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PROYECTO SIP 20060790 “POSIBLES CAMBIOS EN LA FUNCIÓN TIROIDEA POR LA DESNUTRICIÓN TEMPRANA EN LA RATA” ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. INFORME PARCIAL RESUMEN La desnutrición es un problema de salud importante a nivel mundial que se debe estudiar a
detalle ya que interfiere en la diferenciación, maduración y funcionalidad de diversos órganos y
tejidos en las etapas de desarrollo del organismo, provocando de esta manera diversas
alteraciones y disminuyendo la calidad de vida del ser humano. De allí deriva la importancia de
conocer y estudiar las alteraciones que se pueden presentar debido a la restricción de
nutrimentos. La glándula tiroides es un tejido con gran importancia, ya que interviene en el
desarrollo y maduración de diversos órganos, en el metabolismo basal, y en el crecimiento del
organismo. Aunque se han hecho estudios para conocer los efectos de la desnutrición en etapas
tempranas del desarrollo sobre la funcionalidad de diversos órganos, de la glándula tiroides no se
tiene gran información, y se desconoce si las alteraciones que se pudieran provocar en ésta
permanezcan en la edad adulta. Para lograr tal objetivo en el presente estudio se trabajó con dos
grupos de ratas Wistar hembra, uno de los cuales se le proporcionó alimento y agua a libre
demanda (grupo testigo), al otro grupo se le restringió su alimentación al 60 % (grupo
restringido), tomando como 100 % el alimento consumido por el grupo testigo durante todo el
estudio. A ambos grupos se les apareó con ratas macho de la misma cepa y al momento del
parto se ajustó la camada a 8 crías, 4 hembras y 4 machos. A las crías de ambos grupos se les
alimentó a libre demanda a partir del destete y al momento de cumplir 90 días se les sacrificó y
extrajo la glándula tiroides, y se les determinó la concentración de hormonas tiroideas. En el
estudio morfológico se pudo apreciar que las glándulas tiroides de las CRR presentaban zonas
con desorganización celular, y folículos tiroideos con una cantidad de células mayor en
comparación con las CRT; sin embargo, estas alteraciones no se ven reflejadas en la
funcionalidad de la glándula tiroides ya que los resultados de este estudio no muestran diferencia
en la concentración de hormonas tiroideas entre ambos grupos. En conclusión la glándula
tiroides de las CMR presentó zonas con desorganización folicular, lo que sugiere que esos
folículos no son funcionales y que estas deficiencias se ven compensadas con una mayor
cantidad de tirocitos y una mayor concentración de TSH que mantienen adecuadas las
concentraciones de T4 en estos animales.
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I. INTRODUCCIÓN.
El organismo debe ser abastecido de todos los nutrimentos necesarios para su desarrollo
y crecimiento. Los lípidos, las proteínas, y los carbohidratos son los macronutrimentos que
aportan energía suficiente al organismo, mientras que los micronutrimentos son las vitaminas y
minerales necesarios para la actividad enzimática en todos los tejidos. Ambos, micro y
macronutrimentos son obtenidos a través de los alimentos, y la cantidad de estos que el
organismo demanda depende en gran medida de si el organismo se encuentra en una etapa
crítica de desarrollo o no, como la gestación, la lactancia o la pubertad. Por esto, es importante
ingerir en nuestra dieta alimentos variados en cantidades adecuadas para satisfacer nuestras
demandas energéticas en cada etapa de nuestra vida.
La desnutrición se presenta en los individuos como consecuencia de una ingestión y/o
utilización deficiente de alimentos. En general se conoce la desnutrición proteínica, es decir la
generada por la ingestión deficiente de proteínas; y a la energético-proteínica, aquella generada
por la ingestión deficiente de todos los macronutrimentos, siendo la segunda el tipo más común y
de mayor importancia como problema de salud pública a nivel mundial. Al momento de restringir
el suministro del alimento limitamos el aporte de nutrimentos ocasionando efectos adversos en el
organismo en función del tipo de restricción, es decir si se limita el consumo de proteína o de
energía y proteína, y del tiempo en que esta se presenta. Además, cuando la desnutrición se
lleva a cabo en etapas críticas del desarrollo en las cuales el organismo presenta una mayor
demanda de nutrimentos, dichas deficiencias provocarán trastornos mayores (Cravioto y Arrieta,
1995).
La gestación y la lactancia son periodos críticos durante el desarrollo de los diferentes
órganos del individuo, por lo que en este tiempo la demanda energética que ejerce el feto o la
cría lactante al organismo materno, que es quien aporta los nutrimentos a la unidad feto-
placentaria, o bien a la cría a través de la leche materna, es muy elevada (Cravioto y Arrieta,
1995). Algunos autores han reportado que una restricción de proteína y/o de energía y proteína
en la dieta materna durante la gestación afecta el tamaño y peso corporal de la cría y el
desarrollo de varios órganos en el mismo (Ferlatte y Zeman, 1977).
Durante los periodos críticos de desarrollo temprano en la vida de los organismos, estos
tienen la habilidad de responder a situaciones adversas del medio ambiente que pueden afectar
negativamente su desarrollo normal, debido a adaptaciones que ocurren a nivel celular,
molecular y bioquímico. Las adaptaciones que se presentan en consecuencia del estrés
nutricional (desnutrición) pueden cambiar la fisiología y el metabolismo del organismo y algunas
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pueden continuar presentes aún en ausencia del estrés o estímulo que lo inició, dicho evento se
ha definido como “programación metabólica” (Fowden et al., 2006).
En la rata, las consecuencias de la desnutrición proteínica o energético-proteínica en la
rata madre durante la gestación y la lactancia, causan grandes cambios en la estructura y función
de varios órganos de las crías, entre ellos de algunas glándulas endocrinas, como se ha descrito
para el páncreas, lo cual provoca alteraciones en la secreción de insulina (Patel y Srinivasan,
2002).
La desnutrición, la hipoxemia y el estrés pueden alterar tanto en la madre como en el feto
las concentraciones de diversas hormonas incluyendo: la hormona del crecimiento (GH), los
factores de crecimiento tipo insulina (IGFs), la insulina, los glucocorticoides, las catecolaminas, la
leptina, las hormonas tiroideas (HT) y las hormonas placentarias. En general, las condiciones
intrauterinas subóptimas disminuyen las concentraciones de hormonas anabólicas y aumentan
los niveles de hormonas catabólicas.
La manipulación directa de los niveles de HT en el útero alteran el desarrollo fetal y tienen
consecuencias a largo plazo en la función cardiovascular, reproductiva y metabólica de la cría
(Fowden et al., 2006).
En la rata, la glándula tiroides es un tejido endocrino que en la rata empieza a
diferenciarse a partir del día 17-18 de desarrollo fetal (Brown et al., 2000), cuando la estructura y
el coloide folicular aparecen, y la morfología característica que se ha descrito del tejido tiroideo se
presenta hasta después del nacimiento, aproximadamente a los 10 días postparto en la cría
lactante (De Felice et al., 2004).
Se ha reportado que la desnutrición proteínica afecta a la morfogénesis de la glándula
tiroides observándose un retraso en la formación de los folículos tiroideos, número menor de
folículos y de espacio coloidal, en fetos de rata de 17 y 21 días de edad gestacional (Shrader et
al., 1977). Lo anterior sugiere que puede encontrarse alterada también la síntesis de HT,
triyodotironina y tetrayodotironina (T3 y T4 respectivamente).
Cuando la ingestión de alimento de las ratas madre es restringida al 60% con respecto a
la ingestión del grupo testigo, durante todo el período de la gestación y la lactancia (Oberkotter y
Rasmussen, 1992), o bien desde la gestación tardía (día 17 de gestación) y hasta el día 70
postnatal (Aláez et al., 1992) los niveles de T3 y T4 en las crías disminuyen. Sin embargo, se
desconoce si estos cambios son permanentes, y si son provocados por las alteraciones en la
morfología y la funcionalidad de la glándula tiroides en la edad adulta.
En el humano también se ha descrito una relación importante entre el bajo peso al
nacimiento que presentan los niños que han sufrido desnutrición in útero, y las menores
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concentraciones de HT (Kilby et al., 2001). Además, estos individuos presentan también durante
su infancia un retraso importante en sus curvas de crecimiento, lo cual puede relacionarse con
los cambios en las concentraciones de las HT, ya que estas regulan el metabolismo de los
órganos de casi todo el cuerpo y estimulan su crecimiento y desarrollo normal. Lo anterior resalta
también la importancia del estudio de los cambios en la función del tejido tiroideo y de la relación
de las HT con el desarrollo de los individuos con desnutrición temprana.
II. OBJETIVO GENERAL.
Determinar los posibles cambios que produce la desnutrición durante la gestación y la
lactancia en la rata sobre la función de la glándula tiroides de las crías.
III. OBJETIVOS PARTICULARES.
Analizar los efectos de la desnutrición materna durante la gestación y la lactancia sobre:
1. La morfología de la glándula tiroides de las crías en la edad adulta.
2. La concentración plasmática de las hormonas tiroideas (T3 y T4) y de TSH, al nacimiento y
en la edad adulta.
3. El crecimiento de las crías y su composición corporal.
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IV. MÉTODOS
1.- Obtención de los grupos de ratas de estudio.
Se emplearon 12 ratas hembra Wistar con peso de 240 ± 20 g expuestos a un ciclo de
luz-oscuridad 12 :12 h en una cámara aislada con temperatura regulada a 22 ± 1°C, con inicio
del ciclo a las 8 h. Se formaron 2 lotes de 6 ratas cada uno y se separaron en jaulas
individuales con agua ad libitum. Se les dejó una semana de habituación.
A un lote de estos animales se les alimentó a libre demanda (lote testigo), y al otro lote
se le restringió el alimento al 60 % (lote restringido) tomando como 100% el alimento
consumido por el lote testigo. La medición del consumo de alimento y el peso corporal fueron
registrados durante todo el estudio cada tercer día.
A ambos lotes se les mantuvo una semana con machos de la misma cepa (260 ± 20g)
para asegurar el apareamiento, concluida esta semana se separaron de los machos.
Las condiciones de alimentación se mantuvieron durante la etapa de gestación la cual
duró 3 semanas y al momento del parto se ajustó la camada a 8 crías por rata, dejando
preferentemente 4 crías hembra y 4 crías macho por rata en ambos lotes, se tomaron muestras
de sangre a las crías sobrantes para la determinación de HT. El día del parto se consideró como
el día 1 de la lactancia.
2. Desarrollo de las crías.
Se mantuvo a las crías de ambos lotes durante la etapa de lactancia (3 semanas) y al
término de este tiempo se separaron crías hembra y crías macho en ambos lotes y se les
alimentó a libre demanda con una dieta comercial y agua.
Se consideró la etapa de la lactancia desde el día del nacimiento hasta el día 21 de edad,
en el cual la crías fueron separadas de sus madres (destete). Durante toda la lactancia se
registró cada tercer día el peso corporal y la longitud de cada cría en cada una de las camadas
para analizar su crecimiento. La longitud se determinó midiendo la distancia desde la nariz hasta
el orificio anal de las crías.
Al concluir la lactancia, las crías fueron destetadas (en el día 21 de edad) y se
seleccionaron en grupos separados a los machos de las hembras para formar los siguientes
grupos de estudio:
1) Crías nacidas de Rata madre Testigo (CRT): fueron las crías nacidas de las ratas
alimentadas a libre demanda durante la gestación y la lactancia.
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2) Crías nacidas de Rata madre Restringida (CRR): fueron las crías nacidas de las ratas
madre alimentadas con el 60% de la cantidad de alimento consumido por las testigo.
A partir del destete y hasta la edad adulta (90 días), ambos grupos fueron alimentados con
una dieta comercial (Nutricubos de Purina) a libre demanda, con el fin de que estos animales
experimentaran la desnutrición exclusivamente durante la gestación y la lactancia. Cada tercer
día se registró el peso corporal, la longitud y la ingestión de alimento de cada cría.
Al cumplir 90 días de edad se les sacrificó y se les extrajo la glándula tiroides para el
estudio morfológico y se les determinó la concentración de hormonas tiroideas en la sangre.
Las crías restantes de cada camada de las madres control y restringidas se utilizaron para
obtener las muestras de sangre como se indica más adelante.
3. Determinación del gasto energético en reposo.
El gasto energético en reposo se determinó por calorimetría indirecta. Este método permite
conocer la cantidad de energía liberada por unidad de tiempo por los procesos de oxidación de
los sustratos energéticos utilizados por el organismo, basándose en la medición del intercambio
de gases en el proceso respiratorio, ya que en la combustión de los sustratos se combina la
liberación de dióxido de carbono (CO2) con el consumo de oxígeno (O2). La relación de CO2
eliminado y el O2 inspirado se conoce como cociente respiratorio (VCO2/VO2) y su valor es
diferente para los tres sustratos que son utilizados como fuente de energía: 1.0 para los
carbohidratos, 0.71 para los lípidos y aproximadamente 0.83 para las proteínas. El cociente
respiratorio indica, aunque de forma muy relativa, qué compuestos han sido oxidados
preferentemente en un lapso de tiempo (Racotta 2002).
La determinación del gasto energético en reposo se realizó en las crías de 90 días de edad, en
ambos grupos. Todos los animales fueron sometidos a un ayuno nocturno de 15 h antes de la
medición, permitiéndoles sólo el libre consumo de agua. El día de la medición calorimétrica las
ratas se pesaron y estos datos fueron registrados en el equipo de medición, posteriormente se
introdujo a las rata en jaulas individuales y herméticas que se conectaron a un equipo de
calorimetría (Columbus Instruments, Columbus Ohio, USA). El calorímetro fue calibrado antes de
cada determinación con una mezcla estándar de gases que contiene 20.4% de oxígeno y 0.5%
de bióxido de carbono (Praxair, México). El volumen del flujo de aire circulante a las cajas en que
se mantuvo a las ratas durante la medición se fijó en 3.5 L/min. Durante 6 horas continuas se
registró la tasa del consumo de oxígeno (VO2, ml/kg0.75 • h), la producción de bióxido de carbono
(VCO2, ml/kg0.75 • h) y el cociente respiratorio. Los datos obtenidos durante las etapas de
movimiento excesivo de los animales registrados por un detector de movimiento, fueron
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descartados. La variabilidad aceptable en la medición calorimétrica fue <10%. obtenidos durante
las etapas de movimiento excesivo de los animales registrados por un detector de movimiento,
fueron descartados. La variabilidad aceptable en la medición calorimétrica fue <10%.
4. Análisis de la concentración de T3 y T4 en plasma.
4.1. Obtención de las muestras de plasma. Después de ajustar las camadas, las crías restantes de las camadas de cada grupo fueron
sacrificadas por decapitación para obtener las muestras de sangre (1 ml) que se colocaron en
tubos previamente heparinizados, y posteriormente se centrifugaron a 3500 rpm por 15 min
para obtener el plasma que se almacenó en congelación (-70°C), para posteriormente
determinar las concentraciones de T3 yT4 .
En la edad adulta, también se tomaron muestras de sangre de 1 ml en las CC y CR (90 días
de edad). Estas muestras se tomaron de la vena de la cola y fueron tratadas en las condiciones
antes descritas para la obtención del plasma y la posterior medición de las concentraciones de
T3, T4 y TSH.
4.2. Determinación de la concentración plasmática de T3 y T4. La concentración de T3, T4 y TSH en el plasma se determinó por radioinmunoanálisis (RIA)
homólogo para rata. El método se basa en la ley de acción de masas en donde dos antígenos
(Ag) con las mismas características compiten en la misma proporción por el sitio del anticuerpo
(Ab). La concentración fija de un anticuerpo en el sistema limita el número de sitios por los que
compite el antígeno radioactivo (Ag*), el cual se encuentra presente en concentraciones limitadas
y escasa masa, con el antígeno no marcado (Ag) que se agrega en cantidades conocidas (puntos
de la curva estándar) o con cantidades desconocidas de las muestras problema. A medida que
se incrementa la concentración del antígeno Ag, disminuye la posibilidad de que el Ag* se acople
al anticuerpo y forme el complejo Ag*- Ab, lo que da lugar a una menor radioactividad
cuantificable en el complejo. Posteriormente se realizó la separación de los complejos Ag-Ab y
Ag*-Ab de los antígenos libres no unidos al anticuerpo, mediante la adsorción de los antígenos
libres en moléculas de carbón activado cubierto por dextranos. Las dos fracciones se separaron
por centrifugación a 2500 rpm durante 30 min a 4°C, y se cuantificó la radiactividad en ambas
fracciones, utilizando un contador de emisiones gamma (Cobra II de A. Cabrera Company).
Una vez obtenida la radiactividad de las fracciones se calculó la proporción porcentual de T3
(T4 o TSH) radioactiva unida al anticuerpo, con respecto a la radioactividad total (% U/T).
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Los resultados se graficaron en papel semilogarítmico disponiendo en el eje de las ordenadas
el % U/T y en las abscisas la concentraciones de las soluciones estándar de T3 (T4). La
concentración de las muestras se calculó interpolando en la gráfica el % U/T correspondiente.
5. Obtención y tratamiento de la glándula tiroides de las crías. Cuando las CRT y las CRR alcanzaron los de 90 días de edad y después de haber
obtenido las muestras de sangre antes mencionadas, se anestesiaron con 45 mg/kg de
pentobarbital sódico por vía IP. Posteriormente se expuso la glándula tiroides y el tejido fue
extirpado cuidadosamente y se colocó en una solución de formaldehído al 10% (pH=7.3), en la
cual se mantuvieron por al menos una semana para fijar el tejido. Posteriormente se lavó el tejido
con agua corriente al menos 12 horas, se deshidrató y se incluyó en parafina (ver anexo 2) y se
cortó empleando un micrótomo en cortes de 8 µm de espesor, posteriormente los cortes fueron
teñidos empleando la técnica de hematoxilina-eosina (ver anexo 3) y se analizaron en el
microscopio de luz, utilizando el programa analizador de imágenes Motic Images 2.0.
En los cortes de ambos grupos de animales se observó una variación similar en el tamaño
de los folículos tiroideos, por lo cual se les clasificó según el área del folículo en cinco grupos
para facilitar su análisis:
Folículos tipo 1: folículos con un área <4000 μm2. Folículos tipo 2: folículos con un área de 4000 a 7000 μm
2.
Folículos tipo 3: folículos con un área de 7000 a 12000 μm2.
Folículos tipo 4: folículos con un área de 12000 a 16000 μm2.
Folículos tipo 5: folículos con un área >16000 μm2.
Una vez realizada la clasificación se determinó en un campo de área constante
(77199.625 μm2), en ambos lóbulos de cada corte del tejido tiroideo, el número total de cada tipo
de folículo encontrado por área. Además, en cada folículo se cuantificó el área total del folículo
tiroideo, el área del coloide y el número de tirocitos en cada folículo.
Una vez obtenidos estos datos se restó el área coloidal al área total del folículo tiroideo, para
obtener así el área ocupada por la capa simple de tirocitos en el folículo; este resultado se dividió
entre el número de tirocitos en el folículo para determinar el área promedio de cada célula
tiroidea en cada folículo, ya que el área es un indicador de la actividad celular (Berne y Levy,
2004).
6. Análisis de la composición corporal. 6.1. Obtención y peso de los depósitos de grasa.
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A los 90 días de edad, los animales de cada grupo de estudio fueron sacrificados para
obtener la carcasa, que es la porción del cuerpo de la rata desprovisto de la cabeza, la cola, las
patas, la piel y las vísceras. La carcasa se pesó y se congeló a -20°C hasta su análisis. El
tejido adiposo de las zonas parametrial, retroperitoneal y de los intestinos también fueron
extraídos y se registró su peso.
7. Determinación de la composición corporal. 7.1 Humedad de la carcasa.
La humedad de la carcasa de los animales se determinó gravimétricamente. La carcasa se
homogeneizó con agua destilada empleado una licuadora y el homogeneizado se secó en un
horno a 100°C hasta obtener un peso constante. El contenido de humedad se calculó restando
el peso seco de la carcasa del peso húmedo.
7.2. Determinación del contenido de proteínas de la carcasa. El homogeneizado seco obtenido en la determinación de humedad se pulverizó en una
licuadora hasta obtener un polvo fino que se empleó para determinar el contenido de proteína
total por el método de Kjeldahl. Para lo cual, se pesaron muestras de 0.02 a 0.03 g del polvo de
la carcasa que fueron sometidas a digestión con ácido sulfúrico concentrado y con un
catalizador de aluminio y selenio. Después de calentar por 4 h a 300°C, el sulfato de amonio
formado se hizo reaccionar con hidróxido de sodio al 40% para formar amoniaco, cuya
concentración se determinó por titulación con ácido clorhídrico 0.03N.
7.3. Determinación del contenido de lípidos de la carcasa. La extracción de lípidos de la carcasa se realizó por el método de Soxhlet. Se pesaron
muestras de 1 g del polvo de la carcasa seco en cartuchos de celulosa, los cuales se colocaron
en un equipo de extracción tipo Soxhlet. Los lípidos se extrajeron 5 veces con 10 ml de éter de
petróleo y los extractos se colectaron en un recipiente previamente seco y llevado a peso
constante. Una vez concluida la extracción se evaporó el disolvente en una parrilla a 30°C y se
llevaron nuevamente los vasos a peso constante. El peso del residuo lipídico se determinó por
la diferencia entre el peso de los vasos vacíos y los vasos con los lípidos extraídos.
8. Análisis estadístico. Los datos obtenidos fueron analizados empleando la prueba t-Student, o bien por análisis
de varianza bifactorial para medidas repetidas, utilizando en este caso la prueba de
Bonferroni para comparar las medias de cada grupo. En todos los casos se consideró un
valor de significación de p<0.05.
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V. RESULTADOS
Meta 1.- Obtención de las camadas de ratas desnutridas. Dos grupos de 6 ratas hembra de la cepa Wistar (peso corporal de 220-250g) fueron separadas
individualmente en jaulas para cría. Un grupo fue alimentado ad libitum (grupo testigo, MC) y el
otro grupo recibió sólo el 60 % de la ingesta promedio del primer grupo (grupo restringido, MR).
El día del inicio de la restricción, las hembras fueron apareadas con machos adultos de la misma
cepa durante una semana. Durante este periodo, las hembras quedaron preñadas y se continuó
la restricción durante toda la gestación y la lactancia. Se midieron tanto el peso corporal cada
tercer día como la ingestión de alimento diariamente.
1.1- Peso corporal y consumo de alimento de las ratas madre. La figura 1 muestra las variaciones del peso corporal de las ratas madre control (MC) y
restringidas (MR). Durante la gestación las MC mostraron un incremento progresivo de su peso
corporal, alcanzando una ganancia de 168 g de peso al finalizar este período (40% con respecto
a su peso inicial, p<0.001). Mientras que las MR aumentaron su peso significativamente, hasta el
día 16 de la gestación ganaron solo 88 g de peso al finalizar la gestación (26.4% con respecto a
su peso inicial, p<0.01). Fue evidente que la restricción materna durante la gestación afectó
negativamente la ganancia de peso de las MR quienes presentaron durante toda la gestación un
menor peso corporal con respecto a las MC (p<0.001).
Para el día 21 de la gestación, ambos grupos mostraron una disminución importante de su
peso corporal, que coincide con el día del parto.
Durante el período de la lactancia, las MR mostraron un peso significativamente menor
(p<0.001) a las MC y este se mantuvo hasta finalizar el período.
En la figura 2 se muestran las variaciones en el consumo de alimento de las ratas madre
de ambos grupos durante la gestación y la lactancia. Las ratas MR consumieron diariamente solo
el 60% de la cantidad de alimento consumida por las ratas MC, de modo que los cambios en la
ingestión de alimento son similares en ambos grupos de estudio. La ingestión de alimento
durante la gestación se incrementó ligeramente alcanzando un máximo el día 21, después los
animales redujeron su ingesta o dejaron de comer como un claro índice del parto.
200
250
300
350
400
450
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21
Días
Peso
(g).
MR (n=12).
MC (n=10).
Gestación Lactancia
Figura 1. Peso corporal de las ratas madres durante la gestación y la lactancia. Los datos se
muestran como la media ± el error estándar. * Indica diferencia significativa entre las ratas madres control
(MC) y las ratas madres restringidas (MR), del día 5 hasta el final de la lactancia (ANOVA bifactorial para
medidas repetidas, p<0.001).
1
11
21
31
41
51
61
71
81
1
Con
sum
o de
alim
ento
(g)
*
Gestación Lactancia7 14 21 28 35 42
Días
MC (n=10)
MR (n=12)
Figura 2. Consumo de alimento de las ratas madres durante la gestación y la lactancia. Los datos semuestran como la media ± el error estándar.
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Meta 2. Evaluar el desarrollo de las crías 2. 1 Peso corporal y longitud al nacimiento de las crías. La tabla 1 presenta el efecto de la desnutrición materna durante la gestación y la lactancia
sobre el número de crías nacidas por camada, así como sobre el peso y la longitud al nacimiento.
Los resultados muestran que la desnutrición in útero no afecta el número de crías por camada.
Sin embargo, el peso de las crías nacidas de madres restringidas (CR) fue significativamente
menor, con respecto a las crías nacidas de madres control (CC), al considerar el peso total de la
camada (22%, p=0.007) y después de ajustar a 8 crías (23%, p<0.001).
Grupo Número de crías por camada
Peso total de la camada
(g)
Peso de las camada
ajustada (g)
Longitud (cm)
CC
13 ± 1.1
97.1 ± 6.9
61.5 ± 2.5
5.8 ± 0.09
CR
13.1 ± 0.7
75.9 ± 3.2
47.4 ± 1.0
5.6 ± 0.075
P 0.93 0.007* <0.001* 0.081
Tabla 1. Número de crías, peso corporal y longitud al nacimiento. Los datos se muestran como la media ± el
error estándar para n=8 camadas por grupo. * Indica diferencia significativa al comparar a las crías nacidas de
madres restringidas (CR) con las crías de madres control (CC) (t-Student).
2.2. Peso corporal, longitud y consumo de alimento de las crías. Durante el período de la lactancia (día 1 al día 22 de edad), las crías fueron alimentadas por
sus madres. En este tiempo, la desnutrición materna afectó negativamente el desarrollo de las
CR, quienes presentaron siempre un menor peso corporal con respecto a las CC (figura 3), y
concluyeron la lactancia con un peso 43% menor (20.6 ± 1.0 vs. 36 ± 1.7 g, p<0.01). Además las
CR presentaron también un retraso de su crecimiento a partir del día 7 y hasta el final de la
lactancia, tiempo en el cual su longitud fue 17% menor (9.5 ± 0.25 vs. 11.5 ± 0.15 cm, p<0.01)
con respecto a los controles (figura 4).
El día 21 las crías de ambos grupos fueron separadas de sus madres y se alimentaron a libre
demanda con una dieta comercial hasta alcanzar la edad adulta (90 días). En la figura 5 se
presenta el consumo de alimento de las CC y CR, en ella podemos observar que las CR
consumieron menores cantidades de alimento con respecto al control (22% en promedio,
p<0.001), desde el inicio del destete hasta la edad adulta a pesar de tener libre acceso al
alimento. Lo anterior se vio reflejado en la menor ganancia de peso corporal de las CR, quienes
llegaron a la edad adulta con un peso significativamente menor (215.2 ± 2.3 vs. 239.7 ± 1.6 g,
p<0.01) (figura 3) y una menor longitud (20.2 ± 0.18 vs. 21.45 ± 0.13 cm, p<0.001) (figura 4), con
respecto a las CC.
Figura 3. Peestándar. * Ind
nacidas de ma
medidas repet
Figura 4. LonIndica diferenc
restringidas (Cp<0.001).
0
50
100
150
200
250
300
1
Peso
cor
pora
l (g)
0
5
10
15
20
25
1
Long
itud
(cm
)
Lactancia Alimentación a libre demanda
so corporal de las crías. Los datos se muestran como la media ± el error
ica diferencia significativa desde el nacimiento hasta la edad adulta entre las crías
dres restringidas (CR) y las crías de madres control (CC) (ANOVA bifactorial para
idas, p<0.001).
7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91
Días
CC (n=25)CR (n=22)
* p<0.001
Lactancia Alimentación a libre demanda
13
gitud de las crías. Los datos se muestran como la media ± el error estándar. *
ia significativa desde el día 7 hasta la edad adulta entre las crías nacidas de madres R) y las crías de madres control (CC) (ANOVA bifactorial par medidas repetidas,
7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91
Días
CC (n=25)CR (n=22)
* p<0.001
14
Figura 5. Consumo de alimento de las crías. Los datos se muestran como la media ± el
error estándar. * Indica diferencia significativa desde el destete (día 22) hasta la edad adulta entre las crías nacidas de madres restringidas (CR) y las crías de madres control (CC)
(ANOVA bifactorial para medidas repetidas, p<0.001).
Meta 3. Medición del gasto energético 3.1. Gasto de energía en reposo y cociente respiratorio.
La figura 6 presenta los resultados de las mediciones del gasto de energía en reposo en
las crías de edad adulta (CC y CR), expresado como el consumo de oxígeno que es
directamente proporcional al gasto energético. Los datos obtenidos indicaron que el gasto
energético en reposo no tuvo relación con la concentración de hormonas tiroideas, ya que a
pesar de que los animales presentaron concentraciones similares de T3 y T4 (tabla 2), el gasto
energético en reposo de las CR fue significativamente menor (20%, p<0.001) con respecto a los
controles.
Por otra parte, el cociente respiratorio fue similar en ambos grupos, para los cuales se
obtuvieron valores en el rango de 0.7>0.8 (figura 7), lo cual indica que tanto las CC como las CR
oxidaron preferentemente lípidos como normalmente se observa en el estado de ayuno.
0
5
10
15
20
25
22 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91Días
Con
sum
o (g
)
CC (n=25)
CR (n=22)
* p<0.001
Figura 6. Gasto de energía en reposo en crías de 90 días de edla media ± el error estándar para n=6 animales por grupo. Las lsignificativa entre las crías nacidas de madres restringidas (CR)
control (CC).
Figura 7. Cociente respiratorio en crías de 90 días de edad.
media ± el error estándar para n=6 animales por grupo. CR: crías
CC: crías nacidas de madres control. Las letras distintas indican dif
y CR.
������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������
������������������������������������������������������������850
900
950
1000
1050
1100
1150
1200
1250
1300
Con
sum
o de
oxí
geno
(m
l/kg0.
75 h
)
���������� CC
�����CR
0.72
0.73
0.74
0.75
0.76
0.77
VCO
2/VO
2
b
a
a
a
15
ad. Los datos se muestran como
etras distintas indican diferencia y las crías nacidas de madres
Los datos se muestran como la
nacidas de madres restringidas,
erencia significativa entre las CC
������������������������������������������������������������������������������������������������������
CC CR
a
16
Meta 4. Cuantificación de T3 y T4 en plasma 4.1 Concentración plasmática de hormonas tiroideas (T3, T4). La tabla 2 muestra las concentraciones plasmáticas de T3, T4 en las crías recién nacidas y
en la edad adulta. Los resultados mostraron que en las CC la concentración plasmática de T3 al
nacimiento fue mayor con respecto a la observada en el día 90 de edad, mientras que las CR
nacieron con una menor concentración de T3 y esta aumentó para la edad adulta (29%, p=0.041).
Al realizar las comparaciones entre los grupos de estudio, observamos que en el día 1 las
CR tuvieron una menor concentración de T3 (55%, p<0.001) con respecto a los controles; pero
para la edad adulta no se observaron diferencias significativas entre los grupos.
La edad fue un factor que influyó en la concentración plasmática de TSH, ya que ambos
grupos mostraron un aumento significativo de esta hormona en la edad adulta al compararse con
su concentración en el día 1 (p<0.02).
Al nacimiento, observamos que las concentraciones de T4 fueron similares entre los
grupos de estudio. Sin embargo, para la edad adulta las CR presentaron concentraciones
similares de T4 con respecto a las CC.
Grupo Día T4 (ng/ml)
T3 (ng/dl)
CC1
1
8.5 ± 1.5 a
143.6 ± 9 a
90 35 ± 4 b 100 ± 7 b
CR2
1
8 ± 1 ª
64.4 ± 7.9 c
90 33 ± 6 b 91.4 ± 6 b
Tabla 2. Concentraciones plasmáticas de T3, y T4 en las crías de 1 y 90 días de
edad. Los datos se muestran como la media ± el error estándar para n=8 CC y n=12
CR. 1 Crías nacidas de madres Control: CC. 2 Crías nacidas de madres Restringidas:
CR. Las letras distintas indican diferencia significativa entre los grupos de CC y CR, y
entre los días de edad (ANOVA bifactorial, p<0.04).
Figura 8. estándar.
como entre
Se utilizó un lote
que no hay difere
90 posparto.
Se utilizó un lote
que al nacimie
significativamente
diferencia.
B B C
once
ntra
ción
pla
smát
ica
de T
4
10
20
30
40
50
60
(ng/
ml)
Testigo (n=6)
Restringida (n=4)
A
B B
A A A
17
Concentración plasmática de T4. Los datos se muestran como la media ± error
Las letras distintas indican diferencia significativa entre control y restringida, así
los días 1 y 90 de edad (ANOVA bifactorial, p<0.05).
como testigo que fue alimentado a libre demanda. En la figura 24 se observa
ncia significativa en los niveles de T4 entre las CRR y las CRT al día 1 y al día
como testigo que fue alimentado a libre demanda. En la figura 25 se observa
nto, la concentración de T3 en el plasma de las crías restringidas es
menor que en el grupo testigo, mientras que en el día 90 ya no existe esta
0
1 90
Días
Figura 9. C
estándar. La
entre los días
Meta 5. Morfología
Con
cent
raci
ón d
e T 3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
(ng/
dl) Testigo (n=6) Restringida (n=4) A
A
oncentración
s letras distint
1 y 90 de eda
de la glándu
Figura 11 C
teñido con H
de mayor áre
menor.
11
C
B
B
plasmática de T3. Los datos s
as indican diferencia significativa
d (ANOVA bifactorial, p<0.05).
la tiroides
orte de GT de Cría de Rata Te
-E 100X. 1. Se observan folícul
a 2. Los folículos centrales mue
22
1 Días
C C
18
e muestran como la media ± error
entre control y restringida, así como
stigo 90 días
os periféricos
stran un área
90
19
5.1 CORTES HISTOLÓGICOS DE LA GLÁNDULA TIROIDES En las imágenes presentadas, se muestran los núcleos de las células de un color azul-morado, y
el coloide se muestra de color rosa. Como se puede apreciar en la imagen panorámica de un
corte histológico de la glándula tiroides, de una cría de rata testigo (CRT) a los de 90 días de
edad, se observa que los folículos periféricos tienen un área mucho mayor que los folículos
centrales, siendo estos últimos más activos que los periféricos.
Figura 12 Folículos periféricos 400X se
muestra mayor área del folículo
Figura 13 Folículos centrales 400X se
observa menor área folicular
CRÍA DE RATA TESTIGO
Figura 14 Figura 15
Folículos centrales 1000X se observan
núcleos redondos
Folículos periféricos 1000X las células
muestran núcleos aplanados
20
Se observa también en las imágenes (figuras 14 y 15) la diferencia en los núcleos de células
de folículos periféricos y núcleos de células de folículos centrales. Los núcleos de células de
folículos centrales se muestran redondos mientras que los núcleos de células de folículos
periféricos se presentan aplanados. Estas mismas diferencias se observan en las crías de
ratas restringidas (CRR, figuras 19 y 20).
Figura 16. Corte de GT de CRR 90 días teñido con H-E
100X. 1. De igual manera se observan folículos
periféricos de mayor área 2. Los folículos centrales
muestran un área menor
Figura 17 Figura 18
Folículos centrales 400X Se aprecian
zonas con desorganización folicular
Folículos periféricos 400X se muestran
folículos con un área grande y bien
definida
Figura 19 Folículos centrales 1000
observa desorganización de los fol
En los cortes histológicos de CRR
(figuras 17-20), ya que las célu
encuentran dispersas y no se obse
zonas no presentan actividad de s
tanto en los cortes de glándula tiro
y coloide almacenado dentro de los
En las figuras presentada
restringida con cuatro animales d
muestra como testigo (n=6) con se
En la figura 21 se observa q
en los folículos tipo 1 y 2 obteniénd
encontraron en un número significa
En los folículos tipo 3 y 4, aunque
CRR tienen un número ligerament
1
X 1 Se Figura 20 Folículos pe
ículos células muestran un nú
se observan diversas zonas con deso
las no se encuentran formando folí
rva coloide en estas zonas, por lo que
íntesis ni de almacenamiento de hor
ides de CRT se observa una buena o
folículos.
s las crías de madres restringidas
e experimentación (n=4) y las crías d
is animales de experimentación respe
ue las CRR tienen un número mucho
ose diferencia significativa. Los folícul
tivamente mayor en las CRR que en l
no se obtiene diferencia significativa
e mayor en comparación con las CRT
1
21
riféricos 1000X 1 las
cleo aplanado.
rganización folicular
culos, sino que se
se infiere que estas
monas tiroideas. En
rganización folicular
se muestran como
e madre testigo se
ctivamente.
mayor que las CRT
os tipo 5 también se
as CRT.
se observa que las
.
22
Figura 21 Número de folículos con respecto al área folicular. Los datos se muestran como
la media ± error estándar. *Indica diferencia significativa ANOVA bifactorial (p = 0.046)
entre CRR y CRT.
En la figura 22 se muestra el número de tirocitos por folículo en donde se observa que en
las glándulas tiroideas de las crías de ratas restringidas, los folículos tipo 1, 2, 3 y 4 tienen un
número significativamente mayor de células por folículo (ANOVA bifactorial, p=0.017).
0
5
10
15
20
25
1 2 3 4 5Tipo de folículo
No
de fo
lícul
os
Testigo (n=6) Restringida (n=4) *
*
*
23
Figura 22 Número de tirocitos en función del tipo de folículo. Los datos se muestran
como la media ± error estándar. Los * indican diferencia significativa entre el grupo
control y el restringido.
Figura 23. Áreas de tirocitos en función del tipo de folículo. Los datos se muestran como la media ±
error estándar. *Indica diferencia significativa ANOVA bifactorial (p < 0.05).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
1 2 3 4 5Tipo de folículo
No
de ti
roci
tos
Testigo (n=6) Restringida
* *
* *
010
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5 Tipo de folículo
Área
de
los
tiroc
itos
(μm
2 )
Testigo (n=6) Restringida (n=4)
* * * *
24
En la figura 23 se observa que la tendencia general es que el área de los tirocitos de las
CRR es menor en comparación con el presentado por las células de las CRT, se muestra
diferencia significativa en los folículos tipo 1, 2, 3, y 4, en tanto que, en los folículos tipo 5
aunque no se obtiene diferencia significativa entre los grupos, se muestra una ligera diferencia
en el área de las células siendo mayor en las CRT en comparación con las CRR.
Meta 6. Obtención de las carcasas Se obtuvieron las carcasas y se trataron como se describió en métodos.
Meta 7. Determinación de la composición corporal. 7. Composición corporal y peso de los depósitos de grasa corporal. Los resultados del análisis de la composición corporal se presentan como el contenido
de lípidos, proteínas y humedad en la carcasa de las crías en la figura 24. Los datos indicaron
que el porcentaje de humedad y proteínas, con respecto al peso corporal, fue similar entre las
CR y las CC. Sin embargo, el porcentaje de grasa de la carcasa de las CR fue
significativamente menor (7.7 ± 0.6 vs. 9.8 ± 0.6 %), al compararse con los controles.
Figura 24. Composición corporal de la carcasa de las crías de 90 días de edad. Los resultados se
expresan como el porcentaje de humedad, proteínas y lípidos con respecto al peso corporal de los animales,
y se presentan como la media ± el error estándar, en las crías nacidas de madres control CC y en las crías
de madres restringidas CR. Las letras distintas indican diferencia significativa entre CC y CR (t-Student,
p=0.03).
En la figura 25 se presenta el contenido de los depósitos de grasa de la zona
parametrial, retroperitoneal y de la grasa abdominal, en las crías de 90 días de edad,
51525354555657585
CC (n=12) CR (n=6)
Humedad Proteína Lípidos
%
a
a
a
a a
b
25
expresado como el porcentaje de grasa con respecto al peso corporal de los animales. Estos
resultados mostraron que el contenido de grasa parametrial e intestinal de las CR fue similar al
de los controles, pero el contenido de grasa retroperitoneal fue significativamente menor (0.42 ±
0.05 vs. 0.7 ± 0.07 %).
Figura 25. Contenido de grasa de la región parametrial, retroperitoneal y de la grasa abdominal en las crías de 90 días de edad. Los resultados se expresan como el porcentaje de grasa con respecto al peso corporal de los
animales, y se presentan como la media ± el error estándar, en las crías nacidas de madres control CC y en las crías
de madres restringidas CR. Las letras distintas indican diferencia significativa entre CC y CR (t-Student, p=0.038).
VI. DISCUSIÓN
La desnutrición es una condición que afecta el aporte de nutrimentos hacia el individuo
afectado, teniendo como consecuencia un menor aporte de macromoléculas con alto contenido
de energía necesario para todas las funciones celulares. Cuando estas restricciones se
presentan durante periodos críticos del desarrollo, como lo son la etapa fetal y la lactancia, las
consecuencias deben ser más drásticas. La desnutrición durante las etapas de desarrollo
críticas se ha relacionado con alteraciones permanentes en la estructura y función de algunos
tejidos (Lucas, 1991), encontrándose que una restricción de alimento severa (al 50 %) durante
la gestación, provoca retardo en el crecimiento fetal y disminución en el crecimiento postnatal,
cuando la restricción continúa durante la lactancia. Cuando estas ratas alcanzan la edad adulta,
el peso del hígado y de los riñones se encuentra reducido (Garofano et al., 1998). En las
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
% g
rasa
CC (n=12)CR (n=6)
Parametrial Retroperitoneal Abdominal
a
a
a
a
b
a
26
especies altriciales como en la rata, la organogénesis se extiende posterior al nacimiento
(Armitage et al., 2004).
La glándula tiroides es un tejido que empieza a diferenciarse durante los días 17-18 de
la etapa fetal cuando aparecen tanto la estructura como el coloide foliculares, alcanzando su
estructura reconocida alrededor del día 30 postnatal (Brown et al., 2000) y su capacidad
completa de síntesis de hormonas tiroideas. La restricción de alimento al 60 % de la dieta
normal en la rata, durante la gestación y la lactancia, provoca que las madres y las crías tengan
niveles menores de T3 y T4, lo cual demuestra que la restricción dietética provoca alteraciones
en el estado tiroideo de las madres y las crías, y que la ontogenia de la glándula tiroides está
retardada en las crías de las ratas restringidas. Estos efectos en las hormonas tiroideas pueden
estar relacionados con las alteraciones encontradas en la producción de leche y el menor
crecimiento encontrado en estas crías (Oberkotter y Rasmussen, 1992), sin embargo, para
determinar si estas alteraciones son permanentes, es necesario permitir que estos animales
lleguen a la edad adulta y analizar la morfología y la funcionalidad de la glándula tiroides, los
cuales fueron los objetivos del presente estudio.
El análisis histológico de la glándula tiroides muestra la estructura característica de este
tejido. En la imagen panorámica de la glándula tiroides de una cría de rata testigo (CRT) a los
de 90 días de edad se observa que los folículos periféricos son más grandes, con un área
mucho mayor que los folículos centrales, siendo estos últimos más activos que los periféricos.
El estudio morfológico se realizó para observar las posibles alteraciones en las glándulas
tiroides de las CRR. Los resultados mostraron regiones con desorganización folicular y
ausencia del coloide folicular en regiones centrales, lo cual nos permite sugerir que tales
regiones no pueden ser funcionales, ya que se ha perdido la estructura que es fundamental
para la síntesis, secreción y almacenamiento de HT. En tanto que en las glándulas tiroides de
las CRT se observa una buena organización folicular y dentro de los folículos se observa
coloide, por lo que se puede inferir el funcionamiento adecuado de la glándula tiroides en el
caso de estas ratas.
En la figura 21 se observa el número de folículos en un área constante, en donde cabe
mencionar que los folículos pequeños y centrales presentan una mayor actividad, en tanto que
los folículos grandes tienen una escasa actividad, en la figura se puede apreciar un mayor
número de folículos pequeños por área en el caso de CRR en comparación con las CRT por lo
cual se puede sugerir que el mayor número de folículos pequeños al tener éstos una mayor
actividad compensan la falta de actividad de las regiones dañadas.
27
En la figura 22 se observa que el comportamiento en general es que las CRR presentan
mayor número de células en comparación con las CRT, con los cual se sugiere que los folículos
funcionales y bien organizados de las CRR al presentar mayor número de tirocitos tienen una
mayor capacidad de síntesis manteniendo así niveles adecuados de hormonas tiroideas, y en la
figura 23 podemos apreciar que la tendencia es que las células tiroideas de las CRR tengan un
área menor, lo cual confirma la mayor cantidad de células en los diferentes tipos de folículos en
las CRR que en las CRT, esto coincide con algunos estudios en los que, se ha demostrado que
algunas alteraciones en etapas de crecimiento fetal influyen en el crecimiento del tejido y puede
relacionarse con el ciclo de proliferación y diferenciación celular, alterando así, el número total
de células (Behrends et al, 2005).
La medición de la hormona T4 es un buen indicador de la funcionalidad de la glándula
tiroides, ya que como se mencionó anteriormente, es la hormona que se sintetiza y secreta en
mayor cantidad por este tejido (Köhrle et al., 1986). Los resultados obtenidos en el presente
estudio demuestran que no hay diferencia significativa en las concentraciones de esta hormona,
lo cual nos dice que las CRR mantienen niveles adecuados de T4 por lo tanto la capacidad de
la GT para mantener los niveles de T4 no se ve afectada.
Se llevó a cabo la determinación de la concentración de T3 ya que esta hormona es la
que tiene mayor actividad, debido a que es más afín a los receptores que la T4 (Berne y Levy,
2004) y como se mencionó anteriormente la síntesis de las hormonas tiroideas está regulada en
gran parte por una retroalimentación negativa, al aumentarse la concentración de HT se reduce
la secreción y acción de la tirotrofina (TSH), (Berne y Levy, 2004).
Los resultados obtenidos muestran que hay diferencia significativa en las concentraciones de T3
al día 1 posparto, esto se puede explicar ya que en los primeros días posparto aún se siguen
diferenciando y madurando la glándula tiroides, las CRR al estar desnutridas presentan un
retraso en la maduración de diversos órganos (Ferlatte y Zeman, 1977), sobre todo el hepático
(Garofano et al., 1998) y como la mayor cantidad de T3 proviene de la monodesyodación de la
T4 en este tejido, no se lleva a cabo una suficiente transformación de T4 a T3, sin embargo, en el
día 90 se observa que los niveles de T3 son adecuados.
La determinación de TSH en suero, es la prueba más sensible de la función tiroidea
(Clement et al., 2001), ya que alguna alteración en los niveles de TSH son el indicador de una
disfunción tiroidea (Behrends et al,, 2005). La TSH a través del AMPc como segundo
mensajero, induce proliferación celular en las líneas celulares de la tiroides de la rata (De Felice
et al., 2004) lo cual explica el mayor número de células y de esta manera se compensa el daño
en otras regiones de la glándula de CRR donde la actividad es escasa o nula y se mantienen
28
niveles adecuados de hormonas tiroideas. Estos resultados sugieren que las alteraciones
encontradas en la morfología de la glándula tiroides son compensadas, al menos en parte, por
el aumento en la TSH, provocando una proliferación celular mayor y aumentando la síntesis de
hormonas tiroideas, manteniendo reguladas des esta forma, las concentraciones de estas
hormonas.
VII. CONCLUSIONES.
1.- La glándula tiroides de las CRR presentó zonas con desorganización folicular, lo que sugiere
que esos folículos no son funcionales.
2.- Los tirocitos de las CRR presentaron una menor área. Sin embargo, se encontró un mayor
número de folículos centrales en estos animales.
3.- La concentración mayor de TSH coincide con un aumento en el número de tirocitos de los
folículos tiroideos de las CRR.
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