Universidad de San Carlos de GuatemalaFacultad de Agronomarea tecnolgicaSub-rea de manejo y mejoramiento de plantasMdulo de Plantas Ornamentales y MedicinalesAux. Rayza Puluc

Evaluacin de tres relaciones de Bencil Amino Purina y Giberelina, para la propagacin in vitro de Lisianthus, en el laboratorio de cultivo de tejidos vegetales, Facultad de Agronomia, USAC, Guatemala

Vctor Moiss Caras Donis201210842Roberto Andrs Prez Marroqun201112304Edgardo Quionez Montejo 201210544Alex Fernando Sosa Yupe201210589Enio Amilcar Santos Aquino 201210530

Guatemala 13 de Marzo del 201523

Tabla de contenido1Introduccin32Definicin del Problema43Justificacin del Problema54Marco Terico64.1El sector de plantas ornamentales en Guatemala64.2El cultivo de Lisianthus (Eustoma Grandiflorum Raf. Shinners)64.2.1Clasificacin taxonomica64.2.2Botnica y Fisiologa del Cultivo74.3Cultivo de Tejido vegetales74.3.1Etapas del proceso:84.4Cultivo de Meristemos94.4.1Generalidades:94.4.2Ventajas94.4.3Limitantes94.5Fitohormonas104.5.1Citoquininas104.5.2Giberelinas114.5.3cido giberlico124.6Componentes del Medio de Cultivo Murashige & Skoog125Marco Referencial135.1Localizacin135.2Recursos con los que cuenta146Objetivos156.1General156.2Especificos157Hiptesis168Metodologa178.1Metodologa Experimental178.1.1Modelo Estadstico178.1.2Factor de Estudio178.1.3Tratamientos y Repeticiones188.1.4Descripcin de la Unidad Experimental188.2Manejo del Experimento188.2.1Seleccin del material vegetal.188.2.2Seleccin y extraccin del explante188.2.3Preparacin del medio198.2.4Esterilizacin de la cristalera, instrumentos y medios de cultivo.198.2.5Transferencia de explantes en el medio198.2.6Incubacin en medio de induccin.198.2.7Transferencia208.2.8Incubacin.208.2.9Toma de datos208.2.10Evaluacin.208.3Variables de Respuesta209Bibliografia2110Anexos23

ndice de Tabla

Tabla 1. Muestra la Descripcin de las actividades a desarrollar en el proyecto de investigacin25Tabla 2 Muestra los costos del experimento25ndice de Figura

Figura 1 Muestra la ubicacin del laboratorio del cultivo de Tejido vegetales, el cual se identifica con una Cruz.11

ndice de Cuadros

El Cuadro 1 Muestra los componentes principales del medio de cultivo10El Cuadro 2. Posicionamiento de las unidades experimentales. (DCA)16

IntroduccinLa diversidad climtica de Guatemala permite que existan diversas condiciones para la produccin de cultivos. El cultivo de ornamentales consta un sector muy fuerte en este pas, siendo la zona central una de las zonas de mayor produccin. (AGEXPORT, 2014).En Guatemala se reportan alrededor de ciento veinticinco empresas productoras/exportadoras que producen alrededor de 200 especies y 500 variedades propias y extranjeras, este sector posee un 10% de crecimiento anual lo que contribuye al ingreso de divisas al pas de alrededor de cien mil millones de dlares. Por lo cual se convierte en una actividad de suma importancia para la generacin de empleo. (AGEXPORT, 2014).En los departamentos de Sacatepquez, Chimaltenango y Guatemala se lleva a cabo una alta produccin de flores de corte que poseen destinos nacionales e internacionales, siendo este ltimo mercado el ms exigente, esta condicionante pone a los productores bajo una lucha de actualizarse en cuanto a los productos que oferentes. Una alternativa actual en cuanto a las exigencias del mercado extranjero es el cultivo de lisianthus (Eustoma grandiflorum) (Raf.) Shinners, es una especie originaria del sudoeste de Estados Unidos y el norte de Mxico, planta de ciclo anual o bianual dependiendo de la zona. Es una planta de flores vistosas y coloridas, tallos sin espinas de alrededor de 60 a 90 centmetros de largo, puede presentar hasta dieciocho flores por planta, adems posee una larga vida post corte.Lisianthus es una especie que no ha sido estudiada para la produccin en condiciones locales por tal motivo es importante realizar evaluaciones alternativas a la propagacin botnica que hagan ms eficiente la obtencin de plntulas a un menor costo, sanas y en un tiempo relativamente corto respecto a la propagacin botnica o por semilla. En la presente evaluacin se pretender eval el efecto que tiene la relacin de bencil animo purina y giberelina sobre la produccin de yemas laterales para la propagacin in vitro de lisianthus (E. grandiflora) (Raf.) Shinners, como una alternativa para la propagacin botnica, con el fin de reducir costos de produccin y tiempo para obtencin de plantas listas para campo.

Definicin del ProblemaLa produccin de Lisianthus (Eustoma grandiflora) (Raf.) Shinners en el pas de Guatemala es muy limitada debido a que existen variaciones climticas que son difcil de controlar, y al no ser controladas causan los siguientes problemas al momento de propagar dicha especie: 1) Reduccin del 80% de la germinacin si sobrepasa los siguientes rangos 200C a 240C, 2) En etapa de plntula es mucho ms sensible al fenmeno denominado Roseta, lo cual consiste en un retraso floral y un mal desarrollo del tallo si la temperatura es mayor a 350C (SHON, 1997; HARBAUH et al; 1992).

Justificacin del ProblemaEl proyecto pretende establecer una alternativa para la propagacin de lisianthus (E. grandiflora) (Raf.) Shinners, utilizando tcnicas modernas como la propagacin in vitro, para tener beneficios tales como mayor nmero de yemas laterales(mayor nmero de botones florales), mayor uniformidad de poblaciones, material libre de virus y enfermedades; alta produccin y reduccin de incidencia del fenmeno roseta.

Marco TericoEl sector de plantas ornamentales en GuatemalaLa diversidad climtica de Guatemala permite que existan diversas condiciones para la produccin de cultivos. El cultivo de ornamentales representa un sector muy fuerte en el pas, siendo la zona central una de las reas de mayor produccin. (AGEXPORT, 2014). El cultivo de Lisianthus (Eustoma Grandiflorum Raf. Shinners)Este cultivo es una planta anual o bianual, usada mayormente como ornamental. El lisianthus se origin en las zonas hmedas del rea meridional de Estados Unidos y el Norte de Mxico. Forma una roseta de hojas, sobre la que se desarrolla un tallo de 40 o 50 cm de largo; en cuyo extremo aparecen las flores largamente pediceladas de 6 a 9 cm de dimetro y de colores entre el azul y el prpura, en las variedades silvestres. (Shinners, 1957). No es una planta totalmente desrtica en su hbitat natural, el lisianthus se encuentra creciendo a lo largo de las orillas de ros y reas bajas donde siempre hay acceso a agua fresca. Las plantas de Lisianthus desarrollan races profundas hacia abajo del suelo buscando el acceso al agua fresca. (Lima, 1988).Clasificacin taxonomicaEl Lisianthus con nombre cientfico (Eustoma grandiflorum) Raf. Perteneciente a la familia Gentianaceae presenta la siguiente clasificacin taxonmica.Reino.VegetalDivisin.MagnoliophytaClase.MagnoliopsidaOrden.GentianalesFamiliaGentianaceaeTribu.ChironieaeGeneroEustomaEspecieEustoma Grandiflorum (Raf) Shinners (Pea, 2000)

Botnica y Fisiologa del CultivoEl lisianthus se introdujo en Europa y Japn cerca de 1930. A travs de sucesivos programas de mejora, realizados en su mayora por empresas japonesas, se han obtenido variedades hbridas F1 de flores blancas, rojas albaricoque o con mezcla de flores y unas longitudes de 60 a 90 centmetros y con flores sencillas o dobles, estas ltimas con dos o tres ptalos (Salazar, 2008).Su reproduccin se realiza normalmente por semilla, aunque tambin se puede hacer por esqueje o por cultivo in vitro de tejidos. El lisianthus es una planta que se multiplica por semilla muy pequea, (800 por gramo), (Salazar, 2008).El lisianthus forma una roseta de hojas pecioladas, cordiformes (en forma de corazn) y opuestas, cerosas, sobre la que se desarrolla un tallo sin espinas, erecto herbceo, de color verde azulado y 0.6 a 0.7 cm de dimetro. Alcanzando buenas condiciones de 60 a 80 cm de altura. Las flores son tubulosas, bisexuales, cliz tubular, flores en forma de campanilla. Las races pivotantes o tpicas, herbceas son parte muy importante de estas plantas, que por crecer en reas semiridas llegan a profundidades de 1.25 a 1.4 m, (Salazar, 2008).Cultivo de Tejido vegetalesEn su acepcin amplia, el cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogneo de tcnicas que presentan en comn el hecho de que un explante o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, clulas, tejidos u rganos se cultiva aspticamente en un medio artificial de composicin qumica definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Cada fragmento origina una planta idntica a la que se le tom el fragmento, aunque puede ser modificada genticamente para tener variedades artificiales(Mousavi, Behbahani, Hadavi, Miri, & Karimi, 2012) Estas tcnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micropropagacin, propagacin rpida de clones, eliminacin de virus y enfermedades, produccin de haploides, aislamiento y utilizacin de protoplastos, cultivo de embriones, produccin de fitoqumicos,ingeniera gentica, mutacin y seleccin celular, produccin de semillas sintticas y estudios bsicos de anatoma, desarrollo, fisiologa y nutricin vegetal. (Zhang et al., 2014).

Etapas del proceso:El cultivo de tejidos vegetales es el proceso que se inicia con un explante y termina con la obtencin de plantas completas, lo que involucra una serie de etapas, las cuales se enumeran a continuacin:

Eleccin de la planta y/o tejido donante de explantes. En esta fase se incluyen los tratamientos, preparacin y seleccin de las plantas madre a partir de las cuales se inicia el cultivo, siendo imprescindible comprobar la identidad (especie, variedad o cultivar) y su estado de salubridad (libre de patgenos, deficiencias o estrs). Establecimiento: consiste en la desinfeccin de los explantes (generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptacin al medio artificial para inducir: callo, brote, raz o embrin somtico, segn se desee. Se requiere desinfectar superficialmente el material escogido para evitar que en el medio de cultivo crezcan microorganismos, principalmente bacterias y hongos, que competirn ventajosamente con el explante.

Multiplicacin: consiste en generar una cantidad de masa vegetal suficiente para la regeneracin del nmero de plantas necesarias.

Enraizamiento: es el proceso de induccin de la formacin de races con el fin de convertir a los brotes o embriones somticos en plntulas completas. El enraizamiento puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro. En el primer caso se transfieren los brotes obtenidos en la etapa anterior a un medio libre de reguladores de crecimiento o que slo contenga auxinas. Esta operacin se realiza en condiciones de esterilidad (en cabina de flujo). En el segundo caso los brotes se sumergen en una solucin concentrada de auxinas y se transfieren a un sustrato limpio, no necesariamente estril, que puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita. Los brotes que se utilicen en el enraizamiento ex vitro deben ser vigorosos y poseer hojas bien desarrolladas, ya que las plantas deben realizar la fotosntesis para obtener la energa necesaria para desarrollarse y formar las races.

Rusticacin: es el paso de aclimatacin de las plntulas obtenidas in vitro a las condiciones del ambiente usuales fuera del tubo o frasco, es decir al suelo o algn sustrato inerte.

El enraizamiento ex vitro permite que la fase de enraizamiento y la fase de aclimatacin se logren simultneamente y que raramente se forme callo en la base de los explantes, asegurando as una conexin vascular continua entre el vstago y la raz.(George & Manuel, 2013).

Cultivo de MeristemosCultivo de meristemos. Tcnica de cultivo que consiste en aislar aspticamente la regin meristemtica con 1-3 de los primordios foliares ms jvenes e implantarla en un medio de cultivo estril, con el propsito de inducir la diferenciacin de clulas y tejidos en plantas completas, mediante la utilizacin de medios de cultivos adecuados.(Mousavi, Behbahani, Hadavi, Miri, et al., 2012)Generalidades:En multitud de especies cuyo mtodo de propagacin habitual es de tipo vegetativo e incluso en algunas cuya propagacin es por semilla, se encuentran problemas de contaminacin por diversos microorganismos, que los mtodos tradicionales de desinfeccin utilizados por los propagadores y viveristas no consiguen erradicar, ni siquiera mediante tratamientos qumicos agresivos, esto conlleva una serie de prdidas econmicas por prdidas de produccin, de calidad de fruto y hasta de cosechas completas. Incluso utilizando tcnicas de cultivo in vitro es a veces imposible eliminar a determinados organismos patgenos, como virus, micoplasmas, bacterias y hongos endgenos, algunos de los cuales se transmiten incluso va semillas, y ante los cuales muchas veces son ineficaces los antibiticos, bactericidas y antivricos aadidos a los medios de cultivo. (Thorpe, 2012).VentajasLos meristemos son genticamente estables y resultan el tejido idneo para la iniciacin de programas de propagacin in vitro.El cultivo de meristemos permite eliminar la contaminacin de algunos virus por escape, puesto que los tejidos meristemticos se mantienen sanos aun cuando el resto de las clulas estn infestadas. Este mtodo resulta efectivo para el control de bacterias y hongos contaminantes y patgenos.Los progresos alcanzados en su aplicacin han hecho posible propagar gran nmero de especies de importancia econmica, los resultados han sido particularmente atractivos porque se pueden obtener clones limpios de patgenos a partir de plantas sistmicamente infectadas.(Thorpe, 2012).

LimitantesEl xito en el cultivo de meristemo es juzgado por el porcentaje de regeneracin, tamaos pequeos (0.1-0.2mm) crecen lentamente disminuyendo la eficiencia del mtodo. La resistencia de algunos genotipos al cultivo in vitro limita su extensin a diferentes variedades y especies.En la actualidad el cultivo de meristemos apicales constituye una alternativa en la erradicacin de patgenos, aunque no siempre se logran los niveles de efectividad deseados; por esta razn es frecuentemente combinado con otros mtodos de saneamiento que aumenten su eficiencia y generalizacin. (Thorpe, 2012).FitohormonasLas fitohormonas, tambin llamadas hormonas vegetales, son sustancias producidas por clulas vegetales en sitios estratgicos de la planta y estas hormonas vegetales son capaces de regular de manera predominante los fenmenos fisiolgicos de las plantas. Las fitohormonas se producen en pequeas cantidades en tejidos vegetales, a diferencia de las hormonas animales, sintetizadas en glndulas. Pueden actuar en el propio tejido donde se generan o bien a largas distancias, mediante transporte a travs de los vasos xilemticos y floemticos.(AbouZid, 2014).CitoquininasLas citoquininas o citocininas constituye en un grupo de hormonas vegetales que promueven la divisin y la diferenciacin celular. Dicho conjunto de hormonas no se puede encontrar de forma artificial ya que consiste en dar origen al proceso de formacin de los rganos de todas las plantas lo cual hace que esta hormona sea totalmente vegetal y no es necesaria tenerla artificialmente(Mousavi, Behbahani, Hadavi, & Miri, 2012).Efectos en las plantasControl de la dominancia apical: Aunque la dominancia apical est determinada principalmente por las auxinas, las citoquininas controlan la brotacin de las yemas laterales. De esta forma, las citoquininas contribuyen a determinar la arquitectura de una planta.Retraso de la senescencia foliar: Las citoquininas ralentizan el proceso de degradacin de la clorofila, el RNA, los lpidos y las protenas que ocurre en las hojas en el otoo o al ser separadas de la planta.Expansin de los cotiledones: Durante la germinacin, las citoquininas promueven la elongacin de las clulas de los cotiledones en respuesta a la luz.(Xiaoran et al., 2013).Crecimiento VegetativoLa actividad de las plantas se refleja en la continuidad de crecimiento de los brotes y sus hojas, lo cual repercute en mayor rea foliar para maximizar la eficiencia fotosinttica de los cultivos. Las CTS son partcipes de este proceso en cuanto a que los tejidos activos producen esa hormona para estimular la divisin celular y con ello establecer una base o estructura sobre la cual contine el crecimiento.(Thorpe, 2012).Con la aplicacin de citocininas no se obtiene una respuesta rpida de crecimiento como la que se obtiene con aplicacin de cido giberlico, ni se induce una clorosis de las hojas; La respuesta es lenta pero vigorosa, preparando la planta para la produccin de flores y frutos. En casos en que el crecimiento vegetativo haya estado bajo condiciones de estrs (exceso de agua, sequa, no fertilizacin (desbalance nutrimental), salinidad, calor extremo, fro intenso, carga excesiva, enfermedades, etc.), la respuesta a la aplicacin de citocininas es ms efectiva especialmente cuando se hace inmediatamente despus de que el cultivo ha salido de esa condicin de estrs.La aplicacin de citocininas a plantas en etapa adulta (chiles, tomates, etc.) puede reactivar (rebrotar y volver a producir flores) al cultivo y mantener y prolongar as su crecimiento y su capacidad productiva. Sus efectos incluyen el retraso en el envejecimiento.Desarrollo de yemas laterales.Las CTS pueden inducir la apertura de yemas laterales de ramas en diversas especies aunque dicho efecto se obtiene con concentraciones ms altas. En situaciones de excesiva dominancia de la yema terminal hacia las laterales una aplicacin de CTS puede reducir dicha influencia y parcialmente estimular la brotacin lateral. Para este efecto se han manipulado va citocininas la brotacin de yemas laterales algodn con excelentes resultados, y en uvas de mesa, cerezos, manzanos, y dems frutales en los que se busque formacin de ramas productivas en aos subsiguientes.(Thorpe, 2012)-

GiberelinasLa giberelina es una fitohormona producida en la zona apical, frutos y semillas. Sus principales funciones son la interrupcin del perodo de latencia de las semillas, hacindolas germinar, la induccin del desarrollo de yemas y frutos y la regulacin del crecimiento longitudinal del tallo. Su accin se considera opuesta a otra hormona vegetal denominada cido abscsico.(Ecker & Barzilay, 1993).Efectos fisiolgicosEstimula el crecimiento del tallo de las plantas mediante la estimulacin de la divisin y elongacin celular, regulan la transicin de la fase juvenil a la fase adulta, influyen en la iniciacin floral, y en la formacin de flores unisexuales en algunas especies; promueven el establecimiento y crecimiento del fruto, en casos de que las auxinas no aumentan el crecimiento, promueven la germinacin de las semillas (ruptura de la dormicin) y la produccin de enzimas hidrolticas durante la germinacin.(Esizad, Kaviani, Tarang, & Zanjani, 2012).Elongacin del talloHay diferencias con respecto al proceso inducido por las auxinas: expansin por el potencial osmtico. El tiempo que se tarda en obtener respuesta es diferente: auxinas (al cabo de 10-15 min de su aplicacin), GAs (2 3 tras su aplicacin). Los efectos de auxinas y giberelinas en este proceso son aditivos. Las GAs regulan el ciclo celular en los meristemos intercalares, se produce la elongacin celular y luego la divisin celular, estando este efecto mediado por una protena kinasa dependiente de ciclina. En el crecimiento del tallo hay genes que codifican para protenas transductoras de seal.(Thorpe, 2012).cido giberlicoEl AG, cido giberlico es una simple giberelina, promoviendo crecimiento y elongacin celular. Afecta la descomposicin vegetal y ayuda a su crecimiento si est en bajas proporciones, aunque eventualmente la planta desarrolle tolerancia al compuesto. Componentes del Medio de Cultivo Murashige & SkoogPara ralizar propagacin in vitro es necesario utilizar un medio sinttico que provea de todos los nutrientes a los explantes utilizados. El medio basal ser M&S, este es el ms utilizado en investigaciones y progapaciones de este tipo. El Cuadro 1. Componentes principales del medio de cultivo

Fuente: Thorpe

Marco ReferencialLocalizacinEl laboratorio de experimentacin est ubicado en la Facultad de Agronoma, de la universidad de San Carlos de Guatemala, en el tercer nivel del edificio T8 de su campus central zona 12 de la ciudad de Guatemala a 1512msnm, siendo sus coordenadas:

Latitud: 1435'6.97"N Longitud: 9033'12.38"O

Figura 1 Muestra la ubicacin del laboratorio del cultivo de Tejido vegetales, el cual se identifica con una Cruz.Fuente: Google Earth

Segn el insivumeh sistema De la Cruz, utilizando el mtodo de clasificacin de Holdrige. Guatemala se encuentra dentro de una zona de vida: Bosque Hmedo subtropical templado.Sus condiciones generales son: Precipitacin media anual: 1216.2 mm distribuidos en 110 das de mayo a octubre. Temperatura media anual : 18.3C Humedad relativa: 79% Vientos: 17.5 km/h.

Recursos con los que cuentaEl laboratorio de cultivo de tejidos de la FAUSAC cuenta con todo lo necesario para una investigacin exitosa, entre ello todas las reas requeridas como lo son la de esterilizacin y desinfeccin, rea de preparacin de medios, l rea de transferencias, y el rea de incubacin. El equipo con el que se cuenta son diferentes tipos de cristalera, cmara de flujo laminar, autoclave, refrigerador, un aire acondicionado para regular la temperatura y lmparas para suministrar la luz requerida por el cultivo.

ObjetivosGeneralEvaluar tres relaciones de Bencil Amino Purina y Giberelina, para la propagacin in vitro de Lisianthus, en el laboratorio de cultivo de tejidos vegetales, Facultad de Agronomia, USAC, Guatemala Especificos Inducir brotes laterales en ex plantes de lisianthus (E. grandiflora) (Raf.) Shinners bajo condiciones de laboratorio. Definir a los cuantos das despus de la siembra in vitro empiezan a producirse brotes laterales en ex plantes de Lisianthus (Eustoma. Grandiflora) (Raf.) Shinners. Determinar el efecto de las relaciones de reguladores en la longitud promedio de los brotes. Determinar el efecto de las relaciones de reguladores de crecimiento en el nmero de brotes generados a partir de los explantes utilizados.

HiptesisLa relacin de bencil amino purina (BAP) y giberelina tiene efecto sobre la produccin de brotes laterales in vitro de lisianthus (E. grandiflora) (Raf.) Shinners

MetodologaMetodologa ExperimentalSe propone exponer que el Diseo que se utilizara para verificar los fenmenos que ocurrirn en dicho experimento es el de Diseo Completamente al Azar (DCA), ya que se utiliza cuando se tienen condiciones homogneas:Modelo EstadsticoCada observacin del experimento es expresada mediante una ecuacin lineal en los parmetros, el conjunto conforma el modelo de Diseo completamente al Azar (DCA).

Donde lo anterior hace referencia a lo siguiente: Y (ij)= Variable de Respuesta de la ij-sima unidad experimental. = es la media general o media de la poblacin. Ti= Efecto de i-simo tratamiento. Ej. (i)= Error experimental asociado a la Ji-sima unidad experimental. Dicho Modelo estadstico hace referencia que la variable de respuesta Y (ij) depende de la media general (), del i-esimo tratamiento T (i), y del error experimental asociado a la ij-esima unidad experimental (ij).Supuestos a Considerar Los Errores u observaciones son independientes Los errores estn Normalmente Distribuidos Existe Homogeneidad de varianzas. El modelo es lineal y de efectos aditivos

Factor de EstudioHace referencia generalmente a la variable que tiene que controlar el experimentador; para tal caso de dicha investigacin se har nfasis en la produccin de brotes en la planta y la longitud de los brotes en el cultivo de lisianthus (E. grandiflora) (Raf.) Shinners, bajo condiciones controladas.

Tratamientos y RepeticionesSe utilizarn cuatro repeticiones y tres tratamientos, los tratamientos se describen a continuacin. Tratamiento 1: En dicho tratamiento se utilizara el medio MS y una relacin 1:1 de BAP/Giberelinas. Tratamiento 2: En dicho tratamiento se utilizara el medio MS y una relacin de 3:2 de BAP/Giberelinas. Tratamiento 3: En dicho tratamiento se utilizara el medio MS y una relacin de 5:3 de BAP/Giberelinas.

Descripcin de la Unidad ExperimentalLa unidad experimental esta conformada por dos tubos de ensayo. Las unidades experimentales se colocaran en una rejilla, distribuida de la siguiente manera.

El Cuadro 2. Posicionamiento de las unidades experimentales. (DCA)T1R1T2R1T3R3

T2R4T3R2T1R2

T3R1T3R4T2R2

T1R3T2R3T1R4

Fuente: Elaboracin Propia

Manejo del ExperimentoSeleccin del material vegetal.Se utilizaran explantes de lisianthus provenientes de subcultivos del laboratorio de cultivo de tejidos de la Faccultad de Agronoma. Seleccin y extraccin del explanteEl explante seleccionado han sido las yemas laterales del explante de lisianthus, los cuales se van a extraer, cortando una porcin de tallo, conjuntamente con las yemas, debido a que la filotaxia de la planta es opuesta.

Preparacin del medioSe utilizar un medio MS, debido a su contenido adecuado de macro y micro nutriente, vitaminas, fuente de carbono, considerados para el experimento. El medio ser preparado a partir de soluciones concentradas de macro y micro nutrientes, vitaminas y reguladores de crecimiento, los cuales sern B.A.P. y G.A., se utilizar sucrosa como fuente de carbono debido a que es un azcar simple y est en mayor disponibilidad para la planta, todo esto disuelto en agua destilada, el medio antes de agregar el agente gelificante debe alcanzar un pH de 5.8 para que este surta efecto, al obtener el pH deseado incorporando pequeas cantidades de cido o base, se aplica el agente gelificante, en este caso agar, y este se coloca en un microondas con el fin de que el mismo se disuelva con efectividad, y con contenga grumos ni agar sin disolver.Esterilizacin de la cristalera, instrumentos y medios de cultivo.La cristalera, ser desinfectada, empleando dos mtodos distintos, el calor seco, para cristalera, tal como las cajas de petri que son ingresadas a un horno envueltas en papel para no ser contaminadas al contacto, y estas son calentadas a altas temperaturas con el fin de eliminar de su superficie todo aquel agente infeccioso, dgase bacterias, hongos, etc. el otro mtodo es empleando calor hmedo, utilizando un autoclave, con ese mtodo se esterilizan los medios de cultivo, junto con los contenedores del mismo, los cuales son pequeos frascos de vidrio, que son expuestos a una temperatura de 121 centgrados y una presin de 1.4 Kg/cm2, esto con el fin de exterminar todo organismo infeccioso que pueda daar al explante. Recipientes tales como probetas, pipetas y beackers tambin son sometidos a dicha esterilizacin.

Transferencia de explantes en el medioPosteriormente la esterilizacin del medio de cultivo, los explantes sern transferidos en los frascos con medio, y distintas relaciones de reguladores de crecimiento respectivamente, estos sern transferidos en una cmara de flujo laminar, con instrumentos siendo esterilizados constantemente con alcohol al 95% y un mechero, a modo de desinfeccin con calor. Despus de transferir los explantes los recipientes sern cubiertos con papel aluminio para evitar la entrada de patgenos.

Incubacin en medio de induccin.El explante se mantendr en incubacin, se dejar en el medio de induccin por lo menos 21 das para inducir el efecto de los reguladores aplicados al medio de induccin.

TransferenciaLa transferencia se llevar a cabo posteriormente de que el explante haya pasado 21 das en el medio de induccin con reguladores de crecimiento, para ser llevado a otro frasco con medio MS, sin reguladores con el fin, de ver como los reguladores han influenciado en crecimiento del explante.

Incubacin.Posteriormente a ser transferido el explante a un medio MS, sin reguladores, este ser trasladado del rea de transferencias al rea de incubacin, donde sern proporcionadas al explante las condiciones de luz, temperatura y humedad relativa necesaria, para que este crezca de buena y sana manera.

Toma de datosSe realizar una toma de datos al finalizar el ciclo del experimento.Evaluacin.Se realizar una evaluacin estadstica, ANDEVA, siendo este un anlisis de varianza con el fin de determinar si hay alguna diferencia estadsticamente significativa, de haberlo se proceder a realizar un anlisis POST-ANDEVA, esto con el fin de determinar cul de los tratamientos es estadsticamente superior, en funcin a las variables de respuesta analizadas.

Variables de Respuesta Brotes de yemas laterales; las cuales se estarn revisando cada semana despus de haber sido montado el experimento en el laboratorio, y la herramienta que se utilizara para verificar cuantos brotes hay por unidad experimental ser el Ojo Humano. Longitud de los brotes laterales: se medir la longitud de los brotes laterales.

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15. Mousavi, E. S., Behbahani, M., Hadavi, E., & Miri, S. M. (2012). CALLUS INDUCTION AND PLANT REGENERATION IN LISIANTHUS (EUSTOMA GRANDIFLORIUM). [Article]. Trakia Journal of Sciences, 10(1), 22-25.

16. SCHN, M. 1997. El cultivo del lisianthus en la Argentina. Horticultura Argentina 1(2): 13-14.

17. HALEVY, A.H and KOFRANEK A.M. 1984. Evaluation of lisianthus as a new flower crop. HortScience 19(6): 845-847.

AnexosTabla 1. Muestra la Descripcin de las actividades a desarrollar en el proyecto de investigacinMesMarzoAbrilMAYO

No.ActividadSemana123412341234

1Preparacin del medio de cultivo X

2Transferencia de los explantesX

3Monitoreo de los explantesXXXXXXXX

4Transferencia de explantes a medios sin reguladoresX

5Toma de datos

6Sub-cultivo de explantesXX

7Toma final de datosX

8Elaboracin del informe final de investigacinX

Fuente propia

Tabla 2 Muestra los costos del experimentoProductoDescripcinUnidad de medidaCosto US$Cantidad utilizadacosto

Medio MSMedio basal de 4.48 grlitro$ 80.000.288$ 23.04

BAP50 ml 1 ppm a 1000Xml$ 29.702.592$ 1.54

Sucrosa1000 grgr$ 10.0014.4$ 0.14

Agar100 grgr$ 79.101.728$ 1.37

Vitaminas500 mgmg$ 40.70288$ 23.44

ExplantesPlantas en prefloracinunidades$ 5.001$ 5.00

$ 54.53

Fuente: Sigma-aldrich (http://www.sigmaaldrich.com/industries/agriculture/plant-tissue-culture-products.html)