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PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

“ESTUDIOS PRECLÍNICOS FARMACOLÓGICOS DE EXTRACTOS DE

Anthurium schelechtendalii Kunth (RAÍZ DE PIEDRA) EN LA REMISIÓN O

PREVENCIÓN DEL DAÑO RENAL INDUCIDO POR ADENINA EN

MODELOS MURINOS”

DIRECTOR

DR. OCTAVIO CARVAJAL ZARRABAL

ASESOR EXTERNO

M. en C. DULCE MARÍA BARRADAS DERMITZ

PRESENTA

Q.C. SAYRA QUERO HERRERA,

Estudiante de la Maestría en Medicina Forense.

VERACRUZ, VER.

UNIVERSIDAD VERACRUZANA

REGIÓN VERACRUZ

INSTITUTO DE MEDICINA FORENSE

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CONTENIDO

Pág.

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABLAS

LISTA DE ABREVIATURAS

1.-INTRODUCCIÓN …………………………………………………………………1

2.-PLATEAMIENTO DEL PROBLEMA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . …9

3.-JUSTIFICACIÓN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ....10

4.-OBJETIVOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ….11

5.- HIPÓTESIS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . …...12

6.- METODOLOGIA……………. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……….13

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... …...24

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1.-INTRODUCCIÓN

1.1. Enfermedad renal crónica

La Enfermedad Renal Crónica (ERC), en la SSA 2009, se definió como la

“disminución de la función renal expresada por una tasa de filtración glomerular

(TFG) < 60 ml/min/1.73m2 o presencia del daño renal (alteraciones histológicas,

albuminuria-proteinuria, alteraciones del sedimento urinario o alteraciones en

pruebas de imagen) de forma persistente, durante al menos tres meses”

(Cortes et al., 2009)

Esta definición de ERC es consecuente con la adoptada a nivel internacional

por la organización “Mejorando los resultados globales de la ERC” o Kidney

Disease Improving Global Outcomes (KDIGO), 2004, la cual está basada “en

la reducción de la filtración glomerular en combinación con signos de daño

renal”. Específicamente indica como ERC: “daño renal o una tasa (velocidad)

de filtración glomerular < 60 ml/min/1.73m2 por 3 meses o más”. En cuanto al

daño renal especifican que puede ser determinado por la presencia de

albuminuria a través de la relación o cociente albumina/creatinina a 30 mg/g

en dos de tres muestras de orina (Levey, et al., 2005).

La ERC es una patología de alta incidencia, prevalencia y mortalidad en

México y en el mundo. El número de nuevos casos por millón de habitantes por

año (incidencia) es de 200, en la mayoría de los países, mientras que en

países como los E.U.A., Taiwán y algunas regiones de México, alcanza 400

casos o más, por millón de habitantes, por año (Levey y Coresh, 2012).

En el estudio publicado por Franco-Marina, et al., 2011, a partir del registro de

tasas de mortalidad en México por ERC terminal (ERCT) entre 1990-2005, se

desarrolló la proyección para el período 2005-2025. En todos los 5 grupos en

los que se dividieron los estados de la República Mexicana, conforme al grado

de marginación (muy alta; alta; media; baja; muy baja) se proyectó un

constante incremento en la tasa de mortalidad por ERCT, los dos primeros

grupos (marginación muy alta y alta) alcanzaron la tasa más alta para el año

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2025) que es de 983 casos y 745 casos por millón de habitantes,

respectivamente. En cuanto a las tasas de incidencia y prevalencia se estima

que incrementarán del 2005 al 2025 también en estos dos grupos, de 433 y

402 a 1012 y 773 casos por millón de habitantes; y de 1209 y 1242 a 83 % y

56.6 %, respectivamente.

Por su parte, Méndez-Duran, et al., 2010, afirman que la ERC “se considera

una enfermedad catastrófica debido al número creciente de casos, por los altos

costos de inversión, recursos de infraestructura limitados y detección

tardía”.Con su estudio pudieron concluir que en México las causas de la ERC,

en 31,270 pacientes de 127 hospitales, fueron diabetes mellitus (48.5%),

hipertensión arterial (19%), glomerulopatías crónicas (12.7%) y otras causas

(19.8%).Estos resultados son semejantes a los reportados en otros estudios

que identifican a la diabetes y a la hipertensión como principales causales de la

ERC (Haroun, et al., 2003 y Perneger, et al., 1994, citados en Zhang y

Rothenbacher, 2008). Este tipo de causas de ERC se les ha denominado

también como tradicionales, mientras que en Reunión Del Sector Salud De

Centroamerica y Republica Dominicana en el 2013 hacen mención a los

factores tóxico-ambientales (metales pesados, agroquímicos, medicamentos

antiinflamatorios no-esteroideos, antibióticos) integran el grupo de los no-

tradicionales a nivel mundial y generalmente están asociados al grupo de “otras

causas”. (Peraza et al., 2013)

En el 52o Consejo Directivo de la Organización Panamericana de la Salud-

OPS, realizado en Septiembre-Octubre del 2013, se manifestó que en las dos

últimas décadas los pacientes en Centroamérica, diagnosticados con ERC han

aumentado y que es “un grave problema de salud pública”. De igual forma se

expresó que la población más afectada son hombres agricultores menores de

60 años, y que la etiología en este caso no es la común de ERC, esto es,

diabetes e hipertensión. Se ha vinculado a “factores tóxico-ambientales

(probablemente agroquímicos) y ocupacionales (inadecuada higiene laboral en

condiciones de altas temperaturas e insuficiente ingestión de agua) y también

hábitos nocivos como la ingesta de medicamentos nefrotóxicos, especialmente

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de antiinflamatorios no esteroideos” La prevalencia de sustitución de la función

renal aumento aproximadamente en un 300%, pasando de 162 pacientes por

millón de personas, en 1991, a 473 pacientes por millón de personas en el

2006 (OPS, 2013).

Por su parte, el Ministerio de Salud de El Salvador, 2013, indica que este

fenómeno se presenta además de Centroamérica en el sur de México, lo que

resulta congruente con la proyección realizada por Franco-Marina, et al., donde

los estados del sur y sureste mexicano, se encuentran entre los grupos de

marginación muy alta y alta y a su vez de mayor mortalidad, incidencia y

prevalencia de la ERC.

1.2. Herbolaria e IRC.

Debido a la importancia del problema de salud pública de la ERC en México y a

nivel mundial, en la actualidad existe un interés en alternativas de prevención

y terapéuticas para este padecimiento, originadas en la medicina tradicional,

cuyos efectos adversos sean mínimos. El tratamiento actual para la ERC se

limita a esteroides, citotóxicos y tratamiento sustitutivo dependiendo del

estadio de la enfermedad (Javaid et al., 2005). La Medicina alternativa y

especificamente la herbolaria ha utilizado plantas para los padecimientos

renales y sus mecanismos de acción han sido estudiados.

Tal es el caso del Astragalus membranaceus, que es una planta usada en la

medicina china tradicional, cuyo beneficio es la prevención y remisión de la

glomerulonefritis por IgA, que es una enfermedad del glomérulo renal que se

caracteriza por el depósito difuso de inmunoglobulina A a nivel mesangial. Los

principios activos de esta planta son Flavonoides , saponinas , polisacáridos

(inmunoestimulantes responsables de su actividad). (Xu, D. et al.,2008). Un

estudio mostró que esta planta interviene en la protección mitocondrial del

túbulo proximal, al eliminar las formas reactivas de oxígeno, de tal manera que

confiere un efecto antioxidante (Li, X. et al., 2012).

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De igual manera la Acacia Senegal (Goma Arábica), es un polisacárido natural

que posee un alto contenido de fibra soluble y aumenta la excreción de

nitrógeno fecal. La Acacia es de uso común en el medio Oriente en pacientes

con enfermedad renal crónica (Bliss DZ,.et al.,1996). Los efectos renales y

extrarrenales de la goma arábiga se han analizado en modelos murinos. (Nasir

O., 2013).

Se valoró el efecto nefroprotector de Goma Arábica sobre el estrés oxidativo y

la inflamación en un modelo de daño renal inducido por adenina, similar a la

patología dada en la Enfermedad renal crónica no glomerular (Ali. et al., 2013).

En base a los antecedentes planteados y a la evidente necesidad de conocer la

eficiencia en la remisión o prevención de la ERC de compuestos bioactivos

presentes en plantas que por conocimiento etnobotánico se sabe son aplicadas

en la medicina tradicional para problemas renales, 4 instituciones de educación

superior e investigación: Universidad Veracruzana (UV), Instituto de Ecología,

A.C. (INECOL), Instituto Tecnológico de Veracruz (ITV) y Universidad Nacional

Autónoma de México (UNAM) han iniciado conjuntamente el Programa de

Investigación Institucional y Multidisciplinario sobre ERC.

1 .3. Anthurium schelechtendalii Kunth

Una de las plantas sujetas a estudio es Anthurium schelechtendalii Kunth (raíz

de piedra) miembro de la familia Araceae. Esta familia es principalmente

tropical con una mayor diversidad de especies en Asia y América tropical

(Croat, 1998). En México se han registrado 121 especies y 18 géneros; los

géneros Philodendron y Monstera son los más numerosos (Espejo y López–

Ferrari, 1993). La mayoría de las especies se concentran en las zonas

tropicales de los estados de Chiapas, Oaxaca, Yucatán y Veracruz, aunque

existen algunos elementos de zonas templadas; por ejemplo,

Arisaema (Bunting, 1965).

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No existen hasta ahora estudios fitoquímicos específicos en insuficiencia renal

de Anthurium, schelechtendalii, sin embargo existe un reporte de la actividad

antiproliferativa de los extractos de raíz y hojas (Stark, et al., 2009). Por otra

parte, en las hojas de Anthurium versicolor, se han encontrado antioxidantes y

compuestos fenólicos tipo flavonoide en forma de glucósidos (Aquino et al.,

2001).

1.4 Modelo murino de ERC.

Este trabajo de tesis contempla el estudio sobre la capacidad de extractos

obtenidos de la raíz de A. schelechtendalii para remitir o prevenir el daño renal

inducido por adenina en modelos murinos.

Es bien sabido que la mayor parte de nuestra comprensión fundamental de la

bioquímica humana, fisiología, endocrinología y farmacología procede de los

estudios originados de los mecanismos en modelos animales (Larsen, M.Ø.,

2001 citado en Hau, J., 2003) .

En enfermedad renal, las terapias experimentales estudiadas se han aplicado

principalmente en diversas cepas de ratas, pero también se han empleado en

mandriles, perros, gatos, conejos, y ratones. No se han encontrado las mismas

respuestas fisiológicas en todos los animales de experimentación, por lo que

se ha optado por los modelos con mas facilidad de manejo.La enfermedad

renal en los modelos murinos ha sido estudiada en casos de enfermedad

quística (Schieren G.,1996) y la nefritis lúpica (Rees AJ.,1997) .Incluso se han

observado diferencias en el grado de expresión de una enfermedad renal entre

cepas de ratones (He C,.1996).

La etapa funcional y morfológica final de riñón humano y su equivalente a nivel

experimental, el riñón en la rata, exhibe enfermedad túbulo-intersticial

generalizada. La modificación en la dieta baja en proteínas y grasas tanto en

en el metabolismo como en la histología ha sido estudiada por largo tiempo

(Banković-Calić N.,2002).

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El modelo de daño renal inducido por adenina implementada en el alimento

que se utilizará en este trabajo ha sido probado en ratas y ratones y ha

mostrado que los ratones son más sensibles a la adenina (Ali, et al., 2013). En

las ratas parece ser que la disfuncion renal inducida por adenina es reversible,

por lo que estos animales son particularmente útiles para el estudio del efecto

(okada, et al.,1999).

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2.-PLATEAMIENTO DEL PROBLEMA

La insuficiencia renal es un problema de salud en México y especialmente en el

estado de Veracruz, que ocupa desde el 2013 el primer lugar en casos nuevos

con ERC con 600 casos al año por cada millón de habitantes. El modelo murino

de insuficiencia renal creado por la administración de adenina ha sido validado

en diferentes estudios. En este trabajo se plantea estudiar el efecto de remisión

y nefroproteccion para insuficiencia renal.

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3.- JUSTIFICACIÓN.

Desde los inicios de la humanidad el hombre ha tenido como aliadas a las

plantas. Más del 90% de los medicamentos utilizados en el mundo no-

industrilizado son productos naturales y más del 60% de medicamentos usados

en la medicina occidental tienen su origen en plantas y microbios. Un ejemplo

claro es la familia Araceae, pues en México, desde la época prehispánica

diversas especies de esta familia eran utilizadas con fines medicinales,

alimenticios, mágico-religiosos y ornamentales (Mandujano et al., 2002).

Sin embargo, algunas de las plantas de esta familia carecen de estudios

químicos y de actividad biológica; entre ellas podemos citar a las especies del

género Anthurium.

Actualmente se conoce que los extractos de Stenocereus eruca y de

Dracontium loretense tienen efectos analgésicos y antinflamatorios (Imai et al.,

2006;Collantes et al.,2011). Tomando en cuenta lo anterior, en este proyecto se

propone determinar la actividad antiinflamatoria, efecto regenerativo y citotóxico

de extractos orgánicos y metabolitos secundarios de raíz Anthurium

schelechtendalii kunth aplicados a nivel renal.

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4.-OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Determinar la capacidad de raíz de piedra de Anthurium

schelechtendalii kunth en la remisión o prevención del daño renal

por adenina.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

• Establecer la Concentración Letal 50 (LC 50) de los extractos de Anthurium schlechtendalli Kunth en Artemia salina sp.

• Definir las alteraciones bioquímicas e histopatológicas en los riñones inducidas por adenina, en los animales de estudio.

• Determinar la capacidad de remisión de ERC de los extractos de la raíz de Anthurium schelechtendalii Kunth frente al daño renal inducido por adenina.

Determinar la capacidad nefroprotectora de extractos de la raíz de

Anthurium schelechtendalii Kunth frente a la administración de adenina.

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5.- HIPOTESIS

H1 Si existen compuestos bioactivos provenientes de la raíz de Anthurium

schelechtendalii Kunth (Raíz de piedra) en los extractos en estudio, que

muestren capacidad de remisión o prevención del daño renal inducido por

adenina, se harán evidentes en los modelos murinos de experimentación a

través de las valoraciones y exámenes de parámetros bioquímicos e

histopatológicos.

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6. METODOLOGIA

6.1. Tipo de estudio.

Estudio comparativo y experimental en animales, en el cual se evaluará el

efecto nefroprotector y efecto de remisión de Anthurium schelechtendalii

Kunth en un modelo de daño renal inducido por adenina.

Basados en los estudios de Yokozawa, et al., 1986 y Okada, et al., 1999,

respectivamente. Se inducirá un daño renal a los murinos con una dosis de

adenina de 0.75 % administrando en conjunto con la dieta comercial y los

extractos de Anthurium schelechtendalii Kunth elegidos de acuerdo a la

toxicidad para verificar el grado de nefroprotección. Por otro lado, en otro

grupo se administrará la adenina a la misma concentración y ya corroborado el

daño con los marcadores renales se procederá a administrar los extractos de

Anthurium schelechtendalii Kunth.

6.2. Recolección del material vegetal.

Para este estudio se empleará material vegetal previamente recolectado.La

recolección se llevó a cabo el 01 de septiembre de 2013 en la zona de

Tlacojalpan del estado de Veracruz. El muestreo fue a base de conveniencia de

la zona antes mencionada, con un peso total de 2-2.5 kg de planta total. Se

tomó exclusivamente la raíz de este ejemplar, se realizó un tratamiento previo

con agua destilada para eliminar todo tipo de residuo, en seguida se fraccionó

el material en trozos pequeños obteniendo un peso 1850 kg. De este total se

obtuvieron dos partes: la parte A correspondiente a muestra fresca la cual fue

congelada por una semana y la parte B representaba la muestra seca; el cual

se puso a secar a temperatura ambiente en el laboratorio por una semana.

6.3. Obtención de los extractos

6.3.1.- Extractos orgánicos.

El material vegetal recolectado (raíz) se lavará minuciosamente con agua, para

eliminar residuos e impurezas, y se fraccionará en dos partes. Una de ellas se

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secará a temperatura ambiente durante una semana dentro del laboratorio pero

donde le lleguen los rayos del sol y la otra se trabajará como material fresco

dentro de las 48 horas después de la recolección.

100 g del material fresco someterá a extracción con acetato de etilo utilizando

dos extractores Soxhlet (50 gr serán depositados en cada extractor). El extracto

se concentrará en un evaporador rotatorio marca BUGUL-ROTAVAPOR

modelo RE 120 acoplado a una bomba de vacio (aspiración de agua) marca

Cole palmar modelo 7049-50 y a un ciculador refrigerado marca FISONS

modelo HAAKE CH, fijado a una temperatura de 18°C . El extracto se

recolectará y secará con corriente de nitrógeno de alta pureza. (EOMF =

Extracto Orgánico del Material Fresco)

20 gramos del material seco se tratará de la misma forma descrita en el

párrafo anterior para obtener el extracto orgánico correspondiente: EOMS =

Extracto Orgánico de Material Seco.

6.3.2. Extractos Acuosos

6.3.2.1. Maceración

El material vegetal 400 gramos fresco se macerará durante 24 horas en agua,

en recipiente de vidrio ámbar, a temperatura ambiente y con movimientos

rotacionales cada hora, por espacio de 3 minutos cada vez.

Se filtrará el macerado. Primero, a través de coladera de plástico, y el filtrado

que se recolectó se someterá a filtración en embudo Buchner, papel Whatman

No.2, con bomba de aspiración al vacío (marca Cole palmar modelo 7049-50 ).

Se congelará el filtrado resultante por 24 hrs.,y se liofilizará en LABCONCO

FREEZE DRY SISTEM 4.obteniéndose el Extracto Acuoso de Material Fresco

Macerado EAMFM.

Al material vegetal seco se le realizará el mismo procedimiento anterior,

obtenièndose finalmente el Extracto Acuoso de Material Seco Macerado

EAMSM.

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6.3.2.2. Infusión

Otra parte de material 400 gramos se someterá a extracción por infusión. Se le

agregará a la materia prima 1000 ml con agua desionizada a temperatura de

ebullición, durante 1 minuto y 4 minutos en reposo (sin mayor calentamiento).

Y se procesará de la misma forma que el material acuoso por maceración.

De igual manera el material seco se someterá al mismo proceso de extracción

por infusión, después de obtenido, se procederá a seguir con los pasos de

filtración, congelado y liofilización que en el de maceración.

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6.4. Determinación de la CL50 de los extractos

Esta prueba se realizará con Artemia salina,la cual se expondrá a diferentes

concentraciones del extracto tanto acuoso como orgánico.

SE DETERMINARAN LA

CL50 CON LA ARTEMIA

SALINA.

SE REALIZA LA PRUEBA DE

TOXICIDAD AGUDA CON

DIF. CONCENTRACIONES

DICROMATO DE POTASIO.

ESTO TAMBIÉN SERVIRÁ

PARA CONTROL POSITIVO.

LAS PRUEBAS SE REPETIRAN 30

VECES PARA CADA

CONCENTRACIÓN.DEPENDIENDO

DEL RESULTADO.SE AUMENTA O

DISMINUIRA LAS

CONCENTRACIONES.

SE REALIZARAN LOS ENSAYOS

CORRESPONDIENTES PARA

ESTABLECER EL TIEMPO DE

INCUBACIÓN, LA TEMPERATURA

Y EL TIEMPO EN QUE

ECLOSIONAN LAS LARVAS PARA

OPTIMIZAR TIEMPO

SE REALIZA UN ENSAYO

PARA ADQUIRIR DESTREZA

EN LA MANIPULACIÓN DE LAS

LARVAS .Y REALIZAR LOS LAS

PRUEBAS DE CONTROL.

EL CONTROL

NEGATIVO SERA AGUA

SUPLEMENTADA CON

LEVADURA DE

CERVEZA COMERCIAL.

SE PREPARARA DE CADA EXTRACTO UNA SOLUCION

PATRON ( c = 100 g/mL )

DETERMINAR LA

CONCENTRACION LETAL

MEDIA REALIZANDO

DILUCIONES DE 10,100 Y 1000

EN CADA POZO.

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6.5. Manejo de animales y toma de muestras.

Ratas Wistar machos (9-10 semanas con peso de 240 ±10 gr) estarán en una

habitación a una temperatura de 22 º C , con una humedad relativa del 60

%,con un ciclo de luz y oscuridad de 12 h (luces encendidas las 6:00),tendrán

libre acceso al agua y a una alimentación estricta compuesta de la dieta en

polvo que contiene 0.85% de fósforo, 1.12% de calcio, 0.35% de magnesio,

25.3% de proteína cruda y 2,5 UI / g vitamina D3 (Omán Flour Mills, Muscat,

Omán). Los procedimientos con animales y su cuidado se llevaran a cabo de

acuerdo con las leyes y políticas internacionales.

Durante el periodo de tratamiento ratas se pesaran semanalmente y serán

colocadas individualmente en jaulas metabólicas para recoger el orina de 24

hrs. Al final de experimento las ratas se anestesiaran con tratamiento

intraperitoneal y la sangre (3 ml aproximadamente) se tomará de la vena cava

anterior, y se colocará en tubos para colectar suero o plasma(opcional). La

sangre y la orina se centrifugaran a 900 g a 4 ºC durante 15 min. El suero o

plasma obtenido, junto con las muestras de orina, se almacenaran congeladas

a 2-8 ºC en espera de análisis. Los dos riñones serán extirpados envueltos

en papel de filtro y se pesaran. Un corte del riñón derecho se colocara en

formalina al 10% para el procesamiento histológico posterior. El resto de los

riñones se mantendrán congelados a 2 – 8 ºC a la espera de análisis

bioquímico.

Pasada una semana. El riñón izquierdo se homogeneizara en tampón Tris

enfriado con hielo (pH 7,4) para dar un 10% w / v homogeneizado. Este último

se centrifugara a 1500 g a 48C durante 15 min, y el sobrenadante obtenido

será utilizado para medir la actividad de la SOD.

6.6. Esquema de tratamiento.

Los animales (n= 36) se mantienen por una semana en las condiciones

referidas para su adaptación. Se dividen al azar en 6 grupos con 6 ratas en c/u.

El primer grupo o grupo control (gc) se le administra la misma dieta (alimento

comercial) hasta el final del estudio. Al segundo grupo o grupo de daño renal

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inducido (gdri) se le modifica la dieta anterior incorporándosele adenina (0.75%

p/p). La mezcla de adenina con el alimento comercial se realiza pulverizando

ambas. El tercer y cuarto grupo (ExtAx% y ExBy%) reciben la dieta comercial

mezclado con adenina y dos diferentes concentraciones del extracto

respectivamente en estudio. La mezcla de extracto con el alimento comercial

se realiza pulverizando ambos ingredientes. El quinto y sexto grupo (gdri +

ExtA% y gdri+ExtBy%) se les da la mezcla de dieta comercial con adenina

durante dos semanas para producir las alteraciones y después se le deja de

administrarla adenina y se deja con dieta más extracto, todo en forma de

polvo. El tiempo total de experimentación para el estudio en estos 6 grupos es

de 4 semanas.

6.7. Histología renal

Los riñones se fijarán en 10% formalina, deshidratados en concentraciones

crecientes de etanol, serán aclaradas con xileno y embebidos en parafina.

Cinco secciones micrométricas serán preparadas a partir de bloques de

parafina y se tiñeran con hematoxilina y eosina y tricrómico de Masson

utilizando procedimientos estándar.

La evaluación microscópica de las secciones de riñón se llevarán a cabo

asignando una puntuación, que evalúa el área de necrosis de los túbulos

proximales en una escala arbitraria de 0-4 (0, sin necrosis; 1, Área de necrosis

hasta un 25 %de los tubulos ; 2, área necrótica de hasta un 50% de los

tubulos; 3, Necrosis que afecta el 75% de los túbulos 4, Necrosis del 76 al

100% de los túbulos

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6.8. Esquema de determinaciones

ORINA SUERO o PLASMA HOMOGENEIZADO

RENAL

Creatinina

Urea

Acido urico

Proteínas en

orina.

Lactato

Deshidrogenasa

LDH

Capacidad

Antioxidante

GSH Glutatión

SOD Super

Óxido

Dismutasa

CRP Proteína C

Reactiva

TNF-alfa

IL-10

*CHECAR LA PRESION DE LOS MURINOS

6.8.1. Determinaciones analíticas

Las concentraciones de creatinina y urea en plasma o suero serán medidas

por método enzimático. El ácido úrico por método uricasa-PAP. En las

determinaciones de Lactato deshidrogenasa usara el método UV(Fosfatos-

Piruvatos-NADH) .Para las proteínas en orina el método de rojo de pirogalol.

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Realizando las mediciones en espectrofotómetro utilizando kits comerciales

(Randox).

Actividad antioxidante total (TOA) se medirá en suero utilizando un kit de

Oxford Investigación Biomédica (Oxford, MI, EE.UU.).

En homogeneizados de la corteza, la concentración renal de glutatión (GSH)

por método UV y superóxido dismutasa (SOD) método UV cinético con un kit

de Randox, medidos espectrofotométricamente.

Para pruebas de PCR con un inmunoensayo enzimático desarrollado para la

detección y cuantificación de la CRP en suero u otras muestras de fluido

biológico. kit ELISA de Genway Biotech., Inc.

TNF-alfa basado en el método Elisa en sandwich fase sólida con un

anticuerpo monoclonal específico para TNF-α. El processo incluye la

incubación de la muestra a la que se le añade trás el lavado, la enzima

streptavidin-HRP, volviéndose a incubar y lavar. La intensidad de la reacción

coloreada que se produce finalmente, tras la correspondiente adición del

sustrato que actúa sobre la enzima ligada, es directamente proporcional a la

concentración de TNF-α presente en las muestras analizadas. La reacción se

termina mediante la adición de ácido (H2SO4) y la absorbancia se mide a 450

nm. kit ELISA de R & D Systems Europe Ltd.

IL-10.- El kit está basado en un método ELISA en sandwich en fase sólida con

un anticuerpo monoclonal específico para la interleucina10. El proceso incluye

una incubación de la muestra a la que se añade tras el lavado, la enzima

streptavidin-peroxidasa, volviéndose a incubar y lavar. La intensidad de la

reacción coloreada que se produce finalmente tras la correspondiente adición

del sustrato que actúa sobre la enzima ligada, es directamente proporcional a

la concentración de IL-10 presente en las muestras analizadas. Despues se

lee la absorbancia em espectrofotômetro.El kit ELISA de R & D Systems

Europe Ltd.

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VALORES DE REFERENCIA

Creatinina 0.4 a 1.5 mg/dla

Urea 15 a 22 mg/dla

Proteinas en orina 30 mg/dla

Lactato Deshidrogenasa LDH Hasta 15 UI/la

Capacidad Antioxidante 0.52-7.0mg/lc

GSH Glutatión 6.76 – 7.66 mg/gc

SOD Súper Óxido Dismutasa 1.22 – 1.49U/gc

CRP Proteína C Reactiva <1 ng/mlc

TNF-alfa 29,6 y 57,6 pg/mlc

IL-10 17.06-24.66 pg/mlb

(Hernandez et al.,1990)a(Reyero et al.,2001)b (Ali et al.,2013)c

FLUJOGRAMA

SELECCIONAR EL

AREA DE COLECTA

DE LA PLANTA

EXTRACCIONES DE LA RAìZ DE

LA PLANTA EN MEDIO

ACUOSO (MACERACIÓN E

INFUSIÓN) Y

C

EXTRACCIONES DE LA RAìZ DE

LA PLANTA EN MEDIO

ACUOSO (MACERACIÓN E

INFUSIÓN) Y CON ACETATO DE

ETILO

ON ACETATO DE ETILO

PRUEBA PRECLÌNICA EN MODELO MURINO:

-ACLIMATIZACIÓN DE LOS ANIMALES.

- INDUCCION FALLO RENAL CON ADENINA Y

TRATAMIENTO DE LOS ANIMALES

LOS NIVELES DE CONCENTRACIÓN DE

EXTRACTOS A UTILIZAR EN LA PRUEBA

PRECLÍNICA CON MURINOS.

EXTRACCIONES DE LA RAìZ DE LA

PLANTA EN MEDIO ACUOSO

(MACERACIÓN E INFUSIÓN) Y CON

ACETATO DE ETILO

DETERMINAR CL50 CON BASE

A LA PRUEBA TOXICIDAD DE

ARTEMIA SALINA.

-OBTENCIÒN DE MUESTRAS

-PROCESAMIENTO DE

MUESTRAS Y

GENERACIÓN DE RESULTADOS.

22

6.9. Análisis Estadísticos

Los marcadores bioquímicos y datos en cambios morfológicos se expresan

como la desviación estándar media ± (x ± SD). La significación estadística se

determinara con el análisis de los procedimientos de la varianza(ANOVA),

Seguida con la prueba de comparación múltiple de Tukey (P <0,05). Los datos

serán analizados utilizando el programa estadístico SPSS Versión 20, 2011.

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CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

Recolectar la raíz de la planta Preliminar

Obtención de los extractos acuosos y orgánicos

Liofilizarlos

Determinar la cantidad de material de raíz

necesario para realizar los futuros ensayos basados

en el total de rendimiento por extracto.

SEPTIEMBRE DE 2013-

ABRIL DE 2014

Determinar la Concentración letal media(CL 50) con

el ensayo de artemia salina

MAYO DE 2014-

AGOSTO DE 2014

Recolectar material necesario (raíz de la planta)

basados en los cálculos de rendimiento.

Obtención de los extractos

Liofilizarlos

Determinar la concentración letal con el ensayo e

artemia salina .

SEPTIEMBRE –

NOVIEMBRE DE 2014

1. Adquirir a los modelos murinos, verificar que

cumplen los criterios,

2. Periodo de aclimatación.

3. Proceder a administrar la adenina en su

alimentación para producir el daño renal

4. Realizar la determinación de orina, sangre y

biopsia histológica para corroborar el grado

de daño renal

5. Administrar a los murinos( con daño renal el

extracto de la raíz de piedra y monitorear si

existe la remisión

6. Corroborar la mejoría de la enfermedad

DICIEMBRE DE 2014-

FEBRERO DE 2014

24

tomando muestra histológica para comparar .

Organizar los datos MARZO 2015

Analizar los datos estadísticamente ABRIL 2015

Presentación de resultados y conclusiones MAYO 2015

25

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