxy-zimtsäure, wurde

zunächst ein 1,5-ml-Eppendorf-Gefäß bis zur Hälfte mit vorgefertigter Ferulasäure der

Firma Sigma-Aldrich (Taufkirchen, D) gefüllt. Anschließend wurde 1 ml einer Lösung,

bestehend aus 33% ACN und 0,1% TFA, hinzugegeben. Diese Suspension wurde im

nächsten Schritt für wenige Sekunden gevortext und für fünf Minuten ins Ultraschallbad

gestellt, bis eine gesättigte Lösung entstand. Im Anschluss erfolgte für eine Minute die

Zentrifugation bei 13.000 g und Raumtemperatur. Danach wurde die Suspension für ca.

15 Minuten inkubiert, um anschließend erneut für drei Minuten zentrifugiert zu werden.

Nach diesen letzten Schritten konnte der Überstand des Eppendorf-Gefäßes abpippetiert

werden und stand als Matrix für die Messung der Serumproben mit dem MALDI-ToF-

Massenspektrometer zur Verfügung.

Nach der Präparation von Probe und Matrix auf das Target musste einige Minuten

gewartet werden, bis die einzelnen Spots getrocknet waren. Erst dann konnte das Target

in das Gerät gefahren werden. Für jede Probe wurde jeweils ein Spot pro Messung

3 Material und Methoden

23

präpariert. Insgesamt wurden vier Messungen (M1-4) durchgeführt, für welche letztlich

96 Spots präpariert wurden.

Alternativ zur Probenfraktionierung mittels magnetischer Beads wurden alle

Serumproben auch fraktioniert gefällt. Bevor jedoch die Targetpräparation erfolgen

konnte, wurden nicht gelöste Rückstände abzentrifugiert. Anschließend wurden 0,5 µl

der fertigen Proteinlösung auf das Target (MTP 384 target plate ground steel TF,

Bruker Daltonik) präpariert und nachfolgend 1,5 µl gesättigte Ferulasäure, gelöst in

50% ACN und 0,1% wässriger TFA (33/67, vol/vol) hinzupipettiert. Auch in diesem

Fall wurde darauf geachtet, dass die Pipettenspitze den Spot nicht berührte. Nachdem

Proteinlösung und Matrix getrocknet waren, konnte das Target in das Gerät gefahren

werden. Die Messung wurde als Messung 5 (M5) bezeichnet.

Reflex III MALDI-ToF-Massenspektrometer

Die Messung der Proben erfolgte mit einem Reflex III MALDI-ToF-

Massenspektrometer der Firma Bruker Daltonik, ausgestattet mit einer SCOUT

Ionenquelle mit delayed extraction im linear positiv ion mode bei einer

Beschleunigungsspannung von 20 kV. Die Spektren wurden in einem niedrigen

Massenbereich (4-25 kDa) sowie in einem hohen Massenbereich (20-250 kDa)

aufgenommen. Die Laserintensität betrug ca. 80%, wobei im Schnitt 900 Schüsse

aufsummiert wurden. Die Spektren wurden mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen

Standard-Protein-Kalibranten der Firma Bruker Daltonik extern nachkalibriert.

Es wurden zwei unabhängige Messdurchgänge vorgenommen, wobei sich jeder

Messdurchgang aus zwei Einzelmessreihen (M) zusammensetzte. M1 und M2

resultierten aus einer ersten, M3 und M4 aus einer zweiten Probenfraktionierung mit

dem Profiling Kit 100 MB-HIC8. Für jede Messung und jede Probe wurde jeweils ein

Spot pipettiert, wobei die Spots für M1 und M2 beziehungsweise die Spots für M3 und

M4 aus jeweils einem Eluatansatz stammen. M5 ergab sich aus der Bearbeitung der

Proben durch fraktionierte Fällung. Insgesamt wurden für die 24 Proben 120 Spots in

fünf Messungen präpariert. Alle fünf Messungen wurden unabhängig voneinander

analysiert.

3 Material und Methoden

24

Abbildung 4: Reflex III MALDI-ToF-Massenspektrometer der Firma Bruker Daltonik (Bremen, D),

Standort: Proteom-Zentrum Rostock.

3.2.4. SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese

Nachdem die Serumproben fraktioniert gefällt wurden, erfolgte die Auftrennung der

verbliebenen Proteine nach ihrem Molekulargewicht mit Hilfe der SDS-Polyacrylamid

Gelelektrophorese.

Bei der SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese, auch kurz als SDS-PAGE bezeichnet,

handelt es sich um ein Verfahren zur Auftrennung von Molekülen in einem elektrischen

Feld. Die SDS-Page findet vor allem in der Analytik von Proteinen Anwendung. Bei

Sodiumdodecylsulfat (SDS) handelt es sich um ein anionisches Detergens, welches in

der Lage ist, die Proteine zu denaturieren. Diese zerfallen durch die Zugabe von SDS in

ihre Tertiär- sowie Sekundärstruktur, teilweise sogar Primärstruktur. Um auch die

Disulfidbrücken zu spalten, können optional reduzierende Thiole (zum Beispiel

Mercaptoethanol) hinzugegeben werden. Zur Auftrennung der Proteine dient schließlich

ein Gel aus Polyacrylamid, welches in geeignete Elektrolyte eingelegt ist. Es wird eine

elektrische Spannung angelegt, wodurch die Wanderung der negativ geladenen Proteine

in Richtung Pluspol (Anode) erfolgt. Kleine Proteine wandern nun relativ leicht durch

die Maschen des Gels, während große Proteine eher zurückgehalten werden.

Letztendlich ist die Wanderungsgeschwindigkeit abhängig von der Größe der SDS-

Proteinkomplexe sowie von der Porengröße des gewählten Gels. Am Ende des

3 Material und Methoden

25

Vorganges sind alle Proteine nach ihrer Größe sortiert und können durch eine

entsprechende Färbung visualisiert werden.

Zunächst wurde das Proteinpellet der Fraktion II nach fraktionierter Fällung in 300 µL

SDS Probenpuffer (2% SDS, 65 mM Tris/HCl (pH 6.8), 5% Glycerol und Bromophenol

Blau) bei Raumtemperatur gelöst. Die SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese

orientierte sich an einem standardisierten Protokoll [Kienbaum et al. 2009] und ist im

Folgenden kurz beschrieben. Es wurden 2 verschiedene Gele der Firma Invitrogen

verwendet: ein SDS-Polyacrylamid Gel 10% T für die Analyse der Proteine des hohen

Massenbereiches (20-250 kDa) sowie ein weiteres Gel 12% T für die Proteine des

niedrigen Massenbereiches (4-25 kDa). Unter Zugabe des Laemmli-Puffers (25 mM

tris, 192 mM Glycin, 0,1% SDS) liefen die Gele über eine Stunde bei 200 V in einem

Novex Mini-Cell Vertical Elektrophorese System (Invitrogen). Anschließend erfolgte

die Fixierung und Anfärbung der Banden mit Coomassie-Brillant-Blau G-250. Zur

Entfärbung diente eine Lösung aus 10% Ethanol, 2% Phosphorsäure und Reinstwasser.

Als molekularer Massenkalibrant diente ein Broad Range Marker Kit der Firma New

England BioLabs Inc. Zum Schluss wurden die Gele mit Hilfe eines Umax Mirage II

Scanners eingescannt und als TIFF-Datei elektronisch gespeichert.

3.2.5. Proteinidentifizierung

MS Peptide mass fingerprinting

Beim Peptide mass fingerprinting handelt es sich um ein analytisches Verfahren zur

Proteinidentifizierung. Zu diesem Zweck wird das unbekannte Protein mit

beispielsweise Trypsin verdaut, wodurch eine Vielzahl kleinerer Peptide entstehen,

deren Massen dann wiederum massenspektrometrisch bestimmt werden können. Mit

Hilfe einer geeigneten Software kann anschließend durch Vergleich der einzelnen

Peptidmassen mit bekannten Protein-Sequenzen das entsprechende Protein identifiziert

werden.

3 Material und Methoden

26

Bei der Auswertung der MS Spektren mit Hilfe der Software ClinProt tools 2.2 zeigte

sich das differentiellste Ionensignal bei m/z 13.715. Das diesem Ionensignal

zugrundeliegende Protein ließ sich auch nach fraktionierter Fällung der Serumproben

mittels SDS-PAGE visuell darstellen. Für die weitere Analyse wurde der entsprechende

Spot bei 13.000 Da ausgestochen und mit Trypsin (Promega) verdaut. Im Anschluss

wurden 0,8 µl Probe unter Verwendung von 1,6 µl Alpha-cyano-4hydroxy-zimtsäure

(CHCA) als Matrix auf ein AnchorChip 600/384 Target (Bruker Daltonik) präpariert.

Zur Erstellung der Matrixlösung CHCA wurde zunächst eine kleine Menge CHCA der

Firma Bruker Daltonik mit einer Spatelspitze in ein 1,5 ml Eppendorf-Gefäß gegeben.

Anschließend wurde 1 ml einer Lösung, bestehend aus 33% ACN und 0,1% TFA, zur

Verbindung hinzugegeben, die Suspension für wenige Sekunden gevortext und

nachfolgend für fünf Minuten ins Ultraschallbad gesetzt, bis eine gesättigte Lösung

entstand. Im nächsten Schritt erfolgte die Zentrifugation bei 13.000 g und

Raumtemperatur für eine Minute. Im Anschluss wurde die Suspension für 15 Minuten

inkubiert und erneut für drei Minuten zentrifugiert. Nach diesen letzten Schritten konnte

der Überstand des Eppendorf-Gefäßes abpippetiert werden und stand als Matrix zur

Verfügung. Die Messung erfolgte mit einem Reflex III MALDI-ToF-

Massenspektrometer der Firma Bruker Daltonik im positiven Ionen-Modus bei einer

Beschleunigungsspannung von 20 kV.

Um die Spektren extern nachzukalibrieren wurde ein Standard-Peptid-Kalibrant der

Firma Bruker Daltonik verwendet. Die interne Kalibration erfolgte mit Hilfe einzelner

Peptidionensignale, welche sich aus dem Verdau mit Trypsin ergaben. Sowohl die

Software FlexAnalysis 2.4 als auch BioTools 3.0 (Bruker Daltonik) halfen bei der

weiteren Bearbeitung und Analyse der Spektren. Die Datenbanksuche erfolgte gegen

die in-Haus Datenbank SWALL, welche wiederum mit den Programmen Swiss-Prot

und TrEMBL sowie der Software Mascot (Matrix Science, London, UK) arbeitete.

3.2.6. Nephelometrie

Die Nephelometrie ist ein optisches Analyseverfahren, mit dem sich die Konzentration

feinverteilter, kolloidaler Teilchen in Flüssigkeiten oder Gasen quantitativ bestimmen

lässt. Ein Nephelometer besteht aus einer Lichtquelle und einem Fotosensor, welcher im

3 Material und Methoden

27

rechten Winkel zum Lichtstrahl angeordnet ist. Die Partikeldichte ergibt sich aus der

Menge des von den einzelnen Partikeln reflektierten Lichtes. Die Konzentration von

Transthyretin einer jeden Serumprobe wurde nephelometrisch mit Hilfe des Dade

Behring Nephelometers II bestimmt. Dabei wurde nach dem Protokoll des Herstellers

verfahren. Der Referenzbereich für Transthyretin wurde mit 0,2–0,4 mg/ ml angegeben.

Für die nephelometrische Messung wurden jeweils 250 µl Serumprobe verarbeitet.

3.2.7. Software-unterstützte Quantifizierungsmethode

Für die verschiedenen Methoden kamen mehrere unabhängige Auswertestrategien zur

Anwendung.

Die Auswertung der MS-Spektren erfolgte mit Hilfe der Software ClinProtTools 2.2 der

Firma Bruker Daltonik. Diese Software bietet die Möglichkeit, potentielle Biomarker in

komplexen Proteingemischen zu identifizieren und so entsprechende Screeningtests für

die verschiedensten Krankheitsbilder zu entwickeln.

Die Softwareeinstellungen wurden zu Beginn der Auswertung festgelegt und für alle

Messungen beibehalten. Für die Auswertung wurden die insgesamt 24 Spektren einer

Messung in 2 Klassen hochgeladen. Klasse eins beinhaltete 11 PE-Spektren, Klasse

zwei 13 Kontroll-Spektren. Die Peakauswahl, das sogenannte peak picking, erfolgte

anhand des Summenspektrums der jeweiligen Gruppe. Die Einstellungsparameter

lauteten: signal to noise threshold 5,00; relative threshold base peak 0,00%, kein Limit

der Peakanzahl. Die Berechnung der Peaks erfolgte anhand ihrer jeweiligen Fläche

oder auch area. Zur Steigerung der Qualität der Spektren wurden diese mit Hilfe der

Software FlexAnalysis 2.4 der Firma Bruker Daltonik nachbearbeitet. Die Glättung der

Spektren erfolgte nach dem Savitsky–Golay Algorithmus, ein mathematisches

Verfahren für das Glätten von Zeitreihen, bei dem jeder Wert der Serie durch einen

neuen Wert ersetzt wird [Savitzky & Golay 1964]. Die Einstellungsparameter lauteten:

width 2,00 m/z; cycles 3.

Weiterhin wurden folgende Einstellungsparameter für die Software ClinProtTools 2.2

unter dem Punkt spectra preparation festgelegt: Die Baseline Substraction erfolgte im

„Top Hat Baseline Mode“ und „Null Spectra Exclusion“ war aktiviert. Die

Normalisierung der Spektren erfolgte anhand ihrer total ion count, kurz TIC.

3 Material und Methoden

28

Beim Hochladen der Spektren wurden diese von der Software automatisch

nachkalibriert. Dabei dienten solche Massen als Referenzmassen, die letztlich in 30%

aller Spektren vertreten waren. Üblicherweise standen mindestens 50% der Peaks für

die Kalibrierung der Spektren zur Verfügung. Die maximale Abweichung von

Referenzmasse zu Peakmasse war begrenzt auf 1500 ppm. Folglich wurden von der

Analyse solche Spektren ausgeschlossen, deren Peakmassen zu stark von den

Referenzmassen abwichen oder zu wenig Massen aufwiesen, anhand derer eine

Nachkalibration hätte erfolgen können.

Zur Ermittlung der statistischen Signifikanz der einzelnen Peaks der MS-Spektren

wurden diese mit Hilfe verschiedener mathematischer Testverfahren analysiert.

Zunächst sollte der p-Wert des Anderson-Darling Testes des jeweiligen Peaks betrachtet

werden. Dieser entscheidet, ob eine Normalverteilung der Werte vorliegt oder nicht.

Fällt der Anderson-Darling Test größer als 0,05 aus, so liegt eine Normalverteilung vor

und es wird im nächsten Schritt der Studentsche T-Test, kurz T-Test betrachtet. In

dieser Studie liegen lediglich zwei Populationen vor. Folglich arbeitet die Software in

diesem Fall bei der Auswertung mit dem T-Test. Der ANOVA-Test würde im Falle des

Vorliegens von mehr als zwei Populationen Anwendung finden. Eine statistische

Signifikanz liegt dann vor, wenn der p-Wert des T-Testes kleiner 0,05 ist. Liegt der

Wert des Anderson-Darling Testes allerdings unter 0,05, so muss bei Vorliegen von

zwei Populationen der Wilcoxon-Test in Betracht gezogen werden. Bestehen mehr als

zwei Populationen erfolgt die statistische Auswertung mit Hilfe des Kruskal-Wallis-

Testes. Ein statistisch signifikanter Peak liegt vor, wenn der p-Wert des Wilcoxon-

Testes kleiner ist als 0,05.

Weiterhin stand für die Auswertung der Messungen die Software Origin (OriginLab

Corporation) zur Verfügung. Mit Hilfe dieses Analyse- und Darstellungsprogrammes

konnten Box-Whisker-Plots grafisch erstellt und ausgewertet werden.

Die eindimensionalen Gele wurden nach Fixierung und Färbung visuell am Leuchttisch

ausgewertet. Zur Beurteilung der Dichte der einzelnen Banden wurde eine

densitometrische Bildanalyse durchgeführt. Hierfür wurde die Software Phoretix 2D

Advanced (Nonlinear Dynamics Ltd., Newcastle upon Tyne, UK) genutzt.

3 Material und Methoden

29

3.2.8. Statistische Poweranalyse

Zur Ermittlung der für diese Arbeit minimal erforderlichen Probengröße wurde eine

statistische Poweranalyse durchgeführt [Schoonjans et al. 1995; Obuchowski & Zhou

2002]. Diese erfolgt üblicherweise vor Beginn einer Studie. Sie soll Aufschluss darüber

geben, wie groß die Stichprobe pro Gruppe zu sein hat, um valide Ergebnisse zu

erhalten. Die Poweranalyse fand mit Hilfe des statistischen Softwareprogramms

MedCalc (MedCalc Software bvba) statt.

Für den Alpha-Fehler wurde ein Wert von 0,05, für den Beta-Fehler ein Wert von 0,2

festgelegt. Der Beta-Fehler wird damit viermal so groß wie der Alpha-Fehler gewählt.

Der Alpha-Fehler, auch als Fehler 1. Art bezeichnet, besagt, dass die Nullhypothese

verworfen wird, obgleich diese richtig gewesen wäre. Hingegen beschreibt der Beta-

Fehler, oder auch Fehler 2. Art, die Beibehaltung der Nullhypothese, auch wenn

eigentlich die Alternativhypothese richtig gewesen wäre. Die Nullhypothese besagt,

dass kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen besteht. Die sogenannte

Power eines Testes ist definiert als 1-ß und stellt die Teststärke dar. Sie ist umso größer,

je größer der Probenumfang und je kleiner der Beta-Fehler ist. Eine festgelegte Power

von 80% besagt letztlich, dass die ermittelte Fallzahl mit einer Wahrscheinlichkeit von

80% zu einem signifikanten Ergebnis führt. Folglich verbleibt ein Restrisiko von 20%,

dass ein tatsächlich vorhandener Unterschied zwischen zwei Gruppen nicht erkannt

wird. Die Poweranalyse sagt nichts über das tatsächliche Ergebnis der Studie aus,

sondern dient lediglich der Studienplanung.

4 Ergebnisse

30

4 Ergebnisse

4.1. Charakterisierung von Präeklampsie-und Kontrollpatientinnen

Es wurde das Serum von insgesamt 24 schwangeren Frauen untersucht, die sich

zwischen Oktober 2006 und Dezember 2008 in stationärer Behandlung der

Universitätsfrauenklinik Aachen befanden. In diesem Zeitraum wurden 41 hypertensive

Schwangerschaftserkrankungen erfasst, darunter 28 Präeklampsien, 6 Propf-

Präeklampsien und 7 reine Gestationshypertonien. Bei 11 Frauen lag eine manifeste

Präeklampsie vor, mit Entwicklung der Symptomatik zwischen der 23. und 33.

Schwangerschaftswoche. Dem gegenüber standen 13 Probandinnen mit

unkompliziertem Schwangerschaftsverlauf, ebenfalls erfasst zwischen der 23. und 33.

Schwangerschaftswoche ohne klinische oder laborchemische Zeichen einer

Präeklampsie. Im Mittel lag das Alter der Frauen beider Gruppen bei 31 Jahren. Der

Unterschied im präpartalen BMI war gering (PE: 25,8; KO: 26,1). Bei zwei

Präeklampsie-Patientinnen bestand präpartal eine Hypothyreose, alle anderen 22

Patientinnen waren hinsichtlich internistischer Erkrankungen unauffällig.

Bei 10 der 11 PE-Patientinnen wurde die Schwangerschaft per primärer Sektio beendet,

nur in einem Fall wurde eine sekundäre Sektio nach Geburtsstillstand durchgeführt.

Von den Kontrollpatientinnen entbanden drei Frauen spontan, sechs Patientinnen per

primärer Sektio und drei Patientinnen per sekundärer Sektio. Eine Patientin wurde

vaginal operativ entbunden.

Das Geburtsgewicht der Kinder der PE-Gruppe lag im Durchschnitt bei 1278 g mit

einer Standardabweichung von 360 g. Das Geburtsgewicht der Kinder der

Kontrollgruppe lag bei 3256 g mit einer Standardabweichung von 475 g. Es wird

deutlich, dass das Gewicht von Kindern kranker Mütter bei der Geburt wesentlich

niedriger ausfiel, als das Gewicht von Kindern gesunder Mütter. Dies ist zum einen auf

eine, eventuell bei einer Präeklampsie vorliegende fetale Wachstumsrestriktion

zurückzuführen, zum anderen jedoch auch auf die, im Durchschnitt zeitlich früher

durchgeführte Entbindung (PE: 30. SSW, KO: 38. SSW). Der Z-Score lag für die

Präeklampsie-Gruppe durchschnittlich bei < -1,10. Für die Kontroll-Gruppe hingegen

betrug die Standardabweichung des Geburtsgewichtes von der 50. Perzentile etwa -0,25.

Eine Übersicht über das gesamte Patientenkollektiv bietet Tabelle 2.

4 Ergebnisse

31

Tabelle 2: Charakterisierung der Schwangeren.

Patientin Altera) BMI vor

SS

SSWa) Mittlerer

Blutdrucka,b)

Proteinurie a,c,d)

Entbindung in

SSW e)

Geburtsgewicht Z-Score f))

[a] [kg/m2] [w+d] [mmHg] [mg/l] [w+d] [g] [SD]

1 23 34 31+6 148/101 6760 32.+0 1325 -1,52

2 26 31 27+6 160/97 652 28.+3 830 -1,43

3 29 29 32+4 155/95 +3d 32.+5 1345 -1,47 4 30 42 31+5 143/84 451 31.+6 1395 -0,85

5 24 43 32+0 153/83 9140 32.+3 1460 -1,18

6 38 26 30+4 162/97 3382 31.+1 1730 0,1 7 32 34 29+2 142/84 555 32.+2 1465 -1,17

8 26 34 32+4 145/88 2293 33.+1 1690 -1,22

9 46 30 25+4 183/105 2342 26.+2 760 -1,00 10 33 25 23+6 144/93 384 25.+5 680 -1,02

11 34 29 32+0 176/113 2684 32.+2 1380 -1,38

12 31 42 30+4 122/74 180 38.+5 2800 -1,33

13 28 44 33+6 128/74 96 39.+0 3850 0,86

14 21 27 31+5 111/65 49 39.+0 3700 0,50 15 33 31 30+3 111/65 79 38.+6 3710 0,85

16 38 24 28+0 98/52 +1d 38.+0 3340 -0,04 17 28 25 24+0 95/60 0d 41.+0 3995 0,81

18 30 35 28+3 111/56 0d 36.+1 2630 -0,80

19 26 23 28+2 130/70 0d 37.+6 2915 -0,65 20 39 25 28+0 120/70 0d 37.+3 2860 -0,78

21 40 28 32+2 120/75 0d 38.+2 2590 -1,83

22 28 33 31+3 134/72 0d 38.+4 3335 -0,05

23 27 28 30+5 120/46 0d 41.+4 3485 -0,34 24 35 22 30+0 103/60 0d 38.+6 3120 -0,56

a) Zu Beginn der Hospitalisierung (Zeitpunkt der Blutentnahme).

b) Systolischer/diastolischer Blutdruck; Präeklampsie wurde definiert als Bluthochdruck mit Werten

systolisch > 140 mmHg und diastolisch > 90 mmHg, wobei betroffene Frauen bis zur 20. SSW

normotensiv waren.

c) Immunturbidimetrische Untersuchung (Tina-quant albumin, Roche Diagnostics, Mannheim,

Germany); Proteinurie wurde definiert als Ausscheidung > 300 mg/ 24 h.

d) Dipstick Untersuchung; signifikante Proteinurie wurde definiert als > +1.

e) Gestationswoche zum Zeitpunkt der Entbindung.

f) Z-Score: Standardabweichung des Geburtsgewichtes von der 50. Perzentile.

4 Ergebnisse

32

4.2. Anwendung der Massenspektrometrie zur differentiellen

Analytik von Präeklampsie- und Kontrollpatientinnen

Hoher Massenbereich

Bevor die Messung der Serumproben mit dem MALDI-ToF Massenspektrometer

erfolgen konnte, wurden diese mittels magnetischer Beads aufgearbeitet sowie

fraktioniert gefällt. Im hohen Massenbereich zeigten sich Ionensignale zwischen m/z

25.000 und 200.000. Die prominentesten Signale fanden sich bei m/z 66.447, 33.282

und 28.050. Diesen wurde jeweils das einfach sowie doppelt geladene Ionensignal von

humanem Serumalbumin (Mr 66.447) und das einfach geladene Ionensignal von

Apolipoprotein A-I (Mr 28.079) zugeordnet.

Die Ergebnisse der massenspektrometrischen Messung für den hohen Massenbereich

korrelierten weitestgehend mit den Ergebnissen der SDS-PAGE Analyse der fraktioniert

gefällten Serumproben. Bei der SDS-PAGE Analyse konnten Proteinbanden zwischen

25 und 220 kDa beobachtet werden. Der Vergleich der Gele vor (Bahn 1) und nach

(Bahn 2) fraktionierter Fällung zeigte, dass durch die fraktionierte Fällung nahezu alle

Proteine in dem Massenbereich oberhalb von 220 kDa, aber nur zum Teil in dem

Massenbereich zwischen 150 kDa und 97 kDa entfernt wurden. Das Bandenmuster nach

Fällung korrelierte mit den MS-Spektren.

a) b)

Abbildung 5: a) Überblick der Ionensignale einer PE-Probe nach fraktionierter Fällung. Massenbereich

m/z 20.000-220.000. Als Matrix diente Ferulasäure. b) zeigt die SDS-PAGE Analyse (10% T, Coomassie

Blau Färbung) selbiger PE-Probe vor (Bahn 1) und nach (Bahn 2) fraktionierter Fällung.

4 Ergebnisse

33

Die kräftige Bande bei apparentem Molekulargewicht von 55 kDa konnte als humanes

Serumalbumin (m/z 66.437), die Bande bei apparentem Molekulargewicht von 26 kDa

als Apolipoprotein A-I (m/z 28.079) identifiziert werden. Hierzu wurden die in diesen

Banden befindlichen Proteine ausgestochen, mittels Trypsin verdaut und anschließend

mittels Peptide mass fingerprinting identifiziert.

Ionensignale über m/z 70.000 erschienen in den Spektren als sehr kleine Signale von

geringer Intensität. Dies ist vermutlich auf die niedrige Empfindlichkeit der Mehrkanal-

Detektorplatte zurückzuführen. Die Analyse des hohen Massenbereiches zeigte letztlich

keine signifikanten Unterschiede in den Spektren zwischen den Kontroll- und den

Präeklampsieproben und ließen kein Proteinsignal oder gar Cluster erkennen, anhand

dessen eine Trennung der beiden Gruppen möglich gewesen wäre. Der hohe

Massenbereich wurde für die weitere Auswertung folglich nicht weiter berücksichtigt.

Niedriger Massenbereich

Die Auswertung der MS-Spektren konzentrierte sich ausschließlich auf den niedrigen

Massenbereich zwischen m/z 4500 und 25.000. Für die ersten vier Messungen (M1-4)

erfolgte die Proteinseparation der Serumproben mit Hilfe des Profiling Kits 100 MB-

HIC8. Die Mehrheit der Ionensignale zeigte sich im Bereich unter m/z 20.000. Im

Gegensatz dazu fanden sich in der SDS-PAGE-Analyse unter Verwendung von

10%igen Gelen nur schwache Signale für diesen Massenbereich. Die Ursache hierfür

liegt vermutlich in der geringeren Anfärbbarkeit „kleiner“ Proteine, also Proteine mit

einer geringen molekularen Masse. Hingegen lassen sich Proteine mit einer hohen

molekularen Masse leicht mit Coomassie-Brillant-Blau anfärben und sind demzufolge

deutlich als Banden in den Gelen zu erkennen.

4 Ergebnisse

34

Abbildung 6: Darstellung MS-Einzelspektren einer Kontroll (KO)- sowie einer Präeklampsie (PE)-Probe

für den niedrigen Massenbereich von m/z 4.000-25.000 nach Aufarbeitung der Proben mittels des

Profiling Kits 100 MB-HIC8 der Firma Bruker Daltonik.

4.2.1. Monoparametrische Analyse

Nach Aufnahme der 24 Einzelspektren, davon 11 Präeklampsie- und 13 Kontroll-

Spektren, zusammengefasst als Messreihe 1, erfolgte ihre Auswertung mit Hilfe der

Computersoftware ClinProTools 2.2. Im Durchschnitt wurden pro Spektrum ca. 85

Ionensignale detektiert, wovon jedoch nicht alle als statistisch signifikant für die

Gruppendifferenzierung anzusehen waren. Die statistische Relevanz der einzelnen

Signale wurde mit Hilfe verschiedener mathematischer Testverfahren, derer sich die

Software bedient, ermittelt. Eine Übersicht über die Signale bietet die sogenannte Peak-

Statistik-Tabelle, welche aus der Gesamtheit aller Spektren erstellt wurde. Einen

Auszug dieser Tabelle für Messreihe 1 bietet Tabelle 3.

4 Ergebnisse

35

Tabelle 3: Auszug der Peak-Statistik-Tabelle für Messreihe 1 mit den ersten 10 von

insgesamt 80 detektierten Ionensignalen, geordnet nach statistischer Relevanz.

Index Mass Dave PTTA PWKW PAD Ave1 Ave2 StdDev1 StdDev2 CV1 CV2

59 13890,99 113,98 0,019 0,000415 0,0273 70,57 184,55 29,16 81,29 41,32 44,05

20 6858,13 86,36 0,037 0,00288 0,00142 77,24 163,6 25,47 71,79 32,97 43,88

57 13714,96 533,22 0,0383 0,00536 0,00167 280,93 814,14 136,72 470,66 48,67 57,81

58 13833,57 121,19 0,0496 0,0114 0,00843 121,17 242,37 49,68 116,04 41 47,88

21 6917,44 20,54 0,0496 0,0114 0,0912 38,01 58,55 11,77 17,76 30,96 30,33

22 6945,45 14,29 0,12 0,17 0,00524 15,81 30,1 6,27 16,35 39,63 54,32

56 13564,06 3,97 0,12 0,00989 8,57E-06 3,75 7,72 1,27 4,72 33,92 61,12

3 4532,53 6,38 0,216 0,203 0,155 22,78 16,4 7,42 4,8 32,58 29,28

53 12408,32 1,39 0,216 0,406 0,0286 3,33 4,71 0,84 1,84 25,26 39,08

39 8885,61 443,73 0,298 0,203 0,345 1803,66 1359,94 452,78 544,19 25,1 40,02

Index Signalreihenfolge im Summenspektrum

Mass Massenzahl in Da

DAve Differenz zwischen durchschnittlich maximaler und minimaler Peakfläche aller Klassen

PTTA P-Wert Student T-Test (Vorliegen von zwei Klassen) oder ANOVA-Test (Vorliegen von mehr

als zwei Klassen)

PWKW P-Wert Wilcoxon-Test oder Kruskal-Wallis-Test

PAD P-Wert Anderson-Darling Test

Ave1 Durchschnittliche Peakfläche Klasse 1 (Präeklampsie-Gruppe)

Ave2 Durchschnittliche Peakfläche Klasse 2 (Kontroll-Gruppe)

StdDev1 Standardabweichung der durchschnittlichen Peakfläche von Klasse 1

StdDev2 Standardabweichung der durchschnittlichen Peakfläche von Klasse 2

CV1 Variationskoeffizient von Klasse 1

CV2 Variationskoeffizient von Klasse 2

Letztlich konnten für Messreihe 1 aus 80 detektierten Ionensignalen pro Spektrum 5

Signale identifiziert werden, die nach statistischer Analyse durch die Software

signifikant erschienen: (1) m/z 13.891, (2) m/z 6858, (3) m/z 13.715, (4) m/z 13.834, (5)

m/z 6917. Doch stellte sich die Frage, ob jene Signale auch tatsächlich für die

Auswertung relevant waren. Die genauere Betrachtung zeigt, dass es sich bei den

Signalen (2) und (5) um die jeweils doppelt geladenen Ionen der Signale (3) und (4)

und handelte. Des Weiteren erwies sich das Ionensignal (1) m/z 13.891 als

wahrscheinliches Matrixaddukt von m/z 13.715, was bedeutet, dass es sich hierbei um

kein eigenständiges Signal handelte. Folglich entfiel dieses Signal aus der weiteren

Analyse und es standen letztlich noch vier Ionensignale für die Auswertung zur

Verfügung: (2) m/z 6858, (3) m/z 13.715, (4) m/z 13.834 und (5) m/z 6917.

4 Ergebnisse

36

Abbildung 7: Darstellung der Summenspektren für beide Gruppen: Präeklampsie (rot) und Kontrolle

(grün) im niedrigen Massenbereich von m/z 4.000-25.000.

Für alle vier Signale wurden im nächsten Schritt Box-Whisker-Plots erstellt, welche die

Verteilung der entsprechenden Flächen unter den Ionensignalen für insgesamt 24

Spektren in den einzelnen Gruppen aufzeigen (siehe Abbildung 8).

P = 0,00112 p = 8,89389E-4

4 Ergebnisse

37

P = 0,00335 p = 0,00182

Abbildung 8: Box-Whisker-Plots mit Darstellung der Verteilung der Flächen für die Ionensignale a)

13.715, b) 6858, c) 6917 und d) 13.834 für die PE-Gruppe (rot, n =11) und die KO-Gruppe (grün, n = 13).

Die Box entspricht dem Bereich, in dem die mittleren 50% der Daten liegen. Sie wird durch das obere

75%ige und das untere 25%ige Quantil begrenzt. Die Horizontale inmitten der Box entspricht dem

Median. Durch die Whisker werden die außerhalb der Box liegenden Werte dargestellt. Sie geben das 5.

und 95. Perzentil an. Das Kreuz beschreibt das 1. und 99. Perzentil.

Die Berechnung der in Abbildung 8 dargestellten Box-Whisker-Plots erfolgte mit Hilfe

der prozentualen Anteile der einzelnen Flächen. Dazu wurde die Summe aller Flächen

eines Ionensignals aus 24 Spektren als 100% gesetzt und danach der prozentuale Anteil

einer jeden Fläche eines jeden Spektrums bestimmt.

Bei allen Box-Whisker-Plots lag der p-Wert jeweils unter 0,05. Das bedeutet, dass auf

der 0,05-Ebene, die Mittelwerte beider Gruppen sich bedeutend unterschieden. Dies traf

für alle vier Signale zu, allerdings überschnitten sich für Signal m/z 13.834, im

Vergleich zu den übrigen, die Bereiche, in denen die mittleren 50% der Daten lagen.

Aus diesem Grund wurde das Signal von der weiteren Analyse ausgeschlossen.

Mit Hilfe der verbliebenen drei Signale wurden im Folgenden drei Kombinationen

erstellt, anhand derer eine mögliche Trennung der beiden Gruppen im

Koordinatensystem aufgezeigt werden sollte. Die Kombinationen setzten sich wie folgt

zusammen: Kombination (K1) aus m/z 6858 und m/z 13.715, Kombination (K2) aus

m/z 6858 und m/z 6917, Kombination (K3) aus m/z 13.715 und m/z 6917. Die

Reihenfolge der erstellten Kombinationen richtete sich nach der Folge der einzelnen

Signale in der Peak-Statistik-Tabelle. So wurde für Kombination (K1) das erstbeste mit

dem zweitbesten, für Kombination (K2) das erstbeste mit dem drittbesten und für

Kombination (K3) das zweitbeste mit dem drittbesten Signal kombiniert. Anschließend

erfolgte die räumliche Darstellung der ersten Kombination für die 24 Spektren der

ersten Messung (M1) im Koordinatensystem (siehe Abbildung 9). Die Box-Whisker-

4 Ergebnisse

38

Plots hatten bereits eine erste Tendenz hinsichtlich der Verteilung der Massen für die

beiden Gruppen gezeigt. So wies die KO-Gruppe im Durchschnitt stets höhere

Flächenwerte als die PE-Gruppe auf. Zur klaren Differenzierung der beiden Gruppen

wurden nun Grenzen definiert.

Abbildung 9: Räumliche Darstellung der 24 Einzelspektren für Messung 1 im Koordinatensystem,

aufgetragen nach m/z 6858 und m/z 13.715 (Kombination 1) mit Darstellung der selbst definierten

Grenzen sowie Grauzone (graue Schattierung).

Die Grenzwerte wurden aus den Box-Whisker-Plots der jeweiligen Gruppe berechnet.

So wurden alle Spektren, die unterhalb des 0,75-Quantils (P75) für m/z 13.715 und m/z

6858 der PE-Gruppe lagen, als „Präeklampsie“ eingestuft, alle Spektren oberhalb des

0,25-Quantils (P25) für Signal m/z 13.715 und Signal m/z 6858 der KO-Gruppe wurden

als „Kontrolle“ bewertet. Die Ergebnisse dieser ersten Kombination sind in der

folgenden Tabelle zusammengefasst.

4 Ergebnisse

39

Tabelle 4: Ergebnisse für die erste Kombination der ersten Messung bei einer

monoparametrischen Analyse (RP: richtig positiv, RN: richtig negativ, nz: nicht

zugeordnet, FN: falsch negativ).

Kombination 1

Probe Zuordnung Probe Zuordnung

PE_1 RP CN_2 RN

PE_29 FN CN_18 RN

PE_48 RP CN_26 nz

PE_64 RP CN_68 RN

PE_69 nz CN_102 nz

PE_77 RP CN_109 RN

PE_90 nz CN_113 nz

PE_91 RP CN_155 RN

PE_118 RP CN_171 RN

PE_128 RP CN_195 RN

PE_219 RP CN_198 RN

CN_226 nz

CN_227 RN

Insgesamt konnten durch die erste Kombination (K1) 8 von 11 PE-Proben richtig

positiv (RP) zugeordnet werden. Eine PE-Probe wurde als Kontrolle eingestuft (FN)

und 9 von 13 KO-Proben als richtig negativ erkannt. Keine Probe wurde als falsch

positiv (FP) eingestuft. In 6 von 24 Fällen, darunter 2 PE- und 4 Kontroll-Proben,

konnte keine Aussage hinsichtlich der Gruppenzugehörigkeit getroffen werden. Offen

blieb die Frage, ob es möglich wäre, diese ausstehenden 6 Proben mit Hilfe der übrigen

zwei Kombinationen einer entsprechenden Gruppe zuzuordnen. So wurden als Nächstes

in der zweiten Kombination nur die bisher nicht zugeordneten Spektren betrachtet. Die

Grenzen für oberes (0,75-Quantil) und unteres (0,25-Quantil) Quantil wurden

beibehalten, nun allerdings für die Signale m/z 6858 und m/z 6917 festgelegt. Es zeigte

sich, dass lediglich eine weitere PE-Probe über dieser Kombination richtig positiv

zugeordnet werden konnte. Selbiges Verfahren, angewendet auf die dritte Kombination,

ergab hingegen keine weitere Zuordnung zu einer der beiden Gruppen. Letztendlich

verblieben 5 Proben, die nach diesem Verfahren nicht zuzuordnen waren.

Für Messreihe 1 konnte, nach Durchlaufen aller drei Kombinationen, eine Spezifität von

69%, ein positiver Vorhersage-Wert von 100% und ein negativer Vorhersage-Wert von

90% erreicht werden. Des Weiteren zeigte sich im Verlauf der Analyse eine Steigerung

der Sensitivität von ursprünglich 73% auf 82%.

Insgesamt konnten diese Ergebnisse als zufriedenstellend betrachtet werden, jedoch

verblieb nach dieser Auswertungsstrategie stets eine Grauzone zwischen dem oberen

4 Ergebnisse

40

Quantil der PE-Gruppe und dem unteren Quantil der KO-Gruppe (siehe Abbildung 9).

In diesem Fall konnte keine eindeutige Aussage bezüglich der Gruppenzugehörigkeit

getroffen werden, was letztlich als noch unbefriedigend zu bewerten war. Um diese

Grauzone zu eliminieren, wurden zwei Lösungsansätze konstruiert. Der erste Fall

besagte: Alles unterhalb des oberen Quantils für m/z 13.715 und m/z 6858, sei eindeutig

eine „Präeklampsie“, alles oberhalb dieses Quantils eindeutig „Kontrolle“. Der zweite

Fall hingegen lautete: Alles oberhalb des unteren Quantils für m/z 13.715 und m/z 6858

sei eindeutig eine „Kontrolle“, alles unterhalb dieses Quantils eindeutig eine

Präeklampsie. Je nachdem welcher Fall nun zur Anwendung kam, zeigte sich entweder

eine hohe Spezifität für Fall 1 beziehungsweise bei Anwendung von Fall 2 eine

entsprechend hohe Sensitivität. Die Ergebnisse dieses Ansatzes sind in folgender

Tabelle zusammengefasst.

Tabelle 5: Übersicht der Ergebnisse des 2. Ansatzes einer monoparametrischen Analyse

für alle vier Messreihen.

Messung Fall Richtig

positiv

Falsch

positiv

Richtig

negativ

Falsch

negativ

Sensitivität

[%][%]

Spezifität

[%[%]

Positiver

Vorhersage-

wert [%]

Negativer

Vorhersage-

wert [%]

1 1 5 0 13 6 45,45 100,00 100,00 68,42

2 10 4 9 1 90,91 69,23 71,43 90,00

2 1 6 3 10 5 54,55 76,92 66,67 66,67

2 11 6 7 0 100,00 53,85 64,71 100,00

3 1 4 1 12 7 36,36 92,31 80,00 63,16

2 10 3 10 1 90,91 76,92 76,92 90,91

4 1 3 1 12 8 27,27 92,31 75,00 60,00

2 10 3 10 1 90,91 76,92 76,92 90,91

Auch für diesen Ansatz fielen die Ergebnisse nur unzureichend zufriedenstellend aus.

Waren sie doch zu sehr von der willkürlichen Wahl zwischen dem ersten und dem

zweiten Fall abhängig.

Da dieser erste Versuch einer Klassifizierung anhand von nur einer Kombination

lediglich zweier Parameter pro Koordinatensystem erfolgte, wurde der Ansatz als

„monoparametrische Analyse“ bezeichnet.

4 Ergebnisse

41

4.2.2. Multiparametrische Analyse

Die am besten zwischen den beiden Gruppen differenzierenden Ionensignale wurden,

wie bereits bei der monoparametrischen Analyse beschrieben, bei m/z 13.715, m/z

13.834 und m/z 13.891 gemessen. Bei allen Ionensignalen handelte es sich jeweils um

einfach geladene Ionen, die mit Hilfe der Software ClinProTools 2.2 ermittelt wurden.

Es erfolgte die Berechnung des p-Wertes durch verschiedene statistische Tests (siehe

Kapitel 3.2.7), wodurch für Messreihe 1 eine Unterscheidung zwischen differentiellem

und weniger differentiellem Signal möglich war. Allein anhand dieser drei Signale

konnte allerdings, wie bereits in Kapitel 4.2.1. beschrieben, nicht in allen Fällen eine

eindeutige Zuordnung der einzelnen Proben zu einer der beiden Gruppen erfolgen.

Nachfolgend wurden für die weitere Analyse neben den drei am besten

differenzierenden Signalen die drei intensivsten Signale mit herangezogen, also ein

multiparametrischer Ansatz verfolgt.

Abbildung 10: Darstellung der insgesamt 24 Einzelspektren der ersten Messung im sogenannten stack

view (rot: Präeklampsie-Spektren; grün: Kontroll-Spektren).

Die intensivsten Signale zeigten sich in allen Spektren, unabhängig von der

Gruppenzugehörigkeit bei m/z 9390, m/z 9103 und m/z 8886.

4 Ergebnisse

42

Tabelle 6: Übersicht der Ionensignale für die multiparametrische Analyse.

m/z Ladung PTTA PWKW PAD peak area / std dev a) Rang b,c)

1 13891 1+ 0.019 0.000415 0.0273 70.57 / 29.16 1

2 6945 2+ 0.12 0.17 0.00524 15.81 / 6.27 6

3 13834 1+ 0.0496 0.0114 0.00843 121.17 / 49.68 4

4 6917 2+ 0.0496 0.0114 0.0912 38.01 / 11.77 5

5 13715 1+ 0.0383 0.00536 0.00167 280.93 / 136.72 3

6 6858 2+ 0.037 0.00288 0.00142 77.24 / 25.47 2

7 9390 1+ 0.885 1 0.174 3109.2 / 899.53 1

8 9103 1+ 0.65 0.621 0.265 1660.76 / 458.3 3

9 8886 1+ 0.298 0.203 0.345 1803.66 452.78 2

a) Werte aus Messung 1, erster Messdurchgang (MS1)

b) 1-6: die differentiellsten Ionensignale bezogen auf die Peak Statistik (PTTA: p-Wert des "Student

T-Test" (2 Klassen) oder "ANOVA-Test" (> 2 Klassen); PWKW: p-Wert des "Wilcoxon Test" (2

Klassen) oder "Kruskal-Wallis-Test" (> 2 Klassen); PAD: p-Wert des "Anderson-Darling Test").

c) 7-9: die intensivsten Ionensignale bezogen auf die durchschnittliche Peakfläche.

Die drei am besten zwischen den beiden Gruppen differenzierenden Signalen sowie die

drei intensivsten Ionensignale ermöglichten die Formulierung von Regeln, anhand derer

eine Zuordnung zu einer der beiden Gruppen möglich war. Die Daten der ersten

Messreihe (M1) dienten dabei als „Trainings-Set“, um so eine geeignete

Auswertungsstrategie zu entwickeln. Mit Hilfe der 6 Ionensignale wurden insgesamt

fünf Zweierkombinationen erstellt: (1) m/z 13.715 und m/z 13.834, (2) m/z 13.891 und

m/z 8886, (3) m/z 13.715 und m/z 8886, (4) m/z 13.715 und m/z 9103 sowie (5) m/z

13.834 und m/z 9390. Anschließend wurde für jedes Spektrum aus M1 der Quotient aus

den Flächen dieser Ionensignal-Paare berechnet und für die jeweilige Gruppe als Box-

Whisker-Plot dargestellt (siehe Abbildung 11). Es zeigten sich in allen Fällen

signifikante p-Werte (p-Wert < 0,05). Das bedeutet, dass beide Gruppen sich in ihren

Mittelwerten auf dem Signifikanzniveau von 5% signifikant voneinander unterschieden.

Es wurden Grenzen, sogenannte Schwellenwerte, definiert, anhand derer eine

Zuordnung zu einer der beiden Gruppen erfolgen sollte. Die jeweiligen Grenzen, in den

Grafiken als gestrichelte Horizontale dargestellt, lagen oberhalb des 0,75-Quantils der

PE-Gruppe und unterhalb des 0,25-Quantils der Kontroll-Gruppe.

4 Ergebnisse

43

Abbildung 11: Darstellung Box-Whisker-Plots für die erstellten fünf Regeln, welche mit Hilfe der drei

differentiellsten und der drei intensivsten Ionensignale der ersten Messung (M1) formuliert wurden. Die

Proteinseparation für M1 erfolgte mittels des Profiling Kits 100 MB-HIC8 der Firma Bruker Daltonik.

Im nächsten Schritt wurden alle 5 Regeln auf die einzelnen Spektren von M1

unabhängig voneinander angewendet. Wurden bei der Festlegung der Grenzwerte noch

alle 24 Spektren berücksichtigt, sollte nun jedes Spektrum und sein Verhältnis zu den

einzelnen Schwellenwerten für sich betrachtet werden. Wurde der Schwellenwert der

jeweiligen Regel für ein individuelles Spektrum (also einer individuellen Proben)

überschritten, so wurde der Punktwert „0“ vergeben. War dies nicht der Fall und der

4 Ergebnisse

44

Quotient blieb unter dem berechneten Schwellenwert, wurde eine „1“ vermerkt. So

konnte insgesamt nach Anwendung aller fünf Regeln ein kulmulativer Punktwert

zwischen „0“ und „5“ erreicht werden. Betrug der kulmulative Punktwert einer Probe

nach Durchlaufen aller fünf Regeln „2“ oder weniger, erfolgte die Zuordnung dieses

Spektrums zur Gruppe der „Kontrollen“, andernfalls wurde die Probe als

„Präeklampsie“ eingestuft. Nach diesem Verfahren konnten alle Spektren der Messreihe

1, das heißt alle 24 Proben, ihrer jeweiligen Gruppe richtig zugeordnet werden. Die

Sensitivität und Spezifität betrug demnach 100%, ebenso wie der positive und der

negative Vorhersagewert. Die Falsch-positiv- sowie die Falsch-negativ-Rate betrug

jeweils 0%.

Im nächsten Schritt wurden die Regeln nun auf die Daten aus Messreihe 2 des ersten

Messdurchganges angewendet. Diese Messung erfolgte einige Tage nach der ersten,

ohne frische Ansätze für Eluate und Matrix. Hiernach ergaben sich eine Spezifität von

62% sowie eine Falsch-positiv-Rate von 38%, was bei letztlich 24 Proben als sehr

unbefriedigend anzusehen war und diesen Ansatz einer massenspektrometrie-basierten

Analyse wieder in Frage stellte.

Um nun zu eruieren, ob diese schlechte statistische Signifikanz der 2. Messreihe auf das

Verfahren zurückzuführen war oder auf eine eventuelle Schädigung der fraktionierten

Proben während der Zeit der Lagerung, wurde ein zweiter Messdurchgang durchgeführt.

Hierfür wurden alle Serumproben frisch aliquotiert und abermals mit Hilfe von

magnetischen Beads unter Verwendung des Profiling Kits 100 MB-HIC8 fraktioniert.

Der zweite Messdurchgang bestand ebenfalls aus zwei einzelnen Messreihen, genannt

Messreihe 3 und 4. Auch in diesem Fall wurde jede Serumprobe erneut zweimal im

Abstand einiger Tage mit dem MALDI-ToF-Massenspektrometer gemessen. Das

multiparametrische Auswerteverfahren, erneut angewendet auf die Daten von Messreihe

3, zeigte nun abermals hohe Werte für Sensitivität (91%) und Spezifität (85%). Die

Falsch-Positiv-Rate betrug 15%, die Falsch-negativ-Rate nur 9%. Der positive

Vorhersage-Wert lag bei 83%, der negative Vorhersage-Wert bei 92%. Die erneute

Messung der Eluate nach einigen Tagen (Messreihe 4) zeigte abermals einen Abfall der

Spezifität auf 69% und einen Anstieg der Rate falsch-positiver Ereignisse auf 31%.

Zusammenfassend sind die Ergebnisse für alle 4 Messreihen in Tabelle 7 dargestellt.

4 Ergebnisse

45

Tabelle 7: Übersicht der Ergebnisse einer multiparametrischen Analyse für Messreihe

1-4.

Messung Richtig

positiv

Falsch

positiv

Richtig

negativ

Falsch

negativ

Sensitivität Spezifität Falsch

positiv

Rate

Falsch

negativ

Rate

Positiver

Vorhersage-

Wert

Negativer

Vorhersage-

Wert

M1 a) 11 0 13 0 1,00 1,00 0,00 0,00 1,00 1,00

M2 a) 10 5 8 1 0,91 0,62 0,38 0,09 0,67 0,89

M3 b) 10 2 11 1 0,91 0,85 0,15 0,09 0,83 0,92

M4 b,c) 10 4 9 1 0,91 0,69 0,31 0,09 0,71 0,90

a) Erste Aufarbeitung der Serumproben mittels magnetischer Beads.

b) Zweite Aufarbeitung der Serumproben mittels magnetischer Beads.

c) Die Spektren der Patientinnen 12, 14, 21 und 23 waren von schlechter Qualität und wurden direkt

als falsch positiv eingestuft.

Zusammenfassend ist eine Übersicht zur Auswertung in folgender Abbildung gegeben.

Abbildung 12: Übersicht Auswertung

Monoparamterische Analyse mit

3 statistisch signifikanten Signalen

3 Kombinationen

Keine objektive Klassifizierung möglich durch

Grauzonenbildung

Multiparametrische Analyse mit

3 statistisch signifikanten und 3

intensiven Signalen

5 Kombinationen

Objektive Klassifizierung möglich

4 Ergebnisse

46

4.2.3. Verifizierung der Ergebnisse mittels SDS-PAGE

Als Nächstes wurde geprüft, ob diese Auswertungsstrategie einer multiparametrischen

Analyse auch auf andere Methoden der Probenaufarbeitung anwendbar ist oder lediglich

für die Proteinseparation mittels magnetischer Beads, basierend auf dem Reverse-Phase-

Prinzip, gilt. Zu diesem Zweck wurden alle 24 Serumproben einer sogenannten

fraktionierten Fällung zugeführt und Proteine der Fraktion II einer jeden Probe ebenfalls

mit einem MALDI-ToF-Massenspektrometer gemessen. Diese Messung aller Proben

wurde als Messreihe 5 (M5) bezeichnet.

Abbildung 13: Darstellung der Einzelspektren einer KO-Probe sowie einer PE-Probe nach fraktionierter

Fällung. Massenbereich m/z 4000-25.000.

Die Spektren dieser Messreihe unterschieden sich nur leicht von denen aus Messreihe 1.

So zeigten sich auch in diesem Fall die intensivsten Ionensignale bei m/z 9390, m/z

9103 sowie m/z 8886 und die differentiellsten Signale bei m/z 13.715, m/z 13.834

sowie m/z 13.891. Allerdings fielen Unterschiede hinsichtlich der Höhe der Intensitäten

und der Größe der jeweiligen Flächen der Signale auf. Es ergaben sich folglich nach der

Erstellung der Box-Whisker-Plots neue Quotientenwerte mit abermals signifikanten p-

Werten (p-Wert < 0,05). Es wurden nun neue Cut-off-Werte definiert, welche

wiederum, zwischen dem 0,75-Quantil der Präeklampsie-Gruppe und dem 0,25-Quantil

der Kontroll-Gruppe lagen. Es gab jedoch eine Ausnahme. Bei dem Ionensignal-Paar

m/z 13.834 und 9390 befand sich der Grenzwert über dem 0,25-Quantil der Kontroll-

Gruppe. Um mit den früheren Messreihen vergleichen zu können, wurde aber das

Verfahren hier trotz dieses Umstandes nicht geändert.

4 Ergebnisse

47

Diese Methodik einer multifaktoriellen Analyse, angewendet auf die Daten von

Messreihe 5, führte zu einer Sensitivität von 91% sowie einer Spezifität von 92%.

Darüber hinaus zeigte sich ein positiver Vorhersage-Wert von 91% sowie eine negativer

Vorhersage-Wert von 92%. Zusammenfassend sind die Ergebnisse der Messung 5 in

Tabelle 8 dargestellt.

Tabelle 8: Ergebnisse einer multiparametrischen Analyse für Messung 5 nach

Proteinseparation mittels fraktionierter Fällung.

Messung Richtig

positiv

Falsch

positiv

Richtig

negativ

Falsch

negativ

Sensitivität Spezifität Falsch

positiv

Rate

Falsch

negativ

Rate

Positiver

Vorhersage-

Wert

Negativer

Vorhersage-

Wert

M5 10 1 12 1 0,91 0,92 0,08 0,09 0,91 0,92

4 Ergebnisse

48

4.3. Identifizierung von Serumproteinen

SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese

Neben der massenspektrometrischen Untersuchung der Serumproben erfolgte die

Analyse ausgewählter Proben mittels SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese. Von

besonderem Interesse war dabei der Massenbereich unter 20 kDa, da sich dieser bereits

in den vorangegangenen MALDI-ToF-MS Messungen als sehr signalreich

herausgestellt hatte. In Abbildung 13 ist der Massenbereich von 6,5 bis 20 kDa für

jeweils zwei Präeklampsie- und Kontroll-Proben dargestellt. Es zeigten sich sowohl bei

den Präeklampsie- als auch bei den Kontroll-Proben insgesamt sechs Proteinbanden in

dem angegebenen Massenbereich vor (Bahn 1) und nach (Bahn 2) fraktionierter

Fällung.

5 7 23 15

1 2 1 2 1 2 1 220

14

6.5

Retinol binding protein 4Apolipoprotein A-II

TransthyretinApolipoprotein C-III

kDa

PE KO

Abbildung 14: SDS-PAGE-Analyse der Patientenproben 5 und 7 (Präeklampsie-Proben) und 23 und 15

(Kontroll-Proben) vor (Bahn 1) und nach (Bahn 2) fraktionierter Fällung. Verwendet wurde ein 12%iges

Gel. Der Massenbereich umfasste 6,5-20 kDa. Die Färbung der Proteinbanden erfolgte mit Coomassie-

Brillant-Blau G-250. Die massenspektrometrisch identifizierten Proteine sind links abgebildet, die

Lokalisation der Markerproteine ist rechts dargestellt.

Die vier intensivsten Proteinbanden wurden nach in-Gel Verdau mit Trypsin

massenspektrometrisch mittels Peptide mass fingerprinting identifiziert. Die Bande bei

20 kDa enthielt als Hauptkomponente Retinol–bindendes-Protein 4 (Mr 20.943). In der

direkt darunter folgenden Bande fand sich Apolipoprotein A-II (Mr 17.160) und knapp

unterhalb von 6,5 kDa Apolipoprotein C-III (Mr 8765). Die Bande im Bereich von 14

4 Ergebnisse

49

kDa beinhaltete Transthyretin (Mr 13.761). Insgesamt zeigten sich für alle Proteine gute

Signifikanzwerte für das Identifizierungsergebnis, so dass die identifizierten Proteine

als Hauptkomponente in den entsprechenden Banden angenommen werden konnten.

Abbildung 15: Spektrum Peptide mass fingerprinting von Transthyretin (* Hintergrundsignale wie

Trypsin, Matrix, Coomassie-Färbung, Keratin etc.). Transthyretin wurde mit einem Score

(Signifikanzwert) von 226 (Signifikanzgrenze) mit 14 von 26 gesuchten Signalen (RMS 29 ppm) und

einer Sequenzabdeckung von 77% identifiziert.

Densitometrische Gelbandenanalyse

Bereits bei visueller Betrachtung der Gele fiel im Vergleich zur Kontroll-Gruppe eine

scheinbar geringere Intensität der Transthyretin-Banden in der Präeklampsie-Gruppe

auf. Die densitometrische Untersuchung der Proteinbanden ergab, dass die Banden, die

Transthyretin enthielten, eine durchgehend schwächere Intensität in den Präeklampsie-

Proben als in den Kontroll-Proben aufwiesen. Zur Normalisierung wurden die

Intensitäten der einzelnen Banden in Relation zur Intensität von Apolipoprotein A-I der

gleichen Probe gesetzt. Apolipoprotein A-I fand sich in der Bande bei 26 kDa. Im

4 Ergebnisse

50

Gegensatz zu den Kontrollen erreichten die Präeklampsie-Proben keinen Wert über 0,1.

Für die Kontroll-Proben 23 und 15 wurde ein Wert von 0,137 beziehungsweise 0,118

gemessen. Im Vergleich dazu fielen in der Präeklampsie-Gruppe die Werte mit 0,057

für Patientin 5 und 0,089 für Patientin 7 deutlich niedriger aus.

4 Ergebnisse

51

4.4. Nephelometrische Analyse von Transthyretin

Zur Untermauerung der Hypothese, die Transthyretin-Konzentration falle im Serum von

Frauen mit Präeklampsie niedriger aus als im Serum gesunder Schwangerer, wurden

frische, bisher unbehandelte Serumproben nephelometrisch untersucht. Es zeigte sich,

dass die Konzentration dieses Proteins in der Präeklampsie-Gruppe mit durchschnittlich

0.16 mg/mL (Wertebereich 0,13-0,20 mg/ml; n = 11; SA: 0,03 mg/mL) niedriger war

als bei der Kontroll-Gruppe mit 0,19 mg/ml (Wertebereich 0,14-0,22 mg/ml; n = 13;

SA: 0,02 mg/ml) mit signifikantem Ergebnis (Studentischer T-Test, p=0,03).

Abbildung 16: Box-Whisker-Plots mit Gegenüberstellung der Serumkonzentration von Transthyretin für

die Präeklampsie (PE)- und Kontroll (KO)-Gruppe.

Transthyretin, auch als Thyroxin-bindendes Präalbumin (TBP) bezeichnet, stellt ein

Serum-Transportprotein dar, welches vorrangig in der Leber sowie im Plexus

choroideus des Gehirns synthetisiert wird und am Transport der Schilddrüsenhormone

beteiligt ist. Des Weiteren zählt Transthyretin zu den negativen Akutphaseproteinen,

was bedeutet, dass im Falle eines Traumas, bei Entzündungen oder aber Operationen

Transthyretin in der Leber sowie im Blut herrunterreguliert wird [Dickson et al. 1982].

Außerdem bindet es das sogenannte Retinol-bindende-Protein, möglicherweise um so

einem Verlust dessen über die glomeruläre Filtration der Nieren vorzubeugen [Raz &

Goodman 1969].

4 Ergebnisse

52

4.5. Statistische Poweranalyse

Die statistische Poweranalyse dient der Ermittlung der notwendigen Fallzahl einer

Studie.

Unter Verwendung der Daten aus Messreihe 1 wurde anhand der fünf erstellten Regeln

(siehe Abbildung 11, Kapitel 4.2.2.), je nach überprüften Parameter eine

Stichprobenmenge von n = 6 bis n = 10 Probanden für beide Gruppen berechnet.

Folglich wird die Gruppengröße aus Messreihe 1 als ausreichend für weitere Analysen

angenommen. Eine Übersicht über die Poweranalyse für Messung 1 bietet folgende

Tabelle.

Tabelle 9: Übersicht über die Poweranalyse für Messreihe 1.

5 Diskussion

53

5 Diskussion

Zur Identifizierung einer spezifischen Proteinsignatur für das Krankheitsbild der

Präeklampsie wurden Serumproben von insgesamt 24 schwangeren Frauen

massenspektrometrisch untersucht. Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe der

Massenspektrometrie proteomische Biomarkersignaturen im Serum schwangerer Frauen

zu identifizieren, anhand derer es möglich ist, ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung

einer Präeklampsie frühzeitig zu erkennen.

Letztlich konnte ein spezifisches Proteinmuster dargestellt werden, anhand dessen eine

Differenzierung von Präeklampsie und Kontrolle vorgenommen werden konnte. Das

differentiellste Signal konnte als Transthyretin identifiziert werden. Doch muss die

Methodik der Massenspektrometrie in Bezug auf diese Arbeit auch kritisch betrachtet

werden.

5.1. Diskussion der Methodik und Fehleranalyse

Hinsichtlich der Probenhandhabung müssen der zeitliche Aufwand sowie die

praktischen Fertigkeiten des bearbeitenden Laboranten berücksichtigt werden. Für die

Fraktionierung von vier Serumproben mittels magnetischer Beads wurden im

Durchschnitt 45 Minuten benötigt, für die Proteinseparation mittels fraktionierter

Fällung ist mit einem Zeitaufwand von ca. 40 Minuten je Serumprobe zu rechnen. Für

die Probenpräparation sowie die eigentliche Messung sollten nochmals, abhängig von

der Menge der zu präparierenden Proben, mindestens eine Stunde eingeplant werden.

Insgesamt kann mit einem zeitlichen Aufwand von etwa einem Arbeitstag gerechnet

werden hinsichtlich Probentransfer, Präparation sowie Messung. Auch ist hierbei die

Verfügbarkeit eines entsprechenden Massenspektrometers zu berücksichtigen.

Desweiteren ist eine rasche Weiterverarbeitung der Serumproben nach Entnahme von

entscheidender Bedeutung, so dass eine Schädigung der Probe vermieden wird.

Wie Versuche zeigten, ist eine Präfraktionierung der Serumproben erforderlich, da es

sonst aufgrund der Vielzahl von Proteinen zu einer Signalüberlagerung kommt und

damit eine sinnvolle Auswertung der MS-Spektren nicht möglich ist. Doch ist nicht

auszuschließen, dass durch die Proteinseparation mittels magnetischer Beads des

Profilings-Kits MB HIC8 wesentliche differentielle Proteine verloren gehen.

5 Diskussion

54

Die Probenaufarbeitung sowie die anschließende Matrixpräparation sollten weiterhin

stets mit frischen Ansätzen für Eluat und Matrix erfolgen, da es sonst, wie in dieser

Arbeit (Messreihe 2 und Messreihe 4) gezeigt, zu Messfehlern kommt, die dann

wiederum Ausdruck in Form falsch positiver oder falsch negativer Ergebnisse finden.

Die Aufarbeitung der Serumproben mittels magnetischer Beads ist einfach und auch

ohne spezielle Laborkenntnisse zu bewerkstelligen. Für die fraktionierte Fällung der

Proben ist ein gewisses Maß an Laborerfahrung unabdingbar. Auch in diesem Fall sollte

nach dem Auftauen eingelagert Serumproben auf eine rasche Weiterverarbeitung

geachtet werden, da es bei Zeitverzug ansonsten zu einer Schädigung der Proben

kommen kann.

Wie im Ergebnisteil beschrieben, eignet sich bei der Auswertung der gemessenen

Spektren eine monoparametrische Analyse nicht, da sich je nach Fallanwendung eine

entsprechend hohe Sensitivität bzw. Spezifität zeigt. Es sollte folglich stets der, in dieser

Studie herausgearbeitete, multiparametrische Ansatz zur Bestimmung des Risikos der

Entwicklung einer späteren Präeklampsie herangezogen werden. Hierbei sollte

allerdings die frei gewählte Definition der Schwellenwerte bedacht werden, welche erst

in weiteren Studien durch eine Erhöhung der Fallzahl an Gültigkeit gewinnen kann und

damit den Ansatz einer multiparametrischen Analyse etabliert.

Weiterhin entscheidend für die langfristige klinische Anwendbarkeit dieses Verfahrens

ist der Einsatz qualitativ hochwertiger Probenmaterialen aus gut charakterisiertem

Serum-, Gewebe- und Datenbanken sowie das Einhalten standardisierter

Arbeitsprotokolle.

Nicht zuletzt müssen die Verfügbarkeit eines entsprechend geeigneten

Massenspektrometers und damit verbundene Kosten bedacht werden, wobei diese

Problematik bei erfolgreicher Entwicklung eines Sreening-Testes aktiv angegangen

werden kann.

5 Diskussion

55

5.2. Bedeutung von Transthyretin

Transthyretin (TTR) wurde historisch als Präalbumin beschrieben, da es in der

Serumelektrophorese vor der Albumin-Bande zu finden ist. Seine genaue Funktion ist

bisweilen nicht geklärt, jedoch wird ihm eine Rolle in der Verteilung der

Schilddrüsenhormone zugesprochen.

Kürzlich konnte die Arbeitsgruppe um Gharesi-Fard zeigen, dass die plazentare

Konzentration von Transthyretin bei Frauen mit Präeklampsie höher ausfiel als bei

gesunden Frauen. Auch in diesem Fall wurde ein Zusammenhang mit der Pathogenese

der Präeklampsie gemutmaßt [Gharesi-Fard et al. 2010].

Transthyretin wird bei Frauen in der Schwangerschaft auch von den plazentaren

Trophoblastzellen sezerniert, wo es extrazellulär T4 bindet und so zu einer gesteigerten

Internalisierung des Transthyretin-T4-Komplexes führt. Dies scheint eine wichtige

Rolle für den Transport maternaler Schilddrüsenhormone in den fetalen Kreislauf zu

spielen und ist folglich von entscheidender Bedeutung für die fetale Entwicklung, was

letztlich eine fetale Wachstumsrestriktion zur Folge haben kann [Landers et al. 2009].

Diese wird wiederum häufig im Zusammenhang mit einer Präeklampsie beschrieben

[Zupan-Simunek 2010].

Auch in der Amnionflüssigkeit schwangerer Frauen fanden sich Veränderungen

hinsichtlich der Konzentration von Transthyretin. So wies Vascotto et al. in einer Studie

von 2007 eine bereits im zweiten Trimenon signifikant erhöhte Konzentration von

Transthyretin-Monomeren in der Amnionflüssigkeit schwangerer Frauen nach, welche

später eine Präeklampsie entwickelten. Normalerweise liegt Transthyretin als

Homotetramer vor. Bei den Monomeren handelte es sich um die oxidierte Form des

Transthyretins. Es wurde vermutet, dass letztlich der erhöhte oxidative Stress bei einer

Präeklampsie für die erhöhte Monomer-Konzentration in der Amnionflüssigkeit

verantwortlich ist und folglich Transthyretin als künftiger Marker einer Präeklampsie

vielversprechend sein könnte [Vascotto et al. 2007].

Letztendlich ist die Bedeutung von Transthyretin in der Schwangerschaft und dessen

Zusammenhang mit der Entstehung einer Präeklampsie nicht ausreichend geklärt.

5 Diskussion

56

5.3. Massenspektrometrie in der klinischen Forschung

Die Massenspektrometrie hat sich in den letzten Jahren immer mehr im medizinischen

Alltag etabliert, sei es im Bereich der Forschung oder hinsichtlich verschiedener

Screeningtests. So wird zum Beispiel der Guthrie-Test zum Nachweis einer

pathologischen Phenylalaninerhöhung im Blut im Rahmen des Neugeborenenscreenings

zunehmend durch die Tandemmassenspektrometrie abgelöst, wodurch auch andere

Störungen des Aminosäurestoffwechsels diagnostiziert werden können. Mit dieser

Methode werden letztlich nicht mehr nur einzelne Stoffwechselprodukte, die

sogenannten Metaboliten, und damit einzelne Stoffwechselstörungen gesucht, sondern

es werden vielmehr ganze Gruppen biochemischer Moleküle in einem Analysegang

identifiziert und quantifiziert [Hoffmann & Lindner 2002]. Auch zur Diagnostik einer

Homozystinurie und anderer Hypermethioninämien erwies sich die Tandem-

Massenspektrometrie als geeignet [Chace et al. 1996].

Als diagnostischer Screeningtest und auf der Suche nach krankheitsspezifischen

Biomarkern wurden massenspektrometrische Verfahren unter anderem auch bei der

Endometriose, dem Ovarial- und dem Prostatakarzinom eingesetzt [Wölfler et al. 2009;

Petricoin et al. 2002a; Petricoin et al. 2002b].

Das wissenschaftliche Interesse an prädiktiven Markern für hypertensive

Schwangerschaftserkrankungen ist in den letzten Jahren deutlich gestiegen. So

demonstriert bereits 2005 eine Arbeit von Koy et al., dass die genauere Betrachtung des

Proteoms entscheidend zur Erkennung diagnostischer Marker beitragen kann. Es konnte

gezeigt werden, dass es möglich ist, mit Hilfe der Kryodetektor-Massenspektrometrie

Patientinnen mit HELLP-Syndrom in der Schwangerschaft schnell und verlässlich zu

identifizieren [Koy et al. 2005). In der Folge wurden in diesem charakteristischen

Proteinmuster sechs Proteine massenspektrometrische identifiziert, die einen

signifikanten Unterschied in ihrer Expression beim Vergleich gesunder sowie

pathologisch veränderter Plasmaproben aufwiesen. Als prädiktiver Marker für das

HELLP Syndrom erschien vor allem Serum Amyloid A geeignet [Heitner et al. 2006].

Letztendlich wird deutlich, dass die Methodik der Massenspektrometrie mehr und mehr

Einzug in den medizinischen Alltag findet und ein breites Feld an diagnostischen

Möglichkeiten bietet. Nicht zuletzt könnten weitere Rückschlüsse auf

pathophysiologische Vorgänge hinsichtlich der Entstehung einer Präeklampsie gezogen

werden.

5 Diskussion

57

5.4. Klinische Relevanz dieser Arbeit und Ausblick

Die Ergebnisse dieser Arbeit konnten zeigen, dass eine Differenzierung von

Patientinnen mit Präeklampsie und gesunden Schwangeren mit Hilfe einer spezifischen

Proteinsignatur möglich ist. Doch sind dieser Methodik hinsichtlich ihrer klinischen

Anwendbarkeit Grenzen gesetzt.

Neben Zeitaufwand und Probenhandhabung sollten ebenso die Kosten für Material und

Gerätetechnik dieses Verfahrens bedacht werden, welche im klinischen Alltag

berücksichtigt werden müssen. Doch dürften diese Punkte bei erfolgreicher

Entwicklung eines Screeningtestes für die Präeklampsie in den Hintergrund rücken.

Weiterhin kann die, bei den Patientinnen mit Präeklampsie ermittelte höhere

Transthyretin-Serumkonzentration weitere Hinweise auf die Pathophysiologie dieses

schwangerschaftsinduzierten Krankheitsbildes liefern und so weitere Erkenntnisse

hinsichtlich diagnostischer sowie therapeutischer Möglichkeiten aufzeigen. Bezogen auf

die Arbeit von Landers et al. von 2009 könnte bei Möglichkeit einer plazentaren

Substitution von Transthyretin einer fetalen Wachstumsrestriktion bei Frauen mit

Präeklampsie entgegengewirkt werden.

Zusammenfassend mag dieses Verfahren nicht unmittelbar Anwendung im klinischen

Alltag finden, nicht zuletzt da aufgrund einer zu geringen Fallzahl die Aussagekraft

dieser Daten begrenzt ist. Jedoch birgt die Methodik großes Potential und könnte bei der

Vorhersage der Präeklampsie an Bedeutung gewinnen. In diesem Zusammenhang ist es

wichtig, die hier erhobenen Daten an einer größeren Zahl an Schwangeren

reproduzieren zu lassen.

Weitere zu klärende Fragen sind außerdem: Wie groß ist der Einfluss der vor den

Messungen erforderlichen Proteinseparation auf die Messdaten und ist das Verfahren

auch auf andere Arten der Probenfraktionierung anwendbar? Außerdem von Interesse

ist die Frage nach der Möglichkeit, anhand dieser Methode besonders schwere

Verlaufsformen der Präeklampsie, wie das HELLP-Syndrom vor dessen klinischer

Manifestation zu identifizieren. Letztendlich dürfte sich in Hinblick auf eine valide

Aussage, die Bedeutung dieser Arbeit für andere hypertensive

Schwangerschaftserkrankungen, wie die Gestationshypertonie und die

Propfpräeklampsie nur durch eine multizentrische Studie klären lassen. Eine Folgearbeit

dieser Studie befasste sich bereits eingehender mit dem prädiktiven Potential der hier

ermittelten Proteomsignatur für das Krankheitsbild der „early-onset- Präeklampsie“. Es

5 Diskussion

58

konnte gezeigt werden, dass das MALDI-ToF-MS Serum-Profiling ein robustes

Verfahren zur Klassifikation von Präeklampsie- und Kontroll-Proben ist [Pecks et al.

2010].

Das Fazit dieser Studie ist, dass die Erforschung des Proteoms eine Vielzahl

diagnostischer Möglichkeiten bietet, wobei die Massenspektrometrie ein entscheidendes

Mittel zur Erkennung krankheitsspezifischer Proteincluster darstellt. Das MS-Spektrum

einer Serumprobe ist charakteristisch für die Proteinzusammensetzung einer Probe und

erlaubt somit Rückschlüsse auf das Vorliegen eines entsprechenden Krankheitsbildes.

Dabei dienen neben Blutserum ebenso Blutplasma, Urin, Abstriche sowie verschiedene

Gewebeproben als Untersuchungsmaterial, was wiederum die vielseitige

Anwendbarkeit der Massenspektrometrie demonstriert. Auch lassen sich nicht zuletzt

pathophysiologische Vorgänge erfassen, die bislang nicht bekannt waren.

.

6 Zusammenfassung

59

6 Zusammenfassung

Die Präeklampsie bezeichnet eine hypertensive Erkrankung in der Schwangerschaft,

welche sich normalerweise nach der vollendeten 20. SSW entwickelt [Heilmann et al.

2007]. Sie zählt zu den Hauptursachen für mütterliche sowie kindliche Morbidität und

Mortalität [Lyell et al. 2003]. Die Behandlung dieses Krankheitsbildes, dessen

charakteristische Leitsymptome Proteinurie (> 300 mg/24h), Hypertonie (neu

aufgetreten nach vollendeter 20. SSW) sowie Ödeme sind, liegt derzeit einzig und allein

in der Entbindung des Kindes [Obuchowski & Zhou 2002].

Derzeit existiert noch kein aussagekräftiger Test zur sicheren Früherkennung einer

Präeklampsie [Rath & Fischer 2009]. Eine frühe Erkennung des Risikos für die

Entwicklung einer Präeklampsie könnte eine optimale Betreuung in der

Schwangerschaft sowie die frühzeitige Einleitung entsprechender Maßnahmen bei

auftretenden Komplikationen gewährleisten. Unter diesem Gesichtspunkt wurde für

diese Studie das Serum von 24 schwangeren Frauen massenspektrometrisch untersucht.

Es konnte eine für die Präeklampsie typische Proteomsignatur, bestehend aus sechs

Proteinionensignalen, identifiziert werden, mit Hilfe derer ein multiparametrischer

Auswertungsansatz konstruiert wurde. Dieser erlaubte eine Unterscheidung zwischen

„Präeklampsie“ und „gesunde Schwangere“ nach massenspektrometrischer

Untersuchung individueller Serumproben. Doch sind dieser Methodik hinsichtlich ihrer

klinischen Anwendbarkeit bezüglich Zeitaufwand, Probenhandhabung sowie

Verfügbarkeit eines geeigneten Massenspektrometers Grenzen gesetzt.

Das am stärksten differentielle Ionensignal bei m/z 13.715 konnte als Transthyretin-

zugehörig identifiziert werden. Eine nephelometrische Untersuchung der Serumproben

zeigte, dass Patientinnen mit Präeklampsie eine durchschnittlich niedrigere

Konzentration an Transthyretin im Blut aufweisen als gesunde Schwangere. Dies

könnte weitere Rückschlüsse auf die bislang noch unklare Pathogenese der

Präeklampsie liefern sowie Erkenntnisse hinsichtlich diagnostischer und therapeutischer

Maßnahmen aufzeigen.

Zusammenfassend unterstützen die Ergebnisse dieser Arbeit die Auffassung von der

Präeklampsie als heterogenes Krankheitsbild und zeigen, dass mit Hilfe der

Massenspektrometrie die Identifikation einer für die Präeklampsie typische

Proteomsignatur mittels eines multiparametrischen Auswertungsansatzes möglich ist.

7 Literaturverzeichnis

60

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8 Anhang

I

8 Anhang

8.1. Abbildungsverzeichnis

Abb. 1 Uteroplazentares Gefäßsystem 9

Abb. 2 Arbeitsablauf eines Massenspektrometers 14

Abb. 3 Fraktionierung der Serumproben mittels magnetischer Beads 21

Abb. 4 Reflex III MALDI-ToF-Massenspektrometer 24

Abb. 5 Spektrum einer PE-Probe nach fraktionierter Fällung 32

Abb. 6 Darstellung der Einzelspektren zweier Serumproben 34

Abb. 7 Darstellung der Summenspektren beider Gruppen 36

Abb. 8 Flächenverteilung einzelner Ionensignale (Box-Whisker-Plots) 36

Abb. 9 Räumliche Darstellung Einzelspektren im Koordinatensystem 38

Abb. 10 Einzelspektren der ersten Messung im stack view 41

Abb. 11 Box-Whisker-Plots für die selbst definierten Regeln 43

Abb. 12 Übersicht Auswertung 45

Abb. 13 Darstellung Einzelspektren nach fraktionierter Fällung 46

Abb. 14 SDS-PAGE-Analyse einzelner Serumproben 48

Abb. 15 Spektrum Peptide mass fingerprinting von Transthyretin 49

Abb. 16 Gegenüberstellung der Serumkonzentrationen von Transthyretin 51

8 Anhang

II

8.2. Tabellenverzeichnis

Tab. 1 Klassifizierung hypertensiver Erkrankungen in der SS 4

Tab. 2 Charakterisierung der Schwangeren 31

Tab. 3 Auszug der Peak-Statistik-Tabelle für Messung 1 35

Tab. 4 Ergebnisse für die erste Kombination für Messung 1 bei einer

monoparametrischen Analyse, 1. Ansatz 39

Tab. 5 Ergebnisse einer monoparametrischen Analyse, 2. Ansatz 40

Tab. 6 Übersicht Ionensignale einer multiparametrischen Analyse 42

Tab. 7 Ergebnisse einer multiparametrischen Analyse für Messung 1-4 45

Tab. 8 Ergebnisse einer multiparametrischen Analyse für Messung 5 47

Tab. 9 Übersicht Poweranalyse für Messung 1 52

8 Anhang

III

8.3. Publikationen und Kongressteilnahmen

Pecks U, Seidenspinner F, Röwer C, Coy C, Reimer T, Rath W, Glocker MO.

Multifactorial Analysis of Affinity-Mass Spectrometry Data from Serum Protein

Samples: A Strategy to Distinguish Patients with Preeclampsia from Matching Control

Individuals. J Am Soc Mass Spectrom 2010;21(10):1699-711.

Poster, 43. Tagung der Deutschen Gesellschaft für Massenspektrometrie, Halle (D),

2010.

Poster, 58. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Gynäkologie und Geburtshilfe,

München (D), 2010.

8 Anhang

IV

8.4. Danksagung

Hiermit möchte ich mich ganz herzlich bei Prof. Dr. med. W. Rath für die Vergabe des

Promotionsthemas sowie die freundliche Unterstützung bedanken.

Ein besonderer Dank gilt Dr. med. U. Pecks für die intensive und verlässliche

Betreuung dieser Arbeit sowie die Ermöglichung der Publikation. Ebenso danken

möchte ich Herrn Prof. Dr. rer. nat. M. O. Glocker. Vielen Dank für die Unterstützung

während der gesamten Arbeit und die vielen wertvollen Anregungen bei der

Entwicklung der Methodik sowie Auswertungsstrategie. Danke für die intensive

Betreuung während der Durchführung und Auswertung der Experimente sowie bei der

Fertigstellung der Promotion. Danke auch für die Möglichkeit der Vorstellung dieser

Arbeit auf der 43. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Massenspektrometrie.

Ebenso ganz herzlich bedanken, möchte ich mich bei Frau C. Röwer und Herrn T.

Eickner sowie Frau A. Pause und Herrn T. Hartwig, die mir hilfreich zur Seite standen,

mich unterstützten, geduldig meine zahlreichen Fragen beantworteten sowie wertvolle

Anregungen gaben.

Insbesondere danke ich weiterhin Frau M. Sieb für die Einarbeitung und die wertvollen

Hilfestellungen bei der Durchführung und Dokumentation der Experimente. Ich danke

Herrn M. Kreutzer für die Unterstützung bei der Auswertung und Darstellung der

elektronischen Daten. Weiterhin danke ich Frau C. Koy für ihre freundliche

Unterstützung besonders in der Anfangsphase.

Ein besonders lieber Dank gilt meinen Eltern sowie meiner Oma Inge, die mir stets

ermutigend zur Seite standen, mich unterstützten und mir den nötigen Rückhalt gaben.

Ohne sie wäre diese Arbeit nicht möglich gewesen. Danke.

Erklärung § 5 Abs. 1 zur Datenaufbewahrung

Hiermit erkläre ich, dass die dieser Dissertation zu Grunde liegenden Originaldaten bei

mir, Franka Nadine Seidenspinner, Eintrachtstraße 1, 52068 Aachen hinterlegt sind.

Lebenslauf

Persönliche Daten

Geburtsdatum 28.09.1982

Geburtsort Rostock

Staatsangehörigkeit Deutsch

Familienstand Ledig

Arbeit

Seit dem 01.05.2010 Assistenzärztin für Gynäkologie/ Geburtshilfe

Medizinisches Zentrum StädteRegion Aachen GmbH

Studium

15.12.2009 Abschluss des Studiums der Humanmedizin, RWTH

Aachen

18.01.2009 - 31.05.2009 Doktorarbeit am Proteom-Zentrum Rostock

“A Mass Spectrometry-based Multifactorial Analysis

Strategy to Distinguish Patients with Preeclampsia from

Matching Control Individuals”

18.02. 2008 - 18.01.2009 Praktisches Jahr

19. 03.2005 Abschluss der Ärztlichen Vorprüfung

01.10. 2002 Aufnahme des Studiums der Humanmedizin

Praktisches Jahr

01.10.2008 - 18.01.2009 Spital Männedorf (Schweiz), Chirurgische Klinik

09.06.2008 - 28.09.2008 St.-Antonius-Hospital Eschweiler, Klinik für Innere

Medizin

18.02.2008 - 02.06.2008 Universitätsklinikum Aachen, Frauenklinik für

Gynäkologie und Geburtshilfe

Famulaturen

10.09.2007 - 30.09.2007 Anästhesie

Krankenhaus Düren gem. GmbH

01.08.2007 - 02.09.2007 Allgemeinmedizin

Dr. Seidenspinner, Rostock

12.03.2007 - 28.03.2007 Gynäkologie

Universitätsfrauenklinik, Aachen

01.09.2006 - 30.09.2006 Gynäkologie

Universitätsfrauenklinik und Poliklinik, Rostock

02.03.2006 - 19.03.2006 Innere Medizin

Medizinisches Zentrum Kreis Aachen, Würselen

01.09.2005 - 03.10.2005 Allgemeine Chirurgie

Universitätsklinik, Rostock

Schullaufbahn

1993 - 2002 Gymnasium Stefan-Jantzen, Rostock- Lichtenhagen

1989 - 1993 Rudolf- Tarnow- Grundschule, Rostock- Lichtenhagen

Sprachen

Englisch: fließend in Wort und Schrift

Französisch: Grundkenntnisse

Freizeit

Sport (Volleyball, Fitness), lesen, Musik