przegląd wybranych prac z zakresu enzymologii

Przegląd wybranych prac

z zakresu enzymologii

Przegląd wybranych prac

z zakresu enzymologii

Redakcja:

Beata Zdunek

Monika Olszówka

Lublin 2016

Recenzenci:

prof. dr hab. Zdzisław Targoński

dr hab. Anna Jarosz-Wilkołazka

dr hab. Krauze Magdalena

dr hab. Anna Sierosławska

dr n. farm. Sławomir Wilczyński

dr Artur Banach

dr Monika Jach

dr Konrad Kubiński

dr Agnieszka Kuźniar

dr Maciej Masłyk

dr Anna Pytlak

dr Ewa Sajnaga

dr Aleksandra Seta-Koselska

dr Anna Serefko

dr Robert Świder

Wszystkie opublikowane rozdziały otrzymały pozytywne recenzje.

Skład i łamanie: Ilona Żuchowska

Projekt okładki:

© Copyright by Fundacja na rzecz promocji nauki i rozwoju TYGIEL

ISBN 978-83-65272-34-8

Wydawca:

Fundacja na rzecz promocji nauki i rozwoju TYGIEL

ul. Głowackiego 35/348, 20-060 Lublin

www.fundacja-tygiel.pl

Spis treści

Zuzanna Karwowska, Kinga Majchrzak Aktywność bakteryjnych β-glukuronidaz a skutki uboczne wybranych leków . 7

Adrian Zając, Mateusz Pięt, Michał Chojnacki Enzymy o istotnym znaczeniu w chorobie nowotworowej oraz jako cel

nowoczesnych terapii przeciwnowotworowych ............................................... 20

Alina Owsiak, Maria Misiorek, Ewa Żyracka Enzymy antyoksydacyjne i inne białka obronne w procesie starzenia ............ 37

Magdalena Bossowska, Matylda Mielcarska Rola katepsyn B i L w zakażeniu wirusem Ebola ............................................ 51

Olga Andrzejczak Lizozym – aktualne trendy w nauce i przemyśle .............................................. 59

Dariusz Rydzyński Zastosowanie enzymu katalazy w badaniach naukowych ............................... 73

Aneta Ostróżka-Cieślik, Anna Banyś, Beata Sarecka-Hujar Sposoby wykorzystania enzymów w przemyśle farmaceutycznym ................ 83

Katarzyna Dudka, Marzena Baran, Ewelina Karpik Roślinne metabolity wtórne i ich zastosowanie w kosmetyce ........................ 99

Piotr Żelazowski Enzymy w mleczarstwie ................................................................................. 125

Daria Łuczak, Alina Janocha Enzymy jako doskonałe dodatki paszowe w żywieniu kurcząt rzeźnych ...... 136

Natalia Kopik Enzymy w służbie środowisku – plastiki, bioplastiki i ich rozkład ................ 145

Małgorzata Margas Zastosowanie pomiaru aktywności peroksydazy w analizie poziomu stresu

oksydacyjnego u roślin .................................................................................... 154

Małgorzata Jurak, Agnieszka Ewa Wiącek, Emil Chibowski Rola cholesterolu w enzymatycznej hydrolizie modelowych membran

zbudowanych z fosfolipidu DOPC ................................................................. 169

Aneta Białkowska, Joanna Krysiak, Katarzyna M. Szulczewska Metagenom jako źródło unikatowych i ekstremofilnych biocząsteczek ........ 185

Agnieszka Ewa Wiącek, Małgorzata Jurak, Renata Kalisio Badanie wpływu pH i siły jonowej na efektywność enzymu PLA2

w układach emulsyjnych z udziałem liposomów DPPC ............................... 205

Łukasz Łopusiewicz Analiza determinantów katalitycznego optimum pH wybranych alfa-amylaz

pochodzących z bakterii z rodzaju Bacillus .................................................... 230

Matylda Mielcarska, Magdalena Bossowska Cięcie proteolityczne TLR3 przez katepsyny jest istotne dla jego stabilności

oraz sygnalizacji .............................................................................................. 242

Iwona Kowalczyk Molekularne narzędzia do edycji genomów wykorzystujące endonukleazy:

ZFNs, TALENs i CRISPR/Cas9 – porównanie ............................................. 250

Katarzyna Paradowska, Grażyna Ginalska Zastosowanie metody TLC bioautografii do identyfikacji inhibitorów

enzymatycznych – praca przeglądowa ........................................................... 287

Martyna Paździor, Patrycja Horbowicz, Jakub Knurek Proteaza wirusa HIV – budowa, mechanizm działania, inhibitory ................ 313

Indeks autorów ................................................................................................ 328

7

Zuzanna Karwowska1, Kinga Majchrzak

2

Aktywność bakteryjnych β-glukuronidaz

a skutki uboczne wybranych leków

1. Wstęp

Human Microbiome Project, zainicjowany w 2007 roku, miał na celu

zsekwencjonowanie genomu bakterii rezydujących w naszym organizmie.

Projekt ten był odpowiedzią na wcześniejszy cykl badań o nazwie Human

Genome Project (HGP), zainicjowanych w roku 1990, mających na celu

całkowite poznanie genomu człowieka. Jak wykazały wyniki Human Genome

Project ludzki genom oszacowany został na około 20 000 genów, co

porównywalne jest do genomu muszki owocowej. Human Microbiome Project

okazał się dopełnieniem HGP. Dowiódł on, iż mikroorganizmy zamieszkujące

ludzki organizm stanowią jego integralną część, wpływają na procesy

fizjologiczne, metabolizm oraz rozwój chorób[1]. Bakterie symbiotyczne

obecne są głównie w układzie pokarmowym,układzie moczowo-płciowym,na

skórze orazw drogach oddechowych. Ponad 70% całej endogennej mikroflory

znajduje się w jelitach. Związane jest to z faktem, iż ludzkie jelita są

najkorzystniejszym siedliskiem dla bakterii ze względu na dużą powierzchnię

i stały dostęp do składników odżywczych [2]. Skład oraz zagęszczenie

gatunków drobnoustrojów występujących w ludzkich jelitach zależne sąod

wielu czynników. Należą do nich m.in. wiek gospodarza, jego genotyp, styl

życia, dieta a także przyjmowane leki [1, 3, 4, 5, 6].

Mikroflora ludzkich jelit jest jednym z najobficiej zamieszkałych oraz

najbardziej zróżnicowanych siedlisk bakterii na świecie. Tysiące lat

współistnienia człowieka i jego endogennej mikroflory jest sprawiły, iż

stała się ona integralna częścią naszego makroorganizmu. Bakterie

uczestniczą m.in. w ochronie organizmu przed patogenami poprzez

zjawisko zwane odpornością kolonizacyjną. Odporność kolonizacyjna

związana jest z faktem, iż poprzez kolonizację powierzchni jelita bakterie

symbiotyczne nie pozostawiają miejsca do rozwoju drobnoustrojom

chorobotwórczym. [7]. Dodatkowo mikroflora jelit produkuje substancje

[email protected], Studenckie Koło Naukowe przy Katedrze Bromatologii,

Wydział Farmacji, Uniwersytet Medyczny w Łodzi, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytet Łódzki [email protected], Katedra Bromatologii, Wydział Farmacji, Uniwersytet

Medyczny w Łodzi

Zuzanna Karwowska, Kinga Majchrzak

8

przeciwbakteryjne zwane bakteriocynami [5] oraz pobudza organizm gospo-

darza do syntezy czynników przeciwbakteryjnych AMPs (ang. Antimicrobial

peptides), tj. defensyn czy lektyn typu C [2]. Mikroflora jelit zapewnia również

utrzymanie immunologicznej homeostazy regulując poziom limfocytów Treg,

Th17 oraz stosunek limfocytów Th1/Th2 [1]. Bakterie jelitowe zapewniają

dodatkowo prawidłowy rozwój układu nerwowego oraz utrzymanie równo-

wagi neurologicznej poprzez stymulację osi mózg-mikroflora-jelita i pod-

wzgórze-przysadka-jelita oraz zapewnienie prawidłowego stężenia nore-

prepiny i tryptofanu. [2, 8].

Mikroflora jelit uczestniczy również w utrzymaniu homeostazy ener-

getycznej organizmu. Enzymy bakteryjne umożliwiają przekształcanie

składników pokarmowych, takich jak błonnik czy jelitowa mucyna w inne

łatwo przyswajalne substancje, takie jak cukry proste czy krótkołańcuchowe

kwasy tłuszczowe (SFCA, ang. shortchainfattyacid,) [1, 2, 5]. Bakterie

jelitowe wpływają na utrzymanie prawidłowej wagi organizmu poprzez

dostarczenie dodatkowych kalorii z nieprzyswajalnych samodzielnie przez

człowieka oligosacharydów oraz poprzez zwiększenie adsorpcji jelit oraz

modulacje metabolizmu i apetytu. Dodatkowo drobnoustroje jelitowe

produkują witaminy K, B12, B6 oraz B1, kwas foliowy, mają wpływ na

recyrkulację kwasów żółciowych a także uczestniczą w przekształcaniu

potencjalnych mutagenów i karcynogenów, takich jak heterocykliczne

aminy [1, 2]. Bakterie zaliczane do mikroflory jelit posiadają enzymy

zwane fitazami. Fitazy rozkładają kwasy fitowe obecne w ziarnach

uwalniając związane z kwasem minerały, takie jak wapń, magnez czy

fosfor, czyniąc je dostępnymi dla gospodarza [9].

Dodatkowo mikroflora jelit zaangażowana jest w metabolizm leków.

Enzymy produkowane przez drobnoustroje jelitowe zdolne są do zmiany

struktury chemicznej ksenobiotyku, mogą ingerować w aktywność ludzkich

enzymów jelitowych czy wątrobowych, a także zmieniać poziom ekspresji

ludzkich genów zaangażowanych w metabolizm leków [10]. Aktywność

niektórych enzymów mikroflory jelit skorelowana jest z pojawieniem się

efektów ubocznych przyjmowanych leków, co w dalszej perspektywie

wymagać może zarzucenia terapii [11].

Najlepiej poznanymi lekami, których toksyczność związana jest ze

składem oraz aktywnością mikroflory jelit, są głownie niesteroidowe leki

przeciwzapalne (NLPZ) oraz irynotekan (CPT-11). W obu przypadkach

leki sprzęgane są w wątrobie w celu ich unieczynnienia i wydalenia

z organizmu. Jednakże w jelitach, poprzez aktywność bakteryjnych β-gluku-

ronidaz, kwas glukuronowy odłączany zostaje od ksenobiotyku i wykorzys-

tany przez bakterie jako źródło węgla, a uwolniony aglikon uszkadza

enterocyty [10, 11, 12].

Aktywność bakteryjnych β-glukuronidaz a skutki uboczne wybranych leków

9

2. Niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ)

NLPZ stanowi szeroka grupa leków o działaniu przeciwzapalnym, przeciw-

bólowym oraz przeciwgorączkowym. Do NLPZ należą m.in. pochodne kwasu

salicylowego (aspiryna), pochodne kwasu akrylooctowego (diklofenak,

indometacyna), pochodne kwasu arylopropionowego (ibuprofen, ketoptofen,

naproksen), pochodne kwasu fenamowego, oksykamy (piroksykan, melo-

ksykam) i inne [13]. Leki te stosowane są w schorzeniach takich jak: bóle

reumatyczne, pooperacyjne, nowotworowe, stany zapalne, migreny czy

bolesne menstruacje. W związku z faktem, iż wiele NLPZ, takich jak:

paracetamol, aspiryna, ibuprofen czy naproksen dostępnych jest bez recepty,

leki te często są nadużywane [14].

Funkcją NLPZ jest inhibicja cyklooksygenaz (COX), a w dalszej

perspektywie zwalczanie doznań bólowych (nadwrażliwości nocyceptorów)

poprzez hamowanie syntezy prostaglandyn. Prostaglandyny, pochodne kwasu

arachidonowego, należą do grupy parakrynowych hormonów zwierzęcych. Są

szybko metabolizowane, działają lokalnie i biorą udział w wielu procesach

fizjologicznych: wpływają na rozwój stanów zapalnych, regulują skurcze

macicy, wpływają na zwężenie i relaksację naczyń krwionośnych oraz

zaangażowane są proces w agregacji płytek krwi [13].

Cyklooksygenazy katalizują przemiany fosfolipidów błony komór-

kowej, prowadząc do powstawania prostanoidów (m.in. prostaglandyn).

W ludzkim organizmie występują dwie odmiany cyklooksygenaz: COX-1

(ulega ekspresji, jest w prawie wszystkich tkankach biorąc udział

w regulacji procesów fizjologicznych) oraz COX-2 (ulegająca ekspresji po

indukcji mediatorem stresorem zaangażowana w rozwój procesów

zapalnych oraz odczucia bólowe) [2, 13].

Jednakże przyjmowanie NLPZ wiąże się z szerokim spektrum efektów

ubocznych. Dotyczą one m.in układu pokarmowego. Inhibicja syntezy

prostaglandym prowadzi do zmniejszenia produkcji śluzu w żołądku, co

z kolei predestynuje do rozwoju nadżerek i wrzodów [14]. Prostaglandyny

wpływają również na wydalanie sodu z moczem. Zahamowanie ich syntezy

prowadzi więc do zwiększenia stężenia jonów sodu w organizmie, a tym

samym podwyższenia ciśnienia tętniczego, czego skutkiem mogą być m.in.

obrzęki lub nawet udar [13]. Dodatkowo zahamowanie aktywności COX

wpływa na przesunięcie równowagi hemostatycznej w kierunku nadkrzep-

liwości. Zahamowana synteza prostacyklin, o aktywności przeciwzakrzepowej,

przy jednoczesnym braku inhibicji tromboksanu prowadzić może nawet do

ataku serca [12, 23].


10

2.1. Korelacja między aktywnością bakteryjnych β-glukuronidaz

a toksycznością NLPZ

Pomijając szereg w/w. efektów ubocznych stosowania NLPZ u pacjentów

przyjmujących leki takie jak diklofenak czy paracetamol obserwuje się rozwój

schorzeń w dolnym odcinku pokarmowym m.in.: stanu zapalnego w obrębie

jelita cienkiego, choroby wrzodowej, perforacji jelita cienkiego, a nawet

choroby nowotworowej. Rozwój tych schorzeń związany jest z aktyw-

nością bakteryjnych β-glukuronidaz [11].

Część NLPZ (np. diklofenak) sprzęgane są w wątrobie z kwasem

glukuronowym w celu unieczynnienia i wydalenia z organizmu z żółcią.

Jednakże w jelicie cienkim bakterie posiadające aktywność β-glukuronidaz

odłączają od 1-β-O-acyloglukuronidu (AG) kwas glukuronowy, uwalniając

toksyczny aglikon [11, 12].

Uwolniony aglikon na drodze dyfuzji wnika do komórki uszkadzając

błonę komórkową oraz ingeruje w proces fosforylacji oksydacyjnej

w mitochondriach. Dochodzi do obniżenia stężenia ATP w komórce.

Zwiększa się przepuszczalność nabłonka jelitowego, przez co zwiększa się

podatność na infekcje bakteryjne w obrębie jelit. Napływające patogeny

indukują komórki gospodarza do syntezy cytokin prozapalnych, co działa

chemotaktycznie na neutrofile. Rozwijający się stan zapalny prowadzić

może do uszkodzenia tkanek jelita [15]. (Ryc.1)

Ryc.1 Schematyczne przedstawienie metabolizmu diklofenaku, jako reprezentanta niesteroidowych leków przeciwzapalnych


11

3. Irynotekan

Irynotekan (CPT-11) jest rozpuszczalną w wodzie pochodną kampo-

tecyny, alkaloidu wyizolowanego z rośliny Camtothecaacuminata. Związek

ten wykazuje silne właściwości przeciwnowotworowe poprzez zaburzanie

cyklu katalitycznego topoizomerazy I DNA. CPT-11, blokując powino-

wactwo topoizomerazy I do DNA, prowadzi komórkę na szlak apoptozy [16].

CPT-11 należy do chemioterapeutyków pierwszej linii. Stosowany jest

w terapii nowotworów okrężnicy (w terapii FLOFIRI), trzustki (w terapii

FOLIFIRINOX), a także nowotworów płuc, żołądka oraz guzów mózgu [12].

Irynotekan podawany jest w formie proleku. W organizmie pod wpływem

działania karboksyloesteraz, które odłączają od związku pierścień

piperydyny [18], przekształcany jest do formy aktywnej (SN-38) [12]

wykazującej około 100 razy silniejsze działanie toksyczne [16]. W wątrobie

SN-38 sprzęgany jest z kwasem glukuronowym przez enzym UGT1A1

(izoformaenzymu UDP – glukuronozyltransferazy; ang. UDP glucurono-

sylotransferase 1 family, polypeptide A1) a następnie usuwany z organizmu

z żółcią [12]. Jednakże chemioterapia z zastosowaniem irynotekanu związana

jest z pojawieniem się wielu efektów ubocznych takich jak; zwiększenie

potliwości, nadprodukcja śliny, skurcze żołądka, światłowstręt oraz zagra-

żające życiu biegunki. Objawy te zwane są „ostrym syndromem cholino-

ergicznym”. Wystąpienie w/w objawów związane jest z faktem iż irynotekan,

posiadający właściwości inhibitora acetylocholinoesterazy, jednocześnie

stymuluje komórki do uwolnienia neuroprzekaźnika – acetylocholiny zabu-

rzając prawidłowe funkcjonowanie układu nerwowego [17, 18]. Dodatkowo

terapia irynotekanem związana być może z : utratą apetytu, neuropenią czy

mielosupresją [12]. Irynotekan, chemioterapeutyk, stosowany jest w terapii guzów okrężnicy,

trzustki, płuc i mózgu. Jako iż, irynotekan wykazuje aktywność inhibitora

topoizomerazy DNA I, ma on działanie cytostatyczne. Podczas terapii

irynotekan podawany jest w formie proleku CPT-11, następnie pod

wpływem ludzkich enzymów, karboksyloesteraz, ulega on przekształceniu

do formy aktywnej SN-38 poprzez odłączenie pierścienia piperydyny.

W wątrobie SN-38, podobnie jak w przypadku metabolizmu niesteroi-

dowych leków przeciwzapalnych, sprzęgany jest z kwasem glukuronowym.

W jelitach, jednakże, bakteryjne β-glukuronidazy odłączają reszty kwasu

glukuronowego od ksenobiotyku, a toksyczny aglikon uwolniony zostaje

do światła jelita (Ryc. 2). Jako że SN-38, jest 100 do 1000 razy bardziej

toksyczny od formy nieaktywnej CPT-11 oraz posiada właściwości

inhibitora esterazy acetylocholinowej dochodzi do uszkodzenia entero-

cytów oraz zagrażających życiu biegunek [12, 17, 18].


12

Ryc.2 Metabolizm Irynotekanu z uwzględnieniem roli glukuronidaz bakteryjnych i UGT1A1

4. Bakteryjna β-glukuronidaza: budowa i funkcje

Ludzkie β-glukuronidazy należą do enzymów rodziny hydrolaz gliko-

zylowych (GH2). Obecne w lizosomach i mikrosomach większości tkanek

enzymy zaangażowane w hydrolizę glikozaminoglikanów posiadających

reszty kwasu glukuronowego [19, 12]. Enzym bakteryjny wykazuje około 45%

podobieństwo sekwencyjne względem ludzkiego ortologu, jednakże

mechanizm działania i budowa są do siebie bardzo zbliżone [12].

4.1. Budowa ludzkiej -glukuronidazy

β-glukuronidazy występują w formie homotetrameru. Każdy monomer

składa się z trzech domen. Pierwsza, C-końcowa domena, ma budowę

cylindra typu rolady. W obrębie tej domeny znajduje się specyficzny

marker – M6P (mannozo-6-fosforan), rozpoznawany przez lizosomalny

receptor M6PR, zaangażowany w kierowanie enzymu do lizosomu [19].

Druga domena strukturalnie przypomina część stałą immunoglobulin

o strukturze – helisy [22]. Trzecia, N-końcowa domena, o budowie α/β

cylindra, posiada w swojej strukturze miejsce aktywne enzymu. W miejscu

aktywnym najważniejsze reszty aminokwasowe: Glu451, Glu540 oraz

Tyr504 rozmieszczone są w takiej odległości od siebie, aby jak najbardziej

zoptymalizować atak nukleofilowy podczas przetwarzania substratu [19].

UGT1A1


13

4.2. Kinetyka reakcji katalizowanych przez ludzkie

glukuronidazy

Hydroliza reszty kwasu glukruronowego od glikozaminoglikanów kata-

lizowana przez β-glukuronidazy przebiega dwufazowo. W pierwszej fazie

miejsce ma atak nukleofilowy jednego z karboksylanów enzymu na

anomeryczny atom węgla substratu. W fazie drugiej utworzone zostają

wiązania wodorowe między aminokwasami enzymu: Tyr509, Ser557, Asn566

oraz Lys568, a substratem, co prowadzi do rozłamu wiązania glikozy-

dowego substratu na drodze hydrolizy [19].

5. Bakteryjne β-glukuronidazy

Bateryjne β-glukuronidazy należą do ortologów ludzkich enzymów

o 45% podobieństwie sekwencyjnym. Również występują w formie homo-

tetramerycznej, a także odłączają β-glukuronidy pochodzenia endogennego

(proces detoksykacji leków na drodze sprzęgania z kwasem glukuronowym

w komórkach wątroby) oraz egzogennego (składniki pokarmowe, leki)

[20]. Enzymy te występują u około 10% symbiotycznych bakterii

jelitowych. Obecne są u mikroorganizmów z gromady Firmicutes (bakterie

z rodzaju Lactobacillus, Streptococcus, Clostridium, Ruminococcus,

Roseburia, czy Faecalibacterium) [21] np. Clostridium perfringens czy

Streptococcus agalactiae [12], Actinobacteria (Bifidobacterium dentium),

Proteobacterium (E.coli) oraz Bacteroidetes (Bacteroides fragilis) [21].

Enzymy te wpływają na biodostępność i metabolizm leków, sfingolipidów,

flawonoidów oraz składników pokarmowych [12, 19, 20]. Jednakże bak-

teryjne β-glukuronidazy badane są głównie pod kątem wzmagania toksycz-

ności leków prowadzącej do rozwoju różnego rodzaju enteropatii [12].

W wątrobie ksenobiotyki ulegają detoksykacji dwufazowo. Pierwsza

faza obejmuje proces wstępnej hydroksylacji katalizowanej przez enzymy

z rodziny monooksygenaz (lub enzymy grupy cytochromu P-450). Podczas

fazy II detoksykacji ksenobiotyki sprzęgane są z kwasem glukuronowym

(również siarczanami czy glutationem) w reakcji katalizownej przez UDP-

glukuronylotransferazy. Sprzęganie ma na celu zwiększenie polarności

substancji, tak aby mogły one efektywnie zostać wydalone z żółcią lub

moczem [21]. W jelitach bakteryjne β-glukuronidazy odłączają kwas

glukuronowy od ksenobiotyku i zużywają glukuronian jako źródło węgla.

Uwolniony aglikon, jako że nie może ulec wydaleniu z organizmu, wraca

do obiegu co powoduje wzrost jego stężenia. W konsekwencji dochodzi do

uszkodzenia enterocytów i rozwoju enteropatii [12, 19, 20, 21].


14

6. Inhibicja bakteryjnych β-glukuronidaz

W związku z szeregiem schorzeń związanych z aktywnością bakte-

ryjnych β-glukuronidaz od wielu lat trwają badania mające na celu

inhibicję aktywności tegoż enzymu. Efektywny inhibitor nie powinien

działać bakteriobójczo, zmieniać aktywności leku, ale przede wszystkim

wpływać na aktywność ludzkich β-glukuronidaz [11,12]. β-glukuronidazy,

występujące w ludzkich tkankach, pełnią wiele funkcji mających kluczowy

wpływ na organizm człowieka, m.in. biorą udział w usuwaniu z organizmu

siarczanów dermatanu i heparanu, ułatwiają recyrkulacje witaminy D,

hormonów tarczycy, bilirubiny oraz estrogenów, zaangażowane są w prze-

budowę komponentów macierzy zewnątrzkomórkowej, hydrolizę glukuro-

nidów żółci, a także aktywację proleków [19].

Zahamowanie aktywności enzymu β-glukuronidazy, wynikające

np. z mutacji, prowadzi do nagromadzenia w lizosomach związków

tj. siarczanów chondroityny, dermatanu czy heparanu. W konsekwencji

dochodzi do dys-funkcji narządów, opóźnienia umysłowego czy nawet

niepełnosprawności ruchowej [19]. Kluczowe jest więc, aby efektywny

inhibitor β-gluku-ronidazy aktywny był wyłącznie względem enzymu

bakteryjnego.

Celem wybiórczych inhibitorów bakteryjnej β-glukuronidazy są, charak-

terystyczne dla drobnoustrojów, obecne w cząsteczce enzymu struktury

zwane pętlami.

6.1. Motyw NK (NK loop)

W strukturze bakteryjnego, tak jak i ludzkiego enzymu, w miejscu

wiązania substratu, obecny jest motyw (‘pętla’) NK. Motyw ten,

zbudowany z reszt Asparaginy oraz Lizyny, służy jako marker do

identyfikacji enzymu, zalicza się go do białek z rodziny GH2 (hydrolaz

glikozydowych) [12]. (Ryc. 3)


15

Ryc. 3 Sekwencja aminokwasowa motywu NK [12]

6.2. Bakteryjna „pętla” (ang. MicrobialLoop)

Strukturą charakterystyczną wyłącznie dla enzymu bakteryjnego jest

motyw białkowy obecny w centrum aktywnym białka, zwany pętlą.

Obecność pętli związana jest z faktem, iż bakteryjne enzymy przetwarzają

mniejsze substraty od enzymów eukariotycznych. Struktura ta składa się

z 13-17 reszt aminokwasowych, nie jest konserwatywna sekwencyjnie (około

11%-36% podobieństwa między gatunkami) i nie występuje u wszystkich

drobnoustrojów o aktywności β-glukuronidazy. Pętla bakteryjna obecna

jest m.in. u Firmicutes, Proteobacteria oraz Actinobacteria, brak jej

natomiast u Bacteroidetes, Acidobacteriaceae. Jednakże to właśnie

inhibitory oddziałujące z pętlą bakteryjną stanowią główny podmiot badań,

jako że struktura ta obecna jest wyłącznie u bakterii [12]. (Ryc.4)

Ryc. 4. Sekwencja aminokwasowa „pętli” – Microbialloop [12]

6.3. Pętla M

Kolejną sekwencją obecną wyłącznie w organizmach bakteryjnych jest

dipeptyd zwany ‘pętlą M’. Zbudowany jest on z Metioniny oraz


16

Fenyloalaniny u E. coli, u C.perfringens, S. agalactiae występuje w postaci

dipeptydu Leucyna-Metionina. Obecny jest on w centrum aktywnym enzymu

w odległości około 7,5Å od miejsca katalitycznego oraz uczestniczy

w wiązaniu substratu. Brak pętli M występuje w B. fragilis oraz

B. thetaiotaomicron [12] (Ryc. 5).

Ryc. 5 Sekwencja aminokwasowa pętli M w bakteryjnej glukuronidazie

7. Podsumowanie

Mikroflora jelit pełni w ludzkim organizmie wiele ważnych dla zdrowia

funkcji. Uczestniczy w utrzymaniu homeostazy immunologicznej,

energetycznej oraz neurologicznej, chroni przed wnikaniem patogenów

oraz uczestniczy w metabolizowaniu potencjalnych karcynogenów które

codziennie wnikają do organizmu. Symbiotyczną mikroflorę jelit można

uznać za osobny metabolicznie ‘narząd’ [1]. Jednakże uwagę warto

zwrócić na produkty metabolizmu bakterii, gdyż nierzadko uwalniane

związki mogą być potencjalnie chorobotwórcze. W zależności od składu

i obfitości mikrobiomu te same reakcje przebiegać mogą w zróżnicowany

sposób. Ma to miejsce m.in. w przypadku metabolizowania leku. Nieste-

roidowe leki przeciwzapalne stosowane są w leczeniu migren, stanów

zapalnych czy szeroko pojętej nadwrażliwości nocyceptorów ze względu

na ich właściwości inhibitora cyklooksygenazy. Enzym cyklooksygenaza

(COX) pośredniczy w reakcji syntezy m.in. prostaglandyn i prostacyklin,

hormonów tkankowych uczestniczących w wielu procesach fizjologicznych

i zapalnych. NLPZ podczas drugiej fazy detoksykacji sprzęgane są

w wątrobie z kwasem glukuronowym, a następnie wydalane są z żółcią.

Jednakże w jelitach bakteryjne enzymy – β-glukuronidazy, odłączają kwas

glukuronowy od leku, a toksyczny aglikon uwalniany jest do światła jelita.

Stężenie substancji toksycznej w organizmie zwiększa się. Enterocyty


17

narażone na tak dużą dawkę toksyczną ulegają uszkodzeniu. Dochodzi do

rozwoju różnego rodzaju enteropatii tj. stanów zapalnych, owrzodzeń czy

nawet choroby nowotworowej.

Irynotekan, chemioterapeutyk, stosowany jest w terapii guzów okrężnicy,

trzustki, płuc i mózgu. Jako iż, irynotekan wykazuje aktywność inhibitora

topoizomerazy DNA I, ma on działanie cytostatyczne. Podczas terapii

irynotekan podawany jest w formie proleku CPT-11, następnie pod wpływem

ludzkich enzymów, karboksyloesteraz, ulega on przekształceniu do formy

aktywnej SN-38 poprzez odłączenie pierścienia piperydyny. W wątrobie

SN-38, podobnie jak w przypadku metabolizmu niesteroidowych leków

przeciwzapalnych, sprzęgany jest z kwasem glukuronowym. W jelitach,

jednakże, bakteryjne β- glukuronidazy odłączają reszty kwasu glukuro-

nowego od ksenobiotyku, a toksyczny aglikon uwolniony zostaje do światła

jelita (Ryc. 2). Jako że SN-38, jest 100 do 1000 razy bardziej toksyczny od

formy nieaktywnej CPT-11 oraz posiada właściwości inhibitora esterazy

acetylocholinowej dochodzi do uszkodzenia enterocytów oraz zagrażających

życiu biegunek.

Wyzwaniem medycyny personalizowanej jest dobieranie terapii nie tylko

na podstawie symptomów choroby, ale również zważywszy na osobnicze pre-

dyspozycje pacjenta. Polimorfizm genów (np. UDP-glukuronylotransferazy,

enzymu odpowiadającego za sprzęganie kwasu glukuronowego z kseno-

biotykiem w drugiej fazie detoksykacji) spowodowany mutacjami czy

mikroflora jelit zmieniona ze względu na przyjmowane antybiotyki mogą

wpływać na odmienny metabolizm leków. Ten sam związek u pacjenta

z destabilizacją mikrobiomu czy odpowiednią mutacją wywoływać może

szereg skutków ubocznych, nierzadko zagrażających życiu, co wymaga

niekiedy zarzucenia terapii. Dlatego tak ważnym dla zoptymalizowania

efektów terapii jest zagłębienie się w metabolizm leków na płaszczyźnie

genetycznej oraz mikrobiologicznej.

Literatura

1. Olszewska J., Jagusztyn-Krynicka E. K., Human Microbiome Project

– mikroflora jelit oraz jej wpływ na fizjologię i zdrowie człowieka, Post.

Mikrobiol., 2012; 4: 243-256

2. Sekirov I., Russell S. L., Antunes L. C., Finlay B. B., Gut microbiota in health

and disease, Physiol Rev., 3 (2010), s. 859-904

3. Nowak A., Libudzisz Z., Karcynogenna aktywność mikroorganizmów

jelitowych, Żywność. Nauka. ŻYWNOŚĆ. Nauka. Technologia. Jakość.,

6 (2008), s.25-39

4. Simpson H. L., Campbell B. J., Review article: dietary fibre-microbiota

interactions, Aliment PharmacolTher., 42 (2015), s.158-79


18

5. Jandhyala S. M., Talukdar R., Subramanyam C., Vuyyuru H., Sasikala M.,

Nageshwar Reddy D., Role of the normal gut microbiota, World J

Gastroenterol., 21 (2010), s. 787-803

6. Lopetuso L. R, Scaldaferri F., Petito V., Gasbarrini A., Commensal Clostridia:

leading players in the maintenance of gut homeostasis, Gut Pathog. 10 (2013),

s.5-23

7. Szewczyk E. M., Diagnostyka bakteriologiczna, Wyd. PWN SA, Warszawa;

2005, s.205-206

8. Andersson U., Tracey K. J., Reflex Principles of Immunological Homeostasis,

Annual Review of Immunology, 30 (2012), s.313-35

9. Conlon M. A., Bird A. R., The impact of diet and lifestyle on gut microbiota

and human health, Nutrients, 7 (2014), s. 17-44

10. Saad R., Rizkallah M. R., Aziz R. K., Gut Pharmacomicrobiomics: the tip

of an iceberg of complex interactions between drugs and gut-associated

microbes, Gut Pathogens 4 (2012), s.4-16

11. LoGuidice A., Wallace B. D., Bendel L., Redinbo M. R., Boelsterli U. A.,

Pharmacologic Targeting of Bacterial β-Glucuronidase Alleviates Nonsteroidal

Anti-Inflammatory Drug-Induced Enteropathy in Mice, The Journal

Of Pharmacology And ExperimentalTherapeutics., 2 (2012), s. 447-454

12. Wallace B. D., Roberts A. B., Pollet R. M., Mani S., Kelly L., Redinbo M. R.,

Structure and Inhibition of Microbiome β-Glucuronidases Essential to the

Alleviation of Cancer Drug Toxicity, Chemistry&Biology 22 (2015), s. 1238-1249

13. Meek I. L., van de Laar M. A. F. J., Vonkeman H. E., Non-Steroidal Anti-

Inflammatory Drugs: An Overview of Cardiovascular Risks, Pharmaceuticals,

3 (2010) s. 2146-2162

14. Sostres C., Gargallo C. J., Lanas A., Nonsteroidal anti-inflammatory drugs

and upper and lower gastrointestinal mucosal damage, Arthritis Res Ther.

15 (2013), suppl 3

15. Takeuchi K, Satoh H, NSAID-Induced Small Intestinal Damage – Roles

of Various Pathogenic Factor, Digestion., 91 (2015), s. 218-232

16. Miyazaki T., Ikegami T.,Nagai Y., Nguyen A., Matsuzaki Y., Kobayashi K.,

Ceryak S., Bicarbonate Attenuates Irinotecan-Induced Cytotoxicity through

Regulation of Both Extracellular and Intracellular pHs in Intestine Cell Line,

JTC., 4 (2013), s. 944-952

17. https://www.cdhb.health.nz/Hospitals-Services/Child-Health/Child-

Haematology-Oncology/Documents/Irinotecan-Parent-Caregiver-

Information.pdf

18. Blandizzi C., DePaolis B., Colucci R.,Lazzeri G., Laschiera F., Del Tacca M.,

Characterization of a novel mechanism accounting for the adverse cholinergic

effects of the anticancer drug irinotecan

19. Naz H., Islam A., Waheed A., Sly W. S., Ahmad F., Hassan M. I., Human

β-Glucuronidase: Structure, Function, and Application in Enzyme

Replacement Therapy, Rejuvenation Research., 16 (2013), s. 1-13

20. Gloux K., Berteau O., El oumami H., Béguet F., Leclerc M., Doré J.,

A metagenomicβ-glucuronidase uncovers a core adaptive function of the

human intestinal microbiome, Proc Natl Acad Sci., 108 (2011), s. 539-4546

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sostres%20C%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gargallo%20CJ%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lanas%20A%5Bauth%5D

http://www.scirp.org/journal/AuthorInformation.aspx?AuthorID=108916&searchCode=Teruo++Miyazaki&searchField=authors&page=1

http://www.scirp.org/journal/AuthorInformation.aspx?AuthorID=108917&searchCode=Tadashi++Ikegami&searchField=authors&page=1

http://www.scirp.org/journal/AuthorInformation.aspx?AuthorID=108918&searchCode=Yoshiaki++Nagai&searchField=authors&page=1

http://www.scirp.org/journal/AuthorInformation.aspx?AuthorID=108919&searchCode=Amy++Nguyen&searchField=authors&page=1

http://www.scirp.org/journal/AuthorInformation.aspx?AuthorID=108920&searchCode=Yasushi++Matsuzaki&searchField=authors&page=1

http://www.scirp.org/journal/AuthorInformation.aspx?AuthorID=108921&searchCode=Kunihiko++Kobayashi&searchField=authors&page=1

http://www.scirp.org/journal/AuthorInformation.aspx?AuthorID=108922&searchCode=Susan++Ceryak&searchField=authors&page=1

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Blandizzi%20C%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=De%20Paolis%20B%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Colucci%20R%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lazzeri%20G%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Baschiera%20F%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Del%20Tacca%20M%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gloux%20K%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Berteau%20O%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=El%20oumami%20H%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=B%26%23x000e9%3Bguet%20F%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Leclerc%20M%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Dor%26%23x000e9%3B%20J%5Bauth%5D


19

21. Żółtaszek R., Hanausek M., Kiliańska Z. M., Walaszek Z.

, Biologiczna rola

kwasu D-glukarowego i jego pochodnych; potencjalne zastosowanie

w medycynie, PostepyHigMedDosw., 62 (2008), s. 451-462

22. Wallace B. D., Wang H., Lane K. T., Scott J. E., Orans J., Koo J. S., Venkatesh

M., Jobin C., Yeh L., Mani S., Redinbo M. R., Alleviating Cancer Drug

Toxicity by Inhibiting a Bacterial Enzyme, Science., 330 (2010)., s. 831-835

23. Strona internetowa : Registrar Crop

http://www.fda.gov/downloads/Drugs/DrugSafety/ucm089162.pdf

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wallace%20BD%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wang%20H%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lane%20KT%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Scott%20JE%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Orans%20J%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Koo%20JS%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Venkatesh%20M%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Jobin%20C%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yeh%20LA%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mani%20S%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Redinbo%20MR%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/eutils/elink.fcgi?dbfrom=pubmed&retmode=ref&cmd=prlinks&id=21051639

20

Adrian Zając1, Mateusz Pięt

2, Michał Chojnacki

3

Enzymy o istotnym znaczeniu

w chorobie nowotworowej

oraz jako cel nowoczesnych terapii

przeciwnowotworowych

1. Wprowadzenie

Nowotwór jest chorobą wieloczynnikową, istnieje więc wiele punktów,

będących potencjalnym celem jego zwalczania. Mogą to być przede

wszystkim zwiększenie skuteczności terapeutycznej oraz ograniczenie

działań niepożądanych. Tego rodzaju wymagania spełniają terapie

molekularne celowane, które są ukierunkowane na swoiste struktury

w komórkach patologicznych. Chemioterapia jest klasyczną formą

systemowego leczenia chorób nowotworowych, której duże znaczenie

terapeutyczne, szczególnie w połączeniu z nowoczesną chirurgią i/lub

radioterapią, w szczególny sposób przełożyło się na wyniki leczenia. Bardzo

szybki rozwój biologii molekularnej przyczynił się w znacznym stopniu do

odkrycia protoonkogenów oraz czynników transkrypcyjnych, które mogą

warunkować transformację nowotworową. Ogromne nadzieje budzi obecnie

przede wszystkim molekularna terapia celowana, która ukierunkowana jest

na struktury komórek patologicznych, które ściśle związane są z procesami

proliferacyjnymi. Badania związane z tą terapią opierają się m.in. na

poznaniu działania niektórych enzymów (np. cyklooksygenazy, kinaz

tyrozynowych czy metaloproteinaz). Te, ulegając nadekspresji, mogą stać się

bezpośrednim czynnikiem warunkującym powstawanie niektórych rodzajów

nowotworów. Niniejsza praca ma na celu przybliżyć zagadnienia związane

z tymi enzymami i zaburzeniami ich funkcjonowania, mogącymi przyczynić

się do transformacji komórek w komórki nowotworowe.

[email protected], Zakład Anatomii Porównawczej i Antropologii, Wydział Biologii

i Biotechnologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowkiej w Lublinie, www.umcs.pl [email protected], Zakład Wirusologii i Immunologii, Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowkiej w Lublinie, www.umcs.pl [email protected], Zakład Hemotoonkologii Doświadczalnej, II Wydział Lekarski

z Oddziałem Anglojęzycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, www.umlub.pl

mailto:[email protected]



http://www.umlub.pl/

Enzymy o istotnym znaczeniu w chorobie nowotworowej oraz jako cel

nowoczesnych terapii przeciwnowotworowych

21

2. Kinazy tyrozynowe

Przekaźnictwo sygnałów w komórce uwarunkowane jest obecnością

specyficznych białek receptorowych (w tym również o aktywności kinaz

tyrozynowych). Białka te odbierają sygnał od pozakomórkowych ligandów

np.: hormonów peptydowych, czynników wzrostu, czy cytokin, które są

niezdolne do swobodnego przekraczania błon biologicznych. Precyzyjna

regulacja aktywacji tych receptorów warunkuje prawidłowe podziały komór-

kowe, a co za tym idzie optymalne funkcjonowanie całego organizmu.

Nadmierna aktywność enzymów z grupy kinaz może więc prowadzić do

poważnych zaburzeń w sygnalizacji międzykomórkowej, co z kolei przyczynić

się może do niekontrolowanego pobudzenia podziałów komórkowych.

Obecnie prowadzone są coraz bardziej intensywne badania dotyczące poszu-

kiwania skutecznych inhibitorów różnych etapów sygnalizacji między-

komórkowej, które uzależnione są od aktywności enzymów, np. kinaz tyrozy-

nowych, w celu zwiększenia skuteczności terapii przeciwnowotworowych [1‚5].

2.1. Informacje ogólne

Kinazy tyrozynowe są enzymami, których substratem jest reszta

tyrozynowa białek. Odpowiadają one za reakcję fosforylacji protein,

posiadających specyficzną dla kinaz domenę. Poprzez fosforylację,

aktywność tych enzymów prowadzi do zmiany aktywności poszczególnych

białek oraz do aktywacji ich zdolności do przenikania przez błonę

komórkową. Stąd też kinazy tyrozynowe są zaangażowane w większość

szlaków sygnalizacyjnych w komórkach [4‚6]. Reprezentacją kinaz

tyrozynowych są receptorowe kinazy tyrozynowe, które stanowią

integralną częścią receptorów katalitycznych. Do tego typu receptorów

należą głównie receptory czynników wzrostu, np. płytkopochodny czynnik

wzrostu (platelet-derived growth factor, PDGF) czy czynnik wzrostu

naskórka (epidermal growth factor, EGF) [7].Mutacje genów kodujących

kinazy tyrozynowe mogą więc prowadzić do niekontrolowanej proliferacji,

której wynikiem może być rozwój nowotworu, a nawet powstawanie

przerzutów [8].

2.2. Inhibitory kinaz tyrozynowych – Tyrfostiny

Tyrfostiny jest to określenie, którego używa się w odniesieniu do

drobnocząsteczkowych inhibitorów kinaz tyrozynowych. Pierwsze

tyrfostiny zostały wyizolowane z roślin i posłużyły one zespołowi Levitzky

i wsp.pod koniec lat osiemdziesiątych XX w. za pierwowzór dla stworzenia

syntetycznych analogów [9].

Adrian Zając, Mateusz Pięt, Michał Chojnacki

22

2.2.1. Tyrfostiny naturalne – prekursory nowoczesnych

chemioterapeutyków

Jako jedne z pierwszych tyrfostinów, które zostały odkryte były naturalne

związki pochodzenia roślinnego, z grupy flawonów, np. kwercetyna czy

genisteina [9]. Kwercetyna jest organicznym związkiem aromatycznym

z grupy fitozwiązków. Spektrum jej działania jest szerokie, poczynając od

właściwości antyoksydacyjnych, poprzez przeciwzapalne, na immuno-

modulujących kończąc. W odpowiednich warunkach może ona działać

również jako substancja blokująca enzymy lub receptory na zasadzie

interferencji. Zalicza się ją do inhibitorów kinaz tyrozynowych, ze względu

na jej powinowactwo do receptorów, z którymi kinazy te są związane [10].

Genisteina zaś jest organicznym związkiem z grupy izoflawonów. Jej

działanie związane z hamowaniem aktywności kinaz tyrozynowych powoduje

zaburzenie przekaźnictwa sygnałów związanych ze wzrostem komórek

oraz produkcją topoizomerazy II. Dzięki tym właściwościom genisteina

działa silnie cytostatycznie i cytotoksycznie na komórki nowotworowe

kierując je na drogę apoptozy [11].

Odkryte naturalne tyrfostiny okazały się jednak nieselektywnymi

inhibitorami, dlatego zaczęto opracowywać ich syntetyczne pochodne [9].

2.2.2. Tyrfostiny syntetyczne – nowoczesne metody chemioterapii

Pierwszym syntetycznym analogiem naturalnych tyrfostinów był

gefitynib, który specyficznie wiąże się do zmutowanej kinazy EGF. Kinaza

ta odpowiadać może za patomechanizm złośliwych nowotworów

nabłonkowych. Jednakże zaobserwowano, że po zakończonej terapii tym

chemioterapeutykiem, po pewnym czasie następował nawrót choroby. Jak

się później okazało się, pomimo swojej wysokiej specyficzności, lek ten

jest inhibitorem niekonstytutywnym. Oznacza to, że nie wiąże się on na

stałe z enzymami o podwyższonej aktywności [12]. Zmobilizowało to

zespoły naukowców do opracowania nowych syntetycznych inhibitorów,

które stale wiązałyby się z kinazami. W ten sposób został opracowany

erlotynib. Jego działanie warunkowało wysokie i konstytutywne powino-

wactwo do receptorów HER1 i HER2, inhibitor ten hamował także kinazy

niereceptorowe odpowiedzialne za tworzenie się przerzutów [7]. HER-1

i HER-2 są to receptory z grupy receptorów ludzkiego czynnika wzrostu

naskórka. HER-1 i HER-2 znajdują się na powierzchni wielu rodzajów

komórek i warunkują ich reakcje na określone czynniki wzrostu [13]. Ich

aktywność zależy od m.in. transformującego czynnika wzrostu

(transforming growth factor, TGF). Nadekspresja receptorów z tej grupy

może więc prowadzić do nadmiernej proliferacji komórek [14]. Często ich

zwiększona aktywność jest związana z patomechanizmem nowotworu



23

piersi. Gefitynib oraz erlotynib, pomimo swojego wysokiego potencjału

przeciwnowotworowego, okazały się być inhibitorami odwracalnymi,

a więc pomimo, iż wiązały się z kinazami na stałe, po pewnym czasie

mogły zostać odłączone lub zdegradowane. Dlatego naukowcy opracowali

lek, kanertynib, który nieodwracalnie wiązał się do specyficznych

enzymów. Dopiero tak opracowany lek gwarantował najdłuższy biolo-

giczny okres półtrwania substancji czynnej, a co za tym idzie najwyższą

skuteczność leczenia nowotworów, których patomechanizm jest ściśle

zależny od nadekspresji kinaz tyrozynowych [8, 15].

3. Cyklooksygenaza

Kolejnym enzymem, który ulega nadekspresji w komórkach nowo-

tworowych i może być celem terapii, jest cyklooksygenaza, a ściślej – jej

izoforma 2. Zarówno charakterystyka i aktywność, jak również udział tego

enzymu w nowotworzeniu i możliwość stosowania leków skierowanych

przeciwko niemu zostaną omówione w poniższym rozdziale.

3.1. Informacje ogólne

3.1.1. Charakterystyka i aktywność cyklooksygenazy

Cyklooksygenazy (EC 1.14.99.1) to rodzina enzymów o aktywności

mieloperoksydaz, zlokalizowanych na retikulum edoplazmatycznym oraz

błonie jądrowej. Enzymy te, zwane inaczej syntazami prostaglandyn,

katalizują przekształcanie kwasu arachidonowego do prostaglandyn. Proces

ten zachodzi w dwóch etapach, co zostało przedstawione na Rys. 1.

W wyniku ich aktywności powstają: prostaglandyna D2 (PGD2), prosta-

glandyna E2 (PGE2), prostaglandyna F2α (PGF2α), prostaglandyna I2 (PGI2)

czy też tromboksan A2 (TXA2) [16, 17].

Cyklooksygenaza występuje w trzech izoformach: COX-1, COX-2 oraz

COX-3. Izoforma 1, konstytutywnie aktywna i wykazująca stały, niski

poziom w komórkach, zaliczana jest do grupy „housekeeping enzymes”,

czyli enzymów niezmiernie ważnych w prawidłowym funkcjonowaniu

podstawowych procesów w organizmie. COX-3, będąca wariantem

splicingu COX-1, nie występuje u człowieka, aktywna jest w mózgu

i rdzeniu kręgowym psów [16, 17]. COX-2 jest izoformą indukowalną,

pobudzaną przez czynniki wzrostu i cytokiny prozapalne, jak również

indukowalną syntezę tlenku azotu (iNOS, NOS2). Izoforma ta bierze udział

w powstawaniu stanu zapalnego i kancerogenezie [16‚19].


24

Rys. 1. Schemat przedstawiający aktywność enzymatyczną cyklooksygenazy [opracowanie

własne] Kwas arachidonowy w wyniku aktywności fosfolipazy A2 uwolniony zostaje

z błony komórkowej. Następnie przekształcany jest do prostaglandyny G2, co katalizowane

jest przez cyklooksygenazę. Prostaglandyna G2 zostaje przekształcona przez peroksydazę do prostaglandyny H2, z której powstać mogą prostaglandyny: D2, E2, F2α, I2 oraz

tromboksan A2 PLA2 – fosfolipaza A2, COX – cyklooksygenaza, PG – prostaglandyny,

TXA2 – tromboksan A2 [16, 17]

3.1.2. Udział COX-2 w nowotworzeniu

Cyklooksygenaza-2 jest przede wszystkim mediatorem stanu zapalnego.

Bierze także udział w procesie kancerogenezy. Jej nadekspresja prowadzić

może do rozwoju nowotworu na każdym etapie: inicjacji, promocji

i progresji. Zarówno sam enzym, jak i produkty jego aktywności,

w szczególności PGE2, promować mogą transformację nowotworową

poprzez zaburzenie cyklu komórkowego czy indukcję czynników

wzrostowych [16, 17, 20]. Zainicjowane komórki mogą dalej się dzielić

i powielać swój fenotyp dzięki promocji proliferacji oraz hamowania

apoptozy [16‚19]. Rozwojowi nowotworu sprzyja także indukcja

immunosupresji przez prostaglandyny. Dochodzi do niej w wyniku

promocji powstawania komórek immunokompetentnych typowych dla

nowotworu (np. makrofagów M2) oraz hamowania aktywności komórek

o działaniu przeciwnowotworowym (np. komórek NK (Natural Killers))

[17, 21]. Indukcji ulegają także MMPs (metaloproteinazy macierzy



25

zewnątrzkomórkowej), które, wytrawiając macierz, „torują” drogę komórkom

nowotworowym. W połączeniu z indukcją przez COX-2 i PGs angio-

genezy, prowadzić to może do metastaz [16-19, 21]. Wykazano, iż stopień

ekspresji COX-2 jest istotnie powiązany ze stadium rozwoju nowotworu

[21]. Aczkolwiek sama nadekspresja COX-2 nie prowadzi do powstania

nowotworu, niezbędne jest zaistnienie również innych zjawisk [33].

Cyklooksygenaza oraz produkowane w wyniku jej aktywności prosta-

glandyny aktywować lub hamować mogą różne szlaki molekularne, które,

obok samego enzymu, mogą być celem terapii przeciwnowotworowych.

3.2. Terapie skierowanie przeciwko COX-2

Cyklooksygenaza-2 bierze udział w wielu szlakach molekularnych,

dlatego terapie, jak i stosowane w nich inhibitory, mogą być celowane

zarówno w sam enzym, jak również w cząsteczki przez niego aktywowane.

Daje to więcej możliwości opracowywania skutecznych terapii. Niektóre

z tych cząsteczek zostały dokładniej opisane w rozdziałach 2. i 4.

Wpływ COX-2 na określone szlaki molekularne wraz z lekami

i substancjami hamującymi je został przedstawiony na Rys. 2., natomiast

ich opis w poniższym podrozdziale.

Rys. 2. Wpływ cyklooksygenazy-2 na szlaki molekularne wraz z efektem inhibicji tych szlaków

przez określone substancje [opracowanie własne] COX – cyklooksygenaza; NF-κB – czynnik

jądrowy-κB; EGFR – receptor czynnika wzrostu naskórka; HER-2 – receptor kinazy tyrozynowej erbB2; JAK/STAT – szlak JAK/STAT; PKA – kinaza białkowa A; PKC – kinaza białkowa C;

Wnt – szlak Wnt/β-katenina; NLPZ – niesteroidowe leki przeciwzapalne; EKI-785 – inhibitor

receptora EGFR; HS7 – frakcja wyizolowana z grzyba Taiwanofungus camphoratus;

(+) – aktywacja lub stymulacja; (–) - inhibicja


26

3.2.1. COX-2

W toku badań nad COX-2 zastosowano inhibitory, różniące się

mechanizmem działania. Inhibitory cyklooksygenazy (zarówno selektywne,

jak i nieselektywne), wykazały efekt hamowania wzrostu nowotworu.

Nieselektywne inhibitory, takie jak niesteroidowe leki przeciwzapalne

(NLPZ; np. aspiryna, ibuprofen, NS-398) oraz selektywne inhibitoryCOX-

2 (np. Celecoxib, Apricoxib, artesunian) odwracały efekty kancerogenne

enzymu – hamowały proliferację i promowały apoptozę, jak również

hamowały przejście epitelialno-mezenchymalne (epithelial-mesenchymal

transition, EMT),czyli nabycie fenotypu migracyjnego [22‚25]. Pochodne

NLPZ, które nie posiadały bezpośredniej aktywności inhibicji COX-2

(np. Exisulind), wykazywały tzw. mechanizm przeciwnowotworowy

niezależny od COX-2, zachodzący prawdopodobnie poprzez hamowanie

szlaku NF-κB, ułatwienie śmierci komórkowej wywoływanej przez białko

p53 i inne [22]. Inhibitory cyklooksygenazy-2 mogą także hamować aktyw-

ność telomerazy. Wykazano również przeciwnowotworowe właściwości Cele-

coxibu przejawiane poprzez zatrzymanie cyklu komórkowego [22, 26‚29].

Stosowanie NLPZ i selektywnych inhibitorów COX-2 ponadto odwraca

efekt immunosupresji. Hamuje aktywność pro-nowotworowych

makrofagów M2, jednocześnie promując aktywność przeciwnowo-

tworowych limfocytów T cytotoksycznych, komórek NK czy komórek

dendrytycznych (DC) [17].

3.2.2. Szlak NF-κB

Czynnik NF-κB w formie nieaktywnej związany jest ze swoim

inhibitorem, IκB. Aktywacja tego kompleksu zachodzi poprzez kinazę

IKK. Kinaza, po związaniu się z aktywatorem, np. TNF-α, fosforyluje IκB,

co prowadzi do jego odłączenia, ubikwitynacji i degradacji w proteasomie.

Aktywna forma NF-κB trafia do jądra komórkowego, gdzie powoduje

aktywację określonych genów. W przypadku komórek nowotworowych,

dochodzi do permanentnego odłączenia się inhibitora i konstytutywnej

aktywacji NF-κB. Aktywuje on wtedy geny związane z proliferacją,

hamowaniem apoptozy czy angiogenezą, przyczyniając się do kancero-

genezy [18, 19, 30].

Wykazano, iż Nexrutyna hamowała szlak NF-κB, a w rezultacie także

ekspresję genów przez czynnik ten pobudzanych [31]. Inhibicję wobec tego

czynnika wykazywał także partenolid [32].



27

3.2.3. EGFR

Receptor czynnika wzrostu naskórka (epidermal growth factor receptor, EGFR) promuje proliferację i zwiększa przeżywalność komórek. Nadekspresja tego czynnika prowadzić więc może do wzrostu nowotworu i ucieczkę przed apoptozą [20]. Li i in. wykazali, iż COX-2 i EGFR są ze sobą powiązane w przypadku raka jelita grubego, jak również ich interakcje powodują powstawanie polipów w jelicie i ich transformację do nowotworu. Okazało się bowiem, iż COX-2, w sposób bezpośredni oraz pośredni (poprzez PGE2) może powodować nadekspresję kinazy EGFR. Ta z kolei wzmaga aktywność cyklooksygenazy-2, dochodzi więc do wzajemnego pobudzenia aktywności obu czynników [33].

Jednym z inhibitorów receptora EGFR jest EKI-785. Jest to drobno-cząsteczkowy związek, który wiąże się do receptora EFG w miejscu regionu wiążącego ATP i tym samym hamuje aktywność kinazową. Ponadto, zastosowanie EKI-785 w połączeniu z rapamycyną (inhibitorem szlaku mTOR) wykazało efekt synergistyczny, hamując wzrost komórek glejaka w badaniach in vitro [34].

Do zahamowania nadekspresji EGFR stosowano także aspirynę [33].

3.2.4. HER-2

HER-2, białko o aktywności kinazy tyrozynowej, bierze udział w regulacji wzrostu komórek, podziałów i różnicowania. Nadekspresja jego genu, ERBB2, prowadzi do transformacji nowotworowej. Wykazano, iż w wyniku podobieństwa HER-2 do EGFR, nawet w nieobecności ligandów może dojść do aktywacji EGFR i tym samym – kancerogenezy [21]. Wykazano także, iż HER-2, poprzez szlak Ras i dalej szlak MAPK, stymuluje aktywację COX-2. Wzmaga także syntezę i gromadzenie PGE2 w komórkach w badaniach in vitro [35]. HER-2 i COX-2 ulegają wzajemnej aktywacji w niektórych nowotworach (piersi, płuca, żołądka czy jelita grubego), co wzmaga proces kancerogenezy [36, 37]. Molekuła ta została dokładniej opisana w podrozdziale 2.2.2. Do terapii celowanej przeciwko HER, oprócz opisanych wcześniej tyrfostin, wykorzystywany jest m.in. Trastuzumab (Herceptyna), będący swoistym dla tego białka przeciwciałem monoklonalnym [38].

3.2.5. Inne szlaki

Oprócz opisanych w powyższym rozdziale szlaków molekularnych, wiele innych jest kontrolowanych przez COX-2 i dokonano prób ich inhibicji. Należą do nich m.in.: JAK/STAT (hamowany przez berberynę), PKA (hamowany przez Trametinib), PKC (hamowany przez kwas pseudolarowy b wyizolowany modrzewia japońskiego), Wnt/β-katenina (hamowany przez frakcję HS7 z grzyba Taiwanofungus camphoratus) [39‚42].


28

4. Metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej

Metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej stanowią grupę

zależnych od atomu cynku endopeptydaz, których główną funkcją jest

remodeling macierzy zewnątrzkomórkowej. Odgrywają one istotną rolę

w procesie migracji komórek prawidłowych oraz w procesie przerzutu

nowotworowego [43]. Enymy te zdolne są przede wszystkim do degradacji

składników macierzy zewnątrzkomórkowej, a w swoim centrum aktywnym

zawierają atom cynku. Syntetyzowane są w formie preproenzymu

i uwalniane jako proenzymy [44].

Optimum działania metaloproteinazy wykazują w środowisku o pH

obojętnym lub lekko kwaśnym oraz w obecności jonów wapnia. Pierwszym

opisanym tego typu enzymem była kolagenaza 1 odkryta w ogonie kijanki

w 1962 roku przez Charlesa Lapierre’a oraz Jerome Grossa [55].

Dotychczas opisano 28 metaloproteinaz, przypisując im odpowiednie

numery klasyfikacyjne. U człowieka opisano 22 MMPs. Podział

metaloproteinaz na podgrupy oparty jest głownie o swoistość substratową,

a także o różnice w strukturze czwartorzędowej białek [45]. Podział ten

został przedstawiony w tabeli 1.



29

Tab. 1. Podział metaloproteinaz macierzy zewnątrzkomórkowych na podgrupy [opracowanie

własne na podstawie [44]]

Grupa Metaloproteinaza

Kolagenazy

MMP-1

MMP-8

MMP-13

Żelatynazy MMP-2

MMP-9

Stromelizyny

MMP-3

MMP-10

MMP-11

Błonowe MMPs

MMP-14

MMP-15

MMP-16

MMP-17

MMP-24

MMP-25

Matrylizyny MMP-7

MMP-26

Enamelizyny MMP-20

Inne

MMP-19

MMP-21

MMP-23A

MMP-23B

MMP-27

MMP-28

4.1. Budowa metaloproteinaz macierzy zewnątrzkomórkowej

MMPs posiadają budowę wielodomenową. Składają się z domeny

katalitycznej i N-terminalnej prodomeny. Często występującymi

elementami budowy są C-terminalna domena hemopeksyny oraz elastyczny

łącznik łączący ją z domeną katalityczną. Metaloproteinazy błonowe

posiadają także domenę transmembranową, kotwiczącą je w błonie

komórkowej. Niektóre MMPs, MMP-7 czy MMP-28, pozbawione są

domeny hemopeksyny, a te bardziej złożone posiadają także dodatkowe

domeny [46, 47, 54].

Domena katalityczna odpowiadająca za aktywność proteolityczną

enzymu zbudowana jest z trzech α-helis oraz pięciu β-harmonijek

połączonych za pomocą pętli. W domenie tej znajdują się dwa atomy


30

cynku, z których jeden pełni rolę strukturalną, drugi zaś katalityczną oraz

najczęściej trzy jony wapniowe. W miejscu katalitycznym atom cynku

katalizowany jest poprzez trzy histydyny natomiast jego czwartym

ligandem jest cząsteczka wody [45].

Prodomena zawiera propeptyd, który odpowiada za utrzymanie enzymu

w stanie nieaktywnym. [50].

Domena hemopeksyny zawdzięcza swoja nazwę analogii do struktury

hemopeksyny (białka transportującego hem). Jest ona konieczna do

prawidłowego rozpoznawania substratów enzymu. Inną ważną funkcją tej

domeny jest zdolność do wiązania tkankowego inhibitora metaloproteinaz

TIMP [54].

Łącznik zbudowany z 15-65 aminokwasów, odpowiedzialny jest za

utrzymanie stabilnej struktury enzymu, odgrywa również istotną rolę przy

degradacji niektórych substratów metaloproteinaz. Wykazano również, iż

łącznik może uczestniczyć w ułatwianiu degradacji kolagenu łącząc się

z nim [52, 54].

4.2. Aktywacja MMPs

Aktywacja metaloproteinaz jest procesem złożonym i wieloetapowym.

W celu aktywacji enzymu usuwana jest prodomena, przez co centrum

aktywne ulega odsłonięciu. Aktywacja enzymu może zachodzić dzięki

wielu czynnikom. Należą do nich np. czynniki chemiczne (SDS, HgCl2),

zmiany mikrośrodowiska reakcji (zmiany pH, temperatury), a także udział

innych enzymów proteolitycznych [50].

Część metaloproteinaz zawierających swoistą sekwencję w okolicy

końca C-prodomeny aktywowana jest wewnątrzkomórkowo w aparacie

Golgiego. Ten rodzaj aktywacji obecny jest u wszystkich przedstawicieli

błonowych MMPs, a także u MMP-21 [51].

Inny rodzaj aktywacji, aktywacja zewnątrzkomórkowa, zachodzi przy

udziale transbłonowych MMP . Najlepiej poznanym procesem jest

aktywacja MMP-2. Uczestniczy w niej kompleks potrójny MT1-MMP,

TIMP-2 (tkankowy inhibitor metaloproteinaz) oraz pro-MMP-2. Aktywacja

ta jest procesem wielostopniowym. W pierwszym etapie dochodzi do

dimeryzacji MT1-MMP. Następnie do jednego z monomerów przyłącza się

TIMP-2, wiążąc się N-terminalnym końcem. Drugi koniec pozostaje wolny

i stanowi receptor dla pro-MMP-2 [51].

4.3. Rola metaloproteinaz macierzy zewnątrzkomórkowej

Główną rolą metaloproteinaz, w warunkach fizjologicznych, jest

degradacja białek macierzy pozakomórkowej (extracellular matrix, ECM):

kolagenu, fibronektyny, laminy, czy proteoglikanów. Ułatwia to migrację



31

komórek oraz regulację aktywności niektórych czynników wzrostu.

Metaloproteinazy w prawidłowych warunkach odpowiedzialne są za regulację

procesów rozwojowych, kontrolują procesy angiogenezy i gojenia się ran oraz

uczestniczą w tworzeniu receptorów immunologicznych [52].

Metaloproteinazy macierzy uczestniczą również w wielu procesach

patologicznych. W przypadku nowotworów metaloproteinazy odgrywają

kluczową rolę w procesie przerzutowania, ze względu na umożliwienie

komórkom migracji. Warunkiem niezbędnym jest degradacja macierzy

przez MMPs. Komórki nowotworowe jelita grubego wytwarzają przede

wszystkim MMP7, wpływające na wczesne etapy rozwoju guza takie jak

proliferacja, apoptoza i migracja [51].

W przypadku nowotworów litych, w tkance nowotworowej stwierdzono

zwiększoną aktywność niektórych MMP. Zwiększony poziom metalo-

proteinazy koreluje z zaawansowaniem stadium choroby oraz przeży-

walnością pacjentów. MMP9 w raku jelita grubego może służyć jako

marker diagnostyczny, opisujący stopień zaawansowania choroby [48].

Zwiększoną aktywność metaloproteinaz obserwuje się również

w przypadku raka trzustki. Zaobserwowano współzależność pomiędzy

metaloproteinazami MT-MMP i MMP-2 a zwiększeniem włóknienia

w okolicy guza [53].

Wpływ metaloproteinaz jest szczególnie istotny w przypadku nowo-

tworów o dobrym unaczynieniu i wysokim tempie angiogenezy, np. glejaków.

Przyczyniają się one do rozwoju nowotworów i rozrostu guza [49].

4.4. Terapie skierowane przeciwko MMP

Wpływ MMPs jest zmienny w zależności od stopnia zaawansowania

nowotworu. Jednak największą rolę enzymy te odgrywają w jego

początkowych stadiach rozwoju, gdzie tłumienie aktywności metalo-

proteinaz mogło przyczynić się do zatrzymania rozrostu guza i jego

degradacji. Jednakże w przypadku w pełni unaczynionego guza aktywność

tych enzymów nie jest niezbędna do przeżycia. Opisano pozytywne działanie

syntetycznych inhibitorów metaloproteinaz w przypadku raka prostaty. Ich

działanie polegało na chelatowaniu atomu cynku znajdującego się w centrum

aktywnym MMP. Dodatkowo inny syntetyczny inhibitor batimastat

wykazywał pożądane właściwości w testach in vitro, charakteryzował się on

jednak dużą toksycznością wobec komórek prawidłowych [52].

U pacjentów w zaawansowanym stopniu nowotworu wiele dotych-

czasowych terapii przeciwko metaloproteinazom nie wykazało ocze-

kiwanych rezultatów [51].


32

5. Podsumowanie

Nowotwory stanową obecnie ważny społecznie problem medyczny.

Współczesna medycyna dąży do ukierunkowanego leczenia konkretnych

schorzeń. Przykładem takiego działania jest próba stworzenia

spersonalizowanych terapii przeciwnowotworowych. Ważnym i znaczącym

elementem terapii celowanej może być wykorzystanie swoistych

inhibitorów enzymów, których wzmożoną aktywność obserwuje się

w chorobie nowotworowej. Wykorzystanie inhibitorów enzymatycznych

daje możliwość zablokowania konkretnych szlaków metabolicznych, co

daje podwaliny do nowego, bardziej efektywnego leczenia. Niestety ten cel

terapeutyczny może zostać osiągnięty tylko w odpowiednich stadiach

nowotworowych, gdzie aktywność enzymów jest największa. W innych

bardziej zaawansowanych stadiach klinicznych pozytywny wpływ

inhibitorów enzymatycznych może być zbyt mały lub całkowicie

niewidoczny. Badania nad swoistością terapii nowotworowej, także

z wykorzystaniem inhibitorów enzymatycznych, wymagają zatem odpo-

wiedniej wiedzy klinicznej, a także mogą stanowić obiekt zainteresowania

do dalszych badań związanych z powstawaniem i rozrostem nowotworu.

Literatura

1. Kolibaba K. S., Druker B. J., Protein tyrosine kinases and cancer., Biochimica

et Biophysica Acta, 1333 (1997), s. 217-248

2. Levitzki A., Protein kinase inhibitors as novel therapeutic agents,

Pharmacology & Therapeutics, 82 (1999), s. 231-239

3. Zografos G., Domeyer P., Inhibitory kinazy tyrozynowej

i przekaźnictwosyganału: mechanizmy molekularne w aspekcie najnowszych

danych, Współczesna Onkologia, 9 (2005), s. 43-47

4. Blume-Jensen P., Hunter T., Oncogenic kinase signaling, Nature, 411 (2001),

s. 355-365

5. Wiczyńska B., Rolski J., Terapia celowana .Część I. Mechanizmy przesyłania

sygnałów przy udziale receptorów o aktywności kinazy tyrozynowej,

Współczesna onkologia 11(4) (2007), s. 331-336

6. Hubbard S. R., Till J. H., Protein tyrosine kinase structure and function,

Annual Review of Biochemistry, 69 (2000), s. 373-398

7. Fuchs I., Vorsteher N., Buhler H., The prognostic significance of human

epidermal growth factor receptor correlations in squamous cell cervical

carcinoma, Anticancer Research, 27 (2007), s. 959-63

8. Bennasroune A., Gardin A., Aunis D., Cremel G., Hubert P., Tyrosine kinase

receptors as attractive targets of cancer therapy, Critical Reviews in

Oncology/Hematology, 50 (2004), s. 23-38

9. Klein A., Kisielewska J., Tyrfostiny – drobnoczą- steczkowe inhibitory kinaz

tyrozynowych, Postępy Biologii Komórki, 34 (2008), s. 477-494



33

10. Kobylińska A., Janas K. M., Prozdrowotna rola kwercetyny obecnej w diecie

człowieka, Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 69 (2015), s. 51-62

11. Morris S. M., Akerman G. S., Warbritton A. R., Patton R. E., Effect of dietary

genistein on cell replication indices in C57BL6 mice, Cancer Letters, 195

(2003), s. 139-45

12. Lazzaral M., Lane K., Chan R., Impaired SHP2-Mediated Extracellular

Signal-Regulated Kinase Activation Contributes to Gefitinib Sensitivity

of Lung Cancer Cells with Epidermal Growth Factor Receptor–Activating

Mutations,Cancer Research, 70 (2010), s. 3843-3850

13. Ménard S., Tagliabue E., Campiglio M., Pupa S. M., Role of HER2 gene

overexpression in breast carcinoma, Journal of Cellular Physiology,

281 (2000), s. 150-162

14. Matt P., Schoenhoff F., Habashi J., Holm T., Van Erp C., Loch D., Carlson O.

D., Griswold B. F., Fu Q., De Backer J., Loeys B., Huso D. L., McDonnell N.

B., Van Eyk J. E., Dietz H. C., Circulating transforming growth factor-{beta}

in Marfan syndrome, Circulation, 120 (2009), s. 526-32

15. Barker A. J., Gibson K. H., Grundy W., Godfrey S. A., Barlow J. J., Studies

leading to the identification of ZD1839 (Iressa): an orally active, selective

epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor target to the

treatment of cancer, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 11 (2001),

s. 1911-1914

16. Sobolewski C., Cerella C., Discato M., Ghibelli M., Diederich M., The role

of cyclooxygenase-2 in cell proliferation and cell death in human

malignancies, International Journal of Cell Biology, 2010 (2010)

17. Liu B., Qu L., Yan S., Cyclooxygenase-2 promotes tumor growth

and suppresses tumor immunity, Cancer Cell International, 15 (2015)

18. Klampfer L., Cytokines, inflammation and colon cancer, Current Cancer Drug

Targets, 11(4) (2011), s. 451-464

19. Schetter A. J., Heegaard N. H. H., Harris C. C., Inflammation and cancer:

interweaving microRNA, free radical, cytokine and p53 pathways,

Carcinogenesis, 31(1) (2010), s. 37-49

20. Roberts R. B., Min L., Washington M. K., Olsen S. J., Settle S. H., Coffey R.

J., Threadgill D. W., Importance of epidermal growth factor receptor

signaling in establishment of adenomas and maintenance of carcinomas

during intestinal tumorigenesis, Proceedings of the National Academy

of Sciences of the United States of America, 99(3) (2002), s.1521-1526

21. Wu Q. B., Sun G. P., Expression of COX-2 and HER-2 in colorectal cancer

and their correlation, World Journal of Gastroenterology, 21(20) (2015),

s. 6206-6214

22. Wang Z., Chen J. Q., Liu J. L., COX-2 Inhibitors and Gastric Cancer,

Gastroenterology Research and Practice, 2014 (2014)

23. John-Aryankalayil M., Palayoor S. T., Cerna D., Falduto M. T., Magnuson S.

R., Coleman C. N., NS-398, ibuprofen, and cyclooxygenase-2 RNA interference

produce significantly different gene expression profiles in prostate cancer cells,

Molecular Cancer Therapeutics, 8(1) (2009), s. 261-273


34

24. Kirane A., Toombs J. E., Ostapoff K., Carbon J. G., Zaknoen S., Braunfeld J.,

Schwarz R. E., Burrows F. J., Brekken R. A., Apricoxib, a novel inhibitor

of COX-2, markedly improves standard therapy response in molecularly

defined models of pancreatic cancer, Clinical Cancer Research, 18(18) (2012),

s. 5031-5042

25. Zhang P., Luo H. S., Li M., Tan S. Y., Artesunate inhibits the growth and

induces apoptosis of human gastric cancer cells by downregulating COX-2,

OncoTargets and Therapy, 8 (2015), s. 845-854

26. Wang R., Guo L., Wang P.., Yang W., Lu Y., Huang Z., Tang C.,

Chemoprevention of cancers in gastrointestinal tract with cyclooxygenase

2 inhibitors, Current Pharmaceutical Design, 19(1) (2013), s. 115-125

27. Maier T. J., Schilling K., Schmidt R., Geisslinger G., Grösch S.,

Cyclooxygenase-2 (COX-2)-dependent and -independent anticarcinogenic

effects of celecoxib in human colon carcinoma cells, Biochemical

Pharmacology, 67(8) (2004), s. 1469-1478

28. Funakoshi-Tago M., Shimizu T., Tago K., Nakamura M., Itoh H., Sonoda Y.,

Kasahara T., Celecoxib potently inhibits TNFalpha-induced nuclear

translocation and activation of NF-kappaB, Biochemical Pharmacology,

76(5) (2008), s. 662-671

29. Liu H. F., Hsiao P. W., Chao J. I., Celecoxib induces p53-PUMA pathway

for apoptosis in human colorectal cancer cells, Chemico-Biological

Interactions, 176(1) (2008), s. 48-57

30. Grivennikov S. I., Inflammation and colorectal cancer: colitis-associated

neoplasia, Seminars in Immunopathology, 35(2) (2013), s. 229-242

31. Gong J., Xie J., Bedolla R., Rivas P., Chakravarthy D., Freeman J. W.,

Reddick R., Kopetz S., Peterson A., Wang H., Fischer S. M., Kumar A. P.,

Combined targeting of STAT3/NF-κB/COX-2/EP4 for effective management

of pancreatic cancer, Clinical Cancer Research, 20(5) (2014), s. 1259-1273

32. Liao K., Xia B., Zhuang Q. Y., Hou M. J., Zhang Y. J., Luo B., Qiu Y., Gao

Y. F., Li X. J., Chen H. F., Ling W. H., He C. Y., Huang Y. J., Lin Y. C., Lin

Z. N., Parthenolide Inhibits Cancer Stem-Like Side Population of

Nasopharyngeal Carcinoma Cells via Suppression of the NF-κB/COX-2

Pathway, Theranostics, 5(3) (2015), s. 302-321

33. Li H., Zhu F., Boardman L. A., Wang L., Oi N., Liu K., Li X., Fu Y., Limburg

P.J., Bode A. M., Dong Z., Aspirin Prevents Colorectal Cancer by

Normalizing EGFR Expression, EBioMedicine, 2(5) (2015), s. 447-455

34. Rao R. D., Mladek A. C., Lamont J. D., Goble J. M., Erlichman C., James C.

D., Sarkaria J. N., Disruption of parallel and converging signaling pathways

contributes to the synergistic antitumor effects of simultaneous mTOR and

EGFR inhibition in GBM cells, Neoplasia, 7(10) (2005), 921-929

35. Okano H., Shinohara H., Miyamoto A., Takaori K., Tanigawa N.,

Concomitant Overexpression of Cyclooxygenase-2 in HER-2–Positive on

Smad4-Reduced Human Gastric Carcinomas Is Associated with a Poor

Patient Outcome, Clinical Cancer Research, 10 (2004), s. 6938-6945

36. Su J. L , Shih J. Y., Yen M. L, Jeng Y. M, Chang C. C, Hsieh C. Y, Wei L. H,

Yang P. C., Kuo M. L., Cyclooxygenase-2 induces EP1- and HER-2/Neu-



35

dependent vascular endothelial growth factor-C up-regulation: a novel

mechanism of lymphangiogenesis in lung adenocarcinoma, Cancer Research,

64 (2004), s. 554-564

37. Lucarelli A. P., Martins M. M., Montor W., Oliveira V., Galvão M. A. L.,

Piato S., Cyclooxygenase-2 and human epidermal growth factor receptor type

2 (HER-2) expression simultaneously in invasive and in situ breast ductal

carcinoma, Sao Paulo Medical Journal, 129(6) (2011), s. 371-379

38. Kavanagh D. O., Chambers G., O’ Grady L., Barry K. M., Waldron R. P.,

Bennani F., Eustace P. W., Tobbia I., Is overexpression of HER-2 a predictor

of prognosis in colorectal cancer?, BMC Cancer, 9(1) (2009)

39. Liu X., Ji Q., Ye N., Sui H., Zhou L., Zhu H., Fan Z., Cai J., Li Q., Berberine

Inhibits Invasion and Metastasis of Colorectal Cancer Cells via COX-2/PGE2

Mediated JAK2/STAT3 Signaling Pathway, PLoS One, 10(5) (2015)

40. Fujishita T., Kajino-Sakamoto R., Kojima Y., Taketo M.M., Aoki M.,

Antitumor activity of the MEK inhibitor trametinib on intestinal polyp

formation in Apc(Δ716) mice involves stromal COX-2, Cancer Science, 106(6)

(2015), s. 692-699

41. Sun Q., Li Y., The inhibitory effect of pseudolaric acid B on gastric cancer

and multidrug resistance via Cox-2/PKC-α/P-gp pathway, PLoS One, 9(9)

(2014)

42. Yeh C. T., Yao C. J., Yan J. L., Chuang S. E., Lee L. M., Chen C. M., Li C.

H., Lai G. M., Apoptotic Cell Death and Inhibition of Wnt/β-Catenin Signaling

Pathway in Human Colon Cancer Cells by an Active Fraction (HS7) from

Taiwanofungus camphorates, Evidence-based Complementary and Alternative

Medicine, 2011 (2011), s. 1-13

43. Malemud C. J., Matrix metalloproteinases (MMPs) in health and disease:

an overview. Frontiers in bioscience: a journal and virtual library, 11 (2005)

s. 1696-1701

44. Kwiatkowski P., Godlewski J., Śliwińska-Jewsiewicka A., Kmieć Z.,

Rola Metaloproteinaz Macierzy Zewnątrzkomórkowej w procesie inwazji

nowotworu. Polish Annals of Medicine15(1).,(2008)

45. Wysocka, A., Gizinski, S., Lechowski, R., Metaloproteinazy macierzy-ich

struktura oraz znaczenie, Życie Weterynaryjne, 89 (2014)

46. Verma R. P., Hansch C. Matrix metalloproteinases (MMPs): Chemical–

biological functions and (Q)SARs, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 15(6)

(2007), s. 2223-2268

47. Śliwowska I., Kopczyński Z., Metaloproteinazy macierzy

zewnątrzkomórkowej – charakterystyka biochemiczna i kliniczna wartość

oznaczania u chorych na raka piersi, Współczesna Onkologia, 9(8) (2005),

s. 327-335

48. Zucker S.,Vacirca J., Role of matrix metalloproteinases(MMPs) in colorectal

cancer. Cancer and Metastasis Reviews, 23(1-2), (2004), s. 101-117

49. Łapka A., Drąg J., Goździalska A., Jaśkiewicz J., Metaloproteinazy macierzy

pozakomórkowej w glejakach.Postępy Psychiatrii i Neurologii, 17(3), (2008),

s.207-211


36

50. Viappiani S., Nicolescu A. C., Holt A., Sawicki G., Crawford B. D., León H.,

Schulz R., Activation and modulation of 72kDa matrix metalloproteinase-2

by peroxynitrite and glutathione.Biochemical pharmacology, 77(5) (2009),

s. 826-834

51. Lipka D., Boratyński J., Metaloproteinazy MMP. Struktura i funkcja

Metalloproteinases. Structure and function., Journal cover, 69 (2015)

52. Gialeli C., Theocharis A. D., Karamanos N. K., Roles of matrix

metalloproteinases in cancer progression and their pharmacological

targeting, FeBS Journal, 278(1), (2011), s.16-27

53. Łukaszewicz M., Mroczko B., Szmitkowski M., Rola metaloproteinaz i ich

inhibitorów w raku trzustki The role of metalloproteinases and their inhibitors

in pancreatic cancer, Journal cover, 69, (2015)

54. Olszynski K., Zimowska M., Budowa i funkcja metaloproteinaz macierzy

zewnatrzkomórkowej. Postępy Biochemii, 1(55),(2009)

55. Gross J, Lapiere C., Collagenolytic activity in amphibian tissues: a tissue

culture assay, Proceedings of the National Academy of Sciences,48 (6),

(1962)s. 1014-1022



Nowotwór jest chorobą wieloczynnikową, w kancerogenezie uczestniczy więc duża pula

różnych czynników. Pewną część tej puli stanowią enzymy kontrolujące liczne procesy

metaboliczne i szlaki molekularne, a ulegające nadekspresji w komórkach nowotworowych.

Mnogość tych procesów daje możliwość celowania terapii przeciwnowotworowych w wiele punktów, zarówno przeciwko samym enzymom, jak iich szlakom efektorowym.

Opisane zostały trzy grupy enzymów, których nadekspresja przyczynia się do

kancerogenezy. Są to: kinazy tyrozynowe, cyklooksygenaza oraz metaloproteinazy macierzy

zewnątrzkomórkowej. Ujęte zostały właściwości tych cząsteczek, jak również leki i inhibitory wpływające na ich

aktywność – zarówno będące przedmiotem badań, jak i te wprowadzone w standardowych

terapiach przeciwnowotworowych.

Enzymes of significance in cancers and as potential targets in modern

anticancer therapies

Cancers are caused by many agents and actions. A lot of them are enzymes, controlling

numerous metabolic processes and molecular pathways. Those enzymes exhibit

upregulation in cancer cells. Multiplicity of processes controlled by them provides opportunity to target numerous points. Both the enzymes and molecules activated or induced

by them may be a target of anticancer therapies.

Three kinds of enzymes, which upregulation may lead to cancerogenesis, were described.

They are: tyrosine kinases, cyclooxygenase and matrix metalloproteinases. The enzymes’ properties and activity, as well as their inhibitors and drugs aimed at them,

were subject of this article.

37

Alina Owsiak1, Maria Misiorek

2, Ewa Żyracka

3

Enzymy antyoksydacyjne i inne białka obronne

w procesie starzenia

1. Wprowadzenie

Starzenie się organizmu ludzkiego jest jednym z najbardziej istotnych

problemów współczesności. Dzięki zrozumieniu mechanizmów, które

kierują tym procesem można byłoby zapobiegać przedwczesnej śmierci

organizmu, jak również przyczynić się do poprawy jakości jego życia.

Proces starzenia się jest bardzo złożony i zależy od wielu czynników,

zarówno wewnętrznych (na przykład – genetycznych), jak i zewnętrznych

(na przykład - zmian środowiskowych), które działają równocześnie i na

różnych poziomach organizacji organizmu wielokomórkowego [1‚3].

Organizm ludzki jako całość zaczyna się starzeć od 20-25 roku życia,

natomiast starzenie się poszczególnych narządów, układów komórkowych

czy w poszczególnych komórkach może mieć miejsce już na wcześ-

niejszych etapach życia człowieka. W wyniku starzenia się następuje

pogorszenie praktycznie wszystkich funkcji organizmu, co prowadzi do

jego śmierci [4].

W celu zrozumienia mechanizmów uczestniczących w procesie

starzenia się prowadzone są liczne badania nad wpływem jednego lub

wielu różnych czynników na przedłużenie życia organizmów.

Istnieje kilka teorii tłumaczących mechanizm procesu starzenia, wśród

których nadal istotne znaczenie ma teoria wolnorodnikowa. Teoria ta

została przedstawiona po raz pierwszy w 1956 roku przez gerontologa

Denhama Harmana. Głosi ona, że starzenie się organizmów jest wynikiem

powstawania w komórce ,,wolnych rodników tlenowych” jako produktów

ubocznych naturalnego metabolizmu tlenu, oraz ich niespecyficznych

reakcji z makrocząsteczkami komórkowymi [5]. Istotnym źródłem wolnych

rodników są mitochondria, a powstałym w komórce uszkodzeniom można

przynajmniej częściowo przeciwdziałać stosując w odpowiednich stęże-

niach antyoksydanty [6]. Wolne rodniki, a bardziej precyzyjnie reaktywne [email protected], Katedra Biochemii i Biologii Komórki, Wydział Biologiczno-

Rolniczy, Uniwersytet Rzeszowski, www.ur.edu.pl [email protected], Zakład Polimerów i Biopolimerów, Wydział Chemiczny, Politechnika Rzeszowska, www.prz.edu.pl [email protected], Katedra Biochemii i Biologii Komórki, Wydział Biologiczno-

Rolniczy, Uniwersytet Rzeszowski, www.ur.edu.pl

Alina Owsiak, Maria Misiorek, Ewa Żyracka

38

formy tlenu (RFT) wpływają przede wszystkim prooksydacyjnie na

strukturę, a co za tym idzie na funkcjonowanie molekuł komórkowych.

RFT posiadają wolny elektron na orbicie walencyjnej i w związku z tym są

wysoce reaktywne oraz niebezpieczne dla komórek. Do RFT zaliczamy

między innymi: tlen singletowy1O2, ozon O3, anionorodnik ponadtlenkowy

O2•-, rodnik wodoronadtlenkowy

•HO

-2, tlenek i ditlenek azotu NO

• i NO

•2,

bardzo reaktywny rodnik hydroksylowy •OH czy nadtlenek wodoru H2O2

(który nie jest wolnym rodnikiem, ale jest bardziej reaktywny od tlenu

w stanie tripletowym) [7]. W stężeniach fizjologicznych RFT mogą pełnić

funkcje sygnałowe [8]. Natomiast zwiększona synteza RFT lub brak

odpowiedniej obrony antyoksydacyjnej, czyli ,,zaburzenie równowagi

prooksydacyjno – antyoksydacyjnej w komórce w kierunku reakcji

utleniania” prowadzi do stresu oksydacyjnego [9]. Należy podkreślić,

że w komórkach organizmu istnieje permanentny stan stresu oksy-

dacyjnego, który prowadzi do akumulacji uszkodzeń makromolekuł, nawet

w warunkach fizjologicznych. W wyniku przystosowania się organizmów

do warunków tlenowych jak i powstających w komórce RFT powstał

szereg mechanizmów obronnych przed reaktywnymi formami tlenu [7]. Są

to enzymy antyoksydacyjne, które dekomponują RFT zanim dojdzie do

reakcji z makrocząsteczkami komórki. Jeżeli mimo ochronnego działania

enzymów dojdzie do zainicjowania reakcji wolnorodnikowej, komórka

dąży do jej przerwania lub zakończenia. Istotną rolę pełnią tutaj

niskocząsteczkowe antyoksydanty i witaminy. Powstałe w wyniku działania

RFT uszkodzenia biomolekuł są naprawiane lub usuwane w wyniku

działania enzymatycznych systemów naprawczych oraz przy zastosowaniu

niskocząsteczkowych antyoksydantów (na przykład glutationu) [7].

Badania nad procesem starzenia się są obecnie prowadzone na

organizmach modelowych, takich jak: małpa, mysz domowa (Mus

musculus), szczur, ryby (Danio rerio), muszka owocowa (Drosophila

melanogaster), nicień (Caenorhabditis elegans) i drożdże piekarskie

(Saccharomyces cerevisiae).

2. Enzymy antyoksydacyjne i inne białka obronne w procesie

starzenia się organizmów modelowych

W wyniku badań nad procesem starzenia się organizmów ewolucyjnie

oddalonych od człowieka w ich genomach odkryto geny zaangażowane

w wydłużanie życia. Stwierdzono wysoki stopień ich homologii z genami

człowieka (M. musculus – 68%, D. melanogaster – 32%, C. elegans 18%,

S. cerevisiae – 24%) [10]. Wiele z nich to geny kodujące białka

antyoksydacyjne, co jest zgodne z „teorią wolnorodnikową”.

Enzymy antyoksydacyjne i inne białka obronne w procesie starzenia

39

2.1. Dysmutazy ponadtlenkowe a dłuższe życie

Dysmutazy ponadtlenkowe (SOD, EC 1.15.1.1) na drodze dysmutacji

anionorodnika ponadtlenkowego wytwarzają nadtlenek wodoru i tlen

(Reakcja1).

gdzie: O2•- – anionorodnik ponadtlenkowy, SOD – dysmutaza ponad-

tlenkowa, H2O2 – nadtlenek wodoru, O2 – tlen

U organizmów prokariotycznych, pierwotniaków, glonów i niektórych

roślin (na przykład z rodziny krzyżowych) występuje najstarsza filo-

genetycznie dysmutaza ponadtlenkowa (FeSOD), która w swoim miejscu

katalitycznym zawiera żelazo [7]. W komórkach ssaków występują trzy

rodzaje dysmutaz ponadtlenkowych, które do swojej aktywności kata-

litycznej wymagają jonów miedzi i cynku (cytoplazmatyczna i występująca

w przestrzeni międzybłonowej mitochondriów Cu,ZnSOD-1 lub SOD-1,

i zewnątrzkomórkowa EC-SOD lub SOD-3) oraz manganu (MnSOD lub

SOD-2). U szczurów wykryto MnSOD w macierzy mitochondrialnej [11].

U organizmów wielokomórkowych w przestrzeni międzybłonowej

pozakomórkowa dysmutaza ponadtlenkowa EC-SOD, zawiera jony miedzi

i cynku, lecz nie jest homologiczna do Cu,ZnSOD-1 [7]. Wykryto, że 0,2%

tlenu przetwarzanego przez mitochondria w łańcuchu oddechowym zostaje

zredukowane do anionorodnika ponadtlenkowego i przypuszcza się, że

ulega on dysmutacji przez mitochondrialne dysmutazy ponadtlenkowe

MnSOD i Cu,ZnSOD-1 [12, 13].

Badania na ludziach wykazały, że dysmutazy ponadtlenkowe są

szczególnie ważne w momentach wzmożonej produkcji RTF, na przykład

w stanach zapalnych i podczas starzenia się mięśni szkieletowych [14].

Zaburzenia aktywności SOD-1 spowodowane mutacjami przyczyniają się

do uszkodzeń neuronów motorycznych w stwardnieniu zanikowym

bocznym (SLA) jak również mogą prowadzić do choroby Alzheimera [15, 16].

Brak aktywnej SOD-1 u myszy powoduje zaburzenia rozrodu

(u osobników żeńskich), bardzo wysoki poziom stresu oksydacyjnego

w komórkach, przyspieszoną utratę mięśni kończyn tylnych i obniżenie

długości życia o 30% w porównaniu do zwierząt kontrolnych4. Myszy

pozbawione aktywnej SOD-2 (Sod2-/-) wykazują neurodegenerację

gąbczastej części kory mózgowej odpowiadającej za lokomocję, hipo- 4 Wszystkie badania odnośnie długości życia i uszkodzeń organizmów modelowych podano

w porównaniu do ich organizmów kontrolnych (szczepów dzikich)


40

kampa odpowiadającego za formowanie się pamięci oraz pnia mózgu.

Myszy te mają mniejszy wzrost i zwiększoną śmiertelność zaraz po

urodzeniu [17]. Również podwójne mutanty myszy (Sod1-/-/Sod2+/-

) wykazują

30% spadek maksymalnej długości życia. Natomiast nadekspresja Sod15

u myszy nie wpływa znacząco na długość życia zwierząt, chociaż

aktywność SOD-1 w komórkach tych zwierząt jest zwiększona od dwóch

do pięciu razy [18].

U nicienia Caenorhabditis elegans wykryto pięć genów kodujących

dysmutazę ponadtlenkową, a ich delecja nie wpływa na skrócenie życia. Co

więcej delecja sod-2 powoduje wydłużenie życia nicienia, mimo

zwiększonego poziomu stresu oksydacyjnego w komórkach [19]. Zwierzęta

te charakteryzują się jednak obniżoną konsumpcją tlenu w mitochondriach,

co może być formą kompensacji braku SOD-2 [19]. Natomiast eliminacja

pojedynczych genów sod nie przyczynia się do zwiększenia ekspresji

pozostałych genów dysmutaz w celu zrównoważenia obrony anty-

oksydacyjnej. Nie ma zatem jednoznacznych wskazówek za pomocą jakich

mechanizmów C. elegans z delecją sod wykazuje taką samą długość życia

i nie wykazuje wcześniejszych efektów starzenia się [20]. Z kolei nad-

ekspresja dysmutaz ponadtlenkowych SOD1 i SOD2 (osobno) wydłuża

życie nicienia nie tylko poprzez detoksykację anionorodnika ponad-

tlenkowego, lecz poprzez aktywację czynników transkrypcyjnych FoxO

związanych z długowiecznością C. elegans [21].

Zaangażowanie dysmutaz ponadtlenkowych w proces starzenia się jest

szczególnie widoczne u innego organizmu modelowego jakim jest muszka

owocowa Drosophila melanogaster. Brak aktywnej SOD-1 u muszki

owocowej przyczynia się aż do 80% spadku długości życia a delecja Sod2

powoduje śmiertelność zaraz po przepoczwarzeniu [22]. Delecja genu Sod2

w neuronach u D. melanogaster pozwala na przeżycie tylko 20,5%

owadów [23].

U D. melanogaster z nadekspresją Sod1 w neuronach ruchowych

stwierdzono zwiększenie długości życia o 140%. Takie wyniki oznaczają,

że albo życie całego organizmu muchy jest ograniczone przez żywotność

tych post-mitotycznych komórek, albo RFT wpływają na inne systemy

sygnalizacji, być może endokrynne, wydłużające życie D. melanogaster

[24]. Natomiast w innych badania wykazano, że taki pozytywny efekt

zwiększenia ekspresji genu dysmutazy ponadtlenkowej może być tkankowo

specyficzny [25]. Nadekspresja genu manganowej dysmutazy ponad-

tlenkowej również powoduje wydłużenie życia D. melanogaster co jest

5 W całej pracy zastosowano pisownię genów i enzymów zgodnie z cytowaną publikacją


41

wprost proporcjonalne do zwiększenia aktywności tego enzymu

w komórkach [26].

Brak aktywności dysmutaz ponadtlenkowych u drożdży S. cerevisiae

przyczynia się do zwiększenia śmiertelności komórek w wyższych

temperaturach niż ich optimum. Natomiast nadekspresja SOD1 zwiększa

termotolerancję lecz nie ma wpływu na wydłużenie replikacyjnej długości

życia [27,28]. Nadekspresja SOD2 w komórkach drożdży powoduje

skrócenie replikacyjnej długości życia [29]. W innych badaniach

nadekspresja SOD1 i SOD2 wydłuża życie komórek drożdży winnych

rosnących w hodowlach stacjonarnych [30].

2.2. Katalazy a dłuższe życie

Katalazy (CAT, EC 1.11.1.6) przeprowadzają reakcję dyspropor-

cjonowania nadtlenku wodoru do wody i tlenu (Reakcja 2).

gdzie: H2O2 – nadtlenek wodoru, CAT – katalaza, H2O – woda, O2 – tlen

Do swej aktywności katalaza wymaga obecności Fe3+

w grupie

hemowej. W komórkach ssaczych obecność katalazy stwierdzono

w peroksysomach, w jądrze komórkowym i w mitochondriach [31]. Komórki

drożdży mają aktywną peroksysomalną i mitochondrialną katalazę

A (Cta1) oraz cytoplazmatyczną katalazę T (Ctt1) [13]. W peroksysomach

katalaza usuwa nadtlenek wodoru powstający podczas β-oksydacji kwasów

tłuszczowych, a w mitochondriach unieszkodliwia nadtlenek wodoru

powstały w wyniku dysmutacji anionorodnika ponadtlenkowego. Katalaza

występuje w komórkach organizmów aerobowych w miejscach szczególnie

narażonych na duże stężenia tlenu i tak na przykład chroni erytrocyty przed

skutkami stresu oksydacyjnego [32]. Zwiększenie aktywności katalazy

stwierdzono podczas reakcji obronnej w stanach zapalnych organizmu.

Spadek aktywności enzymu wykazano u osób chorych na miażdżycę,

cukrzycę i w chorobie Parkinsona i Alzheimera [33]. Brak aktywnej

katalazy u ludzi (u homozygot) powoduje akatalasemię, a 50% obniżenie

aktywności tego enzymu (u heterozygot) powoduje hipokatalasemię i jest

przyczyną owrzodzenia ust i utraty zębów już w wieku 13-19 lat. Takie

objawy wiąże się z cukrzycą typu 2 [34]. Zmniejszenie aktywności katalazy

u ludzi w komórkach grasicy, może być przyczyną jej przyspieszonego

zaniku [35].

Delecja katalazy w peroksysomach u myszy, jej nadekspresja osobno

lub łącznie z dysmutazą ponadtlenkową nie powodują wydłużenia życia


42

zwierząt [36]. Potwierdzono, że nadekspresja katalazy mitochondrialnej

(MCat) u myszy opóźnia starzenie i hamuje nowotwory płuc [37]. Myszy

z nadekspresją katalazy mitochondrialnej wykazują zmniejszoną utratę

funkcji mięśni szkieletowych, która jest zależna od wieku [38].

Potwierdzono również, że mutanty C. elegans (ctl2) pozbawione

peroksysomalnej katalazy 2 są nadwrażliwe na obecność nadtlenku

wodoru, wykazują zmniejszoną zdolność do składania jaj oraz charak-

teryzują się krótszym czasem życia [39,40]. Natomiast brak katalazy

cytozolowej nie wpływa ani na proces starzenia się ani na zdolność

składania jaj [39].

Brak aktywnej katalazy nie wpływa na długość życia muszki owocowej

w normalnych warunkach, lecz w obecności nadtlenku wodoru następuje

skrócenie długości życia [41]. Łączna nadekspresja katalazy i dysmutazy

ponadtlenkowej w komórkach D. melanogaster zwiększa długość życia do

33% [41].

Delecja obydwu katalaz u S. cerevisiae również nie powoduje zmian

w replikacyjnej długości życia, natomiast obserwuje się znaczne skrócenie

długości życia w obecności milimolarnych stężeń nadtlenku wodoru [42, 43].

2.3. Peroksydaza glutationowa a dłuższe życie

Peroksydaza glutationowa (GPX, EC 1.11.1.9) katalizuje reakcję

utleniania glutationu do disiarczku glutationu wraz z redukcją nadtlenku

wodoru lub nadtlenków organicznych (Reakcja 3).

gdzie: GSH – glutation zredukowany, H2O2 – nadtlenek wodoru, GPX

– peroksydaza glutationowa, GSSG – di siarczek glutationu, H2O – woda.

U ssaków występują cztery formy tego enzymu, które w miejscu

aktywnym zawierają selenocysteinę. Peroksydaza glutationowa jest

bardziej skuteczna w detoksykacji nadtlenku wodoru już w bardzo małych

stężeniach mniejszych niż katalaza [7]. Gpx-1 u myszy wykazuje znaczną

aktywność w cytoplazmie, a zwierzęta pozbawione Gpx-1 (Gpx1-/-

)

wykazują podwyższony poziom markerów stresu oksydacyjnego (w tym

przypadku markerów peroksydacji lipidów). Natomiast myszy te nie żyją

krócej w porównaniu do myszy kontrolnych [44]. Ponadto u myszy

z brakiem aktywnej MnSOD jak i Gpx-1, mimo znacznych uszkodzeń

oksydacyjnych nie zaobserwowano skrócenia życia w porównaniu do

zwierząt kontrolnych. Czwarta forma peroksydazy glutationowej (Gpx-4)

przeprowadza detoksykację nadtlenku lipidów [45]. W komórkach ssaków


43

występuje niski poziom aktywności Gpx-4, lecz w przeciwieństwie do

Gpx-1, peroksydaza ta jest niezbędna do prawidłowego rozwoju

embrionalnego myszy [46]. Mimo że, myszy Gpx4+/-

mają ograniczoną

zdolność do naprawy uszkodzeń oksydacyjnych błon lipidowych,

to w rzeczywistości obserwuje się niewielkie (~ 7%), ale istotne,

wydłużenie średniego czasu życia w porównaniu do kontroli. Wynika to

z mniejszego prawdopodobieństwa nowotworzenia u myszy Gpx4+/-

[47].

Potwierdzono również, że stymulacja przez estrogeny ekspresji genów

peroksydazy glutationowej i manganowej dysmutazy ponadtlenkowej

przyczynia się do dłuższego życia osobników żeńskich u ludzi czy

szczurów [48].

Delecja genów czterech peroksydaz glutationowych wodorotlenków

lipidów u C. elegans spowodowała skrócenie długości życia nicienia oraz

przyczyniła się do znacznych uszkodzeń oksydacyjnych w jelitach [49].

U drożdży homologiem ssaczej Gpx-4 jest Gpx-2, która w miejscu

katalitycznym zawiera dwie cysteiny i współdziała z tioredoksyną jako

czynnikiem redukującym disiarczek glutationu in vitro [50]. Gpx-2 pełni

funkcję sygnałową w procesie sporulacji drożdży jak i zapobiega

peroksydacji lipidów w błonie mitochondrialnej [51].

2.4. Reduktaza glutationowa i inne białka obronne a dłuższe

życie

Reduktaza glutationowa (GR, EC 1.6.4.2.) katalizuje reakcję

odtworzenia zredukowanego glutationu przy udziale NADPH z formy

utlenionej, która powstaje w wyniku działania peroksydazy glutationowej.

Badania prowadzone na ludzkich liniach komórkowych wykazały, że

delecja genu reduktazy glutationowej przyczynia się do indukcji ekspresji

peroksyredoksyny-1 w komórkach narażonych na wysokie stężenie

parcjalne tlenu [52]. Dane te wskazują na istotną wpływ GR na ekspresję

innych białek zaangażowanych w utrzymaniu prawidłowego potencjału

redoks w komórkach ludzkich.

U C. elegans odkryto tylko jeden gen kodujący GR, a jego delecja

powoduje znaczne obniżenie poziomu zredukowanego glutationu w komór-

kach. Reduktaza glutationowa u nicienia jest niezbędna w odpowiedzi na

stres oksydacyjny wywołany juglonem. Delecja genu reduktazy

glutationowej prowadzi do skrócenia średniej długości życia C. elegans

o około 15% [53]. Z kolei nadekspresja genu reduktazy glutationowej

wydłuża życie nicieni maksymalnie do 35% [53]

S. cerevisiae pozbawione aktywności reduktazy glutationowej

charakteryzują się podwyższonym poziomem disiarczku glutationu i są

nadwrażliwe na czynniki wywołujące stres oksydacyjny [54].


44

Enzym tioredoksyna (TRX) pełni w komórkach organizmów aero-

bowych funkcje kontroli stanu oksydacyjno-redukcyjnego (redoks) dzięki

grupom sulfhydrylowym, które z kolei są odnawiane przez reduktazę

tioredoksyny. Trx1 jest enzymem cytoplazmatycznym, natomiast Trx2

występuje w mitochondriach [55]. Dowiedziono, że u myszy delecja genu

mitochondrialnej TRX2 jest letalna już w stadium zarodkowym. Natomiast

myszy Trx2+/- wykazały o 16% zmniejszoną maksymalną długość życia [18].

Reduktazy sulfotlenku metioniny (MSR, EC 1.8.4.11) chronią grupy

tiolowe metioniny przy współpracy z tioredoksyną. Zarówno reduktaza

tioredoksyny, peroksydaza glutationowa jak i reduktazy sulfotlenku

metioniny są selenobiałkami. W zależności od organizmów (u człowieka

lub myszy) u ludzi wyróżniono dwie podstawowe formy MSR: MsrA

zlokalizowana w mitochondriach, cytoplazmie i jądrze, i MsrB obecna

w cytoplazmie i jądrze [56]. Szczep myszy MsrA-/- wykazał o 40%

skróconą długość życia w porównaniu do kontroli [57]. Nadekspresja MsrA

u D. melanogaster przyczyniła się do wzrostu długości życia tych owadów

o 50% w warunkach stresu oksydacyjnego [58]. S. cerevisiae z nieaktywną

MsrA wykazują znaczne skrócenie replikacyjnej długości życia [59].

Natomiast nadekspresja ssaczej MsrB chroni komórki drożdży przed

stresem oksydacyjnym [60].

3. Podsumowanie

Badania prowadzone przy zastosowaniu organizmów modelowych

wskazują na istotne zaangażowanie genów enzymów antyoksydacyjnych

w proces starzenia się tych organizmów. W większości opisanych

eksperymentów prowadzonych nad procesem starzenia się ludzi, myszy,

D. melanogaster, C. elegans czy S. cerevisiae delecja genów enzymów

antyoksydacyjnych skutkuje skróceniem życia tych organizmów, a nad-

ekspresja tych genów wydłuża życie. Brak aktywnych enzymów obrony

antyoksydacyjnej może zwiększać wrażliwość na RFT i prowadzić do

śmierci badanych organizmów zwłaszcza w warunkach zwiększonego

poziomu stresu oksydacyjnego. Natomiast organizmy mogą wytworzyć

różne mechanizmy kompensacji braku tych aktywnych enzymów. Zatem,

zgodnie z ,,teorią wolnorodnikową” można potwierdzić, że RFT

przyczyniają się do przedwczesnego starzenia się organizmów gdy nie ma

odpowiedniej enzymatycznej obrony antyoksydacyjnej.


45

Literatura

1. Balcombe N. R., Sinclair A., Ageing: definitions, mechanisms and the

magnitude of the problem, Best Practice & Research Clinical

Gastroenerology., 15(6) (2001), s. 835-49

2. Weinert B. T., Timiras P. S., Invited review: Theories of aging, Journal

of Applied Physiology, 95(4) (2003), s. 1706-16

3. Payne B. A., Chinnery P. F., Mitochondrial dysfunction in aging: Much

progress but many unresolved questions, Biochimica et Biophysica Acta.,

1847(11) (2015), s. 1347-53. doi: 10.1016/j.bbabio.2015.05.022

4. López-Otín C., Blasco M. A., Partridge L., Serrano M., Kroemer G.,

The hallmarks of aging, The Journal Cell., 153(6) (2013), s. 1194-217.

doi: 10.1016/j.cell.2013.05.039

5. Harman D., Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry,

Journal of Gerontology., 11(3) (1956), s. 298-300

6. Harman D., The biologic clock: the mitochondria?, Journal of the American

Geriatrics Society., 20(4) (1972), s. 145-147

7. Bartosz G., Druga twarz tlenu. (2003) Państwowe Wydawnictwo Naukowe

8. Sandalio L.M., Rodríguez-Serrano M., Romero-Puertas M.C., del Río L.A.,

Role of peroxisomes as a source of reactive oxygen species (ROS) signaling

molecules, Subcellular Biochemistry., 69 (2013), s. 231-55. doi: 10.1007/978-

94-007-6889-5_13

9. Sies H., Cadenas E., Oxidative stress: damage to intact cells and organs,

Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B,

Biological Sciences., 311(1152) (1985), s. 617-631

10. Budovsky A., Tacutu R., Yanai H., Abramovich A., Wolfson M., Fraifeld V.,

Common gene signature of cancer and longevity, Mechanisms of Ageing

and Development 130(1-2) (2009), s. 33-39. doi: 10.1016/j.mad.2008.04.002

11. Okado-Matsumoto A, Fridovich I., Subcellular distribution of superoxide

dismutases (SOD) in rat liver: Cu,Zn-SOD in mitochondria, The Journal of

Biological Chemistry 276(42) (2001), s. 38388-38393

12. Aguilaniu H., Gustafsson L., Rigoulet M., Nyström T., Asymmetric

inheritance of oxidatively damaged proteins during cytokinesis, Science

(New York, N.Y.)., 299(5613) (2003), s. 1751-1753

13. Herrero E., Ros J., Bellí G., Cabiscol E., Redox control and oxidative stress

in yeast cells, Biochimica Et Biophysica Acta 1780 (11) (2008), s. 1217-1235,

doi: 10.1016/j.bbagen.2007.12.004

14. Jackson M. J. ,Strategies for reducing oxidative damage in ageing skeletal

muscle, Advanced Drug Delivery Reviews., 61(14) (2009), s. 1363-1368,

doi: 10.1016/j.addr.2009.07.018

15. Morrison B. M., Morrison J. H., Amyotrophic lateral sclerosis associated with

mutations in superoxide dismutase: a putative mechanism of degeneration,

Brain Research. Brain Research Reviews., 29(1) (1999), s. 121-135

16. Oladzad A. A., Javanian A., Nikkhah M., Meratan A. A., Ghiasi P., Nemat-

Gorgani M., Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by

amyloid aggregates arising from variants of SOD1, International Journal

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sinclair%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11866480

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Weinert%20BT%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12970376

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Timiras%20PS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12970376

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Payne%20BA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26050973

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chinnery%20PF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26050973

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26050973

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=L%C3%B3pez-Ot%C3%ADn%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23746838

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Blasco%20MA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23746838

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Partridge%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23746838

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Serrano%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23746838

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kroemer%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23746838


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sandalio%20LM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23821152

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Rodr%C3%ADguez-Serrano%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23821152

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Romero-Puertas%20MC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23821152

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=del%20R%C3%ADo%20LA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23821152


46

of Biological Macromolecules. 61 (2013), s. 212–217. doi:

10.1016/j.ijbiomac.2013.07.007

17. Izuo N., Nojiri H., Uchiyama S., Noda Y., Kawakami S., Kojima S., Sasaki T.,

Shirasawa T., Shimizu T., Brain-Specific Superoxide Dismutase 2 Deficiency

Causes Perinatal Death with Spongiform Encephalopathy in Mice, Oxidative

Medicine and Cellular Longevity., 2015 (2015), s. 238914. doi:

10.1155/2015/238914

18. Pérez V. I., Bokov A., Van Remmen H., Mele J., Ran Q., Ikeno Y.,

Richardson A., Is the oxidative stress theory of aging dead?, Biochimica

Et Biophysica Acta., 1790(10) (2009), s. 1005-1014. doi:

10.1016/j.bbagen.2009.06.003

19. Van Raamsdonk J.M., Hekimi S., Deletion of the mitochondrial superoxide

dismutase sod-2 extends lifespan in Caenorhabditis elegans, PLoS Genetics.,

5(2) (2009), s. e1000361. doi: 10.1371/journal.pgen.1000361

20. Back P., Matthijssens F., Vlaeminck C., Braeckman B. P., Vanfleteren J. R.,

Effects of sod gene overexpression and deletion mutation on the expression

profiles of reporter genes of major detoxification pathways in Caenorhabditis

elegans

21. Experimental Gerontology., 45(7-8) (2010), s. 603-10.

doi: 10.1016/j.exger.2010.01.014

22. Cabreiro F., Ackerman D., Doonan R., Araiz C., Back P., Papp D., Braeckman

B. P., Gems D., Increased life span from overexpression of superoxide

dismutase in Caenorhabditis elegans is not caused by decreased oxidative

damage, Free Radical Biology & Medicine., 51(8) (2011), s. 1575-82.

doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2011.07.020

23. Magwere T., West M., Riyahi K., Murphy M. P., Smith R. A. J., Partridge L.,

The effects of exogenous antioxidants on lifespan and oxidative stress

resistance in Drosophila melanogaster, Mechanisms of Ageing and

Development., 127(4) (2006), s. 356-370

24. Vitushynska M. V., Matiytsiv N. P., Chernyk Y., Influence of tissue-specific

superoxide dismutase genes expression in brain cells on Drosophila

melanogaster sensitivity to oxidative stress and viability, Tsitologiia i

Genetika., 49(2) (2015), s. 21-8

25. Phillips J. P., Parkes T. L., Hilliker A. J., Targeted neuronal gene expression

and longevity in Drosophila, Experimental Gerontology., 35(9-10) (2000),

s. 1157-1164

26. Landis G. N., Tower J., Superoxide dismutase evolution and life span regulation,

Mechanisms of Ageing and Development., 126(3) (2005), s. 365-379

27. Sun J., Folk D., Bradley T. J., Tower J., Induced overexpression

of mitochondrial Mn-superoxide dismutase extends the life span of adult

Drosophila melanogaster, Genetics., 161(2) (2002), s. 661-672

28. Davidson J. F., Whyte B., Bissinger P. H., Schiestl R. H., Oxidative stress

is involved in heat-induced cell death in Saccharomyces cerevisiae,

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States

of America., 93(10) (1996), s. 5116-5121

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Izuo%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26301039

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nojiri%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26301039

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Uchiyama%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26301039

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Noda%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26301039

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kawakami%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26301039

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kojima%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26301039

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sasaki%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26301039

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Shirasawa%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26301039

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Shimizu%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26301039






http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Cabreiro%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21839827

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ackerman%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21839827

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Doonan%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21839827

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Araiz%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21839827

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Back%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21839827

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Papp%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21839827

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Braeckman%20BP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21839827

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Braeckman%20BP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21839827

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gems%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21839827


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Vitushynska%20MV%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26030970

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Matiytsiv%20NP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26030970

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chernyk%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26030970




47

29. Kirchman P. A., Kim S., Lai C. Y., Jaźwiński S. M., Interorganelle signaling

is a determinant of longevity in Saccharomyces cerevisiae, Genetics., 152(1)

(1999), s. 179-190

30. Fabrizio P., Pletcher S. D., Minois N., Vaupel J. W., Longo V. D.,

Chronological aging-independent replicative life span regulation

by Msn2/Msn4 and Sod2 in Saccharomyces cerevisiae, FEBS Letters.,

557 (1-3) (2004), s. 136-42

31. Fierro-Risco J., Rincón A. M., Benítez T., Codón A. C., Overexpression

of stress-related genes enhances cell viability and velum formation in Sherry

wine yeasts, Applied Microbiology Biotechnology., 97(15) (2013), s. 6867-81,

doi: 10.1007/s00253-013-4850-9

32. Salmon J., Arundell L., Hume C., Brown H., Hesketh K., Dunstan D. W., Daly

R. M., Pearson N., Cerin E., Moodie M., Sheppard L., Ball K., Bagley S., Paw

M. C., Crawford D., A cluster-randomized controlled trial to reduce sedentary

behavior and promote physical activity and health of 8-9 year olds: The

Transform-Us! Study, BMC Public Health., 11(1) (2011), s.759. doi:

10.1186/1471-2458-11-759

33. Ścibior D., Czeczot H., Katalaza – budowa, właściwości, funkcje, Postępy

Higieny Medycyny Doświadczalnej., (60) (2006), s.170-180

34. Yasmineh W. G, Kaur T. P, Blazar B. R, Theologides A., Serum catalase

as marker of graft-vs-host disease in allogeneic bone marrow transplant

recipients: pilot study, Clinical Chemistry., 41(11) (1995), s. 1574-1580

35. Góth L., Rass P., Páy A., Catalase enzyme mutations and their association

with diseases, Molecular Diagnosis: A Journal Devoted to the Understanding

of Human Disease Through the Clinical Application of Molecular Biology.,

8(3) (2004), s.141-149

36. Griffith A. V., Venables T., Shi J., Farr A., van Remmen H., Szweda L.,

Fallahi M., Rabinovitch P., Petrie H. T., Metabolic Damage and Premature

Thymus Aging Caused by Stromal Catalase Deficiency, Cell Reports., 12(7)

(2015), s. 1071-9. doi: 10.1016/j.celrep.2015.07.008

37. Chen Q., Ding Q., Keller J. N., The stationary phase model of aging in yeast

for the study of oxidative stress and age-related neurodegeneration,

Biogerontology (2005) 6(1):1-13

38. Ge X., Pettan-Brewer C., Morton J., Carter K., Fatemi S., Rabinovitch P.,

Ladiges W. C., Mitochondrial catalase suppresses naturally occurring lung

cancer in old mice, Pathobiology of Aging & Age Related Diseases., 5 (2015),

s. 28776. doi: 10.3402/pba.v5.28776. eCollection 2015

39. Umanskaya A., Santulli G., Xie W., Andersson D. C., Reiken S. R., Marks A.

R., Genetically enhancing mitochondrial antioxidant activity improves muscle

function in aging, Proceedings of the National Academy of Sciences

of the United States of America., 111(42) (2014), s. 15250-5. doi:

10.1073/pnas.1412754111

40. Petriv O. I., Rachubinski R. A., Lack of peroxisomal catalase causes

a progeric phenotype in Caenorhabditis elegans, The Journal of Biological

Chemistry., 279(19) (2004), s. 19996-20001






http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Griffith%20AV%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26257169

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Venables%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26257169

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Shi%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26257169

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Farr%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26257169

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=van%20Remmen%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26257169

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Szweda%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26257169

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Fallahi%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26257169

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Rabinovitch%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26257169

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Petrie%20HT%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26257169

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Metabolic+Damage+and+Premature+Thymus+Aging+Caused+by+Stromal+Catalase+Deficiency

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ge%20X%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26400209

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Pettan-Brewer%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26400209

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Morton%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26400209

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Carter%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26400209

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Fatemi%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26400209

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Rabinovitch%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26400209

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ladiges%20WC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26400209


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Umanskaya%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25288763

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Santulli%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25288763

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Xie%20W%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25288763

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Andersson%20DC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25288763

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Reiken%20SR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25288763

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Marks%20AR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25288763

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Marks%20AR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25288763

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Petriv%20OI%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14996832

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Rachubinski%20RA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14996832




48

41. Spiró Z., Arslan M. A., Somogyvári M., Tu Nguyen M., Smolders A., Dancsó

B., Németh N., Elek Z., Braeckman B. P., Csermely P., Sőti C., RNA

Interference Links Oxidative Stress to the Inhibition of Heat Stress Adaptation,

Antioxidants & Redox Signaling., 17(6) (2012), s. 890–901. doi:

10.1089/ars.2011.4161

42. Orr W. C., Sohal R. S., Extension of life-span by overexpression of superoxide

dismutase and catalase in Drosophila melanogaster, Science(New York,

N.Y.) 263(5150) (1994), s. 1128-1130

43. Biliński T., Krawiec Z., Liczmański A., Litwińska J., Is hydroxyl radical

generated by the Fenton reaction in vivo?, Biochemical and Biophysical

Research Communications., 130(2) (1985), s. 533-539

44. Wawryn J., Święciło A., Bartosz G., Biliński T., Effect of superoxide

dismutase deficiency on the life span of the yeast Saccharomyces cerevisiae.

An oxygen-independent role of Cu,Zn-superoxide dismutase, Biochimica

Et Biophysica Acta., 1570(3) (2002), s. 199-202

45. Zhang Y., Ikeno Y., Qi W., Chaudhuri A., Li Y., Bokov A., Thorpe S. R.,

Baynes J. W., Epstein C., Richardson A., Van Remmen H., Mice deficient in

both Mn superoxide dismutase and glutathione peroxidase-1 have increased

oxidative damage and a greater incidence of pathology but no reduction in

longevity, The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and

Medical Sciences 64(12) (2009), s. 1212-1220. doi: 10.1093/gerona/glp132

46. Ursini F., Bindoli A., The role of selenium peroxidases in the protection

against oxidative damage of membranes, Chemistry and Physics of Lipids.,

44(2-4) (1987), s. 255-276

47. Yant L. J., Ran Q., Rao L., Van Remmen H., Shibatani T., Belter J. G., Motta

L., Richardson A., Prolla T. A., The selenoprotein GPX4 is essential for mouse

development and protects from radiation and oxidative damage insults, Free

Radical Biology & Medicine., 34(4) (2003), s. 496-502

48. Van Remmen H., Ikeno Y., Hamilton M., Pahlavani M., Wolf N., Thorpe S.

R., Alderson N. L., Baynes J. W., Epstein C. J., Huang T. T., Nelson J., Strong

R., Richardson A., Life-long reduction in MnSOD activity results in increased

DNA damage and higher incidence of cancer but does not accelerate aging,

Physiological Genomics, 16 (2003), s. 29-37

49. Vina J., Borras C., Gambini J., Sastre J., Pallardo F. V., Why females live

longer than males? Importance of the upregulation of longevity-associated

genes by oestrogenic compounds, FEBS Letters., 579 (2005), s. 2541-2545

50. Sakamoto T, Maebayashi K, Nakagawa Y, Imai H. Deletion of the four

phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase genes accelerates aging

in Caenorhabditis elegans. Genes to Cells., 19(10) (2014), s. 778-92,

doi: 10.1111/gtc.12175

51. Tanaka T., Izawa S., Inoue Y. GPX2, encoding a phospholipid hydroperoxide

glutathione peroxidase homologue, codes for an atypical 2-Cys peroxiredoxin

in Saccharomyces cerevisiae, The Journal of Biological Chemistry., 280 (51)

(2005), s. 42078-42087

52. Ukai Y., Kishimoto T., Ohdate T., Izawa S., Inoue Y., Glutathione peroxidase

2 in Saccharomyces cerevisiae is distributed in mitochondria and involved

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Arslan%20MA%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Somogyv%26%23x000e1%3Bri%20M%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nguyen%20MT%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Smolders%20A%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Dancs%26%23x000f3%3B%20B%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=N%26%23x000e9%3Bmeth%20N%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Elek%20Z%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Braeckman%20BP%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Csermely%20P%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=S%26%23x00151%3Bti%20C%5Bauth%5D

http://dx.doi.org/10.1089%2Fars.2011.4161

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhang%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19776219

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ikeno%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19776219

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Qi%20W%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19776219

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chaudhuri%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19776219

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Li%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19776219

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bokov%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19776219

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Thorpe%20SR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19776219

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Baynes%20JW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19776219

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Epstein%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19776219

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Richardson%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19776219

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Van%20Remmen%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19776219

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yant%20LJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12566075

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ran%20Q%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12566075

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Rao%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12566075


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Shibatani%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12566075

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Belter%20JG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12566075

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Motta%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12566075

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Motta%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12566075


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Prolla%20TA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12566075


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ikeno%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14679299

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hamilton%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14679299

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Pahlavani%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14679299

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wolf%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14679299



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Alderson%20NL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14679299

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Baynes%20JW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14679299

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Epstein%20CJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14679299

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Huang%20TT%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14679299

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nelson%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14679299

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Strong%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14679299

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Strong%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14679299


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sakamoto%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25200408

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Maebayashi%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25200408

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nakagawa%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25200408

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Imai%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25200408


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tanaka%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16251189

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Izawa%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16251189

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Inoue%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16251189

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ukai%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21763276

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kishimoto%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21763276

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ohdate%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21763276

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Izawa%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21763276

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Inoue%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21763276


49

in sporulation, Biochemical and Biophysical Research Communications

411 (3) (2011), s. 580-585. doi: 10.1016/j.bbrc.2011.06.189

53. Fan C. Y., Chou H. C., Lo Y. W., Wen Y. F., Tsai Y. C., Huang H., Chan H.

L., Proteomic and redox-proteomic study on the role of glutathione reductase

in human lung cancer cells, Electrophoresis., 34(24) (2013), s. 3305-14.

doi: 10.1002/elps.201300250

54. Lüersen K., Stegehake D., Daniel J., Drescher M., Ajonina I., Ajonina C.,

Hertel P., Woltersdorf C., Liebau E., The glutathione reductase GSR-1

determines stress tolerance and longevity in Caenorhabditis elegans, PLoS

One., 8;8(4) (2013), s. e60731. doi: 10.1371/journal.pone.0060731

55. López-Mirabal H. R., Thorsen M., Kielland-Brandt M. C., Toledano M. B.,

Winther J. R., Cytoplasmic glutathione redox status determines survival upon

exposure to the thiol-oxidant 4,4’-dipyridyl disulfide, FEMS Yeast Research.,

(2007) 7(3):391-403

56. Szokalska A., Układ tioredoksyna – reduktaza tioredoksyny jako nowy cel

terapii przeciwnowotworowych, Postępy Biologii Komórki., 35(3) (2008),

s. 391-402

57. Hwa-Young K., The Methionine Sulfoxide Reduction System: Selenium

Utilization and Methionine Sulfoxide Reductase Enzymes and Their Functions,

Antioxidants & Redox Signaling., 19(9) (2013), s. 958–969. doi:

10.1089/ars.2012.5081

58. Moskovitz J., Bar-Noy S., Williams W.M., Requena J., Berlett B.S., Stadtman

E.R., Methionine sulfoxide reductase (MsrA) is a regulator of antioxidant

defense and lifespan in mammals, Proceedings of the National Academy

of Sciences of the United States of America 98(23) (2001), s. 12920-12925

59. Ruan H., Tang X. D., Chen M. L., Joiner M. L., Sun G., Brot N., Weissbach

H., Heinemann S. H., Iverson L., Wu C. F., Hoshi T., High-quality life

extension by the enzyme peptide methionine sulfoxide reductase, Proceedings

of the National Academy of Sciences of the United States of America., 99 (5)

(2002), s. 2748-2753

60. Le D. T., Lee B. C., Marino S. M., Zhang Y., Fomenko D. E., Kaya A.,

Hacioglu E., Kwak G. H., Koc A., Kim H. Y., Gladyshev V. N., Functional

analysis of free methionine-R-sulfoxide reductase from Saccharomyces

cerevisiae, The Journal of Biological Chemistry 284(7) (2009), s. 4354-4364

61. Kwak G. H., Kim J. R., Kim H. Y., Expression, subcellular localization,

and antioxidant role of mammalian methionine sulfoxide reductases

in Saccharomyces cerevisiae, BMB Reports., 42 (2009), s. 113-118

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Fan%20CY%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24115172

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chou%20HC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24115172

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lo%20YW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24115172

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wen%20YF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24115172

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tsai%20YC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24115172

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Huang%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24115172

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chan%20HL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24115172

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chan%20HL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24115172


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=L%C3%BCersen%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23593298

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Stegehake%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23593298

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Daniel%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23593298

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Drescher%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23593298

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ajonina%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23593298

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ajonina%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23593298

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hertel%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23593298

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Woltersdorf%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23593298

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Liebau%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23593298



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kim%20HY%5Bauth%5D

http://dx.doi.org/10.1089%2Fars.2012.5081

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ruan%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11867705

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tang%20XD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11867705

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chen%20ML%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11867705

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Joiner%20ML%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11867705

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sun%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11867705

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Brot%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11867705

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Weissbach%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11867705

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Weissbach%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11867705

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Heinemann%20SH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11867705

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Iverson%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11867705

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wu%20CF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11867705

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hoshi%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11867705

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Le%20DT%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19049972

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lee%20BC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19049972

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Marino%20SM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19049972

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhang%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19049972

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Fomenko%20DE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19049972

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kaya%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19049972

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hacioglu%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19049972

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kwak%20GH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19049972

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Koc%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19049972

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kim%20HY%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19049972

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gladyshev%20VN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19049972


50


się organizmów

Streszczenie

Temat starzenia się organizmu i utrzymania go w młodości jest jednym z najbardziej istotnych problemów współczesności. Starzenie się jest procesem złożonym, zależnym od

wielu czynników, zarówno wewnętrznych (na przykład genetycznych) jak i zewnętrznych

(na przykład zmian środowiskowych), które działają równocześnie i na różnych poziomach

organizacji. Proces ten jest równoznaczny z pogarszaniem praktycznie każdej funkcji organizmu w czasie, co w rezultacie prowadzi do śmierci organizmu. Obecnie część badań

naukowych nad procesem starzenia się koncentruje się na poszukiwaniach organizmów

modelowych, które charakteryzują się dłuższym lub krótszym czasem życia w powiązaniu

ze stresem oksydacyjnym. Otóż uważa się, że jedną z przyczyn procesu starzenia się jest powstawanie w komórce „wolnych rodników tlenowych” (RFT) jako produktów ubocznych

naturalnego metabolizmu tlenowego. Wpływają one przede wszystkim prooksydacyjnie na

strukturę i funkcjonowanie molekuł komórkowych. Zwiększona synteza RFT lub brak

odpowiedniej obrony antyoksydacyjnej (na przykład w postaci enzymów anty-oksydacyjnych lub innych białek obronnych) prowadzi do stresu oksydacyjnego w komórce.

Praca przedstawia obecny stan wiedzy czy delecja genów enzymów antyoksydacyjnych

w komórce (między innymi dysmutaz ponadtlenkowych, katalaz, peroksydaz) lub ich

nadekspresja może prowadzić do wydłużenia życia organizmów modelowych (mysz, Caenorhabditis elegans, muszka owocowa, drożdże).

Antioxidant enzymes and other defense proteins in the aging process

of organisms

Abstract About aging and keep it in his youth is one of the most important contemporary issues.

Aging is a complex process depending on many factors, both internal (e.g. genetic) and

external (e.g. environmental changes) that operate simultaneously at different levels

of organization. This process is equivalent to the deterioration of almost any function of the body over time, which in turn leads to the death of the organism. Currently, some research

on aging focused on the search of model organisms that have a longer or shorter life span

in connection with oxidative stress. Now, it is believed that one of the causes of the aging

process is the formation of a cell "reactive oxygen species" (ROS) as by-products of the natural metabolism of oxygen. They affect primarily oxidatively the structure and operation

of cellular molecules. Increased synthesis of ROS or lack of antioxidant defense (such

as antioxidant enzymes and other defensive proteins) results in oxidative stress in a cell. The

paper presents the current state of knowledge or deletion of genes of antioxidant enzymes in the cell (including superoxide dismutases, catalases, peroxidases) or overexpression may

lead to longer life of model organisms (mouse, Caenorhabditis elegans, fruit fly, yeast).

51

Magdalena Bossowska1, Matylda Mielcarska

2

Rola katepsyn B i L w zakażeniu wirusem Ebola

1. Wprowadzenie

Katepsyny są enzymami należącymi do proteaz cysteinowych,

biorącymi udział w takich procesach fizjologicznych jak utrzymywanie

homeostazy, aktywacja bądź inaktywacja białek podczas sygnalizacji

komórkowej. Jednak przede wszystkim katepsyny uczestniczą w końcowej

proteolizie białek w lizosomach pochodzenia wewnątrzkomórkowego, jak

i wchłanianych z zewnątrz na drodze endocytozy [1]. Ponadto, katepsyny

przekształcają wiele proenzymów, prohormonów i neuropeptydów w formy

aktywne, biorą udział w proliferacji komórek oraz ich różnicowaniu się. Ich

udział stwierdzono również w prezentacji antygenu oraz w apoptozie.

Katepsyny są syntetyzowane jako nieaktywne proenzymy a następnie

przetwarzane, aby stać się enzymami aktywnymi [2].

Aktualnie prowadzone są intensywne badania dotyczące poznania

szczegółowej roli katepsyn (w szczególności katepsyn B i L) podczas

wnikania wirusa Ebola do wnętrza zakażanej komórki. Poznanie

mechanizmu ich regulacji oraz wpływu na przekształcanie wirusowej

glikoproteiny w endosomach może posłużyć zapobieganiu zakażenia oraz

opracowaniu efektywnych form terapii przeciwwirusowej.

2. Katepsyny – charakterystyka, występowanie i rola

W 1929 roku do określenia enzymu proteolitycznego została wpro-

wadzona nazwa katepsyna, pochodząca od greckiego słowa kathepsein

oznaczającego trawić. Aktualnie termin ten odnosi się do enzymów

proteolitycznych, zlokalizowanych głownie w lizosomach i charak-

teryzujących się optymalną aktywnością katalityczną przy pH 5.0-6.5 [3].

Ze względu na wysokie stężenie w komórce i aktywność w środowisku

kwaśnym funkcja tych enzymów jest ściśle regulowana. Katepsyny należą

do proteaz cysteinowych – enzymów katalizujących hydrolizę białek oraz

są szeroko rozpowszechnione wśród organizmów żywych, stanowiąc jedną

[email protected], Zakład Immunologii, Katedra Nauk Przedklinicznych, Wydział

Medycyny Weterynaryjnej, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie,

www.sggw.pl [email protected], Zakład Immunologii, Katedra Nauk Przedklinicznych, Wydział

Medycyny Weterynaryjnej, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie,

www.sggw.pl

Magdalena Bossowska, Matylda Mielcarska

52

z najczęściej badanych grup enzymów [4]. Katepsyny są produktami

jednego genu, ale produkty białkowe mogą być polimorficzne w wyniku

allelicznych wariantów genu, alternatywnego splicingu RNA i/lub

modyfikacji posttranslacyjnych. Podobnie do innych proteaz, katepsyny

regulowane są na każdym poziomie ich biosyntezy, w szczególności

poprzez ich przydzielanie do lizosomów, aktywację form proenzymów,

a także ich endogenne inhibitory [5]. Różne typy komórek wykorzystują

wyspecjalizowane molekularne mechanizmy kontrolujące lokalizację

i regulację katepsyn zgodnie z ich przydzieloną funkcją [6].

Katepsyna B funkcjonuje jako endopeptydaza i egzopeptydaza. Ludzki

gen katepsyny B znajduje się w pozycji 8p22-p23.1, a białko jest szeroko

rozpowszechnione w makrofagach, hepatocytach, kanalikach nerkowych,

nabłonku przewodu pokarmowego, fibroblastach, trofoblastach, śliniankach,

trzustce i wszystkich narządach wydzielania wewnętrznego. Katepsyna B

uczestniczy głównie w wewnątrzkomórkowym katabolizmie białek, ale

może również brać udział w innych procesach fizjologicznych, takich jak

przetwarzanie antygenów w odpowiedzi immunologicznej czy aktywacja

hormonów [2].

Katepsyna L jest wytwarzana jako preprokatepsyna L, następnie

transportowana przy pomocy aparatu Golgiego jako prokatepsyna

L w pęcherzykach wydzielniczych, a ostatecznie przechowywana jako

dojrzała katepsyna L w lizosomach. Wewnątrzkomórkowa proteoliza

białek przez katepsynę L jest zaangażowana w wiele ważnych procesów,

stąd też regulacja cyklu komórkowego może być pod kontrolą właśnie tej

katepsyny, gdyż posiada ona zdolność do degradacji czynników

transkrypcyjnych. Ponadto, katepsyna L odgrywa znaczącą rolę w układzie

immunologicznym poprzez degradację łańcucha niezmiennego (invariant

chain – Ii) w przetwarzaniu kompleksu MHC klasy II, co jest kluczowym

etapem podczas prezentacji antygenu [2].

3. Wirus Ebola – systematyka, budowa, objawy zakażenia

Wirus Ebola (EBOV) należy do rodziny filowirusów (Filoviridae).

Wyróżniono 5 podtypów wirusa w zależności od miejsca jego występowania:

Ebola-Zair (ZEBOV), Ebola-Sudan (SEBOV), Ebola-Cote d’Ivore (Wybrzeże

Kości Słoniowej) (CIEBOV), określany także jako Ebola-Taї Forest (TAFV),

Ebola-Reston (REBOV) oraz Ebola-Bundibugyo (BEV) [7].

Wirus Ebola jest wirusem osłonowym posiadającym pojedynczy

niesegmentowany, liniowy materiał genetyczny o ujemnie spolaryzowanej

nici kwasu rybonukleinowego (ssRNA). Pojedyncza cząstka wirusa waha

się od 80 nm aż do 14 000 nm, a wielkość genomu wirusa wynosi 19 kpz.

RNA. Genom wirusa składa się z siedmiu genów kodujących odpowiednio:


53

nukleoproteinę, glikoproteiny (GP), polimerazę RNA zależną od RNA

(białko L) oraz cztery białka strukturalne zwane VP24, VP30, VP35

i VP40. Do białek wiążących się z błoną komórki gospodarza należą:

VP24, VP40 oraz glikoproteina [8].

EBOV wywołuje gorączkę krwotoczną u ludzi i zwierząt, która

początkowo objawia się nagłym osłabieniem, intensywnymi bólami

mięśniowymi i bólem gardła, a w kolejnym etapie wymiotami, biegunką

oraz krwawieniem zarówno wewnętrznym jak i zewnętrznym. Wirus

przenosi się na człowieka poprzez bliski kontakt z zakażonymi zwierzętami

i bardzo szybko rozprzestrzenia się między ludźmi przez bezpośredni

kontakt z zakażoną krwią lub płynami ustrojowymi [9]. W marcu 2014 roku

została ogłoszona epidemia Eboli w Afryce Zachodniej. Rozprzestrzenia

się bardzo szybko i określana jest jako najgroźniejsze wystąpienie gorączki

krwotocznej w historii od czasu jej odkrycia w Zairze w 1976 roku,

a śmiertelność osób zakażonych wirusem wynosi niemal 90%. Według

danych Światowej Organizacji Zdrowia (WHO – World Health Organization)

z dnia 31 grudnia 2014 roku, 8004 osób zmarło z powodu tej choroby

w sześciu krajach: Gwinei, Liberii, Sierra Leone, Nigerii, USA i Mali,

spośród których największa liczba zachorowań i zgonów została

przedstawiona na rysunku (Rys. 1). Ponadto, 29 grudnia 2014 roku

w Wielkiej Brytanii odnotowano pierwszy przypadek zakażenia wirusem

Ebola. Dlatego też obecnie prowadzone badania koncentrują się na

znalezieniu środka terapeutycznego mogącego zahamować replikację

wirusów. Dokonanie tego związane jest z dokładnym poznaniem

molekularnego mechanizmu zakażenia filowirusami.

Rysunek 1. Łączna liczba potwierdzonych, prawdopodobnych i podejrzanych przypadków

oraz zgonów z powodu choroby wywołanej przez wirus Ebola w Gwinei, Liberii i Sierra Leone; opracowanie własne na podstawie danych WHO z dnia 20 sierpnia 2014 i 31 grudnia

2014 roku [10]


54

4. Rola katepsyn B i L podczas wnikania wirusa Ebola do

komórki gospodarza

Pierwszym etapem cyklu życiowego jakiegokolwiek wirusa jest

wiązanie się z powierzchnią komórki gospodarza. W przypadku

filowirusów pierwszymi zakażanymi komórkami są makrofagi i komórki

dendrytyczne, natomiast mogą one atakować większość komórek różnego

typu z wyjątkiem limfocytów oraz innych nieadherentnych komórek.

Ponadto, wszystkie wirusy wykorzystują czynniki mocujące i/lub receptory

komórkowe, aby związać się z błoną komórki gospodarza. Czynniki

mocujące służą jedynie jako cząsteczki wiążące, natomiast receptory

komórkowe są obecnie definiowane jako cząsteczki na powierzchni

komórek, które aktywnie promują internalizację wirusa lub aktywnie

indukują wnikanie wirusa do wnętrza komórki. Wnikanie wirusa jest

procesem, który polega na naruszeniu bariery błony komórkowej

i uwolnieniu genomu do cytoplazmy [11]. Po związaniu z powierzchnią

komórki, filowirusy są internalizowane na drodze makropinocytozy

(odmiana endocytozy najbardziej odpowiednia dla dużych cząstek) [12, 13]

do wczesnych endosomów, które następnie przekształcane są w późne

endosomy/lizosomy. Ponieważ filowirusy otoczone są osłonką, ich

przenikanie do cytoplazmy odbywa się na drodze fuzji z błoną otaczającą

późny endosom/lizosom. Po wniknięciu genom wirusa ulega transkrypcji

i translacji, zostają syntetyzowane nowe białka wirusowe, a następnie

tworzone są wiriony potomne [11, 14].

Podczas fuzji osłonki wirusa z błoną komórki gospodarza zasadniczą

rolę odgrywają wirusowe białka osłonkowe – glikoproteiny (GP).

Glikoproteiny są regularnie rozmieszone na powierzchni osłonki wirusowej oraz

są jedynymi białkami wirusowymi, mającymi decydujące znaczenie dla

tego właśnie procesu [14, 15]. GP wirusa Ebola są syntetyzowane jako

pojedyncze łańcuchy polipeptydowe, które następnie przekształcane są

podczas biosyntezy w aparacie Golgiego przez furynopodobną proteazę do

podjednostki GP1 i GP2. Podjednostki te są połączone ze sobą wiązaniem

dwusiarczkowym (S-S). Trzy jednostki GP1-SS-GP2 tworzą homotrimer,

który znajduje się na powierzchni wirionu i umożliwia jego wiązanie

z błoną zakażanej komórki [11, 14]. Krytycznym momentem podczas

wnikania wirusa Ebola do komórki jest proteoliza glikoproteiny pod wpływem

katepsyn B i L, która odbywa się w późnych endosomach/lizosomach [15].

Liczne dane literaturowe wskazują, że obecność obu katepsyn jest

niezbędna podczas przedostawania się materiału genetycznego wirusa do

cytoplazmy komórki [15‚18]. Wykazano, że początkowo katepsyna

L usuwa domenę mucyno-podobną (mucin-like domain) i resztę glikanową

(glycan cap), co oznacza rozszczepienie GP1 do mniejszej podjednostki


55

GP1 o masie 20kDa, a następnie katepsyna B odcina reszty N-końcowe od

miejsca działania katepsyny L, usuwając 1kDa masy GP1. W ten sposób

powstaje forma GP1 o masie 19kDa [11, 19]. Zatem początkowa proteoliza

GP pod wpływem katepsyny L ułatwia wiązanie białek osłonki wirusa

z czynnikami znajdującymi się w błonie endosomu. Ponadto, oprócz

procesu makropinocytozy i proteolizy prowadzonej przez katepsyny,

zidentyfikowano rolę nowego czynnika – białka znajdującego się w błonie

endosomu (NPC1), który najprawdopodobniej wiąże się z uformowaną

podjednostką GP1, umożliwiając w ten sposób wnikanie wirusa Ebola do

wnętrza zakażanej komórki [20, 21].

Aby wykazać rolę omawianych enzymów zbadano wpływ selektywnego

inhibitora katepsyny B (CA074) oraz inhibitora katepsyny B i L (FYdmk)

na zakażenie komórek Vero wirusem pęcherzykowego zapalenia jamy

ustnej (VSV) zawierającego pseudotyp GP wirusa Ebola z brakującą

domeną mucynopodobną w podjednostce GP1 (VSV-GPΔMuc). Badania

wykazały, że hamowanie zakażenia było ściśle skorelowane z inaktywacją

katepsyny B, ale nie katepsyny L [15]. Ponadto udokumentowano, że po

przekształceniu glikoproteiny, wiązanie wirusa i wydajność zakażania

komórek docelowych jest zwiększona [15‚17]. Jednakże, według Gnirss

i wsp. (2012) proces przekształcania glikoproteiny 4 podtypów EBOV:

ZEBOV, SEBOV, CIEBOV oraz REBOV w różnym stopniu zależy od

aktywności katesyn B i L podczas wnikania wirusów do komórek 293T

in vitro [22]. Warto podkreślić, że mechanizm przekształcania białek

wirusowych wiążących się z błoną komórki gospodarza jest analogiczny

u wielu innych rodzajów wirusów, np. ludzkiego wirusa niedoboru

odporności (HIV – human immunodeficiency virus), ostrego zespołu

niewydolności oddechowej (SARS – severe acute respiratory syndrome),

wirusa zapalenia wątroby myszy typu 2 (MHV – mouse hepatitis virus),

a także wirusa Hendra oraz Nipah. Białka znajdujące się na powierzchni

wymienionych wirusów ulegają proeolizie przeprowadzanej również przez

katepsyny znajdujące się w endosomach [15, 22‚26].

Aktualne dane literaturowe wskazują zatem, że zarówno katepsyna

B jak i L odgrywają niezwykle istotną rolę podczas zakażenia wirusem

Ebola na etapie przekształcania glikoproteiny wirusowej w celu prze-

dostania się materiału genetycznego wirusa do cytoplazmy.

5. Podsumowanie

Rola katepsyn podczas zakażeń wywołanych przez wirus Ebola jest

obecnie intensywnie badana. Wiele danych literaturowych wskazuje, że

wnikanie wirusa do wnętrza komórki za pośrednictwem glikoproteiny

zależy od aktywności zarówno katepsyny B jak i L, przy czym udział tych


56

enzymów w aktywacji GP może się różnić między gatunkami EBOV. Obie

katepsyny B i L promują fuzję wirusowej GP z błoną komórki gospodarza,

umożliwiając tym samym przedostawanie się materiału genetycznego

wirusa Ebola do wnętrza komórki. Wiadomo również, że zastosowanie

inhibitorów obu katepsyn wpływa na wydajność procesu zakażenia.

Na podstawie przeprowadzonych licznych badań można stwierdzić, że

katepsyny B oraz L pełnią kluczową rolę w formowaniu glikoproteiny

wirusowej, aby wirus mógł wniknąć do cytoplazmy komórki gospodarza

i rozpocząć proces replikacji materiału genetycznego. Zakażenie wywołane

przez wirus Ebola stanowi ogromne zagrożenie ze względu na duży

wskaźnik śmiertelności oraz brak swoistych metod zapobiegania i leczenia.

Dlatego też poznanie mechanizmów regulujących udział katepsyn podczas

wnikania wirusa Ebola oraz innych rodzajów wirusów może przyczynić się

do opracowania skutecznych metod zwalczania zakażeń wywołanych przez

EBOV, a także innych zakażeń wirusowych oraz opracowania efektywnych

form terapii przeciwwirusowej.

Literatura

1. Kos J., Sekirnik A., Premzl A., Zavasnik B. V., Langerholc T., Turk B., Werle B., Golouh R., Repnik U., Jeras M, Turk V., Carboxypeptidases cathepsins X and B display distinct protein profile in human cells and tissues, Experimental Cell Research, 306 (2005), s. 103-113

2. Tan G. J., Peng Z. K., Lu J. P., Tang F. Q., Cathepsins mediate tumor metastasis, World Journal of Biological Chemistry, 26 (2013), s. 91-101

3. Poręba W. , Gawlik K., Gutowicz J., Katepsyna B a proces inwazji nowotworowej, Postępy Biochemii, 48 (2002), s. 111-120

4. Turk V., Stoka V., Vasiljeva O., Renko M., Sun T., Turk B., Turk D., Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers, Biochimica et Biophysica Acta, 1824 (2012), s. 68-88

5. Magister Ń., Kos J., Cystatins in Immune System, Journal of Cancer, 4 (2013), s. 45-56

6. Brix K., McInnes J., Al-Hashimi A., Rehders M., Tamhane T., Haugen M. H., Proteolysis mediated by cysteine cathepsins and legumain – recent advances and cell biological challenges, Protoplasma, 252 (2015), s. 755-774

7. Feldmann H., Geisbert T. W., Ebola hemorrhagic fever, The Lancet, 377 (2011) s. 849-862

8. Ansari A. A., Clinical features and pathobiology of Ebolavirus infection, Journal of Autoimmunity., 55 (2014), s. 1-9

9. Wichmann D., Schmiedel S., Kluge S., Isolation in patients with Ebola virus disease, Intensive Care Medicine., 41 (2015), s. 511-513

10. World Health Organization, Ebola Response Roadmap Situation Report, (2014), s. 1-16

11. White J. M., Schornberg K. L., A new player in the puzzle of filovirus entry, Nature Reviews Microbiology, 10 (2013), s. 317-322


57

12. Saeed M. F., Kolokoltsov A. A., Albrecht T., Davey R. A., Cellular entry of ebola virus involves uptake by a macropinocytosis-like mechanism and subsequent trafficking through early and late endosomes, PLOS Pathogens, 6 (2010), s. 1-15

13. Mulherkar N., Raaben M., de la Torre J. C., Whelan S. P., Chandran K., The Ebola virus glycoprotein mediates entry via a non-classical dynamin-dependent macropinocytic pathway, Virology, 419 (2011), s. 72-83

14. Lee J. E., Saphire E. O., Ebolavirus glycoprotein structure and mechanism of entry, Future Virology., 4 (2009), s.621-635

15. Chandran K., Sullivan N. J., Felbor U., Whe;an S. P., Cunningham J. M., Endosomal Proteolysis of the Ebola Virus Glycoprotein is necessary for Infection, Science, 308 (2005). 1643-1655

16. Schornberg K., Matsuyama S., Kabsch K., Delos S., Bouton A., White J., Role of Endosomal Cathepsins in Entry Mediated by the Ebola Virus Glycoprotein, Journal of Virolo., 80 (2006), s. 4174-4178

17. Kaletsky R. L., Simmons G., Bates P., Proteolysis of the Ebola Virus Glycoproteins Enhances Virus Binding and Infectivity, Journal of Virology, 81 (2007), s. 13378-13384

18. Sanchez A., Analysis of Filovirus Entry into Vero E6 Cells, Using Inhibitors of Endocytosis, Endosomal Acidification, Structural Integrity, and Cathepsin (B and L) Activity, The Journal of Infectious Diseases, 196 (2007), s. 251-258

19. Bale S., Liu T., Li S., Wang Y., Abelson D., Fusco M., Woods V. L. Jr., Saphire E. O., Ebola Virus Glycoprotein Needs an Additional Trigger, beyond Proteolytic Priming for Membrane Fusion, PLOS Neglected Tropical Diseases, 5 (2011), s. 1-6

20. Carette J. E., Raaben M., Wong. A. C., Herbert A. S., Obernosterer G., Mulherkar N., Kuehne A. I., Kranzusch P. J., Griffin A. M., Ruthel G., Dal Cin P., Dye J. M., Whelan S. P., Chandran K., Brummelkamp T. R., Ebola virus entry requires the cholesterol transporter Niemann-Pick C1, Nature, 477 (2011) s. 340-343

21. Cote M., Misasi J., Ren T., Bruchez A., Lee K., Filone C. M., Hensley L., Li Q., Ory D., Chandran K., Cunningham J., Small molecule inhibitors reveal Niemann-Pick C1 is essential for Ebola virus infection, Nature, 477 (2011), s. 344-348

22. Kubo Y., Hayashi H., Matsuyama T., Hironori S., Yamamoto N. Reovirus Entry by Endocitosis and Cathepsin Proteases, Advances in Virology, (2012), s. 1-14

23. Huang I. C., Bosch B. J., Li W|., Farzan M., Rottier P. M., Choe H., SARS-CoV, but not HCoV-NL63, utilizes cathepsins to infect cells: viral entry, Advances in Expreimental Medicine and Biology, 581 (2006), s. 335-338

24. Qiu Z., Hingley S. T., Simmons G., Yu C., Das Sarma J., Bates P., Weiss S. R., Endosomal proteolysis by cathepsins is necessary for Marine coronavirus Mouse hepatitis virus type 2 spike-mediated entry, Journal of Virology, 80 (2006), s. 5768-5776

25. Pager C. T., Dutch R. E., Cathepsin L is involved in proteolytic processing of the Hendra virus fusion protein, Journal of Virology., 79 (2005), s. 12714-12720

26. Pager C. T., Craft W. W. Jr., Patch J., Dutch R. E., A mature and fusogenic

form of the Nipah virus fusion protein requires proteolytic processing

by cathepsin L,Virology 346 (2006), s. 251-257


58


Streszczenie Katepsyny należą do lizosomowych proteaz cysteinowych – enzymów, katalizujących

hydrolityczny rozpad łańcucha peptydowego. Umiejscowione są w lizosomach jako

endopeptydazy. Działanie katepsyn jest ściśle regulowane ze względu na ich wysokie

stężenie w komórce i zdolność do pracy w środowisku kwaśnym. Ich rola polega głównie na przekształcaniu wielu proenzymów i prohormonów w formy aktywne, jednak ich funkcja

zależy przede wszystkim od ich lokalizacji w komórce lub tkance.

Ostatnio przeprowadzone badania wykazały, że katepsyny B i L są niezbędnymi czynnikami

podczas wnikania wirusa Ebola do komórek. Pierwszym etapem wniknięcia wirusa jest wiązanie z czynnikami mocującymi i receptorami na powierzchni komórek za pomocą

wirusowej glikoproteiny (GP), składającej się z dwóch podjednostek: GP1 i GP2. Następnie

wirus ulega internalizacji do wczesnego endosomu, który jest przekształcany do późnego

endosomu/lizosomu zawierającego katepsyny B i L. Proteazy te powodują rozszczepienie

GP1 do mniejszej podjednostki GP1 o masie 20 kDa, a następnie do jeszcze mniejszej

podjednostki o masie 19 kDa. Najbardziej krytycznym etapem zakażenia jest rozpoczęcie

fuzji wirusa i błony endosomu, co jest niezbędne do penetracji wirusa i jego replikacji.

Podsumowując, katepsyny B i L biorą udział w krytycznym etapie – proteolizie GP wirusa Ebola, umożliwiając fuzję wirusa z błoną endosomu, co prowadzi do zakażenia.

Zrozumienie szczegółowej roli katepsyn może przyczynić się do rozwoju skutecznych

metod zapobiegania oraz leczenia zakażenia wirusem Ebola.

The role of cathepsins B and L during Ebola virus entry

Abstract

Cathepsins belong to the lysosomal cysteine proteases – a group of enzymes that catalyze the hydrolytic breakdown of the peptide chain. They are located in lysosomes as the

endopeptidases. The activity of cathepsins is tightly regulated due to their high

concentration in cells and the ability to operate in an acidic environment. Their major role

is the transformation of many proenzymes and prohormones into their active form. However, their function depends on the cathepsin location in the cell compartment or in a tissue.

Recent studies have shown that cathepsin B and cathepsin L are essential factors during

Ebola virus (EBOV) infection. The first stage of virus penetration is binding to the

attachment factors and receptors on the cell surface through the viral glycoprotein (GP), that is composed of two subunits: GP1 and GP2. Next, virus is internalized into a macro-

pinosome, which is then converted into late endosome/lysosome containing cathepsin B and

cathepsin L. These proteases cleave EBOV GP1 and generate a 20 kDa fragment, and then

a 19 kDa form of the glycoprotein. The most critical step is the initiation of fusion between viral and endosome membrane, which is required for the virus penetration and ensuing

replication.

In summary, cathepsins B and L are involved in the critical step – the proteolysis of EBOV

GP, that enablies the fusion of the viral and endosome membrane and that leads to the infection. Understanding the detailed role of the cathepsins could contribute to the

development of the methods for the prevention and treatment of Ebola virus infections.

59

Olga Andrzejczak1

Lizozym – aktualne trendy w nauce i przemyśle

1. Wprowadzenie

Lizozym (N– acetylomuramylohydrolazamukopeptydowa, muramidaza,

N- cetylomuramylohydrolaza,1,4-β-N-acetylomuramidaza) jest enzymem

z klasy hydrolaz, powszechnie obecnym w świecie żywym, o numerze EC

3.2.1.17 w klasyfikacji enzymów opracowanej przez Komitet Nazewnictwa

Międzynarodowej Unii Biochemii i Biologii Molekularnej (Nomenclature

Committee of International Union of Biochemistry and Molecular Biology,

IUBMB) [1, 2, 3].

Występuje zarówno w organizmach wirusów, bakterii, bakteriofagów,

roślin jak i zwierząt. Nazwę nadał mu już w 1922 r. Aleksander Fleming

(1881-1955), który jako jeden z pierwszych zaobserwował obecność bakte-

riolitycznie działającego czynnika, obecnego w płynach ustrojowych [1, 3, 4].

Prowadzone w kolejnych latach badania nie wykazały przydatności

lizozymu jako bezpośredniej substancji bakteriobójczej w leczeniu chorób

[1]. Zaczęto go natomiast wykorzystywać jako substancję modelową

w licznych badaniach z zakresu mikrobiologii, medycyny, enzymologii,

krystalografii oraz biologii molekularnej. Znalazł również zastosowanie

jako środek konserwujący w przetwórstwie żywności [5, 6]. Dopiero

przełom XX i XXI wieku przyniósł nowe możliwości zastosowania tego

białka. Wiele z nich w dalszym ciągu znajduje się w fazie badań

laboratoryjnych.

Niniejsza praca stanowi przegląd aktualnego stanu wiedzy dotyczącej

lizozymu, ze szczególnym uwzględnieniem kierunków badań nad tym

enzymem.

2. Podstawowe informacje

Łańcuch białkowy lizozymu tworzy 129 resztaminokwasowych. Struktura

natywna stabilizowana jest dzięki czterem mostkom disiarczkowym. Masa

cząsteczki jest równa 14,4 kDa, wartość punktu izoelektrycznego to,

zależnie od źródła pochodzenia enzymu, od 10,7 do 11,0, zaś jej kształt jest

niemal elipsoidalny, o wymiarach 4,5 × 3,0 ×3,0 nm. Nie zawiera grupy

[email protected], Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii, Wydział

Biotechnologii i Nauk o Żywności, Politechnika Łódzka, www.p.lodz.pl

Olga Andrzejczak

60

prostetycznej. Strukturę trzeciorzędową tworzą dwie domeny, z których

jedna zawiera przede wszystkim struktury β- kartki, druga natomiast

α-helisy. Pomiędzy oboma domenami znajduje się szczelina z miejscem

aktywnym wiążącym substrat. W przebiegu reakcji enzymatycznej

uczestniczą reszta kwasu glutaminowego (Glu35) oraz reszta kwasu

asparaginowego (Asp52), ulokowane po dwóch przeciwnych stronach

wiążącej substrat szczeliny[3, 6, 7, 8].

Działanie enzymu polega na katalizie rozkładu muraminy – peptydoglikanu

będącego składnikiem budulcowym bakteryjnych ścian komórkowych.

Enzym rozszczepia w peptydoglikanie wiązanie β-1,4-glikozydowych

pomiędzy atomem C-1 kwasu N- acetylomuraminowego (MurNAc) oraz

atomem C-4 Nacetyloglukozaminy (GlcNAc) [9]. Do rozszczepienia

wiązania glikozydowego konieczna jest obecność cząsteczki wody.

W cząsteczce lizozymu grupy hydrofobowe zgrupowane są w jej części

wewnętrznej, hydrofilowe zaś w zewnętrznej. Wiązanie substratu odbywa

się za pomocą działania sił van der Waalsa. Towarzyszy temu zmniejszanie

się szczeliny z miejscem aktywnym [3, 6, 7, 8].

Lizozym wykazuje działanie hydrolityczne w stosunku do ścian

komórkowych bakterii Gram- dodatnich. Jego aktywność w kierunku

bakterii Gram- ujemnych jest nieduża, ze względu na zawarte w ich

ścianach komórkowych dodatkowe polipeptydy, lipoproteiny oraz

lipopolisacharydy, które tworzą warstwę ochronna. Utrudnia ona dostęp

enzymom i może stanowić czynnik inaktywujący. Lizozym wykazuje

również aktywność w kierunku komórek eukariotycznych [3, 6]. Enzym ten

jest bardzo stabilny termicznie ze względu na obecność mostków

disiarczkowych. Jest również stabilny w roztworach kwaśnych.

Ogrzewanie roztworu muramidazy o pH poniżej 8,5 do temperatury równej

100°C nie powoduje inaktywacji enzymu. Stopniowa utrata aktywności

zachodzi natomiast w pH przekraczającym 9,0 [8].

Muramidaza wykazuje działanie przeciwbakteryjne, przeciwgrzybicze,

przeciwwirusowe i przeciwzapalne [6]. Stwierdzono jej działanie anta-

gonistyczne wobec m.in. Bacillus sp. (B. subtilis, B. licheniformis, B. mega-

terium, B. mycoides, B. pumilus, B. coagulans, B. amyloliquefaciens,

B. polymexa, Bacillusanthracis i B. macerans) [10, 11, 12]. Wykazano

również,iż muramidaza może wykazywać działanie przeciwwirusowe

wobec wirusaHIV-1 [13, 14]. W innych badaniach stwierdzono, iż niskie

stężenia laktoferrynyi lizozymu mogą zapobiegać tworzeniu się

biofilmowKlebsiellapneumoniaesubsp. pneumoniae [15]. W pracy tej

badano biofilmy złożone z jednego rodzajubakterii- K. pneumoniae subsp.

pneumoniae lub E. coli. Lizozym może także działać antagonistycznie

wobec grzybow mikroskopowych [16, 17]. W badaniach opisano muramidazę


61

wyizolowaną z fasoli mung,wykazującą aktywność zarowno przeciwgrzybiczą

(wobec Pythiuma phanidermatum, Sclerotiumrolfsii i Botrytiscinerea), jak

i przeciwbakteryjną(wobec Staphylococcus aureus) [16]. W innej pracy

opisano lizozym wyizolowany z fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris).

Enzym wykazywał działanie hamujące wobec grzybów z gatunków Alternaria

alternata (Fr). Keissl, Pythiuma phanidermatum, Fusarium oxysporum

i Botrytiscinerea, orazdziałanie przeciwbakteryjne wobec Staphylococcus

aureus. Jednakże, niewykazał efektu przeciw-bakteryjnego wobec bakterii

Gram-ujemnych [17]. Opisano również aktywność przeciwdrobnoustrojową

wobec bakterii Salmonella sp. oraz Proteus mirabilis i Pseudomonas

fluorescens [18, 19]. W tabeli 1 przed-stawiono przykłady mikroorga-

nizmów, wobec których lizozym wykazuje aktywność.

Tabela 1.Przykłady mikroorganizmów podatnych na działanie lizozymu

Grupa Przykłady Referencje

Wirusy HIV-1 [13,14]

Bakterie Gram- ujemne Salmonella [18]

Proteus [19]

Pseudomonas [19]

Klebsiella [15]

Eschericha [20]

Bakterie Gram-dodatnie Bacillus [10. 11, 12]

Lactobacillus [21]

Listeria [18]

Staphylococcus [16]

Streptococcus [22]

Grzyby mikroskopowe Fusariumoxysporum [16]

Fusariumsolani [16]

Pythiumaphanidermatum [16]

Sclerotiumrolfsii [16]

Botrytiscinerea [16]

Candida albicans [23]

Źródło: Opracowanie własne.

Olga Andrzejczak

62

3. Lizozym w świecie organizmów żywych.

Lizozym jest jednym ze składników nieswoistej, humoralnej odpowiedzi

immunologicznej. Występuje w przyrodzie powszechnie, począwszy

od organizmów najprostszych, do jakich należą wirusy aż po organizmy

wyższe.

Jego obecność stwierdzono w organizmach wszystkich typów

kręgowców- ryb, płazów, gadów, ptaków oraz ssaków. Można go znaleźć

w komórkach układu immunologicznego (granulocytach, monocytach,

makrofagach) w płynach ustrojowych (osocze krwi), w wydzielinach

(surowiczo- śluzowe, ślina, łzy, mleko) oraz jajach ptaków [1, 6, 24].

Tabela 2 przedstawia zawartość tego białka w wybranych wydzielinach

pochodzenia roślinnego i zwierzęcego.

Tabela 2. Zawartość lizozymu w wybranych źródłach, w organizmach roślinnych i zwierzęcych

(ppm świeżej masy (FW)); zastosowana jednostka oznacza liczbę cząstek na milion i jest

jednostka stężenia molowego.

Królestwo Źródło Lizozym (ppm FW)

Zwierzęta Białko jaja kurzego 2500–3500

Białko jaja kaczego 1000-1300

Białko jaja gęsiego 500-700

Łzy człowieka 3000-5000

Mleko człowieka 55-75

Krowie mleko 10-15

Ludzka śledziona 50-160

Ludzka grasica 60-80

Ludzka trzustka 20-35

Rośliny Sok z kalafiora 25-28

Sok z papai 8-9

Sok z kapusty 7-8

Źródło: Na podstawie [3]

Wymienia się trzy postaci lizozymu obecne u organizmów zwierzęcych.

Są to typ c (ang. chicken, conventional type; tzw. typ kurzy), typ g (ang.

goose-type; tzw. typ gęsi), a także obecny m.in. w organizmach bez-

kręgowców typ i (ang. invertebrate type). Lizozym należący do typu c,

pochodzący z białka jaja kurzego stanowi model w badaniach dotyczących

struktury i funkcji lizozymu. Tabela 3 przedstawia wszystkie trzy główne typy

muramidazy i organizmy świata zwierząt, w których można je znaleźć [1].


63

Tabela 3. Główne typy lizozymu występujące w świecie zwierząt

Typ Organizmy

Typ c Strunowce (bezczaszkowce, kręgowce)

Stawonogi

Typ g Strunowce (osłonice, kręgowce)

Mięczaki

Typ i Szkarłupnie

Mięczaki

Pierścienice

Nicienie

Gąbki

Stawonogi

Źródło: Na podstawie [1].

Zmiany poziomu lizozymu w organizmach żywych stosowane są jako

markerrożnego rodzaju procesów. Dla przykładu w badaniach prowadzonych

nadrybami Rutilusfrisii kutum należącymi do karpiokształtnych stwier-

dzono,iż zawartość muramidazy obecnej w tkankach nerek, wątroby

i śledzionyosobnikówzarówno męskich jak i żeńskich spadała w okresie od

października do marca, odpowiadającemu najniższym temperaturom

powierzchni morza,zwiększała się zaś w okresie tarła [25].

4. Zastosowanie praktyczne lizozymu i aktualne kierunki badań

Lizozym wykorzystywany jest obecnie w takich dziedzinach jak

medycyna,kosmetologia czy też przemysł spożywczy. Głównym źródłem

handlowymlizozymu jest białko jaja kurzego [3]. Badania nad zastosowaniem

lizozymunadal trwają. Niniejszy rozdział prezentuje wykorzystanie lizozymu

w przemyśle oraz kierunki badań prowadzonych nad tym enzymem.

4.1. Przechowalnictwo żywności

W ostatnich latach wiele uwagi i zainteresowania skierowano na

naturalne środki przeciwdrobnoustrojowe, które mogłyby być wyko-

rzystywane w przemyśle spożywczym. Tymczasem lizozym został uznany

przez KomisjęEkspertow WHO/FAO ds. stosowania dodatków do

żywności za środek bezpieczny już w 1992 roku. Dozwolono na jego

stosowanie podczas produkcji i utrwalaniażywności. Obecnie jest stosowany

na skalę przemysłową w wielu krajach Europy (m. in. Belgia, Francja,

Dania, Włochy, Niemcy), w Australii i Japonii. W wielu gałęziach

przemysłu spożywczego wykorzystuje się go powszechnie do kontroli

Olga Andrzejczak

64

bakterii kwasu mlekowego w różnorodnych produktach, jak również do

celu utrwalania świeżych warzyw, owoców, ryb i mięsa poprzez pokrycie

ich powierzchni lizozymem [3, 26]. Wykazano, że czysty, wyizolowany

enzym może wydłużyć termin przydatności do spożycia artykułów

żywieniowych [26].

Wysoka stabilność termiczna umożliwia zachowanie aktywności

litycznej tego białka w szerokim zakresie temperatur, co wykorzystywane

jest podczas konserwacji produktów rybnych i mięsnych. Z kolei

w przemyśle serowarskim, podczas produkcji serów dojrzewających,

stanowi czynnik redukujący liczbę

bakterii kwasu mlekowego (przyczyna tzw. późnego wzdęcia serów).

Pozwala również na monitoring obecności bakterii kwasu mlekowego

w piwie i winie,bez wpływu na właściwości sensoryczne gotowego

produktu. W piwie nie pogarsza również stabilności piany. Hamuje także

rozwój tzw. hiochi – bakterii w sake.

Duże zróżnicowanieproduktów spożywczych sprawia, iż opracowano

różnorodne formy aplikacji enzymu – w formie dodatku do przetworów,

w postaci środka powlekającego lub roztworówprzeznaczonych do sprys-

kiwania lub tez moczenia gotowych wyrobów [6, 26].


65

Tabela 4.Zastosowanie preparatów enzymatycznych opartych na lizozymie

Branża Produkt Mechanizm działania

Mleko

i nabiał

Mleko Inhibicja Listeria monocytogenes

Twardy ser Inhibicja Clostridium tyrobutyricum,

Bacillus cereus

Odtłuszczone mleko Oddziaływanie na Listeria monocytogenes i L. Plantarum przez połączenie lizozymuz

homogenizacją wysokociśneniową

Camembert Inhibicja Listeria monocytogenes

Mięso

i ryby

Świeże mięso Inhibicja Carnobacteriumsp.845 przez

połączenie lizozymu i nizyny

Bawole mięso Działanie bakteriobojcze na Brochotrix

thermosphacta przez połączenie lizozymu i EDTA

Mielone mięso

Inhibicja wzrostu Pseudomonas

fluorescens dzięki kombinacji lizozymu ichitooligosacharydow, przedłużenie

terminu przydatności do spożycia produktu

Szynka i kiełbaski

bolońskie

Inhibicja Microchothrix thermosphacta,

Leuconos tocmesenteroides przez

połączenie lizozymu i nizyny

Paszteciki mięsne

zestrusia

Aktywność antybakterujna kombinacji

lizozymu, nizyny i EDTA wobec Listeria

monocytogenes

Schabwieprzowy Inhibicja Brachothrix thermosphacta

Surowy mielony

tuńczyk i produkty zikry

łososia

Kontrola wzrostu Listeria monocytogenes

Dorsz Kontrola wzrostu Listeria monocytogenes

Napoje

Czerwone i białewino Kontrola wzrostu Oenococcus oeni, Lactobacillus

spp., Pediococcus damnosus, Pediococcus parvulus

Piwo Opóźnienie wzrostu Lactobacillus brevis,

Pediococcus damnosus

Soki owocowe Kontrola wzrostu Shigella typhimurium

Źródło: Według [3]

W handlu dostępne są preparaty zawierające peptydy uzyskane

z lizozymu,wykorzystywane jako naturalny środek konserwujący żywność.

Wykazano,iż zastosowanie ich w stężeniu równym bądź większym niż

10 μg/ml działainhibująco wobec zarówno wegetatywnych jak i przetrwal-

nikowych formBacillussubtilis, które są uznawane za czynnik powodujący

zatrucia pokarmowe [10]. W innych badaniach analizowano wpływ

lizozymu nie poddanegomodyfikacjom na żywotność Bacillus cereus,

B. subtilis, B. anthracis orazB. pumilusw białku jaja, mielonej wołowinie

i mleku [11]. Stwierdzono,iż dodatek lizozymu w dawce 2mg/ml,

w temperaturze reakcji równej 60ₒCzwiększył szybkość inaktywacji

Olga Andrzejczak

66

B. anthracisw stosunku do próby bez dodatkulizozymu. Tabela 4 prezentuje

niektóre możliwości potencjalnego zastosowania preparatów enzymatycznych

zawierających lizozym.

Prowadzono również badania nad optymalizacją pH, temperatury

i czasuw procesie termicznej modyfikacji lizozymu w celu zwiększenia

jegowłaściwości bakteriobójczych wobec E. coli, która jest bakteria Gram-

ujemną,przy równoczesnym zachowaniu aktywności bakteriobójczej wobec

bakteriiGram- ujemnych. Najlepsze wyniki pozwolił uzyskać czas

modyfikacji równy 15 minut, temperatura 80°C, oraz bufor octanowy o pH

4,40 jako środowiskoreakcji [28]. Podjęto również próby chemicznych

modyfikacji lizozymu [29]. Tabela 5 przedstawia przykłady tego typu

modyfikacji oraz ichpotencjalne zastosowanie. Przykładem może być

sprzęganie glukozaminy do lizozymu za pomocą rozpuszczalnego

w wodzie karbodiimidu, poprawiające właściwości funkcjonalne tego

białka, takie jak m. in. lepsza rozpuszczalność w różnych wartościach pH

i temperatury [30].

Yuceer i Caner badali zastosowanie tego enzymu pod kątem zwiększania

świeżości przechowywanych jaj [5]. Stosowano lizozym samodzielnie

orazw kombinacji z chitozanem w powłokach, którymi powlekano

przechowywanejaja. Badania wykazały, iż 10, 20 oraz 60% dodatek

lizozymu w kombinacjiz chitozanem może być obiecującą alternatywą dla

stosowanych obecnie technikpozwalających na utrzymanie świeżości długo

przechowywanych jaj.

W innych badaniach [29] analizowano fizykochemiczne i bakterio-

statyczne właściwości lizozymu zmodyfikowanego z wykorzystaniem

kwasu mlekowego.Biały proszek uzyskiwany poprzez żelowanie jaj

kwasem mlekowymrozpuszczany w roztworach o wartości pH od 2 do 10,

przy czasach inkubacji 30-720 minut wykazywał aktywność enzymatyczną

rzędu 50%. Spadekaktywności enzymatycznej obserwowano wraz ze

wzrostem stężenia soliw roztworze, jak również wraz ze wzrostem

temperatury (w zakresie 40-100○C). badany preparat wykazywał

aktywność bakterostatyczną w stosunku dobakterii E. coli K12,

S. typhimurium TA98 i B. cereus BCRC 15324. Stwierdzono, iż zasto-

sowana metoda może stanowić tanią alternatywę dlastosowanych obecnie

w przemyśle spożywczym dodatków bakteriostatycznych.


67

Tabela 5.Modyfikacje lizozymu oraz ich właściwości

Modyfikacja Wpływ na funkcjonalność

Glukozamina

Ulepszona rozpuszczalność w różnych wartościach pH

i temperatury, zwiększona stabilność cieplna, aktywność

i stabilność emulsji

Dekstran Zwiększona aktywność przeciwbakteryjna względem E. coli

i S. aureus w produktach spożywczych (np. serze, mleku)

Dekstran Działanie bakteriobójcze wobec bakteryjnych

izolatów od krów cierpiących na zapalenie sutek

Chitozan Działanie ochronne przeciw E. coli, L. monocytogenes

i S. faecalis

Celuloza Przygotowanie tekstyliow z potencjalną barierą przeciw

inwazji drobnoustrojowej

Guma arabska Zwiększona aktywność przeciwbakteryjna

względem E. coli i S. aureusw majonezie

Guma ksantanowa Zwiększona aktywność przeciwbakteryjna

względem E. coli i S. aureus

Siarczan dekstranu Zwiększona aktywność przeciwbakteryjna


Beta- glukan

jęczmienia

Zwiększona aktywność przeciwbakteryjna


Tragakanta Zwiększona aktywność przeciwbakteryjna

względem E. coli, S. typhimyrium, B. cereus i S.aureus

Inulina Ulepszone właściwości użytkowe

Trawienie ficyną

i trypsyna lizozymu

sprzężonego z dekstranem

Zwiększona aktywność peptydów E. coli i B.cereus

Źródło: Na podstawie [31], zmienione.

4.2. Medycyna i weterynaria

W branży farmaceutycznej lizozym od wielu lat wykorzystuje się

w produktach farmaceutycznych mających na celu leczenie zakażeń bakte-

ryjnych, wirusowych i grzybiczych, np. leczenie bólu gardła, zwiększających

naturalną odporność organizmu, w terapii wspomagającej w chorobach

nowotworowych (jako środek przeciwbólowy), w leczeniu paradontozy,

w zapobieganiu próchnicy, w odżywkach dla niemowląt, w mleku przez-

naczonym do karmienia wcześniaków cierpiących na rożnego rodzaju infekcje,

w terapii leukemii wywołanej promieniowaniem jonizującym czy też prepa-

ratach do czyszczenia soczewek). Lizozym w znaczący sposób wspomaga

terapię antybiotykowa, jak również leczenie z zastosowaniem antys-

eptyków,kortykosteroidów i enzymów proteolitycznych. Lizozym jest również

wykorzystywany w testach immunologicznych typu ELISA [3, 6, 7, 31, 32].

Analizowano aktywność lizozymu z jaja kurzego, osadzanego na

tradycyjnych i hydrożelowych materiałach stosowanych przy produkcji

soczewek kontaktowych [32]. Soczewki przechowywano w warunkach

Olga Andrzejczak

68

in vitro w buforze fosforanowym (PBS) z dodatkiem 2mg/ml lizozymu

z jaja kurzego, a następnie krotko płukano w PBS w celu usunięcia

niezwiązanego materiału.Aktywność lizozymu wahała się od 24% do aż

91% w zależnościod zastosowanego do produkcji soczewek materiału.Hall

i wsp. badali nowy proces umożliwiający określenie aktywności biolo-

gicznej nienaruszonej warstwy lizozymu znajdującej się na powierzchni

biomateriału, wykorzystywany w produkcji soczewek kontaktowych [33].

Peptydy uzyskiwane z lizozymu odznaczają się działaniem bakterio-

statycznym pomimo, iż nie zachowują aktywności enzymatycznej. Przykładem

jest peptyd o sekwencji aminokwasowej His−Gly−Leu−Asp−Asn−Tyr−Arg,

hamujący aktywność bakterii Staphylococcusaureus.Ichzaletami są niska

masa cząsteczkowa oraz brak odczynu alergicznegou pacjentów leczonych

preparatami z ich udziałem. Natomiast zastosowanieniemodyfikowanego

lizozymu może skutkować reakcją alergiczną pacjentów [8].

Prowadzono również badania dotyczące oddziaływania preparatów

zawierających lizozym na zwierzęta. Wykazano korzystny wpływ

stosowaniadodatku lizozymu w diecie prosiąt na wzrost zwierząt, stan ich

jelit orazodporność nieswoistą [34]. Zwierzęta karmiono przez okres 28 dni

dietąz dodatkiem 0, 30, 60, 90 i 120 mg/kg lizozymu i antybiotyków.

Dodateklizozymu na poziomie 90 mg/kg paszy dawał większy średni

dzienny przyrostmasy zwierząt w stosunku do grupy kontrolnej, jak

również lepszy stan zdrowiajelit prosiąt. Suplementacja diety dodatkiem

lizozymu w ilości 60 i 90 mg/kg zwiększała natomiast aktywność

fagocytarną makrofagów otrzewnowych u prosiąt.

W innych badaniach oceniano reakcję prosiąt otrzymujących preparat

rozpuszczonego w wodzie lizozymu (4000 jednostek lizozymu/ mg)

po doustnym obciążeniu enterotoksycznym szczepem E. coli [35].

Z kolei ocena samej aktywności lizozymu w organizmach ludzi

i zwierzątmoże być wskaźnikiem występowania zmian patologicznych lub

stanowićparametr pozwalający na ocenę zmian zachodzących w ich

organizmach podwpływem niekorzystnych warunków środowiskowych.

W badania nad karasiemzłocistym (Carassiusauratus) oceniano zmiany

aktywności muramidazy w odpowiedzi na stan niedotlenienia u ryb.

Aktywność lizozymu i enzymów antyoksydacyjnych mierzono w nerkach

i wątrobie po ekspozycji na warunkiniedotlenienia.

Badania pozwoliły zaobserwować znaczący spadek aktywności enzymów

antyoksydacyjnych i lizozymu przy poziomie tlenu rozpuszczonego

równym 1i 2 mg/l [36].


69

5. Podsumowanie

Lizozym jest enzymem obecnym w komórkach wielu organizmów,

występujezarówno w organizmach jednokomorkowych, jak i wyższym.

Pierwszedoniesienia na jego temat datują się na l. 20 XX w. Mimo, iż jest

on stosunkowodobrze opisany, wciąż stanowi temat kolejnych badań i prac

naukowych. Dziękiswoim właściwościom przeciwbakteryjnym, przeciw-

grzybiczym, przeciwwirusowym i przeciwzapalnym praktyczne zastosowanie

znalazłzarówno w medycynie, weterynarii jak i przemyśle spożywczym,

przedewszystkim w przechowalnictwie żywności. Nadal trwają prace nad

nowymimożliwościami aplikacji tego białka w różnorodnych dziedzinach

naukii przemysłu.

Literatura

1. Callewaert L., Michiels C.W., Lysozymes in the animal kingdom, Journal

of Biosciences, 35 (2010), s. 127-160

2. Enzymenomenclaturedatabase. http://enzyme.expasy.org/EC/3.2.1.17

(dostęp:28.11.2015)

3. Liburdi K., Benucci I., Esti M., Lysozyme in Wine: An Overview of Current

andFuture Applications, Comprehensive Reviews in Food Science and Food

Safety,13(2014), s. 1062-1073

4. Wiesner J., Vilcinskas A., Antimicrobial peptides: the ancient arm of the

humanimmune system, Virulence, 1 (2010), s. 440-464

5. Yuceer M., Caner C., Antimicrobial lysozyme – chitosan coatings affect

functionalproperties and shelf life of chicken eggs during storage, Journal

of the Science ofFood and Agriculture, 94 (2014), s.153-162

6. Borowiak R., Leśnierowski G., Próba zwiększenia funkcjonalności

preparatówotrzymanych metodą wysokotemperaturowej modyfikacji lizozymu,

Żywność NaukaTechnologia Jakość, 19(2012), s. 124-134

7. Leśnierowski G., Kijowski J., Lysozyme, BioactiveEggCompounds.

Edytorzy:Huopalathi R., Lopez R., Anton M., Schade R. Springer-Verlag,

Berlin 2007, s. 33-42

8. Gołąb K., Warwas M., Białka jaja kurzego – właściwości biochemiczne

izastosowania, Advanced in Clinical and ExperimentalMedicine, 14(2005),

s. 1001-1010

9. Leśnierowski G., Fizykochemiczne metody modyfikacji i pomiaru aktywności

lizozymu, Rozpr. nauk. Wyd. AR w Poznaniu, Poznań 387(2007), 387, s. 1-104

10. Abdou A. M., Higashiguchi S., Aboueleinin A. M., Kim M., Ibrahim H. R.,

Antimicrobial peptides derived from hen egg lysozyme with inhibitory effect

againstBacillus species, Food Control., 18(2007), s. 173-178

11. Guariglia-Oropeza V., Helmann J. D., Bacillus subtilis σV confers

lysozymeresistance by activation of two cell wall modification pathways,

peptidoglycan O-acetylation and d-alanylation of teichoic acids, Journal

of bacteriology, 193(2011),s. 6223-6232

Olga Andrzejczak

70

12. Sung K., Khan S. A., Nawaz M. S., Cerniglia C. E., Tamplin M. L., Phillips R.

W., Kelley L. C., Lysozyme as a barrier to growth of Bacillus anthracis strain

Sterne inliquid egg white, milk and beef, Food microbiology, 28(2011),

s. 1231-1234

13. Cole A. M., Cole A. L., Review article: Antimicrobial Polypeptides are Key

Anti-HIV- 1 Effector Molecules of Cervicovaginal Host Defense, American

Journal – of Reproductive Immunology, 59(2008), s. 27-34

14. Lee-Huang S., Maiorov V., Huang P. L., Ng A., Lee H. C., Chang Y. T., Chen

H. C., Structural and functional modeling of human lysozyme reveals a

uniquenonapeptide, HL9, with anti-HIV activity, Biochemistry, 44(2005),

s. 4648-4655

15. Sheffield C. L., Crippen T. L., Poole T. L., Beier R. C., Destruction of single

speciesbiofilms of Escherichia coli or Klebsiella pneumoniae subsp.

pneumoniae bydextranase, lactoferrin, and lysozyme, International

Microbiology, 15(2013),s. 183-187

16. Wang S., Ng T.B., Chen T., Lin D., Wu J., Rao P., Ye, X., First report

of a novel plantlysozyme with both antifungal and antibacterial activities,

Biochemical andbiophysical research communications, 327(2005), s. 820-827

17. Wang S., Ye X.,Rao P., Isolation of a novel leguminous lysozyme and study

on theantifungal activity, Food research international, 47(2012), s. 341-347

18. Datta S., Janes M. E., Xue Q. G., Losso J., La Peyre, J. F., Control

of Listeriamonocytogenes and Salmonella anatum on the surface of smoked

salmon coatedwith calcium alginate coating containing oyster lysozyme and

nisin, Journal ofFood Science, 73(2008), s. 67-71

19. Cegielska-Radziejewska R., Szablewski T., Leśnierowski G., Kijowski, J.,

Przeciwbakteryjna aktywność modyfikowanego lizozymu wobec bakterii

Proteusmirabilis i Pseudomonasfluorescens, Aparatura Badawcza

i Dydaktyczna, 15(2010), s. 79-84

20. Chen X., Niyonsaba F., Ushio H., Okuda D., Nagaoka I., Ikeda, S., Ogawa H.,

Synergistic effect of antibacterial agents human β-defensins, cathelicidin LL-

37 andlysozyme against Staphylococcus aureus and Escherichia coli, Journal

ofdermatological science, 40(2005), s. 123-132

21. Tribst A. A., Franchi M. A., Cristianini M., Ultra-high pressure

homogenizationtreatment combined with lysozyme for controlling

Lactobacillus brevisontamination in model system, Innovative Food Science

& Emerging Technologies, 9 (2008)., s. 265-271

22. Domenech M., Garcia E., Moscoso M., In vitro destruction of Streptococcus

pneumoniae biofilms with bacterial and phage peptidoglycan hydrolases,

Antimicrobialagents and chemotherapy, 55(2011), s. 4144-4148

23. Samaranayake Y. H., Cheung B. P. K., Parahitiyawa N., Seneviratne C. J.,

Yau J. Y. Y.,Yeung K. W. S., Samaranayake L. P., Synergisticactivity

of lysozyme and antifungalagentsagainst Candida albicansbiofilms on

dentureacrylicsurfaces, Archives oforalbiology, 54(2009), s. 115-126

24. Futoma-Kołoch B., Bugla-Płoskońska G., Efektywność bakteriobójczego

działaniasurowicy wynikająca z obecności układu dopełniacza i lizozymu


71

wobec bakterii, które unikają odpowiedzi immunologicznej organizmu,

Postępy Hig. Med. Dośw.,2009; 63: 471-484

25. Heidari B., Farzadfar F., Effects of temperature and gonadal growth on the

lysozymelevel of immune tissues in the male and female Caspian kutum

(Rutilusfrisiikutum), AquacultureResearch, (2015), DOI: 10.1111/are.12886

26. Salejda A. M., Krasnowska G., Bioaktywne składniki jaja kurzego –

możliwości aplikacyjne w biokonserwacji mięsa oraz jego przetworów,

Bromatologia i chemiatoksykologiczna., 47(2014), s. 72- 81

27. Cegielska-Radziejewska R., Leśnierowski G., Kijowski J., Properties and

application of egg white lysozyme and its modified preparations – a review,

PolishJournal of Food Nutrutrition Sciences,58 (2008), 5-10

28. Kopeć K., Lutyńska A., Dąbkowska K., Intensyfikacja właściwości

bakteriobojczych lizozymu na drodze jego termicznej modyfikacji, Inżynieria

i Aparatura Chemiczna, 4(2014), 259-260

29. Ramezani R., Esmailpour M., Aminlari M., Effect of conjugation with

glucosamine on the functional properties of lysozyme and casein, Journal

of the Science of Food and Agriculture, 88(2008), 2730-2737

30. Aminlari L., Hashemi M. M., Aminlari M., Modified Lysozymes as Novel

Broad Spectrum Natural Antimicrobial Agents in Foods, Journal of food

science, 79(2014), 1077-1090

31. Zimecki M., Artym J., Właściwości terapeutyczne białek i peptydów z siary

i mleka, Postepy i Higiena Medycyny Doświadczalnej, 59(2005), s. 309-323

32. Suwala M., Glasier M. A., Subbaraman L. N., Jones L., Quantity and

conformationof lysozyme deposited on conventional and silicone hydrogel

contact lens materialsusing an in vitro modell, Eye & contact lens, 33(2007),

s. 138-143

33. Hall B., Jones L., Forrest J. A., Measuring the kinetics and activity

of adsorbedproteins: In vitro lysozyme deposited onto hydrogel contact lenses

over short timeperiods. Journal of Biomedical Materials Research Part A.,

101(2013), s. 755-764

34. Long Y., Lin S., Zhu J., Pang X., Fang Z., Lin Y., Wu D. (2015)., Effects

of dietarylysozyme levels on growth performance, intestinal morphology, non-

specific immunity and mRNA expression in weanling piglets, Animal Science

Journal, doi:10.1111/asj.12444

35. Nyachoti C. M., Kiarie E., Bhandari S. K., Zhan, G., Krause, D. O. ,Weaned

pigresponses to K88 oral challenge when receiving a lysozyme supplement,

Journal ofanimal science, 90(2012), s. 252-260

36. Zhao Y., Jiang X., Kong X., Di G., Nie G., Li, X., Effects of hypoxia

on lysozymeactivity and antioxidant defences in the kidney and spleen

of Carassiusauratus, Aquaculture Research, (2015). DOI: 10.1111/are.12876

Olga Andrzejczak

72


Streszczenie Artykuł stanowi przegląd aktualnego stanu wiedzy dotyczącego lizozymu, enzymu

obecnego zarowno w organizmach jednokomorkowych jak i u organizmow wyższych.

Prezentuje sposoby jego zastosowania w przemyśle spożywczym (przede wszystkim

w przechowalnictwie żywności), w medycynie (aktywność przeciwbakteryjna, przeciwgrzybicza, przeciwwirusowa i przeciwzapalna muramidazy) i weterynarii na przestrzeni ostatniej

dekady.

Lizozym – current trends in science and industry

Abstract

The article is an overview of the current state of knowledge on lysozyme. It is an enzyme

present in both single-celled organisms as well as in higher organisms. The article presents methods of use of lysozyme in the food industry (mainly of stored food), medicine

(antibacterial activity, antifungal activity, antiviral activity and anti-inflammatory activity)

and veterinary medicine over the last decade.

73

Dariusz Rydzyński1

Zastosowanie enzymu katalazy

w badaniach naukowych

1. Wstęp

Nadtlenek wodoru jest jedną z najczęściej występujących reaktywnych

form tlenu (RFT). Tworzony jest przez enzymy z klasy oksydoreduktaz

poprzez redukcję dwóch elektronów z tlenu cząsteczkowego, z nadtlenków

lub po prostu podczas utleniania cząsteczek biologicznych. Nadtlenek

wodoru powstaje w mitochondriach, peroksysomach, a także chloro-

plastach w czasie transportu elektronów. Zarówno H2O2, jak i powstający

z jego rozkładu rodnik hydroksylowy (·OH) są niezwykle szkodliwe dla

większości komponentów komórki. Rodnik hydroksylowy powstaje

w reakcji Fentona podczas utleniania jonów metali przejściowych [1].

W czasie stresu oksydacyjnego, w trakcie jego kluczowego etapu, następuje

utlenianie nienasyconych kwasów tłuszczowych, tworzą się wodoro-

nadtlenki lipidów inicjujące łańcuchowe reakcje prowadzące do rozpadu

poszczególnych organelli a w następstwie zniszczenia całych komórek.

Zaburzona zostaje struktura błony komórkowej, a także zmianie ulega jej

płynność [2]. Nadtlenek wodoru jest swego rodzaju nieorganicznym

posłańcem wytwarzanym przez komórki podczas metabolizmu tlenowego.

Niewielkie jego ilości wyzwalają reakcje adaptacyjne organizmów.

Zwiększenie jego zawartości w komórkach wpływa dodatnio na ekspresję

białek związanych ze stresem, a także enzymów antyoksydacyjnych [3, 4,

5, 6]. W wyższych stężeniach nadtlenek wodoru staje się szkodliwy dla

komórek i tkanek. Może wywoływać programowaną śmierć komórek,

a także uszkadzać kwasy nukleinowe, białka i wspomniane lipidy [7].

Przeciwstawiać się takiemu biegowi wydarzeń mogą enzymatyczne oraz

nieenzymatyczne systemy antyoksydacyjne. Głównym enzymem zapo-

czątkowującym usuwanie reaktywnych form tlenu jest dysmutaza ponad-

tlenkowa (SOD). Prowadzi ona dysmutację rodnika ponad-tlenkowego do

nadtlenku wodoru. Powstały H2O2 jest następnie przekształcany przez

katalazę oraz różne klasy peroksydaz do wody i tlenu cząsteczkowego.

W usuwaniu wolnych rodników uczestniczą także nieenzymatyczne anty-

oksydanty. Możemy do nich zaliczyć witaminę C, glutation, flawonoidy,

1 Katedra Fizjologii, Genetyki i Biotechnologii Roślin, Wydział Biologii i Biotechnologii,

Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie, www.uwm.edu.pl, [email protected]

Monika Mańko, Jarosław Zubrzycki, Robert Karpiński

74

pochodne fenolowe, tokoferole oraz karotenoidy, a także posiadającą

właściwości osmoprotekcyjne prolinę [8, 9, 10]. Celem pracy było

przedstawienie roli katalazy w wykrywaniu stresu oksy-dacyjnego

organizmów powstającego pod wpływem zanieczyszczeń, niekorzystnych

warunków środowiska, a także roli enzymu w ocenie czystości

mikrobiologicznej produktów pochodzenia rolniczego.

2. Ewolucja enzymów katalitycznych

Pojawienie się enzymów katalitycznych mogło mieć miejsce u Archeonów (Archebakterii) około 3,5 miliarda lat temu, kiedy pierwsi przodkowie bakterii planktonowych wykształcili możliwość oddychania tlenowego. Dzięki temu nastąpiła przyspieszona ewolucja prehistorycznych katalaz oraz innych enzymów antyoksydacyjnych u pierwotnych sinic około 2,7 miliarda lat temu [11]. Ewolucyjnym punktem zwrotnym rozpo-czynającym erę organizmów tlenowych było połączenie przez sinice działania dwóch fotosystemów – fotosystemu II o wysokim potencjale utleniającym wodę oraz fotosystemu I o niskim potencjale redukującym ferredoksynę. Doprowadziło to do możliwości przeprowadzania przez te organizmy tlenowej fotosyntezy. Dalsza ewolucja katalaz zachodziła wraz ze wzrostem zawartości tlenu w atmosferze. Duże znaczenie dla rozwoju grupy katalaz miało pojawienie się około 2 miliardy lat temu organizmów eukariotycznych. Na drodze ewolucji wykształciły się trzy genetyczne rodziny katalaz: typowe (jednofunkcyjne) katalazy hemowe, dwufunkcyjne katalazo-peroksydazy hemowe oraz nieposiadające hemu katalazy manganowe [12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19].

3. Katalaza

Pierwsze wzmianki o katalazie, a właściwie o jej właściwościach biochemicznych, pojawiły się w 1900 roku. Natomiast po raz pierwszy wyizolowano ją w 1937 roku z wątroby wołowej. Do dnia dzisiejszego pozyskano i przebadano katalazę pochodzącą od wielu organizmów należących do różnych klas. Badano katalazę izolowaną ze zwierząt, roślin, drożdży, a także bakterii [20].

Katalaza jest enzymem bardzo efektywnym, w ciągu jednej minuty rozkłada około 6 mln cząsteczek H2O2 (stała szybkości reakcji wynosi 1,7×10

7×1 mol

–1xs

–1) [20]. Katalazy hemowe uznaje się za należące do

najbardziej efektywnych enzymów, w ciągu jednej sekundy mogą przeprowadzić rozkład ponad miliona cząsteczek nadtlenku wodoru [21]. Przy małym stężeniu nadtlenku wodoru katalazy dwufunkcyjne mogą także wykazywać działalność peroksydazową. Dawcą wodoru do procesu jest wtedy metanol, etanol, azotany III lub inne związki. Następuje utlenienie wyżej wymienionych związków z jednoczesną redukcją nadtlenku wodoru do wody [20].

Zastosowanie metod inżynierii odwrotnej do projektowania sztucznego krążka międzykręgowego

75

4. Zastosowanie katalazy w badaniach

Katalaza odgrywa ogromną rolę w odpowiedzi antyoksydacyjnej

organizmów. Fakt ten znajduje swoje odzwierciedlenie w ilości pomiarów

aktywności enzymu przeprowadzanych przez licznych naukowców. Zhang

i inni wykonali badania nad możliwością zastosowania katalazy do oceny

zanieczyszczenia mikrobiologicznego produktów pochodzenia rolniczego

(mleka, ziaren zbóż). Urządzenie do detekcji katalazy składało się

z reaktora o pojemności jednego litra, grzałki, czujnika temperatury,

mieszadła magnetycznego, układu sterującego, wyświetlacza oraz

biologicznego czujnika tlenu. W reaktorze umieszczano próbki. Reakcję

inicjowano poprzez dodanie do reaktora nadtlenku wodoru. Znajdujące się

w produkcie mikroorganizmy, a konkretnie enzym katalaza produkowany

przez grzyby i bakterie rozkładał dodany nadtlenek do wody i tlenu

cząsteczkowego (grzyby w większości są organizmami katalazo-

pozytywnymi). Wzrost zawartości tlenu był wychwytywany przez

zamontowany w reaktorze czujnik tlenu. Aktywność katalazy przeliczana

była automatycznie i pokazywana na wyświetlaczu. W celu skalibrowania

metody przeprowadzono pomiary aktywności czystych mikroorganizmów

występujących w danych produktach (Aspergillus glaucus, Aspergillus

candidus, Aspergillus flavus, Penicillium cyclopium, Bacillus subtilis,

Staphylococcus aureus oraz Streptococcus thermophilus). Wymienione

mikroorganizmy podczas przechowywania w niskiej temperaturze oraz

niskiej wilgotności powietrza mogą nie zwiększać swojej liczebności

pomimo obecności w produktach. Dopiero zmiana warunków

przechowywania ujawnia ich występowanie. Badacze wykazali dwukrotne

zwiększenie aktywności katalazy u grzybów pleśniowych podczas ich

wzrostu w porównaniu do grzybów nieaktywnych. Mogło to mieć związek

z uruchomieniem systemów antyoksydacyjnych podczas wzrostu

mikroorganizmów. Ponadto zanotowano wzrost aktywności katalazy wraz

ze wzrostem temperatury przechowywania mleka. Wykazano, zatem że

ilość zanieczyszczeń mikrobiologicznych ma bezpośrednio związek

z warunkami przechowywania produktów rolnych. Badania potwierdziły

możliwość zastosowania metody opartej na aktywności katalazy do

wykrywania zanieczyszczeń produktów pochodzenia rolnego. Zastosowana

metoda posiada większą czułość oraz otrzymanie wyniku zajmuje mniej czasu

niż w standardowej metodzie płytek agarozowych [22, 23, 24, 25, 26, 27].

Rośliny ze względu na ograniczoną możliwość przemieszczania się

musiały dobrze rozwinąć metaboliczne sposoby obrony przed czynnikami

stresowymi. Stresorami mogą być zarówno czynniki abiotyczne

(temperatura, dostępność wody, wysokie zasolenie gleby, zawartość metali

ciężkich w podłożu), jak i biotyczne (wirusy, bakterie, grzyby, owady).


76

Badano wpływ silnego zasolenia podłoża na rośliny, a konkretnie na

aktywność katalazy. Materiałem badawczym była katalaza izolowana

z liści oraz brodawek korzeniowych roślin fasoli (Phaseolus vulgaris) oraz

lucerny (Medicago sativa). Rośliny uprawiano w podłożu zawierającym

wzrastające stężenia chlorku sodu. Odnotowano zmniejszenie aktywności

katalazy w porównaniu do próby kontrolnej zarówno w liściach (40%), jak

i brodawkach korzeniowych (75%) roślin fasoli przy stężeniach soli

odpowiednio 25 i 50 mM. W roślinach lucerny zmniejszenie aktywności

katalazy następowało przy dawce 200 mM NaCl dla liści (80%). Katalaza

w brodawkach korzeniowych okazała się bardziej czuła na działanie soli

w mniejszych dawkach, jednocześnie wykazując większą odporność na

działanie wyższej dawki NaCl. Spadek aktywności odnotowano przy obu

zastosowanych dawkach (100 i 200 mM), wynosił on odpowiednio 35

i 45%. Badacze przeprowadzili testy in vitro celu analizy czy zare-

jestrowane zmiany aktywności są spowodowane bezpośrednim wpływem

NaCl na katalazę, czy przyczynia się do nich inny związek produkowany

przez rośliny podczas stresu. Aktywność katalazy izolowanej z liści fasoli

spadła o ponad 50% przy dawce soli 150 mM, natomiast enzym z liści

lucerny wykazywał podobny spadek aktywności przy dawce 25 mM.

Odnotowano więc rozbieżność w aktywności izolowanej katalazy

pomiędzy roślinami lucerny oraz fasoli. Jako przyczynę tego zjawiska

autorzy podają różnice w reakcji obronnej obu roślin, polegające na innych

sposobach walki z nadmiarem soli. Pomimo tego katalaza pochodząca

z brodawek korzeniowych wykazywała podobne tendencje u obu roślin

zarówno w badaniach in vivo, jak i in vitro. Enzym z fasoli wykazywał

silną inhibicję aktywności przy stężeniach NaCl większych niż 50 mM,

natomiast katalaza izolowana z lucerny była nadal aktywna w 30% przy

stężeniu 500 mM [28, 29].

Podobne rezultaty otrzymał wcześniej inny zespół naukowców.

Udowodnili oni wpływ chlorku sodu zawartego w podłożu (50 mM) na

aktywność katalazy izolowanej z brodawek korzeniowych fasoli

(Phaseolus vulgaris). Enzym wykazywał wyraźny spadek aktywności

(69%) spowodowany obecnością soli w podłożu [30]. W glebie mogą

ponadto występować inne czynniki wywołujące stres oksydacyjny

w roślinach. Zaliczamy do nich metale takie jak kadm, ołów, glin.

W przeciwieństwie do żelaza, miedzi lub cynku, które w niewielkich

ilościach są niezbędne do wzrostu roślin, wymienione metale (Cd, Pb, Al)

wykazują szkodliwość nawet w minimalnych dawkach. W badaniach nad

szkodliwością metali często wykorzystuje się katalazę. Zmiany w jej

aktywności świadczą o wystąpieniu stresu oksydacyjnego, a co za tym idzie

o szkodliwości badanego pierwiastka lub związku chemicznego [31, 32].


77

Katalaza może być także enzymem określającym wpływ herbicydów na

rośliny. Nemat Alla oraz Hassan przeprowadzili badania nad wpływem

atrazyny na rośliny kukurydzy. Atrazyna jest herbicydem blokującym

przepływ elektronów przez fotosystem II, co skutkuje powstaniem

tripletowej formy chlorofilu, która wchodzi w reakcję z tlenem

cząsteczkowym powodując powstanie tlenu singletowego, a co za tym idzie

reaktywnych form tlenu. Dwie linie roślin kukurydzy (Zea mays L.) Hybrid

351 oraz Giza 2 traktowano rekomendowaną dawką polową atrazyny

w jednym eksperymencie oraz w innym stosowano różne dawki (50, 100,

150 oraz 200% zalecanej dawki) w celu sprawdzenia efektu dla mniejszych

oraz większych niż zalecane ilości środka. Następnie badano wpływ

herbicydu na parametry fizjologiczne roślin. Wyniki znacząco różniły się

w zależności od linii kukurydzy. W linii Giza 2 atrazyna wpływała

hamująco na aktywność katalazy zarówno podczas upływu kolejnych dni

od podania zalecanej dawki, jak i po traktowaniu zmniejszonymi

i zwiększonymi dawkami herbicydu. Inaczej przedstawiały się wyniki

uzyskane w linii Hybrid 351. Eksperyment obrazujący wpływ zalecanej

dawki wraz z upływem czasu wykazał spadek aktywności katalazy

trwający do 8 dnia od traktowania herbicydem, 12 dnia nastąpił wzrost

aktywności do wartości bliskiej próbie kontrolnej. Zastosowanie różnych

dawek atrazyny skutkowało podobnie jak w linii Giza 2 spadkiem

aktywności enzymu, był on jednak znacznie niższy. Autorzy wskazują jako

przyczynę tych rozbieżności różnice w sposobie detoksykacji reaktywnych

form tlenu oraz atrazyny. Linia Giza 2 ma mniej wydajny system radzenia

sobie ze stresem oksydacyjnym, z czego wynikają różnice w aktywności

enzymów [2, 33, 34].

Innym herbicydem, którego wpływ na rośliny testowano między innymi

przy użyciu enzymu katalazy jest Roundup Ultra 360 SL. Jest to środek

chwastobójczy stosowany na liście, pod względem chemicznym jest

izopropyloaminową solą glifosatu. Stosowany jest zarówno na rośliny

jednoliścienne, jak i dwuliścienne, roczne i wieloletnie. Mechanizm

działania herbicydu polega na hamowaniu fotosyntezy, zaburzeniach

w szlaku kwasu szikimowego oraz zmniejszeniu aktywności cytochromu

P450. Jako roślinę badawczą wybrano rzęsę drobną (Lemna minor L.) ze

względu na to, że jest to roślina modelowa bardzo często wykorzystywana

w badaniach ekotoksykologicznych. Zastosowano Roundup w stężeniach

1,58 mM; 3,16 mM; 31,58 mM. Materiał do badań aktywności enzymów

pobierano po 4, 8, 24 i 48 godzinach od traktowania herbicydem.

Wykazano wpływ zastosowanego środka na aktywność katalazy roślin

rzęsy drobnej. Następował wzrost aktywności enzymu wraz z upływem

czasu ekspozycji na Roundup. Nie wykazano natomiast wpływu

zwiększania stężenia herbicydu na aktywność enzymu. Otrzymane wyniki


78

mogą świadczyć o wpływie środka chwastobójczego na zwiększoną

produkcję reaktywnych form tlenu w roślinach [35, 36, 37, 38, 39, 40].

Testy wykorzystywane w badaniach ekotoksykologicznych nie

ograniczają się tylko do katalaz izolowanych z roślin. W celu sprawdzenia

jakości wód oraz wydajności ich oczyszczania w oczyszczalniach ścieków

stosuje się test biologiczny wykorzystujący rozwielitki (Daphnia magna).

Rozwielitki są jednymi z najbardziej czułych na chemiczne

zanieczyszczenia środowiska organizmów. Z tego względu są stosowane na

całym świecie, jako zwierzęta modelowe podczas prowadzenia badań nad

toksycznością związków chemicznych. Efekt biologiczny objawia się

stanem stresu, w którym organizmy produkują reaktywne formy tlenu oraz

aktywują kaskadę reakcji prowadzącą do usuwania czynników

zagrażającym komponentom komórkowym. Uruchamiane są enzymatyczne

antyoksydanty, takie jak dysmutaza ponadtlenkowa, katalaza oraz

peroksydaza [41, 42, 43]. Dafnie wykorzystywano m.in. przy ocenie

toksyczności takich związków jak: fenantren, metylimidazol, sulfatiazol,

piren, a także metale, takie jak miedź i kadm. Chen i in. przeprowadzili

badania jakości oczyszczania wód w oczyszczalniach ścieków. Wśród

metod znalazły się testy na aktywność katalazy, które wykazały

zwiększenie aktywności enzymu w próbach traktowanych niewielką ilością

wody pochodzącej z procesu oczyszczania. Zwiększenie dawki wody

pościekowej skutkowało obniżeniem aktywności katalazy. Przeprowadzone

doświadczenia udowodniły przydatność testu z wykorzystaniem katalazy

do oceny jakości wód [44, 45, 46, 47].

5. Wnioski

Katalaza jest enzymem znanym od bardzo dawna. Została wyizolowana

z wielu organizmów. Poznano jej strukturę, geny ją kodujące, znane są

mechanizmy jej działania. Jednak do dnia dzisiejszego zainteresowanie nią

utrzymuje się na wysokim poziomie. Cały czas prowadzone są badania nad

wykorzystaniem katalazy do nowych zastosowań. Odgrywa ona istotną rolę

w ocenie toksyczności związków na organizmy żywe, oraz bioindykacji

środowiska naturalnego. Istnieje wiele metod opisujących izolację oraz

pomiar aktywności katalazy.


79

Literatura

1. Zamocky M., Furtmüller P. G., Obinger C., Antioxidants & Redox Signaling.

10(9) (2008), s. 1527-1548. doi:10.1089/ars.2008.2046

2. Aravind P., Prasad M. N. V., Modulation of cadmium-induced oxidative stress

in Ceratophyllum demersum by zinc involves ascorbate–glutathione cycle and

glutathione metabolism, Plant Physiology and Biochemy, 43 (2005), s. 107-116

3. Veal E. A., Day A. M., Morgan B. A., Hydrogen peroxide sensing

and signaling, Molecular Cell, 26 (2007), s. 1-14

4. Ristow M., Schmeisser S., Extending lifespan by increasing oxidative stress,

Free Radical Biology and Medicine, 51 (2011), s. 327-336

5. Mesquita A., Weinberger M., Silva A., Sampaio-Marques B., Almeida B.,

Leao C., Costa V., Rodrigues F., Burhans W. C., Ludovico P., Caloric

restriction or catalase inactivation extend yeast chronological lifespan

by inducing H2O2 and superoxide dismutase activity, Procedings of the

National Academy of Sciences of the United States of America,107 (2010),

s. 15123-15128

6. Goldberg A. A., Bourque S. D., Kyryakov P., Gregg C., Boukh-Viner T.,

Beach A., Burstein M. T., Machkalyan G., Richard V., Rampersad S., Cyr D.,

Milijevic S., Titorenko V. I., Effect of calorie restriction on the metabolic

history of chronologically aging yeast, Experimental Gerontology, 44 (2009),

s. 555-571

7. Choudhury S., Panda P., Sahoo L., Panda S. K., Reactive oxygen species

signalling in plants under abiotic stress, Plant Signaling & Behavior, 8 (2013),

23681. doi: 10.4161/psb.23681

8. Rejeb K. B., Abdelly C., Savouré A., How reactive oxygen species and proline

face stress together, Plant Physiology and Biochemistry, 80 (2014), s. 278-

284. doi:10.1016/j.plaphy.2014.04.007

9. Suzuki N., Koussevitzky S., Mittler R., Miller G., ROS and redox signalling

in the response of plants to abiotic stress, Plant, Cell & Environment, 35

(2012), s. 259-270

10. Asghari M., Soleimani Aghdam M. S., Impact of salicylic acid on postharvest

physiology of horticultural crops, Trends in Food Sciensce & Technology,

21 (2010), s. 502-509

11. Bernroitner M., Zamocky M., Furtmüller P.G., Peschek G.A., Obinger C.

Occurrence, phylogeny, structure, and function of catalases and peroxidases

in cyanobacteria, Journal of Experimental Botany., 60 (2009), s. 423-440

12. Drews G., in: Peschek G.A., Obinger C., Renger G. (Eds.), Bioenergetic

Processes of Cyanobacteria, Springer, Dordrecht (2011), s. 265-284

13. Peschek G.A., Bernroitner M., Sari S., Pairer M., Obinger C., in: Peschek

G.A., Obinger C., Renger G. (Eds.), Bioenergetic Processes of Cyanobacteria,

Springer, Dordrecht (2011), s. 3-68

14. Bekker A., Holland H.D., Wang P.L., Rumble D., Stein H.J., Hannah J.L.,

Coetzee L.L., Beukes N.J., Dating the rise of atmospheric oxygen, Nature.,

427 (2004), s. 117-220


80

15. Diaz A., Loewen P.C., Fita I., Carpena X., Thirty years of heme catalases

structural biology, Archives of Biochemistry and Biophysics, 525 (2012),

s. 102-110

16. Whittaker J.W., Non-heme manganese catalase – The other catalase, Archives

of Biochemistry and Biophysics, 525 (2012), s. 111-120

17. Nicholls P., Classical catalase: ancient and modern, Archives


18. Passardi F., Favet J., Zamocky M., Jakopitsch C., Penel C., Obinger C.,

Dunand C., Phylogenetic distribution of catalase-peroxidases: are there

patches of order in chaos? Gene, 397 (2007), s. 101-113

19. Chelikani P., Fita I., Loewen P.C., Diversity of structures and properties

among catalases, Cellular and Molecular Life Science, 61 (2004), s. 192-208,

DOI: 10.1089/ars.2008.2046

20. Ścibior D., Czeczot H., Katalaza: budowa, właściwości, funkcje, Postępy

Higieny Medycyny Doświadczalnej, 60 (2006), s. 170-180

21. Alfonso-Prieto M., Vidossich P., Rovira C., The reaction mechanisms of heme

catalases: an atomistic view by ab initio molecular dynamics, Archives


22. Cai J. P., Wang X., Huang S. X., Effects of temperature on safe moisture

and mould development of stored wheat, Cereal & Feed Industry, 309 (2012),

s. 18-21

23. Kaaya A.N., Kyamuhangire W., The effect of storage time and agroecological

zone on mould incidence and aflatoxin contamination of maize from traders

in Uganda, International Journal of Food Microbiology, 110 (2006), s. 217-223

24. Hansberg W., Salas-Lizana R., Domínguez L., Fungal catalases: function,

phylogenetic origin and structure, Archives of Biochemistry and Biophysics,

525 (2012), s. 170-180

25. Lanier C., Richard E., Heutte N., Airborne molds and mycotoxins associated

with handling of corn silage and oilseed cakes in agricultural environment,

Atmospheric Environment, 44 (2010), s. 1980-1986

26. Tang F., Cheng S., Wu S., Growth of spoilage fungi in stored corn, Journal

of the Chinese Cereals and Oils Association, 23 (2008), s. 137-140

27. Zhang S. B., Zhai H. C., Hu Y. S., Wang L., Yu G. H., Huang S. X., Cai J. P.,

A rapid detection method for microbial spoilage of agro-products based on

catalase activity, Food Control, 42 (2014), s. 220-224

28. Tejera N.A., Iribarne C., Palma F., Lluch C., Inhibition of the catalase activity

from Phaseolus vulgaris and Medicago sativa by sodium chloride, Plant

Physiology and Biochemistry, 45 (2007), s. 535-541

29. Tejera N. A., Soussi M., Lluch C., Physiological and nutritional indicators

of tolerance to salinity in chickpea plants growing under symbiotic conditions,

Environmental and Experimental Botany, 58 (2006), s. 17-24

30. Jebara S., Jebara M., Limam F., Aouani M. E., Changes in ascorbate

peroxidase, catalase, guaiacol peroxidase and superoxide dismutase activities

in common bean (Phaseolus vulgaris) nodules under salt stress, Journal

of Plant Physiology, 162 (2005), s. 929-936


81

31. Gratão P. L., Polle A., Lea P. J., Azevedo R. A., Making the life of heavy

metal stressed plants a little easier, Functional Plant Biology, 32 (2005),

s. 481-494

32. Gallego S. M., Pena L. B., Barcia R. A., Azpilicueta C. E., Iannone M. F.,

Rosales E. P., Zawoznik M. S., Groppa M. D., Benavides M.P., Unravelling

cadmium toxicity and tolerance in plants: insight into regulatory mechanisms.

Environmental and Experimental Botany, 83 (2012), s. 33-46

33. Ali M. B., Hahn E. J., Paek K. Y., Effects of temperature on oxidative stress

defense systems, lipid peroxidation and lipoxygenase activity in Phalaenopsis,

Plant Physiology and Biochemistry, 43 (2005), s. 213-223

34. Nemat Alla M. M., Hassan N. M., Changes of antioxidants levels in two maize

lines following atrazine treatments, Plant Physiology and Biochemistry, 44

(2006), s. 202-210

35. Yu W., Zhang R., Li R., Guo S., Isolation and characterization of glyphosate

regulated genes in soybean seedlings, Plant Science., 172 (2007), s. 497-504

36. Tan S., Evans R., Singh B., Herbicidal inhibitors of amino acid biosynthesis

and herbicide-tolerant crops, Amino acids, 30 (2006), s. 195-204

37. Ulanov A., Lygin A., Duncan D., Widholm J., Lozovaya V., Metabolic effects

of glyphosate change the capacity of maize culture to regenerate plants,

Journal of Plant Physiology, 166 (2009), s. 978-987

38. Ashan N., Lee D. G., Lee K. W., Alam I., Lee S. H., Bahk J. D., Lee B. H.,

Glyphosate induced oxidative stress in rice leaves revealed by proteomic

approach, Plant Physiology and Biochemy, 46 (2008), s. 1062-1070

39. Moldes C. A., Medici L. O., Abrahão O. S., Tsai S. M., Azevedo R. A.,

Biochemical responses of glyphosate resistant and susceptible soybean plants

exposed to glyphosate, Acta Physiologie Plantarum., 30 (2008), s. 469-479

40. Kielak E., Sempruch C., Mioduszewska H., Klocek J., Leszczynski B.,

Phytotoxicity of Roundup Ultra 360 SL in aquatic ecosystems: biochemical

evaluation with duckweed (Lemna minor L.) as a model plant, Pesticide

Biochemistry and Physiology, 99 (2011), s. 237-243

41. Zeng Y., Fu X., Ren Z., The effects of residual chlorine on the behavioural

responses of Daphnia magna in the early warning of drinking water

accidental events, Procedia Environmental Sciences, 13(2012), s. 71-79

42. Pau C., Serraa T., Colomera J., Casamitjanaa X., Salab L., Kampf R., Filtering

capacity of Daphnia magna on sludge particles in treated wastewater, Water

Research, 47 (2013), s. 181-186

43. Pavlaki M. D., Ferreira A. L. G., Soares A. M. V. M., Loureiro S., Changes

of chemical chronic toxicity to Daphnia magna under different food regimes,

Ecotoxicology and Environmental Safety, 109 (2014), s. 48-55

44. Yu M., Wang S. H., Luo Y. R., Han Y. W., Li X. Y., Zhang B. J., Wang J. J.,

Effects of the1-alkyl-3-methylimidazolium bromide ionic liquids on the

antioxidant defense system of Daphnia magna, Ecotoxicology and

Environmental Safety, 72 (2009), s. 1798-1804

45. Zhang X., Xia X., Dong J., Bao Y., Li H., Enhancement of toxic effects

of phenanthrene to Daphnia magna due to the presence of suspended

sediment, Chemosphere, 104 (2014), s. 162-169


82

46. Kim J., Park Y., Choi K., Phototoxicity and oxidative stress responses

in Daphnia magna under exposure to sulfathiazole and environmental level

ultraviolet B irradiation, Aquatic Toxicology, 91 (2009), s. 87-94

47. Chen T., Xu Y., Zhu S., Cui F., Combining physico-chemical analysis with

a Daphnia magna bioassay to evaluate a recycling technology for drinking

water treatment plant waste residuals, Ecotoxicology and Environmental

Safety., 122 (2015), s. 368-376

Zastosowanie enzymu katalazy w badaniach naukowych

Streszczenie

Nadtlenek wodoru jest jedną z najczęściej występujących reaktywnych form tlenu (RFT).

Powstaje w wielu reakcjach chemicznych, jako produkt uboczny, jest substancją szkodliwą dla organizmu. W wyniku reakcji nadtlenku wodoru z jonami metali takimi jak żelazo lub

miedź powstaje najbardziej reaktywny ze wszystkich rodnik hydroksylowy (·OH). Katalaza

jest enzymem z grupy oksydoreduktaz, rozkłada nadtlenek wodoru powodując uwalnianie

tlenu cząsteczkowego. Występuje w komórkach bakterii tlenowych, roślin, grzybów, a także zwierząt i ludzi. Katalaza jest enzymem bardzo efektywnym, w ciągu jednej minuty

rozkłada około 6 mln cząsteczek H2O2. Pierwsze wzmianki o katalazie pojawiły się

w 1900 roku. Od tamtego czasu enzym cieszy się niesłabnącym zainteresowaniem

naukowców. Katalazę wykorzystuje się do określania wpływu związków chemicznych oraz metali na rośliny oraz oceny toksyczności danych substancji dla środowiska.

Z powodzeniem jest także stosowana do wykrywania zanieczyszczeń mikrobiologicznych

żywności oraz jako test do oceny jakości oczyszczania wody w oczyszczalniach ścieków.

The use of the enzyme catalase in research

Abstract

Hydrogen peroxide is one of the most common reactive oxygen species (ROS). It is formed in many chemical reactions, as a byproduct and is harmful for the organism. In the reaction

of hydrogen peroxide with metal ions, such as iron or copper, is formed the most reactive

of all, the hydroxyl radical (·OH). Catalase is an enzyme, belonging to the oxidoreductases,

which decomposes the hydrogen peroxide causing release of molecular oxygen. It occurs in the cells of aerobic bacteria, plants, fungi, animals and humans. Catalase is a very effective

enzyme, within one minute it decomposes about 6 million molecules of H2O2. The first

mention of catalase appeared in 1900. Since then, the enzyme has enjoyed popularity among

scientists. Catalase is used to determine the effect of chemicals and metals to plant, estimate toxicity of the substance to the environment. It is also successfully used to detect microbial

contamination of food and as a test of the quality of water purification in sewage treatment

plants.

83

Aneta Ostróżka-Cieślik1, Anna Banyś

2, Beata Sarecka-Hujar

3

Sposoby wykorzystania enzymów

w przemyśle farmaceutycznym

1. Wprowadzenie

Przemysł farmaceutyczny wykorzystuje enzymy w preparatyce leków

stosowanych w terapii chorób nowotworowych, autoimmunologicznych,

zaburzeniach trawienia, lizosomalnych chorobach spichrzeniowych (LChS),

miażdżycy oraz w chorobach o podłożu bakteryjnym, wirusowym czy też

grzybiczym. Enzymatyczna terapia zastępcza (ETZ) polega na okresowym

dostarczaniu brakującego enzymu lub jego zmodyfikowanej formy, co

pozwala złagodzić objawy choroby, jednak nigdy nie dochodzi do

całkowitego wyleczenia. Chorzy muszą do końca życia przyjmować leki.

Szersze zastosowanie enzymów jako leków napotyka ciągle poważne

problemy, w tym m. in. duże rozmiary cząstek enzymów, które

uniemożliwiają przenikanie przez błony komórkowe w podaniu poza-

jelitowym i wziewnym oraz niekorzystne reakcje immunologiczne. Leki

enzymatyczne charakteryzuje również niska trwałość podczas przecho-

wywania [1, 2]. Większość badań podejmujących próbę zwiększenia

biodostępności i stabilności enzymów i jednocześnie ograniczenia

ubocznych skutków terapii enzymatycznej dotyczy preparatów o kontro-

lowanym uwalnianiu, gdzie enzym jest uwięziony w polimerycznym lub

lipidowym rusztowaniu, ulegającym degradacji w organizmie i uwal-

niającym enzym [3]. Warunki stosowane w technologii niektórych z tych

systemów są niekorzystne (wysoka temperatura, niekorzystne dla danego

białka pH) i mogą prowadzić do szybkiej denaturacji białka [4]. Niezwykle

ważne jest zatem nadanie enzymom postaci umożliwiającej aplikację oraz

dawkowanie, przy zachowaniu ich złożonej struktury. Opracowana

formulacja powinna zapewnić:

1 [email protected], Zakład Technologii Postaci Leku, Katedra Farmacji Stosowanej ,

Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach [email protected], Zakład Technologii Postaci Leku, Katedra Farmacji Stosowanej, Wydział

Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląski Uniwersytet

Medyczny w Katowicach 3 [email protected], Zakład Technologii Postaci Leku, Katedra Farmacji Stosowanej,

Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląski

Uniwersytet Medyczny w Katowicach

Aneta Ostróżka-Cieślik, Anna Banyś, Beata Sarecka-Hujar

84

maksymalny efekt terapeutyczny;

stabilność w formie leku;

odpowiednią trwałość w okresie przechowywania;

optymalny czas, miejsce i szybkość działania;

bezpieczną i dogodną dla pacjenta formę podania [5].

Duży postęp w dziedzinie opracowania systemów dostarczania leku

umożliwił podanie substancji o strukturze białkowej drogą doustną,

pozajelitową i wziewną. Najbardziej rozpowszechnioną drogą podania leku

jest aplikacja doustna. Jednak podanie enzymów w klasycznej postaci typu

tabletka, kapsułka, wiąże się z koniecznością ich użycia w dużej dawce.

Wynika to z dezaktywacji enzymów w kwaśnym pH soku żołądkowego.

Podejrzewa się, że podanie wysokiej dawki np. lipazy trzustkowej może

być przyczyną wystąpienia zespołu kolonopatii włókniejącej [6].

2. Cel pracy

Celem pracy było przedstawienie obecnego stanu wiedzy na temat

technologii sporządzania leków zawierających enzymy oraz charakterystyka

wybranych preparatów obecnych na rynku farmaceutycznym w Polsce.

3. Doustna aplikacja enzymu

Podanie enzymu drogą doustną zoptymalizowano dzięki technologii

wielokompartmentowej formy leku. Dawka substancji czynnej jest

podzielona między liczne mini, mikro i nanocząstki, które mogą stanowić

jej zbiornik lub nośnik. Kompartmenty (minitabletki, peletki, mikrosfery,

mikrokapsułki) najczęściej umieszcza się w kapsułkach lub w niektórych

przypadkach tabletkuje. System wielokompartmentowy zapewnia

wygodniejszą terapię i skuteczniejszą kontrolę uwalniania substancji

czynnej w określonym miejscu i czasie (ang. drug delivery system, DDS)

[7]. Na uwalnianie mają wpływ: rozmiar kapsułki i stopień jej wypełnienia,

rozmiar i rodzaj masy kapsułkowej oraz masa cząsteczkowa enzymu.

3.1. Minitabletki

Minitabletki to tabletki o wielkości 1-3 mm. Technologia ich otrzy-

mywania jest wzorowana na produkcji tabletek konwencjonalnych.

W skład masy tabletkowej wchodzi jedna lub kilka substancji leczniczych

oraz jedna lub kilka substancji pomocniczych, które tabletkuje się metodą

bezpośrednią lub po uprzedniej granulacji. Do tabletkowania wykorzystuje

się tabletkarki wyposażone w stemple (jedno lub wielotrzpieniowe) oraz

matryce odpowiedniej wielkości. Modyfikację uwalniania substancji

czynnej uzyskuje się powlekając minitabletki wielkocząsteczkowymi

Sposoby wykorzystania enzymów w przemyśle farmaceutycznym

85

substancjami błonotwórczymi. Zastosowana otoczka chroni substancję

czynną (enzymy) przed inaktywacją w środowisku soku żołądkowego.

Umieszczenie minitabletek w kapsułkach pozwala uzyskać wielo-

zbiornikowy lek o modyfikowanym uwalnianiu [8].

Kapsułkę żelatynową twardą z minitabletkami dojelitowymi zawie-

rającymi enzymy trzustkowe wykorzystano w preparatach Pangrol®, Utrase

MT®, Zenpep

®. Preparaty te, oparte na innowacyjnej technologii

kapsułkowania Eurand Minitabs są stosowane w mukowiscydozie,

zapaleniu trzustki i resekcji trzustki [5, 8].

W pojedynczej kapsułce znajduje się standaryzowana ilość minitabletek

w przeliczeniu na aktywność enzymatyczną pankreatyny. Minitabletki

powleczone są otoczką wielkocząsteczkowej substancji błonotwórczej

(kwas polimetakrylowy), która jest odporna na działanie kwasu

żołądkowego i przeciwdziała inaktywacji kompleksu pankreatyny. Rdzenie

minitabletek zawierają enzymy trawienne: lipazę, amylazę i proteazy.

Kompleks pankreatyny zostaje uwolniony w obojętnym lub lekko zasadowym

środowisku jelita cienkiego, po rozpuszczeniu otoczki polimerowej.

Enzymy nie są jednak wchłaniane w przewodzie pokarmowym, ale

w kolejnym etapie ulegają rozkładowi pod wpływem soków tra-

wiennych/flory bakteryjnej i wydalane z kałem. Innowacyjność tej

technologii daje możliwość podania doustnego minitabletek po uprzednim

wysypaniu ich z kapsułki. Jest to dogodna forma aplikacji dla pacjentów,

którzy mają problem z połykaniem [5, 8‚10].

3.2. Peletki

Peletki są formą granulatu o wielkości 0,5-2 mm. Zbudowane są

z rdzenia i otoczki, mogą zawierać 10%-90% substancji leczniczej.

Otrzymuje się je na drodze powlekania rdzeni, granulacji na mokro, na

drodze stapiania oraz ekstruzji i sferonizacji. Najczęściej podawane są

doustnie jako układ wielokompartmentowy (zamknięte w kapsułce

żelatynowej twardej lub jako składnik masy tabletkowej sprasowane

w tabletkę). Wykorzystywane są głównie w celu modyfikacji uwalniania

substancji czynnej, a w konsekwencji otrzymania formy leku o opóźnionym,

przedłużonym, spowolnionym lub kontrolowanym uwalnianiu. Aby

uzyskać peletki o opóźnionym uwalnianiu w proksymalnym odcinku jelita

powleka się je otoczkami polimerowymi, korzystając najczęściej z metody

w tzw. warstwie fluidalnej. Zastosowane polimery powinny być

rozpuszczalne w środowisku zasadowym lub nierozpuszczalne. Substancja

czynna uwalniana jest przez otoczkę na drodze dyfuzji, a następnie

w wyniku powolnej degradacji polimeru [11, 12].


86

Kapsułkę żelatynową twardą z peletkami dojelitowymi zawierającymi

enzymy trzustkowe wykorzystano w preparatach Lipancrea® oraz Neo-

Pancreatinum Forte®. Preparaty te są wykorzystywane w przypadku

upośledzenia czynności trzustki. Zawierają kompleks pankreatynowy

pochodzenia zwierzęcego w składzie: lipaza, amylaza, proteaza. Peletki

powleczone są otoczką odporną na działanie soku żołądkowego

i umożliwiającą uwolnienie enzymów w dwunastnicy, ich fizjologicznym

miejscu działania. Do powlekania zastosowano kopolimer kwasu

metakrylowego oraz kopolimer kwasu metakrylowego i etylu akrylan (1:1)

z dodatkiem cytrynianu trietylu jako plastyfikatora. W pojedynczej

kapsułce znajduje się standaryzowana ilość peletek w przeliczeniu na

aktywność enzymatyczną pankreatyny. Zastosowanie tej technologii

umożliwia także doustną aplikację peletek po uprzednim wysypaniu ich

z kapsułki [13, 14].

3.3. Mikrocząstki

Terminem mikrocząstka określa się postać leku o budowie matrycy

sferycznej lub kapsułki, wielkości od 1 µm-1000 µm. Należą tu mikrosfery

i mikrokapsułki, które mogą wchodzić w skład leku wielokompartmentowego.

Mikrokapsułki są postacią leku o rozmiarze 5 µm-1000 µm. Zbudowane są

z otoczki i rdzenia, którego masa wynosi najczęściej 30%-95% masy

mikrokapsułki. W zależności od rodzaju otoczkowanej substancji (stała,

ciekła lub gazowa) kształt mikrokapsułki może być kulisty, regularny lub

nieregularny. Jako substancje otoczkujące wykorzystuje się polimery

pochodzenia naturalnego bądź syntetycznego, które powinny spełniać

określone wymagania. Nie mogą wykazywać działania toksycznego,

kancerogennego, nie powinny indukować odpowiedzi immunologicznej,

ani kumulować się w postaci produktów metabolizmu. Najczęściej są to

pochodne białkowe, węglowodanowe (polimery naturalne), pochodne

celulozy (syntetyczne) oraz poliestry, polibezwodniki (syntetyczne

biodegradowalne). Polimery nieulegające biodegradacji rzadko są

stosowane, ze względu na ryzyko kumulacji w organizmie np. w nabłonku

przewodu pokarmowego. Uwalnianie substancji czynnej z mikrokapsułek

zachodzi na drodze dyfuzji [15‚18].

Technologia otrzymywania mikrokapsułek z enzymami wymaga

stosowania łagodnych warunków, najlepiej temperatury pokojowej.

Opracowano wiele metod mikrokapsułkowania substancji termolabilnych.

Najprostszą jest żelowanie alginianów pod wpływem kationów wielo-

wartościowych [19]. W metodzie przy użyciu ekstruzji zawiesinę substancji

czynnej rozprasza się na mikrokropelki, następnie wkrapla do polimeru,

w którym materiał otoczki ulega zestaleniu. Technikę tę wykorzystano do


87

zamknięcia lizozymu w membranie z PLGA (kopolimer kwasu mlekowego

i glikolowego) [20]. Mikrokapsułkowanie koacerwacyjne opiera się na

zjawisku koacerwacji, rozdzielenia faz w roztworze koloidów/polimerów

i utworzenia faz ciekłych. Czynnikami indukującymi ten proces są: zmiana

temperatury, stężenia, pH, dodanie rozpuszczalnika lub soli nieorganicznej.

W konsekwencji dochodzi do zestalenia się ścianek otoczki. Często

stosowaną techniką jest także metoda w warstwie fluidalnej. Na dnie

komory umieszcza się sproszkowane rdzenie, na które nanosi się za

pomocą dysz od dołu lub góry roztwór/zawiesinę polimeru otoczkującego.

Równolegle z procesem otoczkowania zachodzi suszenie [17, 19‚21].

Mikrosfery w odróżnieniu od mikrokapsułek zbudowane są z polimeru,

w którym substancja czynna jest rozpuszczona lub zawieszona (rzadziej

emulgowana). Ich wielkość mieści się w zakresie 1 µm-500 µm, jednak

w lecznictwie największe znaczenie mają te o wielkości 10 µm-50 µm.

Mikrosfery można aplikować drogą dożylną, podskórną, doustną,

donosową, do oka oraz bezpośrednio do tkanki zmienionej chorobowo.

Matryce polimerowe stanowią wielkocząsteczkowe substancje błonotwórcze

pochodzenia naturalnego lub syntetycznego. Najczęściej wykorzystywane

są poliestry α i β-hydroksykwasów (kwas polimlekowy oraz kopolimer

kwasu mlekowego i glikolowego). Uwalnianie substancji leczniczej

z mikrosfer może mieć charakter fizyczny (erozja matrycy polimerowej)

lub chemiczny (hydroliza polimeru). Tworzą się wówczas mikrokanały

umożliwiające dyfuzję substancji leczniczej [22‚25].

Technologia otrzymywania mikrosfer, podobnie jak mikrokapsułek

wymaga stosowania temperatur oscylujących wokół temperatury

pokojowej. Najczęściej wykorzystuje się w tym celu metodę emulsyjną.

Substancję aktywną emulguje się w roztworze polimeru PLGA (w chlorku

metylenu), otrzymując emulsję w/o. Następnie wprowadza się do wodnego

roztworu alkoholu poliwinylowego do momentu uzyskania emulsji

wielokrotnej typu w/o/w. W trakcie mieszania dochodzi do odparowania

chlorku metylenu i wytrącenia PLGA, który inkorporuje substancję czynną.

Finalnym produktem są mikrosfery, które poddaje się liofilizacji [26, 27].

Metodą stosunkowo często stosowaną jest technika suszenia

rozpyłowego. Termolabilne substancje aktywne zawiesza się w polimerze,

a następnie rozpyla w strumieniu zimnego powietrza. Otrzymana forma

charakteryzuje się agregacją składnika aktywnego w matrycy polimerowej

[27]. Innym wariantem tej metody jest stosowanie wyższych temperatur

powietrza wlotowego, przy zastosowaniu tzw. chłodzącego efektu

odparowania. W konsekwencji temperatura cząstek poddanych suszeniu

jest stosunkowo niska. Dodatkowo stabilizuje się strukturę wtórną białek

enzymatycznych dodatkiem cukrów wielowodorotlenowych/alkoholi


88

wielowodorotlenowych, które tworzą wiązania wodorowe lub malto-

dekstryn, substancji szklisto-twórczych [27‚29].

Mikrocząstki wykorzystano do opracowania formulacji wielu

preparatów zawierających enzymy: Pertzye®, Creon

® (zatwierdzone przez

Agencję Żywności i Leków, ang. Food and Drug Administration, FDA)

oraz Lipram®, Pancrelipase

®, Pangestyme

® [30‚34]. Preparaty te zawierają

standaryzowane wyciągi z trzustek zwierzęcych (wieprzowych i wołowych),

o odpowiedniej aktywności enzymatycznej lipazy, amylazy, proteazy.

W przypadku Kreonu® (polska nazwa produktu leczniczego), jako formulację

zastosowano zamknięte w kapsułce „minimikrosfery”. Przypuszczalnie

enzymy zostały inkorporowane w matrycę polimerową (mikrosfera)

i otoczone otoczką dojelitową ftalanu hypromelozy (mikrokapsułka).

Standaryzowana ilość mikrokapsułek została umieszczona w kapsułce

żelatynowej twardej tworząc lek wielokompartmentowy. Polimer, z którego

zostały wykonane uwalnia enzymy trzustkowe po uprzednim rozpuszczeniu

się w dwunastnicy [35].

3.4. Liposomy

Enzymy mają kilka innych ważnych potencjalnych zastosowań

terapeutycznych, w tym jako antykoagulanty, środki przeciwzapalne i leki

degradujące amyloid [36, 37]. Ze względu na duże rozmiary cząstek

białkowych wydaje się, że umieszczanie ich w liposomach może zwiększyć

możliwości terapii enzymatycznych. Należy jednak zwrócić uwagę na

ograniczoną stabilność układów liposom – białko, przy czym nie zawsze

polepszenie stabilności wpływa pozytywnie na aktywność enkapsulo-

wanego enzymu.

Liposomy to postać leku umożliwiająca zachowanie właściwości

enkapsulowanych w nich substancji i dostarczenie ich do miejsca

docelowego w organizmie. Są to sferyczne lub owalne struktury wodno-

lipidowe, o wymiarach 0,01 do 1,0 μm, w których rdzeń stanowi

mikrokropelka fazy wodnej otoczonej otoczką pojedynczą lub kilkoma

otoczkami, zbudowanymi z podwójnej warstwy lipidowej [38]. Rozróżnia

się wiele rodzajów liposomów w zależności od wielkości pęcherzyków

oraz ilości warstw otoczki liposomu, w tym: jednowarstwowe (małe – SUV

i duże – LUV), wielowarstwowe, wielokompartmentowe oraz ze względu

na ich właściwości, m. in. konwencjonalne, kationowe, elastyczne (w tym

transferosomy), ethosomy, niosomy, układy lipid-polimer [39]. W błonie

liposomalnej głównym składnikiem są lipidy lub/i fosfolipidy. Zwykle

obojętny ładunek otoczki liposomu może być zmodyfikowany poprzez

wprowadzenie komponentu zawierającego określony ładunek (terapia

celowana). Substancja aktywna, która jest umieszczona w liposomie, może


89

być rozpuszczona w fazie wodnej lub związana mieszaniną fosfolipidów

stanowiących otoczkę liposomu. Takie właściwości zapewniają kontro-

lowane, jak również przedłużone uwalnianie substancji aktywnej.

W przypadku enzymów, wbudowanie ich w dwuwarstwę lipidową

liposomu powoduje konieczność takiej modyfikacji białka, która nada mu

właściwości hydrofobowe, np. specyficzna reakcja acylowania dysmutazy

ponadtlenkowej. Liposomy z enzymami wbudowanymi w dwuwarstwę

lipidową nazwano enzymosomami [40].

Dane literaturowe przedstawiają wyniki wielu badań dotyczących

efektywności liposomalnych form enzymów. Jednymi z pierwszych były

badania Yarosh et al. [41]. Wykazali oni, że specyficzny enzym – T4

endonukleaza V (T4N5), naprawiający uszkodzenia DNA w postaci

cyklobutanowych dimerów pirymidynowych (CPD), dostarczany

w liposomach do komórek skóry ssaków, zwiększa usuwanie uszkodzeń

CPD z DNA i redukuje ilość zmian nowotworowych u myszy naświetlanych promieniami UV. Autorzy umieścili enzym T4N5

w liposomach, które zawierały w swym składzie fosfatydylocholinę,

fosfatydyloetanoloaminę, kwas oleinowy i hemibursztynian cholesterolu

i otrzymano je metodą dializy detergentowej (ang. detergent dialysis

method); liposomy kontrolne zawierały natomiast nieaktywne formy

enzymu T4N5 [42]. W celu miejscowej aplikacji liposomów na skórę,

zostały one następnie wprowadzone w 1% hydrożel wykonany z solą

fizjologiczną buforowaną fosforanem. Kolejnym przykładem enzymu wprowadzonego do liposomów jest

paraoksonaza-1 (PON1), która jest A-esterazą, hydrolizującą wiązania

estrów fosforanowych. PON1 odgrywa rolę w miażdżycy, w chorobach

neurologicznych (choroba Parkinsona i Alzheimera). Z uwagi na krótki

okres półtrwania ludzkiej PON1, który wynosi 5 minut, jej wartość

terapeutyczna jest bardzo ograniczona [43]. Wcześniejsze badania

dotyczące wprowadzenia PON1 do liposomów wykazały wzrost stabilności

enzymu i jego aktywności in vivo [44]. Obecnie, Han et al. przygotowali

liposomy zawierające PON1 oczyszczoną z surowicy królika (L-PON1)

z wykorzystaniem metody dyspersji filmu lipidowego (ang. film-dispersion

method) [45]. Autorzy wykazali, że L-PON1 uzyskane tą metodą mają nie

tylko odpowiedni wygląd i kształt, nie rozwarstwiają się i mają wysoki

wskaźnik inkapsulacji, ale również niewielki rozmiar cząstek i utrzymują

aktywność enzymu [45].

Dane literaturowe wskazują, że okres półtrwania enzymów anty-

oksydacyjnych zamkniętych w liposomach (dysmutaza ponadtlenkowa,

katalaza) ulega znaczącemu wydłużeniu, z kilku minut do kilku godzin

[46]. Enkapsulacja dysmutazy w liposomach poprawia także wydajność jej

transportu do komórek [47]. Prowadzone są również badania nad


90

podawaniem enzymów antyoksydacyjnych enkapsulowanych w liposomach

przez inhalację. Wyniki tych badań są obiecujące i wskazują, że podanie

w ten sposób dysmutazy i katalazy powoduje wzrost ich aktywności

w pęcherzykach płucnych typu II [48].

Liposomy są szczególnie istotnymi nośnikami leków w terapii

celowanej nowotworów. Po osiągnięciu komórki docelowej, liposom może

z nią oddziaływać na kilka sposobów, w tym: przez wymianę lipidów,

endocytozę lub fuzję błony liposomu z błoną komórkową [49]. W terapii

antynowotworowej – ADEPT – opisanej po raz pierwszy przez Banghawe

et al. [50] mogą być stosowane specyficzne immunoliposomy

(immunoenzosomy), które transportują enzymy aktywujące podawane

proleki (leki w formie nieaktywnej). Przykładami takich enzymów mogą

być: fosfataza alkaliczna katalizująca przemianę fosforanu etopozydu

(prolek) do formy aktywnej – etopozydu, deaminaza cytozyny aktywująca

przemianę 5-fluorocytozynę do fluorouracylu lub karboksypeptydaza

A – α-alaninę metotreksatu do metotraksatu [51].

Podejmowane są również próby enkapsulacji enzymów w liposomach

otoczonych jedną lub kilkoma warstwami polimeru, tzw. layersome.

W układzie liposom-polimer umieszczono fosfatazę alkaliczną (ALP) [52],

enzym hydrolityczny, który farmakologicznie jest wykorzystywany

w leczeniu hipofosfatazji i sepsy wywołanej endotoksynami bakterii Gram-

ujemnych. Autorka wykazała, że pokrywanie liposomu polimerem

hydrofobowo-kationowym (PHK) wpływa na wzrost stabilności układu

i aktywności enzymu w odróżnieniu od układów liposom-polielektrolit

(C-PVA) [52]. Seung Hyuck Bang et al. [53] badali możliwość enkapsulacji w lipo-

somach lizosomalnych enzymów wyekstrahowanych z Saccharomyces

cerevisiae. Enzymy te wykazują aktywność przeciwdrobnoustrojową

przeciwko Escherichia coli i Shigella flexneri. Autorzy przygotowali

liposomy z L-α-fosfatydylocholiny i cholesterolu metodą hydratacji filmu

lipidowego (ang. film hydration method) lub tylko z lipidów. Zaob-

serwowali, że po sześciu dniach liposomy uzyskane z mieszaniny lipidu

i cholesterolu uwalniały małą ilość zamkniętych w nich enzymów,

natomiast z liposomów otrzymanych jedynie z lipidów uwolniła się duża

ilość enzymów lizosomalnych [53].

4. Wziewna aplikacja enzymu

Terapia inhalacyjna polega na dostarczeniu leku w postaci aerozolu do

układu oddechowego pacjenta, zawieszeniu w strumieniu powietrza

wdychanego, penetracji dróg oddechowych i depozycji w docelowym

miejscu. Fazę rozpraszającą aerozolu stanowi powietrze, natomiast fazę


91

rozproszoną drobne cząstki leku w postaci płynnej. Wysoko unaczyniona

powierzchnia pęcherzyków płucnych (80 m2) stanowi optymalną i szybką

drogę absorpcji mikrocząstek i makrocząstek <40kDa. Drogą wziewną

można podawać roztwory, liposomy, zmikronizowane zawiesiny i nanocząstki.

Stosowanymi rozpuszczalnikami są głównie woda, etanol, izopropanol,

rzadziej skroplone gazy. Zaletą tej metody jest dużo mniejszy w porów-

naniu z podaniem doustnym efekt pierwszego przejścia oraz w kon-

sekwencji obniżone ryzyko wystąpienia działań niepożądanych. Ponadto

można uzyskać wysokie stężenie leku w miejscu zmienionym chorobowo.

Wadą natomiast jest zmienna i charakteryzująca się małą powtarzalnością

depozycja leku. Wielkość wdychanych cząstek determinuje miejsce ich

osadzania się w układzie oddechowym. Cząstki o wielkości 20-100 µm

deponowane są w nosie, jamie ustnej i gardle. Z kolei te o rozmiarze 6-12 µm

osadzają się w tchawicy i oskrzelach. Do pęcherzyków płucnych docierają

natomiast cząstki wielkości 1-5 µm, a cząstki < 1µm wydychane są

z powietrzem. Stwierdzono, że w obwodowych drogach oddechowych

depozycja cząstek wynosi 30% - 38%. Zależy to od stanu płuc pacjenta

(pojemności, temperatury, objętości oddechowej, stosunku fazy wdechu do

wydechu, wilgotności powietrza w drogach oddechowych), toru

oddychania (nosowy, ustno-gardłowy) oraz stosowanego nebulizatora

[54‚57]. Podanie wziewne wykorzystano do aplikacji rekombinowanej

ludzkiej dezoksyrybonukleazy. Stanowi ona odpowiednik ludzkiego

enzymu, który rozcina pozakomórkowe DNA. Substancję czynną

otrzymuje się wykorzystując metody inżynierii genetycznej. Lekiem zarejestrowanym w Polsce i stosowanym w nebulizacji dornazy alfa

(rekombinowanej ludzkiej dezoksyrybonukleazy 1) jest preparat

Pulmozyme®. Terapię tą stosuje się w leczeniu mukowiscydozy, w celu

poprawy czynności płuc [54, 58, 59].

5. Pozajelitowa aplikacja enzymu

Płynom infuzyjnym stawia się restrykcyjne wymagania. Muszą być

jałowe, wolne od substancji gorączkotwórczych oraz zanieczyszczeń

nierozpuszczalnych. Dodatkowo powinny być izohydryczne, izojoniczne

i izoosmotyczne. Związki wielkocząsteczkowe powinny być rozpuszczone

w izoosmotycznym roztworze np. 5% glukozy lub izotonicznym 0,9%

NaCl. W technologii sporządzania roztworów do wlewów korzysta się z

niewielu grup substancji pomocniczych. Są to związki korygujące pH

(wodoro-węglan sodu, bufor fosforanowy) i/lub ciśnienie osmotyczne

(mannitol, sorbitol) oraz zwiększające trwałość substancji czynnej i jej

rozpusz-czalność. Jako rozpuszczalnik stosuje się wyłącznie wodę do

wstrzykiwań. Płyny infuzyjne nie mogą zawierać substancji


92

przeciwbakteryjnych. W przypadku indywidualizacji leczenia do

przygotowania roztworów infuzyjnych stosuje się koncentraty [17].

Jednym z preparatów do podania pozajelitowego zawierających enzymy

jest Aldurazyme, zalecany w mukopolisacharydozie I (MPS I). Zawiera

on kopię deficytowego enzymu – laronidazę, którą otrzymuje się drogą

rekombinacji DNA. Enzym produkowany jest przez komórkę jajnika

chomika, do której wprowadzono gen umożliwiający jego produkcję.

Funkcją laronidazy jest rozkład siarczanu dermatanu oraz siarczanu

heparanu – jednych z głównym glikozaminoglikanów (GAG) zwanych

dawniej mukopolisacharydami. Preparat podawany jest w cotygodniowym

wlewie dożylnym [60, 61].

W mukopolisacharydozie typu VI podaje się Naglazyme. Preparat zawiera

galsulfazę, odpowiednik ludzkiego enzymu – arylosulfatazy B, biorącego

udział w kataboliźmie siarczanu dermatanu oraz siarczanu chondroityny.

Preparat podaje się jako wlew 4-godzinny raz w tygodniu [62, 63].

Cerezyme (imiglucerase) zarejestrowany jest w leczeniu choroby

Gauchera, czyli jednej ze sfingolipidoz (LChS). W chorobie tej obserwuje

się brak glukocerebrozydazy (kwaśnej beta-glukozydazy), enzymu odpo-

wiedzialnego za rozkład końcowego tłuszczowego produktu przemiany

materii – glukocerebrozydu. Imigluceraza jest kopią alglucerazy,

otrzymywaną drogą rekombinacji DNA. Preparat ten po rozpuszczeniu

podaje się we wlewie dożylnym [64, 65]. W chorobie Gauchera

zarejestrowany w Polsce jest też preparat Vpriv (velaglucerase alfa).

Zawiera on kopie enzymu, którego deficyt występuje w organizmie

chorego. Produkowany jest w formie proszku do sporządzenia roztworu do

infuzji. Europejska Agencja ds. Leków (ang. European Medicines Agency,

EMA) nie wydała jednak zezwolenia na wprowadzenie do obrotu preparatu

Elelyso, zawierającego taliglucerazę alfa. W USA natomiast preparat ten

może być podawany w chorobie Gauchera dzięki decyzji FDA [66, 67].

Innym przykładem preparatu podawanego jako ETZ jest Fabrazyme

(agalsidase beta). Stanowi on liofilizowany, suchy proszek agalzydazy beta,

zamknięty w fiolce. Agalzydaza beta jest postacią ludzkiej α-galaktozydazy

A i otrzymuje się ją metodą rekombinacji DNA. Proszek rozpuszcza się

w wodzie do wstrzykiwań, w celu przygotowania koncentratu, następnie

rozcieńcza 0,9% roztworem NaCl w worku do infuzji i podaje we wlewie

dożylnym. Zarejestrowane wskazanie to choroba Fabry’ego. U chorych

obserwuje się odkładanie w komórkach nerek triheksozyloceramidu (Gb3)

[68, 69]. W tej samej chorobie może być podawany również Replagal

(agalsidase alfa) [70].

Myozyme (alglucosidase alfa) jest wskazany u pacjentów z chorobą

Pompego (glikogenoza typu II - LChS). Chorzy wykazują niedobór


93

alglukozydazy alfa – enzymu rozkładającego glikogen. Ten nierozłożony

wielocukier gromadzi się w różnych tkankach takich jak serce, tkanka

mięśniowa, w tym przepona. Choroba ta może ujawnić się w wieku

niemowlęcym ale i w późniejszym czasie [71]. W zespole Huntera (MPS

II) podawany jest preparat o nazwie Elaprase (idursulfase). Raz

w tygodniu pacjenci dostają odpowiednią dawkę leku w formie wlewu

dożylnego [72].

6. Podsumowanie

Postęp w dziedzinie terapii enzymami obserwowany jest każdego dnia.

W 2015 roku FDA nadała „status terapii przełomowej” dla olipudazy alfa.

Terapia ta zostanie w przyszłości wykorzystana w leczeniu pacjentów

z nieneurologicznymi objawami niedoboru kwaśnej sfingomielinazy

(choroba Niemanna-Picka – LChS). Pierwsze wyniki przedstawiono

podczas Sympozjum Organizacji Chorób Lizosomalnych (WORLD) na

początku 2015 roku [73]. Rozwijająca się obecnie terapia genowa stanowi

również nadzieję na skuteczną w niedalekiej przyszłości farmakoterapię

chorób wynikających z enzymatycznie uwarunkowanymi zaburzeniami

homeostazy organizmu.

Literatura

1. van de Weert M., Moeller E. H., Immunogenicity of Biopharmaceuticals,

Springer Publications, New York, 2008

2. Frokjaer S., Otzen D. E., Protein drug stability: A formulation challenge,

Nature Reviews Drug Discovery, 4 (2005), s. 298-306

3. Bysell H., Mansson R., Hansson P., Malmsten M., Microgels and

microcapsules in peptide and protein drug delivery, Advanced Drug Delivery

Reviews, 63 (2011), s. 1172-1185

4. Ye M., Kim S., Park K., Issues in long-term protein delivery using biodegra-

dable microparticles, Journal of Controlled Release, 146 (2010), s. 241-260

5. Kolodziejczyk M., Zgoda M., Eurand Minitabs® – innowacyjna formuła

aplikacji kompleksu enzymatycznego pankreatyny, Polimery w Medycynie,

40 (2010), s. 21-28

6. Iwańczak F., Najczęstsze przyczyny chorób trzustki u dzieci, Nowa Pediatria,

3 (2002), s. 159-162

7. Dai C., Wang B., Zhao H., Microencapsulation peptide and protein drugs

delivery system, Colloids Surf B: Biointerfaces, 41 (2005), s. 117-20

8. Sznitowska M., Minitabletki nowe rozwiązania technologiczne

i terapeutyczne, Świat Przemysłu Farmaceutycznego, 3 (2012), s. 13-16

9. Toskes P., Secci A., Thieroff-Ekerdt R., ZENPEP Study Group., Efficacy

of a novel pancreatic enzyme product, EUR-1008 (Zenpep), in patients with

exocrine pancreatic insufficiency due to chronic pancreatitis, Pancreas,

40 (2011), s. 376-82

http://www.nature.com/nrd/

http://www.journals.elsevier.com/advanced-drug-delivery-reviews/

http://www.journals.elsevier.com/advanced-drug-delivery-reviews/

http://www.journals.elsevier.com/journal-of-controlled-release/


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Dai%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15737536

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wang%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15737536

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhao%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15737536


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Toskes%20PP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21343835

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Secci%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21343835

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Thieroff-Ekerdt%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21343835

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=ZENPEP%20Study%20Group%5BCorporate%20Author%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21343835/


94

10. Konstan M. W., Liou T. G., Strausbaugh S. D., Ahrens R., Kanga J. F., Graff

G. R., Moffett K., Millard S. L., Nasr S. Z., Siméon E., Spénard J., Grondin J.,

Efficacy and Safety of a New Formulation of Pancrelipase (Ultrase MT20)

in the Treatment of Malabsorption in Exocrine Pancreatic Insufficiency

in Cystic Fibrosis, Gastroenterology Research and Practice, 2010:898193

11. Sawicki W., Łepek P., Kleina M., Otoczki na tabletkach i peletkach

– budowa, funkcja, mechanizm i metody powlekania, Farmacja Polska,

66 (2010), s. 378-382

12. Sawicki W., Krasowska M., Metody i mechanizm wytwarzania tabletek. Część

II, Farmacja Polska, 65 (2009), s. 59-68

13. Karta charakterystyki produktu leczniczego NEO-PANCREATINUM FORTE

zatwierdzona w 2008 roku przez Ministerstwo Zdrowia, Departament Polityki

Lekowej i Farmacji

14. Karta charakterystyki produktu leczniczego LIPANCREA zatwierdzona

w 2011 roku przez Polfa Warszawa S.A

15. Agnihotri N., Mishra R., Goda C., Arora M., Microencapsulation – A Novel

Approach in Drug Delivery: A Review, Indo Global Journal of Pharmaceutical

Sciences, 2 (2012), s. 1-20

16. Bartkowiak A., Brylak W., Hydrożelowe mikrokapsułki z udziałem

naturalnych i chemicznie modyfikowanych chitozanów–właściwości

mechaniczne i porowatość, Polimery, 51 (2006), s. 547-554

17. Janicki S., Fiebig A., Sznitowska M., Farmacja stosowana: podręcznik

dla studentów farmacji, Warszawa, Wydaw. Lekarskie PZWL, 2013

18. Sobczak M., Olędzka E., Kołodziejski W., Kuźmicz R., Polimery

do zastosowań farmaceutycznych, Polimery, 52 (2007), s. 411-420

19. Azarnia S., Lee B. H., Robert N., Champagne C. P., Microencapsulation

of a recombinant aminopeptidase (PepN) from Lactobacillus rhamnosus S93

in chitosan-coated alginate beads, Journal of Microencapsulation, 25 (2008),

s. 46-58

20. Yeo Y., Park K., A new microencapsulation method using an ultrasonic

atomizer based on interfacial solvent exchange, Journal of Controlled Release,

3 (2004), s. 379-388

21. Piasecka A., Goderska K., Mikrokapsułkowanie białek – metody

i zastosowanie, Biotechnologia,1 (2010), s. 34-45

22. Balcerkiewicz M., Grześkowiak E., Corre P., Ratajczak-Enselme M., Wolc A.,

Szlufik K., Biofarmaceutyczna ocena bupiwakainy inkorporowanej w postaci

mikrosfer polimerowych, Farmacja Polska., 65 (2009), s. 163-170

23. Alagusundaram M., Chetty M. S., Umashankari C., Microspheres as a Novel

drug delivery system – A review, International Journal of Chemical

Technology., 12 (2009), s. 526-534

24. Allen L. V., Popovich N. G., Ansel H. C., Pharmaceutical Dosage Forms

and Drug Delivery Systems, Delhi, India: BI Pubication, 8 (2005), s. 265

25. Szymańska E., Winnicka K., Mikrosfery – nowoczesna postać leku do oczu

o kontrolowanym uwalnianiu, Farmacja Polska, 65 (2009), s. 378-386

26. Sznitowska M., Technologia mikrocząstek i nanocząstek jako nośników leków,

Farmacja Polska, 57 (2001), s. 962-969

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Konstan%20MW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21197074

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Liou%20TG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21197074

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Strausbaugh%20SD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21197074

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ahrens%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21197074

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kanga%20JF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21197074

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Graff%20GR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21197074

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Graff%20GR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21197074

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Moffett%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21197074

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Millard%20SL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21197074

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nasr%20SZ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21197074

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sim%C3%A9on%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21197074

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sp%C3%A9nard%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21197074

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Grondin%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21197074



http://jml2012.indexcopernicus.com/Indo+Global+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences,p2677,6.html

http://jml2012.indexcopernicus.com/Indo+Global+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences,p2677,6.html

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Azarnia%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18188731

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lee%20BH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18188731

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Robert%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18188731

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Champagne%20CP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18188731




http://scialert.net/jindex.php?issn=1996-3416

http://scialert.net/jindex.php?issn=1996-3416


95

27. Sinha V. R., Trehan A., Biodegradable microspheres for protein delivery,

Journal of Controlled Release , 90 (2003), s. 261-80

28. Piasecka A., Goderska K., Mikrokapsułkowanie białek – metody

i zastosowanie, Biotechnologia, 1 (2010), s. 34-45

29. Samborska K., Suszenie rozpyłowe enzymów – przyczyny inaktywacji oraz

metody i mechanizmy ich stabilizacji, ŻYWNOSC-Nauka Technologia Jakość,

6 (2010), s. 7-17

30. Ferrone M., Raimondo M., Scolapio J. S., Pancreatic Enzyme

Pharmacotherapy, Pharmacotherapy, 27 (2007), s. 910-20

31. Krishnamurty D., Rabiee A., Jagannath S., Andersen D., Delayed release

pancrelipase for treatment of pancreatic exocrine insufficiency associated

with chronic pancreatitis, Therapeutics and Clinical Risk Management,

2009; 5: 507-520

32. Kuhn R. J., Gelrud A., Munck A., Caras S., CREON (Pancrelipase Delayed

Release Capsules) for the treatment of exocrine pancreatic insufficiency,

Advances in Therapy, 27 (2010), s. 895-916

33. Layer P., Keller J., Lankisch P. G., Pancreatic enzyme replacement therapy,

Curr Gastroenterology Report, 3 (2001), s. 101-108

34. Kadiyala V., Suleiman S., Darwin L., Pancreatic Exocrine Insufficiency. Part

2 of 2: Monitoring Clinical Response to Treatment, Gastroenterology

and Endoscopy News, 64 (2013), s. 1-7

35. Karta charakterystyki produktu leczniczego Kreon®. MAH approved

04.02.2013

36. Torchilin V., Peptide and protein drug delivery to and into tumors: challenges

and solutions, Drug Discovery Today, 8(2003), s. 259-266

37. Nalivaeva N. N., Beckett C., Belyaev N. D., Turner A. J., Are amyloid-

degrading enzymes viable therapeutic targets in Alzheimer’s disease? Journal

of Neurochemistry, 120 (2012), s. 167-185

38. Van Kuijk-Meuwissen M., Mougin L., Junginger Hans E., Bouwstra J. A.,

Application of vesicles to rat skin in vivo: a confocal laser scanning

microscopy study, Journal of Controlled Release, 56 (1998), s. 189-196

39. Sarecka-Hujar B., Jankowski A., Wysocka J., Liposomy - postać modyfikująca

transport substancji aktywnych przez skórę.: Część 2. Zastosowanie

w transporcie leków o działaniu ogólnoustrojowym, Annales Academiae

Medicae Silesiensis, 65 (2011), s. 45-50

40. Gaspar M. M., Martins M. B., Corvo M. L., Cruz M. E., Design

and characterization of enzymosomes with surface-exposed superoxide

dismutase, Biochimica et Biophysica Acta, 1609 (2003), s. 211-217

41. Yarosh D., Alas L. G., Yee V., Oberyszyn A., Kibitel J. T., Mitchell D.,

Rosenstein R., Spinowitz A., Citron M., Pyrimidine dimer removal enhanced

by DNA repair liposomes reduces the incidence of UV skin cancer in mice,

Cancer Research, 52 (1992), s. 4227-4231

42. Yarosh D., Tsimis J., Yee V., Enhancement of DNA repair of UV damage

in mouse and human skin by liposomes containing a DNA repair enzyme,

Journal of the Society of Cosmetic Chemists, 41 (1990), s. 85-92

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sinha%20VR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12880694

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Trehan%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12880694


http://impactfactor.pl/czasopisma/26833-zywnosc_nauka-technologia-jakosc

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ferrone%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17542772

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Raimondo%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17542772

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Scolapio%20JS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17542772


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Krishnamurty%20DM%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Rabiee%20A%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Jagannath%20SB%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Andersen%20DK%5Bauth%5D

http://www.researchgate.net/journal/1176-6336_Therapeutics_and_Clinical_Risk_Management

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kuhn%20RJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21086085

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gelrud%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21086085

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Munck%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21086085

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Caras%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21086085

http://www.advancesintherapy.com/



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Layer%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11276376

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Keller%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11276376

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lankisch%20PG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11276376

http://gastro.oxfordjournals.org/content/current

http://onlinelibrary.wiley.com/journal/10.1111/(ISSN)1471-4159

http://onlinelibrary.wiley.com/journal/10.1111/(ISSN)1471-4159

http://www.sciencedirect.com/science/journal/13881981

http://www.researchgate.net/journal/0037-9832_Journal_of_the_Society_of_Cosmetic_Chemists


96

43. Broomfield C. A. A purified recombinant organophosphorus acid anhydrase

protects mice against soman, Pharmacology & Toxicology, 70 (1992), s. 65-66

44. Petrikovics I., Hong K., Omburo G. et al., Antagonism of paraoxon intoxication

by recombinant phosphotriesterase encapsulated within sterically stabilized

liposomes, Toxicology and Applied Pharmacology,156 (1999), s. 56-63

45. Han Z. K., Liu Z. N., Yuan L., Zhang P. S., Zhao M., Preparation

of paraoxonase-1 liposomes and studies on their in vivo pharmacokinetics

in rats, Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, 41 (2014),

s. 825-829

46. Corvo M. L., Martins M. B., Francisco A. P., Morais J. G., Cruz M. E.,

Liposomal formulations of Cu,Zn-superoxide dismutase: physicochemical

characterization and activity assessment In an inflammation model, Journal

of Controlled Release, 43 (1997), s. 1-8

47. Briscoe P., Caniggia I., Graves A., Benson B., Huang L., Tanswell A. K.,

Freeman B. A., Delivery of superoxide dismutase to pulmonary epithelium

via pH-sensitive liposomes, American Journal of Physiology, 268 (1995),

s: L374-L380

48. Baker R. R., Czopf L., Jilling T., Freeman B. A., Kirk K. L., Matalon S.,

Quantitation of alveolar distribution of liposome-entrapped antioxidant

enzymes, American Journal of Physiology, 263 (1992), s. L585-L594

49. Kociubińska A., Kozubek A., Liposomy jako przenośniki leków, Lek

w Polsce., 11 (2001), s. 41-47

50. Bagshawe K. D., Surinder K. S., Burke P. J. et al., Developments with targeted

enzymes in cancer therapy, Current Opinion in Immunology, 11(1999), s. 579-583

51. Szwed M., Marczak A., Rogalska A., Matusiak A., Jóźwiak Z., Rola

przeciwciał monoklonalnych w transporcie leków do komórek

nowotworowych, NOWOTWORY Journal of Oncology, 60 (2010), s. 442-450

52. Łukasiewicz M., Układy liposom-polimer jako nośniki białek zakotwiczonych

przez GPI, Zeszyty Naukowe Towarzystwa Doktorantów UJ Nauki Ścisłe,

5 (2012), s. 57-75

53. Seung H. B., Simranjeet S. S., Yang-Hoon K., Jiho M., Preparation

of liposomes containing lysosomal enzymes for therapeutic use, Biotechnology

and Bioprocess Engineering, 19 (2014), s. 766-770

54. Karolewicz B., Pluta J., Haznar D., Nebulizacja jako metoda podawania

leków, Farmacja Polska, 65 (2009), s. 291-304

55. Kamin W., Schwabe A., Kramer I., Inhalation solutions – which one are

allowed to be mixed? Physico-chemical compatibility of drug solutions

in nebulizers, Journal of Cystic Fibrosis, 5 (2006), s. 205-213

56. Zaru M., Mourtas S., Klepetsanis P., Fadda A. M., Antimisiaris S. G.,

Liposomes for drug delivery to the lungs by nebulization. European Journal

of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 67 (2007), s. 655-666

57. Pirożyński M., Florkiewicz E., Radzikowski K., Praktyczne aspekty

nebulizacji u dorosłych (w) Praktyczne aspekty nebulizacji, Pirożynski M.

(red.), Bielsko-Biała, Alfa Medica Press 2013

http://journalseek.net/cgi-bin/journalseek/journalsearch.cgi?field=issn&query=0901-9928

http://www.journals.elsevier.com/toxicology-and-applied-pharmacology/

http://onlinelibrary.wiley.com/journal/10.1111/(ISSN)1440-1681/issues



http://www.physiology.org/

http://www.physiology.org/





97

58. Lichtinghagen R. Determination of Pulmozyme (dornase alpha) stability using

a kinetic colorimetric DNase I activity assay, European Journal

of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 63 (2006), s. 365-368

59. Ramsey B. W., Dorkin H. L. Consensus conference: practical applications

of Pulmozyme. Pediatric Pulmonology, 17 (1994), s. 404-408

60. Wraith J. E., Jones S., Mucopolysaccharidosis type I, Pediatric Endocrinology

Reviews, 12 (2014), s. 102-106

61. Karta charakterystyki preparatu Aldurazyme. EMA/477396/2013

62. Karta charakterystyki preparatu Naglazyme. EMA/763262/2010

63. Jurecka A., Różdżyńska A., Marucha J., Czartoryska B., Tylki-Szymańska A.,

Mukopolisacharydoza typu VI (choroba Maroteaux-Lamy’ego) – opis

przypadku, Pediatria i Medycyna Rodzinna, 6 (2010), s. 151-155

64. Jędrzejek M., Wiślińska K., Świder G. Choroba Gauchera-problem diagnozy

oraz skuteczności leczenia enzymatycznego. Prezentacja 4 przypadków,

PrzypadkiMedyczne.pl, e-ISSN 2084-2708, (27) 2012, s. 105-112

65. Karta charakterystyki preparatu Cerezyme. EMA/498833/2010

66. Karta charakterystyki preparatu Vpriv. EMA/568813/2010

67. Tekoah Y., Tzaban S., Kizhner T., Hainrichson M., Gantman A., Golembo M.,

Aviezer D., Shaaltiel Y., Glycosylation and functionality of recombinant

B-glucocerebrosidase from various production systems, Bioscience Reports,

33 (2013), e00071

68. Karta charakterystyki preparatu Fabrazyme EMA/65766/2013

69. Bazan-Socha S., Miszalski-Jamka T., Petkow-Dimitrow P., Musiał J.

Stabilizacja kliniczna choroby Fabry’ego w toku 54-miesięcznej

enzymatycznej terapii zastępczej – ciąg dalszy obserwacji. Polskie Archiwum

Medycyny Wewnętrznej., 117 (2007), s. 260-265

70. Karta charakterystyki preparatu Repragal. EMA/396624/2015

71. Karta charakterystyki preparatu Myozyme. EMA/31154/2011

72. Karta charakterystyki preparatu Elaprase. EMA/657978/2014

73. http://www.sanofi.pl/l/pl/medias/3F18F1FE-A537-42C0-B061-

7EA9AA891071.pdf 20.11.2015


Streszczenie

Przemysł farmaceutyczny wykorzystuje enzymy w preparatyce leków stosowanych

w terapii wielu chorób. Enzymatyczna terapia zastępcza polega na podaniu brakującego enzymu katalizującego daną reakcję. Dzięki różnym postaciom leku, w których enzymy są

zamykane można je wprowadzić do organizmu drogą doustną, pozajelitową lub wziewną.

Najbardziej rozpowszechnioną drogą podania jest aplikacja doustna. Dawka enzymu może

być wtedy rozdzielona na małe kompartmenty (minitabletki, peletki, mikrosfery lub mikrokapsułki), które będą zamknięte w postaci dogodnej dla pacjenta, tabletce lub

kapsułce. Dzięki takiej formie podania można modyfikować uwalnianie enzymu otrzymując

lek o opóźnionym, przedłużonym, spowolnionym lub kontrolowanym uwalnianiu.

Liposomy, jako postać leku umożliwiają dostarczenie enzymu do miejsca docelowego w organizmie oraz chronią go przed dezaktywacją. Strukturę, w której enzym zamknięty jest

wewnątrz liposomu nazywa się enzymosomem. Można go podawać również drogą

wziewną. Zaletą tej drogi podania jest dużo mniejszy w porównaniu z podaniem doustnym



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ramsey%20BW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8090614

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Dorkin%20HL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8090614


98

efekt pierwszego przejścia oraz w konsekwencji obniżone ryzyko wystąpienia działań

niepożądanych; wadą natomiast jest zmienna i charakteryzująca się małą powtarzalnością

depozycja leku. Szczególnie restrykcyjne wymagania stawia się płynom infuzyjnym,

a personel medyczny musi mieć doświadczenie w leczeniu pacjentów z chorobami rzadkimi. Celem pracy było przedstawienie obecnego stanu wiedzy na temat technologii sporządzania

leków zawierających enzymy oraz charakterystyka wybranych preparatów obecnych na

rynku farmaceutycznym w Polsce.

The use of enzymes in the pharmaceutical industry

Abstract

The pharmaceutical industry employs enzymes in preparation of drugs used in the treatment of many diseases. Enzyme replacement therapy involves the administration via parenteral

route of a missing enzyme catalyzing a given reaction. Due to different forms of enzyme-

containing drugs, they can have various routes of administration - oral, parenteral or by

inhalation. Oral administration is the most common one. It allows to divide the dose of the enzyme into small compartments (mini pills, pellets, microspheres or microcapsules), which

then will be encased in a receptacle convenient for the patient, a tablet or a capsule. With

this form of administration, it is possible to modify the release of the enzyme, so as to obtain

medication with delayed, prolonged, slow or controlled release. Liposomes (as a form of medicine) allow to convey the enzyme to a particular destination in the body and to

protect it from degradation. The structure containing the enzyme enclosed within a liposome

is called an enzymosome. It can be also administered by inhalation. Inhaled drugs

experience much lower first pass effect than those administered orally. Consequently, the

occurrence of adverse effects is less likely. However, they also have a drawback: their

deposition is variable and is characterised by low reproducibility. Infusion fluids must meet

stringent requirements, and medical personnel must have experience in the treatment

of patients with rare diseases. The aim of this work was to present the current state of knowledge on production

technology of drugs containing enzymes and to characterise selected pharmaceutical

preparations available in Poland.

99

Katarzyna Dudka1, Marzena Baran

2, Ewelina Karpik

3

Roślinne metabolity wtórne

i ich zastosowanie w kosmetyce

1. Wstęp

Historia kosmetyków sięga czasów starożytnych – już wtedy wyko-

rzystywano naturalne składniki. Z biegiem czasu kosmetyki zaczęły

odgrywać coraz większą rolę, ze względu na większą wiedzę ludzi na temat

higieny oraz możliwości produkcji kosmetyków z produktów pochodzenia

naturalnego. Produkty te były głównym źródłem i fundamentem kosme-

tyków. Rozwój kosmetologii nastąpił po odkryciu syntezy związków

biologicznie czynnych ze związków syntetycznych. Obecnie przemysł

kosmetyczny opiera się na dokonaniach takich dziedzin nauki jak

biochemia, chemia, medycyna. Wraz z rozwojem zainteresowania tą

dziedziną, wzrosła też świadomość stosowania produktów kosmetycznych

oraz metod ich wytwarzania. Współcześnie wzrosło zainteresowanie

kosmetykami pochodzenia naturalnego. Związki użyte w środkach do

pielęgnacji mogą być pozyskiwane jako ekstrakty z roślin lub otrzymywane

na drodze syntezy chemicznej lub procesów biotechnologicznych [1].

Rośliny wytwarzają ogromną ilość związków chemicznych. Część z nich

powstaje w trakcie metabolizmu pierwotnego (białka, aminokwasy,

tłuszcze), zaś pozostałe są produktami metabolizmu wtórnego. W wyniku

licznych badań oraz obserwacji zaczęto wykorzystywać metabolity wtórne

w przemyśle kosmetycznym ze względu na ich unikalne właściwości [2].

Od dawna ekstrakty pochodzenia roślinnego były używane jako

aktywne związki w produkcji kosmetyków. Świadczy to o tym, iż świat

roślin jest bogatym zasobem substancji biologicznie aktywnych. Każdego

roku pojawiają się nowe kosmetyki, w których odkryta i opisana

dobroczynna aktywność tych związków zostaje opatentowana. Metabolity

wtórne w szczególności wykorzystywane są w produktach, które mają za

zadanie opóźnić proces starzenia. Stwierdzono, że związki te zwalczają

wolne rodniki, przyczyniające się do rozwoju procesu starzenia się 1 [email protected], Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie, Wydział

Biologii i Biotechnologii 2 [email protected], Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie, Wydział Biologii i Biotechnologii 3 [email protected], Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie, Wydział

Biologii i Biotechnologii

Katarzyna Dudka, Marzena Baran, Ewelina Karpik

100

organizmu. Skutkuje to zaburzeniami struktury warstwy rogowej skóry,

uszkodzeniem żywej warstwy naskórka oraz skóry właściwej. Metabolity

wtórne w szczególności wykorzystywane są w produktach, które mają za

zadanie opóźnić proces starzenia. Stwierdzono, że związki te zwalczają

wolne rodniki przyczyniające się do rozwoju procesu starzenia się

organizmu. Skutkuje to zaburzeniami struktury warstwy rogowej skóry,

ponadto uszkodzeniem żywej warstwy naskórka oraz skóry właściwej.

Czynniki zewnętrzne przyczyniają się do peroksydacji lipidów, z których

zbudowane są fosfolipidy błon komórkowych. W wyniku utlenienia

lipidów powstają nadtlenki lipidów, które pośrednio lub bezpośrednio

uszkadzają białka. Powoduje to zaburzenie homeostazy i uwolnienie

kompleksów białkowych, które wywołują stan zapalny.

Peroksydacja niszczy cement międzykomórkowy, co prowadzi do

zniszczenia zewnętrznej bariery – naskórka. W konsekwencji przyczynia

się do odwodnienia skóry i zwiększenia jej wrażliwości na alergeny i inne

czynniki zewnętrzne. Metabolity wtórne regulują aktywność metaloproteinaz.

Zakłócenie pracy tych enzymów jest spowodowane obecnością wolnych

rodników, które mogą działać jako wtórne przekaźniki w aktywacji czynników

transkrypcyjnych. Powoduje to wydzielanie substancji prozapalnych, takich

jak cytokiny i interleukiny. Proces zaburzenia regulacji aktywności

metaloproteinaz prowadzi także do osłabienia ekspresji genów odpowie-

dzialnych za syntezę kolagenu. Wymienione wyżej procesy przyczyniają

się do osłabienia sprężystości skóry, powstawania zmarszczek oraz zmian

jej pigmentacji. Dzięki właściwościom związków pochodzenia roślinnego

takich jak polifenole i politerpeny następuje zahamowanie aktywności tych

enzymów. Metabolity wtórne wywołują dezaktywację metaloprotein

poprzez chelatację jonów dwuwartościowych Fe, Mg, Cu, które są

kofaktorami enzymów. Polifenole ze względu na fakt, iż w ich strukturze

obecne są wolne grupy hydroksylowe mogą tworzyć z metalami

przejściowymi kompleksy. Powoduje to zmniejszenie potencjału

oksydacyjno-redukującego polifenoli i stabilizuję utlenionej formy metalu.

Metabolity wtórne dodatkowo stymulują działanie niektórych enzymów

takich jak hialuronidazy, kolagenazy, lipoksydazy, dzięki czemu aktywują

budowę tkanki łącznej skóry. Dzięki tym właściwościom metabolity

wtórne znalazły szerokie zastosowanie w przemyśle kosmetycznym [3].

2. Charakterystyka metabolitów wtórnych

Metabolity wtórne są to organiczne niskocząsteczkowe związki

chemiczne produkowane przez liczne grupy organizmów, takie jak grzyby,

bakterie i rośliny. Metabolity wtórne to zespół substancji różnorodnych

i specyficznych, które nie są niezbędne do przeprowadzania funkcji

Roślinne metabolity wtórne i ich zastosowanie w kosmetyce

101

życiowych. Metabolizm wtórny i pierwotny są ze sobą ściśle skorelowane,

mają podobne drogi syntezy, chociaż nie zawsze metabolity pierwotne są

substratem dla metabolitów wtórnych. Substancje metabolizmu wtórnego

wytwarzane są w konkretnych tkankach i organach. Produkowane są na

określonym etapie rozwoju i magazynowane, pełniąc różnorodne

zastosowanie w organizmie. Związki te powstają w wyniku tysięcy

sprzężonych ze sobą reakcji biochemicznych, które mają charakter

łańcuchowy, czyli produkt końcowy reakcji jest materiałem wyjściowym

dla reakcji następnej. W tym procesie powstają dodatkowo metabolity

pośrednie, kiedy to szybkość chociaż jednej reakcji ulegnie zwolnieniu

i stanowią one materiał wyjściowy dla nowych reakcji, tworzących boczny

łańcuch metaboliczny. Uczestniczące w tych zabiegach enzymy to proste

niespecyficzne związki chemiczne o zbliżonej budowie do substratu.

W wyniku tych reakcji syntezowane są grupy związków o podobnej do

siebie strukturze chemicznej [4]. Obecność metabolitów wtórnych jest

cechą taksonomiczną ułatwiającą przyporządkowanie organizmów do

odpowiednich grup. Liczba poznanych metabolitów szacowana jest na

około 100 do 200 tysięcy. Każdego roku wykrywa się około 1600 nowych

związków. Ponadto tylko 10% roślin wyższych zbadano fitochemicznie.

Dla porównania, liczba poznanych metabolitów wtórnych syntetyzowanych

przez drobnoustroje oceniana jest na ponad 20 000, a metabolitów

wtórnych wytwarzanych przez zwierzęta na około 2500. Substancje te

cieszą się coraz większym zainteresowaniem przemysłu. Wykorzystywane

są jako farmaceutyki substancje zapachowe, barwniki, biopestycydy,

dodatki do żywności i kosmetyków. Obecnie ok. 25% stosowanych leków

zawiera związki, które bezpośrednio lub pośrednio pochodzą z roślin.

Pozyskanie substancji użytecznych dla celów przemysłowych prowadzi się

metodami, które powinny doprowadzić do zwiększenia produkcji

i zmniejszenia kosztów. Metabolity pozyskiwane są z reguły dzięki

ekstrakcji z surowca roślinnego pochodzącego z uprawy. Zawartość tych

składników jest niska (1% suchej masy) i zmienna, uzależniona niestety od

warunków środowiska. Większość roślin wytwarzających przydatne

metabolity jest trudno dostępna, chroniona lub występuje w określonych

warunkach klimatycznych.

Na skalę przemysłową do syntezy metabolitów wtórnych wykorzystuje

się metody biotechnologiczne, które niosą ze sobą wiele zalet takich jak

kontrolowane warunki hodowli umożliwiające otrzymanie jednorodnego

produktu oraz zwiększenie produktywności poprzez selekcję wysoko

wydajnych linii oraz elicytacje [5]. Metabolity wtórne zostały podzielone

na 3 główne grupy: terpeny, związki fenolowe, alkaloidy [6].


102

2.1. Synteza metabolitów wtórnych

Podstawowe szlaki metaboliczne u każdej z grup roślin przebiegają

w zbliżony sposób. Wszystkie reakcje zachodzą na bazie substratów

powstałych w wyniku fotosyntezy. Substratami tego procesu są cukry proste.

Dalsze przemiany biochemiczne zachodzą w procesie oddychania, prowadzą

one do syntezy białek, lipidów i kwasów nukleinowych. Od głównych szlaków

odchodzą boczne zarówno kataboliczne, jak i anaboliczne procesy (Rys. 1).

Badając powstawanie substancji organicznych w roślinach podział na

metabolity pierwotne i wtórne jest trudny, ze względu na ścisłe korelacje

między nimi. Metabolity pierwotne często są prekursorami do syntezy

metabolitów wtórnych. Synteza poszczególnych związków zachodzi w orga-

nach dla nich charakterystycznych [6]. Jest to proces kosztowny dla rośliny,

który wymaga dopływu prekursorów ze szlaków metabolizmu podstawowego

oraz enzymów i bogatych w energię cząsteczek NADPH i ATP [7].


103

Rysunek 1. Synteza metabolitów wtórnych [4]

2.2. Związki powstające na poszczególnych etapach metabolizmu

wtórnego

Synteza metabolitów wtórnych zachodzi na trzech szlakach kwasu

szikimowego, mewalonowego, malonowego. Podstawowym związkiem

łączącym te procesy jest acetylo-CoA, powstaje on w procesie glikolizy [6].


104

2.2.1. Szlak kwasu szikimowego

Proces ten jest to ciąg przemian, w wyniku których powstają związki

należące do aminokwasów aromatycznych. Syntezowane są one na drodze

reakcji fosfoenolopirogronianu z erytrozo-4-fosforanem. W ten sposób

powstają:

alkaloidy;

związki fenolowe;

pochodne kwasu cynamonowego;

fenylopropanoidy.

2.2.2. Szlak kwasu mewalonowego

Proces ten jest to ciąg reakcji, który zachodzi w cytozolu. Produkty tego

szlaku należą do terpenoidów i powstają w wyniku kondensacji 3 cząsteczek

acetylo-CoA. W tym procesie syntezowane są również pirofosforan izopentylu

oraz pirfosforan 3,3 dimetyloallilu, które ulegają ponownej kondensacji

tworząc wspomniane terpenoidy. Druga droga syntezy pirofosforanu

izopentylu zachodzi w plastydach, gdzie produkowane są karotenoidy.

2.2.3. Szlak kwasu malonowego

Tym sposobem powstają związki fenolowe przy udziale szlaku kwasu

szikimowego. Prekursorem tego szlaku tak jak i pozostałych jest acetylo-CoA.

W wyniku współpracy ze szlakiem szikimowym powstają związki bardziej

złożone, posiadające pierścienie aromatyczne takie jak flawonoidy [6].

2.3. Regulacja syntezy metabolitów wtórnych

Metabolity wtórne powstały w komórkach na drodze ewolucji najpraw-

dopodobniej z metabolitów pierwotnych w wyniku licznych przemian

materii zachodzących po fazie wzrostu i rozwoju. Produkcja metabolitów

wtórnych jest zależna od fazy rozwoju rośliny (specjalizacji narządów,

tkanek), funkcji danego metabolitu i przedziałowości w obrębie komórki.

Potwierdzeniem tego zjawiska jest fakt, że terpenoidy gromadzone są tylko

w kanałach żywiczych, komórkach lateksowych oraz gruczołach olejko-

dajnych. Interesującym przykładem segmentacji komórki są kompleksy

enzymatyczne występujące tylko w określonych obszarach tej struktury. Do

prawidłowego funkcjonowania organizmów żywych enzymy muszą być

transportowane, jednak wiąże się to z dużym nakładem energii. Na syntezę

związków metabolicznych duży wpływ mają również uwarunkowania

genetyczne. Metabolity powstają tylko u niektórych grup roślin i są dla

nich charakterystyczne. Zauważono, że białka katalityczne uczestniczące

w produkcji metabolitów regulowane są poprzez odpowiednie mRNA,


105

obróbkę posttranslacyjną materiału genetycznego zapoczątkowywaną przez

czynniki zewnętrzne. W warunkach hodowlanych poliploidyzacja genomu

powoduje wzrost produkcji związków swoistych. Warunki środowiska takie

jak dostępność do światła, zmiany temperatury, natężenie promieniowania

UV, dostępność substancji pokarmowych, związków mineralnych przyczynia

się do zmian ilości uzyskanych produktów. Regulacja metabolizmu

wtórnego opiera się ponadto na procesach znanych z metabolizmu

pierwotnego czyli hamowania substratem i nagromadzenia produktu [2].

Powstanie wolnych rodników spowodowane jest promieniowaniem UV,

promieniowaniem jonizującym [10].

Negatywne działanie promieniowanie UV na skórę może być nas-

tępujące (Rys. 2):

uszkodzenie naskórka widoczne jako rumień i zmiana pigmentacji;

powstanie reaktywnych form tlenu powodujących proces foto-

starzenia skóry;

uszkodzenie włókien kolagenowych i elastycznych;

pobudzenie metaloproteinaz;

uszkodzenie naczyń krwionośnych;

rogowacenie naskórka;

uszkodzenie DNA komórek naskórka [11].

Rysunek 2. Działanie promieniowania UV na skórę [11]

3. Terpeny

Terpeny są to organiczne związki chemiczne. Jednostką strukturalną tej

grupy jest pięciowęglowy układ izoprenu a zatem są to oligomery izoprenu,

w których reszty izoprenowe połączone są w sposób głowa – ogon (Rys. 3).


106

Należą one do naturalnych węglowodorów pochodzenia roślinnego.

Terpeny są to związki hydrofobowe, których liczbę szacuje się na około 20

tysięcy.

Rysunek 3. Wzór strukturalny izoprenu [8]

Terpeny mogą mieć budowę zarówno łańcuchową jak i cykliczną złożoną

z jednego lub kilku pierścieni. Stanowią szeroką klasę, którą dzielimy

w zależności od liczby jednostek izoprenowych wchodzących w skład

cząsteczki.

Wśród terpenów wyróżniamy kilka klas, które zostały przedstawione

poniżej w Tabeli 1.

Tabela 1. Podział i przykłady terpenów [4]

Klasa Grupa Liczba cząsteczek

węgla Przykład

Monoterpeny Olejki eteryczne 10 Cytral, Linalol,

Mentol

Seskwiterpeny Żywice 15 Salinen

Dwuterpeny Kwasy żywicowe 20 Kalafonia

Trójterpeny Sitosterole 30 Saponina

Czteroterpeny Karotenoidy 40 Likopen, Karoten


107

Spośród terpenów najlepiej poznanymi i mającymi największe zasto-

sowanie w przemyśle kosmetycznym są grupy karotenoidów oraz olejków

eterycznych. Dlatego ich właściwości zostaną bliżej przedstawione w pracy.

3.1. Synteza terpenów

Substratem do biosyntezy terpenów jest acetylo-CoA, który w wyniku

kondensacji tworzy kwas mewalonowy. W czasie dalszych przemian kwasu

mewalonowego tworzy się aktywny izopren - pirofosforan izopentenylu

(IPP), który jest biologiczną jednostką syntezy terpenoidów (Rys. 4) [4].

Rysunek 4. Synteza terpenów [9]

3.2. Karotenoidy

Karotenoidy to grupa organicznych związków, węglowodorów

nienasyconych o licznych podwójnych wiązaniach sprzężonych występujących

w konfiguracji trans, dzięki cyklizacji łańcucha poliizopentenolowego.

Zbudowane są z jednostek izoprenowych o 40-węglowym łańcuchu.

Charakterystyczne dla tej grupy jest występowanie dwóch pierścieni

cykloheksylowych połączonych łańcuchem węglowym [2]. Klasyfikowane są

w dwie grupy czyli karoteny zbudowane z węglowodorów i pochodne tlenowe

– ksantofile [4].

3.2.1. Synteza karotenoidów

Biosynteza karotenoidów następuje na dwóch drogach:

1. Karotenoidy powstają na drodze kondensacji 2 cząsteczek difosforanu

digeranylu w obecności syntazy fitoenu – w tej reakcji powstaje fitoen.

Związek ten następnie ulega reakcjom katalizowanym przez oksydazy,

dzięki czemu powstaje likopen. W wyniku jego cyklizacji powstaje

α-karoten i β-karoten. W następnych etapach syntezy związki te

przekształcane są w procesie hydroksylacji w zeaksantynę i luteinę

w obecności epoksydazy zeaksantyny. Model tej syntezy występuje

u wszystkich roślin wyższych.


108

2. Karotenoidy powstają w wyniku syntezy 2 cząsteczek difosforanu

farnezylu, dzięki czemu powstaje łańcuch 30-węglowy. Model ten

ogranicza się tylko do bakterii z rodziny Streptococcus, Staphylococcus,

Heliobacterium [12].

3.2.2. Działanie karotenoidów

Karotenoidy są antyoksydantami czyli pochłaniają energię tlenu

w stanie singletowym doprowadzając go do jej utraty i zmiany stanu

energetycznego. Umożliwiają to obecne w cząsteczkach karotenoidów

liczne skoniugowane podwójne wiązania absorbujące energię świetlną oraz

występowanie cykloheksanowych pierścieni z grupami hydroksylowymi

oraz ugrupowaniami ketonowymi. Mechanizm właściwości przeciwutle-

niających powiązany jest ze zdolnością do fotoprotekcji czyli unieszkodli-

wianiem wolnych rodników tlenowych i rodników peroksylowych. Rodniki

zwiększają zdolność enzymatycznych układów przeciwutleniających

dysmutazy ponadtlenkowej i katalazy [12]. Poprzez zastosowanie

karotenoidów i ich pochodnych następuje zmiana zabarwienia skóry

dodatkowo poprawę jej kolorytu co wykorzystuje się w leczeniu

przebarwień skórnych oraz preparatach samoopalających. Karotenoidy

zapobiegają również powstawaniu piegów. Związki te mają w dodatku

zdolność do pochłaniania promieniowania ultrafioletowego, dzięki czemu

działają jak filtr, przeciwdziałając efektowi fotostarzenia skóry,

podrażnieniom, a w konsekwencji nowotworom. Normalizują pracę

gruczołów łojowych, powodują oczyszczenie mieszków włosowych

i stymulują proces eksfoliacji naskórka, a dzięki czemu mają działanie

przeciwtrądzikowe [13].

3.2.3. Charakterystyka wybranych karotenoidów

Duże znaczenie w kosmetologii znalazły takie związki należące do

karotenoidów jak β-karoten oraz likopen. Zostaną one przedstawione

w dalszej części pracy.

3.2.3.1. β-Karoten

β-Karoten jest to związek chemiczny, należący do karotenów, który

stanowi około 70-80% tej grupy. Na obu końcach cząsteczki znajdują się

układy β-jonowe. Związek ten nie ma aktywności optycznej. Występuje

w formie trans i zawiera 11 podwójnych wiązań sprzężonych (Rys. 5).

W obecności liazy i 2 cząsteczek wody ulega rozpadowi do formy alkoho-

lowej witaminy A, która jest określana jako prowitamina A. Powstaje ona

w wyniku rozkładu podwójnego wiązania cząsteczki tworzy się retinal,


109

który jest produktem pośrednim. Retinal jest następnie redukowany do

witaminy A (Rys. 6) [2].

Rysunek 5. Wzór strukturalny β-karotenu [2]

Rysunek 6. Wzór strukturalny witaminy A [2]

β-Karoten znajduje się w produktach pochodzenia roślinnego (marchwi,

dyni, papryce) i stamtąd jest ekstrahowany. Na dużą skalę otrzymywany

jest syntetycznie lub przez fermentację. Występuje również w bakteriach

fotosyntetyzujących [2].

Działanie karotenu jest ściśle skorelowane z działaniem witaminy A. Oba

te związki biorą udział w licznych procesach zachodzących w organizmie.

Ze względu na korzyści płynące z ich stosowania, znalazły one duże zasto-

sowanie w przemyśle kosmetycznym. Kosmetyki zawierające witaminę A

i β-karoten stosuje się ze względu na właściwości przeciwutleniające

w środowisku hydrofobowym. Tworzą układ antyoksydacyjny stanowiący

barierę ochronną. Jest to zjawisko korzystne, ponieważ zachwianie

równowagi prooksydacyjno-oksydacyjnej powoduje patologiczne uszko-

dzenia komórek i tkanek.

W kosmetykach wykorzystuje się właściwości witaminy A i β-karotenu,

które mają na celu zmniejszenie szkodliwego działania czynników

zewnętrznych. Preparaty z dodatkiem tych związków są stosowane w celu

zwiększenia elastyczności skóry poprzez zmniejszenie jej rogowacenia.

Zalecane są w celu opóźnienia procesów starzenia skóry. Wynikiem ich

stosowania jest zmniejszenie drobnych zmarszczek i bruzd oraz rozjaś-

nienie przebarwień, plam soczewicowatych. Substancje te przyczyniają się

do zwiększenia liczby fibroblastów i regulacji syntezy kolagenu. Powodują

zwiększenie żółtego zabarwienia skóry, które jest obecnie zjawiskiem


110

pożądanym. Kosmetyki stosowane przed ekspozycją na słońce chronią

przed jego szkodliwym działaniem, poprzez zwiększenie absorpcji

promieniowania [14].

3.2.3.2. Likopen

Likopen jest to związek organiczny, należący do grupy węglowodorów

nienasyconych o strukturze liniowej. Posiadający 13 wiązań podwójnych,

w tym 11 sprzężonych (Rys.7). Jest produkowany przez rośliny oraz

bakterie autotroficzne. Występuje w dużych ilościach w pomidorach,

arbuzie, ogólnie w owocach o czerwonej skórce [17].

Rysunek 2. Wzór strukturalny likopenu [17]

Likopen otrzymywany jest z materiału roślinnego poprzez ekstrakcje

rozpuszczalnikami organicznymi przy wysokiej temperaturze i zwiększonym

ciśnieniu. Posiada silne właściwości antyoksydacyjne, neutralizując wolne

rodniki na drodze addycji rodnika, oderwania wodoru lub przeniesienia

elektronu. Pełni funkcję donora, a następnie sam staje się rodnikiem [16].

Produkty z ekstraktem likopenu wykorzystywane są w kosmetyce. Ekstrakt

stosuje się produkcji kremów ochronnych przed UV, w kosmetykach

mających na celu regenerację i ujędrnienie skóry oraz rewitalizację.

W szczególności korzystny jest on dla cery suchej, ziemistej. Dodatkowo

posiada efekt tonizujący zalecany w pielęgnacji cery tłustej. Posiada też

właściwości odmładzające, redukując procesy starzenia, nadaje jej elastycz-

ności i jędrności poprzez regulację produkcji prokolagenu. Prokolagen jest

białkiem prekursorowym kolagenu, które dodatkowo zabezpiecza kwas

hialuronowy przed rozpadem [17].

3.3. Olejki eteryczne

Olejki eteryczne to produkty metabolizmu wtórnego złożone z wielu

składników należących do terpenów (monoterpenów, seskwiterpenów,

terpenów alifatycznych), aldehydów, ketonów, alkoholi (tłuszczowych,

terpenowych, aryloalifatycznych), estrów, laktonów, pochodnych fenylo-

propanu i kwasów organicznych [6]. W olejkach eterycznych spotyka się


111

dodatkowe substancje siarkowe, azotowe, tropolony, kumaryny oraz

pochodne acetylenu. W skład jednego olejku może wchodzić kilkanaście

do kilkuset związków chemicznych o różnym stężeniu i właściwościach

[18]. Obecnie poznano ponad 1500 substancji wchodzących w skład

olejków eterycznych. W większości przypadków można wyróżnić jeden

związek nadający charakterystyczny aromat, który również wpływa na

właściwości farmakologiczne i biologiczne olejku [20]. Olejki eteryczne

produkowane są przez rośliny w komórkach gruczołów wydzielniczych

epidermy lub w epidermalnych zbiorowiskach olejkowych ewentualnie

w zewnętrznej części roślin (włoskach gruczołowych lub kwiatach).

Synteza tych metabolitów następuje w cytoplazmie z udziałem struktur

Golgiego i siateczki śródplazmatycznej.

W wyniku produkcji olejku dochodzi do starzenia się komórki, o czym

świadczy zanik cytoplazmy, której miejsce zastępuje substancja olejkowa.

Substancje te są magazynowane w zbiornikach:

Egzogenicznych, czyli zewnątrztkankowych, gdzie gromadzone są

wytwory epidermy (gruczołów olejkowych i włosków gruczołowych).

Zbiorniki te umiejscowione są w zewnętrznej części organu. Ilość

produkowanych substancji olejkowych zależy od gatunku rośliny,

ilości i wielkości włosków.

Endogeniczne, czyli wewnątrztkankowe, które rozproszone są

w tkance miękiszowej. Zbiorniki te to kanały i przewody olejowe.

Ilość wyprodukowanych substancji jest bardzo zmienna i zależy od

gatunku rośliny oraz ilości i wielkości włosków gruczołowych. Zawartość

olejków w poszczególnych organach uwarunkowana jest porą roku, porą

dnia, czynnikami zewnętrznymi.

Olejki eteryczne występują u większości roślin, a duże ich stężenie

znajduje się w liściach, kwiatach, łodygach. Rozpowszechnione są one

u takich grup jak jasnotowate, bodziszkowate, astrowate i rutowate.

Występują również u roślin nagonasiennych w igłach i szyszkach [6].

Olejki eteryczne otrzymywane są poprzez proste metody chemiczne:

Ekstrakcję – jest to metoda wyodrębnienia składnika poprzez dyfuzję

substancją, która lepiej rozpuszcza składniki aromatyczne znajdujące

się w olejkach eterycznych. Rozdzielenie frakcji powstałego

roztworu następuje, dzięki różnicy gęstości składników;

Destylację – z parą wodną jest to metoda wykorzystująca nasyconą

parę wodną, która przepuszcza się przez surowiec roślinny. Para

wodna z rozpuszczonymi w niej składnikami jest skraplana

i następnie dochodzi do rozdzielnia wonnych substancji nierozpusz-

czalnych w wodzie;


112

Destylację wodną – w tym przypadku surowiec roślinny umieszcza

się w wodzie, którą podgrzewa się do wrzenia. Olejek otrzymuje się

w wyniku skraplania pary wodnej dzięki jej ochłodzeniu;

Macerację – jest to rodzaj ekstrakcji olejków poprzez umieszczenie

ich w tłuszczach w wysokiej temperaturze. Otrzymaną w tym procesie

pomadę rozdziela się alkoholem etylowym w celu uzyskania olejku

eterycznego;

Wytłaczanie – jest metoda polegająca na wyciśnięciu olejków

z produktu. Następnie uzyskany ekstrakt jest poddawany dekantacji

i filtracji;

Absorpcję – jest to metoda wykorzystująca zjawisko pochłaniania

olejków przez tłuszcze. Roztwór tych dwóch substancji po pewnym

czasie powoduje powstanie pomady z której olejek uzyskuje się

poprzez ekstrakcje lotnymi rozpuszczalnikami [19].

3.3.1. Wybrane olejki eteryczne wykorzystywane w kosmetyce

W tej części pracy zostaną przedstawieni najciekawsi przedstawiciele

olejków eterycznych. Znalazły one duże zastosowanie w przemyśle

kosmetycznym.

3.3.1.1. Olejek bornylu

Olejek cyprysowy pozyskiwany jest z cyprysu jego liści, szyszek,

gałązek. Cyprys jest to roślina występująca w klimacie śródziemno-

morskim. Głównymi składnikami tego olejku są limonen, pinen, trans –

ocymen, myrcen, octan terpinylu, octan bomylu, karen, linalol, cedrol.

Przedstawiony olejek ma działanie antyseptyczne, przeciwwirusowe

i przeciwbakteryjne. Ma właściwości ściągające, dlatego stosowany jest

w produktach mających na celu zmniejszenie objawów pocenia.

Wykorzystywany jest w preparatach do cery tłustej działając ściągająco,

maskując problemy trądzikowe oraz rozszerzone pory. Olejek stosowany

jest również w płynach po goleniu, zmniejszając krwawienie po

skaleczeniu. Dodawany do szamponu zmniejsza przetłuszczanie włosów

oraz łupież [20].

3.3.1.2. Olejek lawendowy

Olejek pozyskiwany jest z lawendy prawdziwej, roślina ta uprawiana

jest w południowej Francji. Głównymi składnikami olejku są limonen,

ocymen, myrcen, pinen, linalol, lawadulol, borneol. Olejek lawendowy

stosowany jest do skóry problematycznej, gdyż niweluje trądzik. Używany

w leczeniu obrzęków, zapaleń, poparzeń skóry wywołanych przez

promieniowanie słoneczne [20].


113

3.3.1.3. Olejek neroli

Olejek ten otrzymywany jest z kwiatów gorzkiej pomarańczy.

Podstawowymi składnikami olejku są limonen, linalol, nerol, geraniol,

fernezol, octan linalolu, octan nerylu. Olejek ma działanie kojące

nawilżające, dlatego stosowany jest do skóry wrażliwej, podrażnionej.

Olejek neroli ma dodatkowo funkcję tonizującą skórę. Powoduje

opóźnienie procesów starzenia skóry, powstawania zmarszczek, kamufluje

pękające naczynka. Stosowany zapobiegawczo przed powstawaniem

rozstępów oraz na zmiany już istniejące.

Większość olejków eterycznych wykorzystywanych jest w aromaterapii

do masażu np. olejek lawendowy, geraniowy, które mają działanie

odprężające. Olejek różany, eukaliptusowy wspomagają koncentracje oraz

działają pobudzająco. Olejki szeroko rozpowszechnione są w produkcji

perfum ze względu na przyjemny aromat [20].

4. Związki fenolowe

Związki fenolowe są to związki aromatyczne bezazotowe zbudowane

z sześciowęglowych pierścieni aromatycznych do których przyłączone są

grupy hydroksylowe -OH lub jej pochodne [4]. Substancje te upowszechnione

są w przyrodzie, a ich liczbę szacuje się na około 8 tysięcy. Klasyfikacja

związków fenolowych jest niezwykle utrudniona ze względu na zróżnicowaną

budowę oraz szlaki syntezy [6].

4.1. Synteza związków fenolowych.

Synteza zachodzi w komórkach roślinnych na kilku drogach, a substratem

tego procesu zawsze są związki alifatyczne. Mogą być produkowane na

dwa odmienne sposoby:

1. Szlakiem kwasu szikimowego – substratami tego procesu, gdzie

powstaję kwas szikimowy są powstający podczas glikolizy kwas

fosfoenolopirogronowy i erytrozo-4- fosforan powstający podczas

cyklu pentozowego. W kolejnych etapach rekcji powstaje kwas 3-

dehydrochinonowy z którego finalnie powstaje szikimian. W ten

sposób powstaje kwas szikimowy. Kwas ten jest produktem

pośrednim kolejnych reakcji w wyniku, których tworzą się związki

aromatyczne;

2. Substratem w syntezie związków fenolowych mogą być acetylo-CoA

i malonylo-CoA, z których w wyniku reakcji powstają poliketydy

ulegające procesowi cyklizacji, dzięki temu tworzą się związki

aromatyczne;

3. Synteza związków aromatycznych może również zachodzić poprzez

cyklizacje terpenów [4].


114

4.2. Działanie związków fenolowych

Związki fenolowe posiadają właściwości antyoksydacyjne chroniące

organizm przed stresem oksydacyjnym. Ma to na celu destrukcję reak-

tywnych form tlenu, zablokowanie wolnych rodników i enzymów posia-

dających właściwości przeciwutleniające szczególnie z grupy oksydaz.

Dodatkowo związki fenolowe chelatują jony metali dwuwartościowych.

Mechanizm działania polega na stabilizacji wolnych rodników poprzez

związanie ich w kompleks lub uwodornienie. Właściwości związków

fenolowych zwiększają się wraz ze wzrostem ilości grup hydroksylowych

w cząsteczce i stopniem zestryfikowania [21].

Związki fenylowe jest to obszerna grupa, która została podzielona ze

względu na charakterystyczne ugrupowania występujące w ich strukturze.

Zostało to przedstawione w Tabeli 2.

Tabela 2. Podział i przykłady związków fenylowych [opracowanie własne]

Grupa związków fenylowych Charakterystyczne ugrupowanie Przykład

Pochodne fenylopropanu Fenylopropan (1 pierścień

aromatyczny) z dołączonym

łańcuchem trójwęglowym

Kumaryna

Kwas ferulowy

Flawonoidy Trzy pierścienie aromatyczne

połączone atomem tlenu poprzez

pierścień heterocykliczny

Cyjanina

Luteolina

Garbniki Spolimeryzowane związki

fenylowe

Galotanina

4.2.1. Garbniki

Garbniki należą do polifenoli, ze względu na liczne grupy hydroksylowe

występujące w cząsteczce. Są to bezazotowe związki naturalne o bardzo

dużej masie cząsteczkowej. W dużym stężeniu gromadzone są w korze,

korzeniach i liściach (igłach) roślin nagonasiennych i nagozalążkowych.

Tworzą trwałe nierozpuszczalne połączenie z białkami, dzięki czemu

działają ściągająco na błony śluzowe i skórę. Wykazują działanie

antybakteryjne, antysupresyjnie oraz działają przeciwutleniającą [22].

4.2.2. Flawonoidy

Flawonoidy są to polifenole, których szkielet składa się z 15 atomów

węgla. Tworzą one charakterystyczny układ 2 pierścieni aromatycznych

połączonych mostkiem trójwęglowym. Mostek tworzony jest przez

wiązanie podwójne między węglem oraz grupą karbonylową. Jest on

w dalszym etapie przekształcany w pierścień heterocykliczny zawierający

atom tlenu.


115

Flawonoidy to związki masowo występujące w roślinach. W dużej liczbie

znajdują się u roślin okrytonasiennych ponadto możemy je spotkać u roślin

niższych – glonów, mszaków. Flawonoidy w wysokim stężeniu możemy

znaleźć w kwiatach, liściach, owocach rzadziej w nasionach, drewnie, korze

[23]. Flawonoidy magazynowe są w wakuolach, gdzie połączone są

z sacharydami w postaci O-glikozydów, a część sacharydowa składa się z 1-5

podjednostek. Związki te pełnią rolą barwników ze względu na obecność

w budowie wiązań podwójnych, grup hydroksylowych oraz pierścieni

aromatycznych [6]. Obecnie poznanych jest około 6000 związków z tej grupy,

niektóre z nich zostaną przedstawione w Tabeli 3 [23]. Jest to bardzo

zróżnicowana klasa, różniąca się w budowie ze względu na:

ilość i umiejscowienie grup hydroksylowych, sulfonowych meto-

ksylowych;

typ wiązania glikozydowego z monosacharydami;

ilość cukrów w cząsteczce;

występowanie układów dimerycznych;

stopień utlenienia mostka trójwęglowego [23].

Tabela 3. Grupy flawonoidów [24]

Nazwa grupy Przedstawiciel

Antocyjany Cyjanidyny, Europinidyny, Pelargonidyna

Flawonole Mirycetyna, Morina, Kemferol

Flawony Rutyna, Hesperdyna, Kwercentyna

Flawanole Katechina, Epikatechina

Flawanony Naryngenina, Hasperedyna

Izoflawony Genisteina, Daidzein

4.2.2.1. Synteza flawonoidów

Flawonoidy są syntezowane z prekursorów metabolizmu podstawowego,

ich produkcja jest procesem skomplikowanym zachodzącym na 2 drogach:

szlak kwas mewalonowego, szlak kwasu szikimowego [23].


116

4.2.2.2. Działanie antyoksydacyjne flawonoidów wykorzystywane

w kosmetyce

Flawonoidy to substancje mające działanie antyoksydacyjne spowo-

dowane obecnością licznych grup hydroksylowych, wiązań podwójnych,

oraz grupy karbonylowej występujących w cząsteczce [24]. Aktywność

antyoksydacyjną potęguje zwiększenie liczby podstawników przy

pierścieniu B szczególnie jeżeli jest to grupa hydroksylowa, katecholowa,

pirogalloolowa [25]. Pożądane jest również ułożenie podstawników

w pozycji para i orto. Działanie antyoksydacyjne zwiększane jest dzięki

acetylacji kwasami fenolowymi reszt glikozydowych flawonoidów.

Natomiast przyłączenie do szkieletu reszty cukrowej obniża zdolność to

niszczenia wolnych rodników.

Mechanizm działania flawonoidów polega na niszczeniu wolnych

rodników tlenu oraz jego reaktywnych form. Na drodze zmniejszenia ich

produkcji poprzez zahamowanie enzymów biorących udział w wytwo-

rzeniu wolnych rodników tj. mieloperoksydazy, oksydazy ksantynowej.

Ponadto flawonoidy chelatują jony metali zapobiegając przez to powstaniu

rodnika hydroksylowego. Pośrednio flawonoidy mają zdolność do

zatrzymania kaskady przemian wolnorodnikowych w nieenzymatycznej

i enzymatycznej peroksydacji lipidów [24].

4.2.2.3. Antocyjany

Antocyjany to związki chemiczne należące do polifenolowych flawo-

noidów. Są to pochodne kationu flawyliowego – 2 fenylobenzo-

piryliowego, który występuje w formie karboniowej lub oksyniowej

(Rys.8). Grupa tych metabolitów zróżnicowana jest na podstawie ilości

i rozmieszczenia podstawników przy aromatycznych pierścieniach [20].

Antocyjany to barwniki szeroko rozpowszechnione w roślinach okryto-

nasiennych z wyjątkiem rzędu goździkowatych. Związki te nadają barwę

płatkom kwiatów i owocom. Naturalnie występują w formie glikozydów

połączonych z sacharydami i są magazynowane w wakuoli. Liczbę

poznanych antocyjanów szacuje się na ok. 300 [6].

Zostały one przedstawione ze względu na duże zainteresowanie nimi

przemysłu kosmetycznego.


117

Rysunek 3. Kation flawyliowy [26]

4.2.2.4. Synteza antocyjanów

Synteza antocyjanów jest procesem fotochemicznym, zachodzi przy

udziale światła a skutkiem tej reakcji jest pełniejsze zabarwienie owoców.

Antocyjany w wysokim stężeniu występują w owocach, zaś w mniejszej

ilości w liściach i łodygach. Działanie antocyjanów, jako barwników

maskowane jest przez chlorofil. Natężenie barwy, którą uzyskujemy dzięki

syntezie antocyjanów zależy od wzrastającej ilości grup hydroksylowych,

dających owocom i kwiatom barwę od pomarańczowej do czerwonej,

tendencja ta jest cofana przez grupy metoksylowe [6].

4.3. Charakterystyka wybranych związków fenolowych

Związki fenolowe jest to bardzo duża grupa występująca licznie

w roślinach wyższych. Ich korzystne właściwości zostały wykorzystane

w przemyśle kosmetycznym (Tabela 4).


118

Tabela 4. Przykładowe związki fenolowe i ich właściwości kosmetyczne [28]

Nazwa związku Występowanie Działanie

Myrtylina Borówka

Stymuluje karotenocyty przyśpieszając w ten

sposób regenerację skóry oraz jej sprężystość

dzięki zatrzymaniu wody w głębszych partiach

kwasu hialuronowego.

Izokwercyna Skrzyp polny Stosowany przeciwko łamliwości paznokci

i włosów.

Resweratrol Winogrona

czerwone i białe Działanie antyseptyczne

Betaina Burak czerwony Działanie antyoksydacyjne, redukuje wolne

rodniki

Rutozyd Brzoza Niweluje objawy łuszczycy oraz trądziku

Cyjanidyna Głóg Działanie antyoksydacyjne, redukuje wolne

rodniki

Tanina Zielona herbata Działanie antybakteryjne

4.3.1. Kwas ferulowy

Jednym z bliżej nam poznanych związków fenolowych jest kwas ferulowy,

czyli 4-hydroksy-3-metoksycynamonowy (Rys. 9). To organiczny związek

chemiczny, należący do pochodnych fenylopropanu, a dokładnie kwasu

cynamonowego. Syntetyzowany jest z aminokwasu L-fenyloalaniny i tyrozyny

poprzez szlak kwasu szikimowego. W przyrodzie występuje w konformacji

trans. Duże jego stężenie możemy znaleźć w ryżu, kukurydzy, pomidorach.

Spotykany jest w postaci wolnej i kowalencyjnie związanej z ligniną i innymi

biopolimerami [29].

Rysunek 4. Wzór strukturalny kwasu ferulowego [29]

Kwas ferulowy ma silne właściwości przeciwutleniające. Dzięki obecności

pierścieni aromatycznych i łańcuchów bocznych z wiązaniami podwójnymi


119

destabilizuje wolne rodniki. Absorbuje promieniowanie UV poprzez tworzenie

stabilnego fenoksy rodnika, zapobiegając tym samym zmianom patologicznym

skóry. Ponadto wykazuje działanie przeciwzapalne zmniejszając stężenia

mediatorów zapalnych np. prostaglandyn oraz hamując ekspresję białka iNOS

i interferonu. Kwas ferulowy zaleca się w leczeniu przebarwień skórnych,

ponieważ kontroluje enzym aktywujący ten proces. Przydatny w terapii

przeciwtrądzikowej szczególnie trądziku różowatego i innych zmian skórnych

takich jak łojotokowe zapalenie skóry, atopowe zapalenie skóry [29].

5. Alkaloidy

Alkaloidy to związki organiczne o charakterze zasadowym. Zbudowane

są z układu cyklicznego, w którym występuje chociaż jeden atom azotu

w pierścieniu lub poza pierścieniem. Obecne są w komórkach roślinnych

o wysokim metabolizmie pod postacią kwasów organicznych w soku

wakuolarnym. Alkaloidy zdolne są do tworzenia połączeń z garbnikami

i sacharydami. Występują u roślin wyższych z rodziny makowatych,

psiankowatych, jaskrowatych oraz toinowatych [6].

5.1. Biosynteza alkaloidów

Alkaloidy syntezowane są z aminokwasów najczęściej z fenyloalaniny,

lizyny, tryptofanu i ornityny. Kluczowym substratem w produkcji wielu

alkaloidów jest benzylotetrahydroizochinolina, powstająca w wyniku

kondensacji 2 cząsteczek fenyloalaniny [30].

5.2. Podział alkaloidów

Alkaloidy dzielimy ze względu na układy pierścieni występujące w ich

strukturze oraz substraty niezbędne do syntezy tych związków (Tabela 5) [4].


120

Tabela 5. Podział alkaloidów (opracowanie własne na podstawie [4])

Klasa alkaloidów Charakterystyczne

ugrupowanie chemiczne.

Substrat do

syntezy Przykład

Alkaloidy

chinolizydynowe

Podwójny pierścień

chinolizydynowy

Aminokwasy

alifatyczne Lupina, Sparteina

Alkaloidy indolowe Pierścień indolowy Tryptofan Brucyna, Rezerpina,

Kurara

Alkaloidy

izochinolowe

Podwójny pierścień

izochinolowy

Fenyloalanina,

tyrozyna

Morfina, Kodeina,

Papaweryna

Alkaloidy steroidowe Układ sterenu związany

z cukrami Brak danych

Tomatydyna,

Solanidyna

Alkaloidy tropanowe

Układ tropanowy

zbudowany

z 2 skondensowanych pierścieni

heterocyklicznych

Ornityna lizyna Hioscyjamina,

Atropina, Kokaina

Alkaloidy pirydynowe Pierścień pirydynowy Ornityna, Lizyna Nikotyna

Alkaloidy purynowe

Układ pierścieniowy

zasady purynowe

nukleotydów

Glicyna,

glutamina Kofeina, Teofilina

5.3. Charakterystyka wybranych alkaloidów

5.3.1. Kofeina

Kofeina (1,3,7-trimetylo-1H-puryno-2,6(3H,7H)-dion) to związek orga-

niczny (Rys. 10). Jest to alkaloid purynowy pochodzenia roślinnego, a jego

najważniejszym źródłem jest kakaowiec i owoce krzewu kawowca [31].

Rysunek 5. Wzór strukturalny kofeiny [31]


121

5.3.1.1. Zastosowanie kofeiny w kosmetyce

Z powodu swoich unikalnych właściwości kofeina znalazła szerokie

zastosowanie w przemyśle kosmetycznym. Posiada ona właściwości

antyoksydacyjne, dzięki zawartości związków polifenolowych w formie

fenolokwasów. Stosowana jest przede wszystkim do redukcji zmarszczek

i ujednolicenia kolorytu skóry. Ekstrakt z kakaowca jest dodawany do

wszelkiego rodzaju maseczek nadającym skórze blasku i elastyczności.

Stosowana jako dodatek do kremów pod oczy daje efekt rozjaśniający.

Kofeina przy udziale kwasów fenolowych tworzy kompleks ochraniający

skórę przed działaniem promieniowania słonecznego. Występujący w kawie

kwas chlorogenowy (połączenie fenolokwasu kawowego oraz kwasu

chlorogenowego), cytrynowy, octowy i jabłkowy reguluje jej niskie pH,

dlatego kofeina wspaniale sprawdza się jako dodatek do kawowego

peelingu mechanicznego. Peeling ten ma na celu usunięcie zewnętrznej

warstwy naskórka. Kofeina zwiększa szybkość przemiany materii wnika do

skóry właściwej i pobudza przepływ krwi naczyniach krwionośnych co

powoduje uwolnienie zbędnego tłuszczu z adiopocytów i przyśpieszenie

rozkładu do kwasów tłuszczowych. Zależność tą wykorzystuje się

w zabiegach powodujących redukcję tkanki tłuszczowej i cellulitu. Zabiegi

tego typu mają również na celu poprawę sprężystości i nadanie gładkości

skóry. Od dawna do preparatów pielęgnujących włosy dodawano kofeinę,

ponieważ działa korzystnie na mieszki włosowe zmniejszając efekty

łysienia męskiego. Znamienny i przyjemny zapach kawy wykorzystywany

jest w salonach kosmetycznych do aromaterapii [24].

5.3.2. Piperyna

Piperyna to 1-[5-(1,3-benzodiokso-5-ylo)-1-okso-2,4-pentadienylo]

piperydyna (Rys. 11). Jest to związek chemiczny, należący do grupy

alkaloidów. Jest to pochodna piperydyny, związku izolowanego z pieprzu

czarnego [32].

Rysunek 6. Wzór strukturalny piperyny [32]


122

5.3.3. Wykorzystanie piperyny w kosmetykach

Piperyna wykorzystywana jest szczególnie w kremach do twarzy.

Ekstrakt z pieprzu w małych ilościach zwiększa przyswajalność przez skórę

składników aktywnych, ponieważ wzmacnia on płynność warstwy lipidowej

naskórka. Powoduje on, że skóra staje się on lepiej przepuszczalny dla

składników odżywczych. Piperynę wykorzystuje się jako dodatek do

mydeł, detergentów toników, perfum. Szerokie zastosowanie znalazła

w środkach odchudzających. Jest to wynikiem, tego że pobudza ona

zakończenia nerwowe w przewodzie pokarmowym, powodując zwiększenie

wydzielania enzymów trawiennych [32].

6. Podsumowanie

Metabolity wtórne to ważna grupą związków aktywnie czynnych, która

jest wykorzystywana w przemyśle kosmetycznym. Zostały one szeroko

rozpowszechnione ze względu na swoje pozytywne działanie na organizm.

Chronią nas przed pejoratywnym działaniem czynników zarówno

egzogennych, jak i endogennych. W przyszłości oczekuje się, że kosmetyki

pochodzenia naturalnego zyskają coraz większą popularność, dzięki

rozwijającym się ruchom proekologicznym. Wzrastający popyt powoduje

zainteresowanie naukowców, którzy coraz lepiej poznają mechanizmy

kierujące metabolizmem wtórnym. Systematycznie odkrywane są nowe

związki należące do produktów metabolizmu wtórnego, mogące mieć

realne zastosowanie w kosmetologii.

Literatura

1. Czyż K., Surowce kosmetyków naturalnych, czyli ile natury w produktach

organicznych cz. II, Przemysł kosmetyczny, 1/2010 (2010), s. 10-11

2. Kączkowski J., Biochemia roślin, tom 2 Metabolizm wtórny, Wydawnictwo

Naukowe PWN, Warszawa, (1993), s. 10-11, 137-138, 232-245, 267-276,

285-293, 299-311

3. Ratz-Łyko A., Składniki aktywne pochodzenia naturalnego w kosmetykach

anti-age, Cosmetology Today: Patents and movention, 3/2013, (2013), s. 10-11

4. Czerwiński. W., Fizjologia roślin, Państwowe Wydawnictwo Naukowe,

Warszawa (1977): 256-273

5. Wysokińska H., Chmiel A., Produkcja roślinnych metabolitów wtórnych

w kulturach organizmów transformowanych, Biotechnologia, 4(77), (2006),

s.124-126

6. Kozłowska M., Fizjologia roślin, Państwowe Wydawnictwo Rolnicze i Leśne,

Poznań, (2007), s. 266-287

7. http://www.hydro.biol.uw.edu.pl

8. http://portalwiedzy.onet.pl

9. http://www.uz.zgora.pl


123

10. Igielska-Kalwat J., Gościańska J., Nowak I., Karotenoidy jako naturalne

antyoksydanty, Postępy Higieny Medycyny Doświadczalnej, 69 (2015),

s. 418-421

11. Bowszyc-Dmochowska M., Działanie promieniowania ultrafioletowego

na skórę, Ostre i przewlekłe uszkodzenia słoneczne, Homines Hominibus,

vol. 6, (2010): s. 29-42

12. Gryszczyńska A., Gryszczyńska B., Opala B., Karotenoidy. Naturalne źródła

biosyntezy, wpływ na organizm ludzki, Postępy Fitoterapii, 2/2011, (2011),

s. 127-143

13. Zabłocka K., Biernat J., Wpływ wybranych składników pożywienia na ryzyko

rozwoju raka płuc – witaminy i prowitaminy, Bromatologia i Chemia

Toksykologiczna, XLIII, 2, (2010), s. 147

14. http://bez-recepty.pgf.com.pl/index.php

15. http://www.solecrin.pl

16. http://kosmetologia.com.pl/

17. Belter A., Giel-Pietraszuk M., Oziewicz S., Chomczynski P., Barciszewski J.,

Likopen – występowanie, właściwości oraz potencjalne zastosowanie, Postępy

Biochemi, 57 (4), (2011): s. 372-380

18. Kwiatkowska E., Likopen w profilaktyce chorób cywilizacyjnych, Postępy

Fitoterapii, 1/2010, (2010), s. 38-41

19. Król S., Skalica-Woźniak K., Kendefer-Szerszeń M., Stepulak A., Aktywność

biologiczna i farmakologiczna olejków eterycznych w leczeniu i profilaktyce

chorób infekcyjnych, Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 67,

s. 1000-1001

20. Flis A., Pikul K., Olejki eteryczne w kosmetologii, Studenckie Naukowe

Czasopismo Internetowe, nr 3 (15), (2013), s. 64-71

21. Parus A., Przeciwutleniające i farmakologiczne właściwości kwasów

fenolowych, Postępy Fitoterapii, 1/2011, (2013), s. 48-53

22. Stańczyk A., Garbniki katecholowe różnych gatunków herbat, Bromatologia

i Chemia Toksykologiczna, XLI, 1, (2008), s. 95-96

23. Jasiński M., Mazurkiewicz E., Radziewicz P., Figlerowicz M., Flawonoidy-

budowa właściwości i funkcje ze szczególnym uwzględnieniem roślin

motylkowatych, Biotechnologia, 2 (85) (2009), s. 81-88

24. Majewska M., Czeczot H., Flawonoidy w profilaktyce i terapii, Terapia i leki,

65(5), (2009), s. 369-373

25. Krasowska A., Łukaszewicz M., Czy warto jeść kolorową żywność, AURA,

2, (2003), s. 20-21

26. https://pl.wikipedia.org/wiki/Antocyjanidyny

27. Piątkowska E., Kopeć A., Leszczyńska T., Antocyjany -charakterystyka,

występowanie i oddziaływanie na organizm ludzki, Żywność. Nauka,

technologia, jakość, 4(77), (2011) s. 24-32

28. Stołowska A., Kłobus G., Charakterystyka flawonoidów i ich rola

w kosmetyce i terapii, Postępy Kosmetologii, vol. 1/1, (2010), s. 9-12

29. Srinivasan M., Sudheer A., Menon V., Ferulic Acid: Therapeutic potential

therapy its antioxidant property, Journal of Clinical Biochemisty and

Nutrition, 40(2), (2003), s.92-100


124

30. http://www.pg.gda.pl/chem/Katedry/Organa/attachments/article/122/9.%20Al

kaloidy.ppt

31. Bojarowicz H., Przygoda M., Kofeina cz. I Powszechność stosowania kofeiny

oraz jej działanie na organizm, Problemy Higieny i Epidemiologii, 93 (1),

(2012): 8-9

32. Soni and Associates Inc., Notification for black pepper extract (Bioperine),

Division of Biotechnology and Gras Notice Review, (2013), s. 2-7


Streszczenie

Metabolity wtórne powstają na drodze metabolizmu wtórnego czyli nie są to substancje

niezbędne do wzrostu i rozwoju, jednak pełnia istotne funkcje w organizmach żywych. Metabolity wtórne są to związki organiczne produkowane przez wiele grup organizmów

takie jak bakterie, grzyby, rośliny. Chemicznie są to związki niskocząsteczkowe,

produkowane z produktów metabolizmu podstawowego czyli kwasu szikimowego, kwasu

mewalonowego i kwasu malanowego. Syntezowane są na drodze licznych przemian katabolicznych ściśle sprzężonych ze sobą w których uczestniczą specyficzne enzymy.

Regulowany na zasadzie sprzężenia zwrotnego, czynników środowiska oraz genów

regulatorowych. Metabolity wtórne jest to liczna grupa związków, ich ilość szacowana jest

obecnie na około 20 tysięcy. Dla ułatwienia związki te podzielono je na 3 grupy; terpeny, związki fenolowe i alkaloidy. Metabolity wtórne znalazły, dzięki swoim unikatowym

właściwościom szerokie zastosowanie w kosmetologii w szczególności jako środki

ochraniające przed działaniem wolnych rodników, zwiększające elastyczność skóry.

Zwiększająca się liczba zwolenników kosmetyków naturalnych ruchów proekologicznych powoduje coraz większe zainteresowanie naukowców tematem metabolizmu wtórnego.

Plant secondary metabolites and their use in cosmetics

Abstract

Secondary metabolites are produced by metabolism secondary so they aren't substances

necessary for growth and development, but they have important role in living organisms.

Secondary metabolites are organic compounds produced by many groups, like a bacteria, fungi, plants. Chemically, they are low molecular compounds, produced from basic

metabolism substance -shikimic acid, mevalonic acid and propanedioic acis. They are

synthesized by a number of catabolism closely coupled reaction with each involving specific

enzymes .Adjustable a feedback factors of the environment and regulatory genes. Secondary metabolites are a large group of compounds, their amount is estimated at approximately

20,000. compounds were divided into three groups; terpenes, phenolic compounds and

alkaloids. Secondary metabolites found, thanks to its unique properties, widely used

in cosmetology in particular of protecting against free radicals, increasing skin elasticity. Increasing number of followers of of natural cosmetics ecological movement cause the

growing interest of scientists topic of secondary metabolism.

125

Piotr Żelazowski1

Enzymy w mleczarstwie

1. Wstęp

Intensywnie rozwijający sie przemysł spożywczy poszukuje coraz to

nowych, doskonalszych technologii, mających na celu zmniejszenie kosztów

produkcji, przyspieszenie poszczególnych procesów, przedłużenie trwałości

produktów żywnościowych oraz poprawę ich cech organoleptycznych.

Wykorzystanie enzymów w technologii mleczarskiej stwarza możliwość

zrealizowania tych założeń. Dodatkowo, konieczność utrzymania stałej jakości

produktu, przy zmiennej jakości surowców i skomplikowanym, niejedno-

krotnie wieloetapowym i złożonym procesie produkcji powoduje, że enzymy

stają się elementem wręcz niezbędnym i koniecznym.

2. Cel pracy

Celem prezentowanego opracowania jest przedstawienie enzymów

mających wykorzystanie w przemyśle mleczarskim. Szczególną uwagę

poświęcono grupie enzymów używanych przy produkcji serów oraz

wykorzystywanych w produkcji innowacyjnych produktów mlecznych jak

np. mleko bezlaktozowe.

3. Enzymy wykorzystywane w przetwórstwie mleka

Pierwszym wykorzystanym przemysłowo enzymem była podpuszczka.

Została ona w 1874 roku wyizolowana przez duńskiego naukowca

Christian’a Hansen’a z żołądków młodych cieląt i wykorzystana w procesie

produkcji sera. Obecnie enzym ten pozyskuje się zupełnie inaczej, stosując

metody rekombinacji DNA [1].

Tradycyjnie pozyskiwana podpuszczka stanowi mieszaninę enzymów,

w której główny składnik stanowi chymozyna. Może ona także zawierać

pepsynę i inne proteazy. Jej skład zależy od wielu czynników, głównie

wieku cieląt. Oba te enzymy – chymozyna i pepsyna, jak również inne

enzymy powodujące ścinanie mleka, są szeroko stosowane w technologii

serowarskiej, a wszystkie one należą do grupy proteinaz asparaginowych

(EC 3.4.23). Ponieważ na rynku występuje wiele różnych rodzajów i źródeł

1 [email protected], Katedra Przetwórstwa Produktów Zwierzęcych, Wydział

Technologii Żywności, Uniwersytet Rolniczy im. Hugona Kołłątaja w Krakowie,

www.ur.krakow.pl

Piotr Żelazowski

126

tego typu enzymów Międzynarodowa Federacja Mleczarska (IDF/FIL)

oficjalnie ogłosiła podział enzymów stosowanych w przetwórstwie mleka.

Określenie „podpuszczka” jest zarezerwowana dla preparatów enzyma-

tycznych otrzymanych z żołądka przeżuwaczy, natomiast inne enzymy

(głownie pochodzenia mikrobiologicznego) powinny być określane jako

„koagulanty” [2].

Wiele roślin jest zdolnych do produkcji proteinaz prowadzących do

koagulacji kazeiny mleka. Związki te nie są jednak wykorzystywane

w skali przemysłowej, lecz przy produkcji lokalnych (głównie w Portugalii)

serów rzemieślniczych. Podstawowy roślinny koagulat wykorzystywany

w produkcji tych specjalnych serów jest ekstrahowany z kwiatu karczocha

Cynara cardunculus [2]. Badania prowadzone na serach z mleka koziego

i owczego [3, 4] wskazują, że koagulant tego typu może być stosowany

w celu przyspieszenia dojrzewania sera.

Jak dotąd najlepiej rozpowszechnionym i szeroko stosowanym koa-

gulantem jest ten produkowany przez Rhizopus miehei. Oprócz niego,

znane są inne rodzaje enzymów koagulujących produkowane przez:

R. pusillus;

Cryphonectria parasitica;

Kluyveromyces lactis;

Aspergillus niger.

Oprócz preparatów koagulujących i podpuszczki w przemyśle mle-

czarskim wykorzystuje się także inne enzymy (tabela 2). Większość z nich

stosowana jest w technologii produkcji serów i ma za zadanie poprawę

jakości produktu gotowego poprzez wzmocnienie smaku i zabezpieczenie

przed rozwojem szkodliwej mikroflory.


127

Tabela 6. Enzymy stosowane w przetwórstwie mleka

Enzym Źródło Katalizowany proces Zastosowanie

Chymozyna

(podpuszczka) trawieniec cieląt hydroliza κ-kazeiny

koagulacja mleka

podczas produkcji serów

Pepsyna trawieniec bydlęcy hydroliza kazeiny

zazwyczaj stosowana z

chymozyną jako

składnik

podpuszczki

Lipaza/esteraza

gardziel kozy

i jagniąt, trawieniec cieląt, świńska

trzustka

hydroliza trójglicerydów

wzmocnienie smaku

serów, modyfikacja frakcji tłuszczowych

poprzez estryfikacje

Lizozym białko jaja kurzego

hydroliza

polisacharydów

budujących ściany

komórkowe bakterii

zapobieganie

późnym wzdęciom

serów

wywoływanym przez spory bakterii

Laktoperoksydaza serwatka, bydlęca

siara

utlenianie jonów rodankowych do

bakteriobójczego

hipotiocyjanowego

zimna sterylizacja

mleka

Źródło: [1]

Zastosowanie enzymów w technologii serowarskiej daje największe

możliwości. Istnieje wiele metod włączenia tych biokatalizatorów w proces

technologiczny. Na rysunku poniżej przedstawiono uproszczony schemat

produkcji sera twardego i półtwardego.

Rysunek 1. Schemat produkcji sera twardego i półtwardego [2]

Według powszechnej wiedzy, dodatek enzymów do gotowej masy

serowej jest stosunkowo trudny, dlatego najłatwiej jest go dodać do mleka

przerobowego. Oczywiście istnieje ryzyko, że cześć enzymów przejdzie

w procesie technologicznym do serwatki, ale i tak stanowi to najprostszą

i najchętniej wykorzystywaną metodę. W procesie produkcji serów pół-

twardych istnieje możliwość dodatku enzymów do wody technologicznej

Piotr Żelazowski

128

stosowanej w procesie osuszania ziarna. Preparaty enzymatyczne można

też dodawać do miękkiego ziarna serowego, dzięki czemu enzym zostanie

przez nie wchłonięty. Ostatnią stosowaną metodą jest dodatek preparatów

enzymatycznych do solanki w której odbywa się solenie lub jednoczesny

ich dodatek z solą podczas solenia na sucho [2].

Biorąc pod uwagę bardzo duży wysiłek naukowców w celu pogłębiana

wiedzy na temat enzymatycznego dojrzewania serów skutkujący

pojawianiem się obszernej i wyczerpującej literatury, zdumiewający jest

fakt, że tylko kilka firm zdołało zastosować tę wiedzę do produkcji nowych

preparatów enzymatycznych, które mogłyby znaleźć zastosowanie w tej

technologii. Jak dotąd znana jest technologia enzymatycznie mody-

fikowanych serów (EMC enzyme-modified cheese), jednakże jest to

przestarzała metoda wykorzystująca dodatki smakowe w produkcji serów

i produktów seropodobnych. Dane literaturowe przedstawiają setki

wyników badań związanych z produkcją na małą skalę i prób pilotażowych

dobrze poznanych odmian sera, jednak tylko kilka z nich osiągnęło

zamierzony efekt. Znany jest jeden preparat enzymatyczny stosowany

w produkcji przemysłowej wpływający na poprawę jakości serów oraz

przyspieszający ich dojrzewanie. Jest to Accelase® firmy Danisco. Badania

dowiodły, że jego zastosowanie pozwala na skrócenie czasu dojrzewania

serów z 9 do 5 miesięcy. Dodatkowo, jego dodatek do masy serowej,

zmniejsza odczucie smaku gorzkiego oraz pozwala na spotęgowanie smaku

kwaśnego w gotowym produkcie [2]. Wartym wspomnienia jest enzym

zwany urokinazą, dodawany do mleka w celu aktywacji plazminogenu

w plazminę. Zwiększona ilość plazminy przyspiesza proteolizę podczas

dojrzewania, co w konsekwencji przyspiesza rozwój struktury w serach

twardych i półtwardych [5].

3.1. Chymozyna

Jak już wcześniej wspomniano chymozyna była pierwszym enzymem,

który został przemysłowo wykorzystany w technologii żywności. Obecnie

enzym ten nie jest pozyskiwany z żołądków przeżuwaczy lecz na drodze

mikrobiologicznej z wykorzystaniem genetycznie zmodyfikowanego

szczepu Escherichia coli K-12. Przy pomocy rDNA, gen odpowiedzialny

za produkcje prochymozyny (nieaktywnej formy tego enzymu) został

przeniesiony do E. coli. Komórki bakterii syntetyzują i gromadzą

nieaktywną chymozynę, a następnie poddawane są rozkładowi – enzym

natomiast zostaje izolowany i rozpuszczany. Prochymozyna obecna

w roztworze jest oczyszczana i przekształcana w aktywną formę na drodze

reakcji z kwasem. Również drożdże Kluyveromyces marxianus var. lactis

zostały zmodyfikowane poprzez wszczepienie genu kodującego bydlęcą


129

prochymozynę. Zastosowanie tej modyfikacji wynikało ze zdolności tego

gatunku do sekrecji dużych ilości tego enzymu do pożywki hodowlanej [1].

Chymozyna (EC 3.4.23.4) jest endoproteazą zaliczaną do grupy

proteinaz aspartylowych o masie cząsteczkowej około 35 kDa. Jej punkt

izoelektryczny (pI) wynosi 4,6. W formie natywnej występuje w pH 2 lub

8,5 w postaci pro-chymozyny, która w pH około 5,5 jest przekształcana

w formę aktywną – chymozynę. Enzym ten charakteryzuje się zdolnością

do szybkiej koagulacji frakcji κ-kazeiny poprzez hydrolizę wiązania

peptydowego między 105 i 106 aminokwasem w łańcuchu polipepty-

dowym (tj. fenyloalaniną i metioniną) [6].

Rysunek 2. Schemat enzymatycznej koagulacji kazeiny przy otrzymywaniu skrzepu

podpuszczkowego [opracowanie własne]

Na skutek hydrolizy, część łańcucha od 106 do 169 aminokwasu

(glikomakropeptyd) odszczepia się od cząsteczki κ-kazeiny. Dzięki temu

cząsteczka traci swój hydrofilowy charakter co skutkuje agregacją tej

frakcji białkowej i powstaniem skrzepu (rysunek powyżej). Proces ten

stanowi podpuszczkową metodę tworzenia skrzepu serowego i stanowi

podstawę w produkcji serów podpuszczkowych [7].

3.2. Pepsyna

Pepsyna (EC 3.4.23.1) jest endopeptydazą aspartylową o masie

cząsteczkowej 35 kDa. Stanowi ona składnik zwierzęcej podpuszczki i bierze

udział w dojrzewaniu serów twardych i półtwardych, pozwalając na

wytworzenie odpowiedniej tekstury oraz aromatu. Ilość pepsyny obecna

w podpuszczce zależy w głównej mierze od wieku cieląt od których została

pobrana. Optymalne pH działania tego enzymu to 2-2,5 [6, 8, 9]. Pepsynę

można podzielić na dwa typy, a każdy z nich charakteryzuje się odmiennymi

właściwościami i specyficznością substratową:

Piotr Żelazowski

130

Pepsyna A jest dominującą proteinazą występującą w żołądku

ssaków, charakteryzująca się niską specyficznością i wyższą podat-

nością na zmiany pH niż sama podpuszczka.

Pepsyna B (EC 3.4.23.2) charakteryzuje się wysokim stopniem

proteolizy białek [8].

Wśród preparatów podpuszczki stosowanych w technologii serowarskiej

bardzo często stosuje się mieszaninę czystej chymozyny i pepsyny.

Obecność obu frakcji prowadzi do hydrolizy białek mleka (κ-kazeiny)

i uzyskania odpowiedniego skrzepu. Z kolei podczas dojrzewania pozwala

ona na uzyskanie uzyskania odpowiedniej tekstury oraz wytworzenie

substancji nadających aromat i smak sera. Na przykład preparat KALASE®

firmy CSK food enrichment, w swoim składzie zawiera około 80%

chymozyny i 20% pepsyny, dzięki czemu pozwala na produkcje sera

twardego lub półtwardego o odpowiednich cechach organoleptycznych [10].

3.3. Lizozym

Lizozym (EC 3.2.1.17), czyli N-acetylomuramylohydrolaza lub mura-

midaza, to białko enzymatyczne odkryte w XX wieku przez szkockiego

naukowca Aleksandra Fleminga. Jego naturalnym źródłem jest białko jaja

kurzego, które w suchej masie zawiera około 3,5% tego enzymu. Wykazuje

on aktywność w stosunku do hydrolizy wiązań β-1,4-glikozydowych

pomiędzy cząsteczką kwasu N-acetylomuraminowego i N-glukozaminą.

Związki te stanowią główny budulec ścian komórkowych bakterii przez co

enzym ten, ze względu na swoją specyfikę doprowadza do lizy komórek

bakteryjnych [11]. Oprócz tego, muramidaza doprowadza do aglutynacji

komórek bakteryjnych, co jest swoistym mechanizmem nieenzyma-

tycznym, wpływającym na bakteriostatyczny charakter tego enzymu [12].

Na właściwości lizozymu mają wpływ następujące czynniki:

temperatura;

pH;

stężenie chlorku sodu.

Wysoką aktywność hydrolityczną enzymu odnotowuje się w tempe-

raturze 60⁰C oraz pH na poziomie 6,0 do 7,0. Do aktywności lizozymu

wymagana jest również obecność chlorku sodu w środowisku reakcji.

Badania wykazały, że temperatura podniesiona do 40⁰C doprowadza do

oligomeryzacji enzymu, przez co traci on w pewnym stopniu swoje

hydrolityczne właściwości, ale pozwala to jednocześnie na zwiększenie

jego antybakteryjnego charakteru względem bakterii Gram-dodatnich

i Gram-ujemnych. Dzieje się tak na skutek zmiany w konformacji białka

(odsłonięcie grup funkcyjnych o hydrofobowym charakterze) i lepszego

przenikania lizozymu przez membranę bakteryjną [12].


131

Oprócz bakterii patogennych z rodzaju Staphylococcus i Streptococcus,

białko to oddziałuje także na ściany komórek grzybowych – między innymi

Phytophthora nicotianaae, Fusarium oxysporum, Botrytis cinerea i Candida

albicans [11].

Lizozym znajduje się w wielu surowcach zwierzęcych i roślinnych.

W tabeli poniżej przedstawiono zawartość lizozymu w różnych surowcach.

Tabela 7. Zawartość lizozymu w surowcach roślinnych i zwierzęcych

Surowiec Zawartość lizozymu

Białko jaja kurzego 3,2 mg/ml

Mleko ośle 1,43 mg/ml

Mleko krowie 0,13 µg/ml

Ludzka siara 65 µg/ml

Kalafior 27,6 µg/ml

Kapusta 2,3 µg/ml

Źródło: opracowanie własne na podstawie: [12, 13]

Dzięki swoim bakteriostatycznym i bakteriobójczych zdolnościom

w stosunku do bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, lizozym znalazł

zastosowanie w wielu gałęziach przemysłu spożywczego (np. w przemyśle

piwowarskim wykorzystuje się go do kontroli ilości bakterii kwasu

mlekowego przy produkcji piwa), farmacji a nawet medycynie. Jednak to

przemysł mleczarski wiedzie prym w badaniach prowadzonych z jego

udziałem. Muramidaza znalazła zastosowanie przy produkcji serów

dojrzewających, gdzie ogranicza rozwój Clostridium tyrobutyricum.

Drobnoustrój ten, należący do grupy bakterii fermentacji masłowej jest

odpowiedzialny za wady serów – tzw. późne wzdęcia. Muramidaza nie

wpływa na same procesy produkcyjne sera, ale znacznie poprawia cechy

sensoryczne produktu końcowego [11, 12].

3.4. Laktoperoksydaza

Laktoperoksydaza (EC 1.11.1.7) występuje naturalnie w mleku surowym,

siarze i ślinie. Białko to bierze aktywny udział w ochronie organizmu

przeżuwaczy przed infekcjami – wykazuje działanie bakteriobójcze

w stosunku do bakterii Gram-ujemnych oraz bakteriostatyczne w stosunku

do Gram-dodatnich [14]. Enzym ten zaliczany jest do grupy peroksydaz,

który poprzez wykorzystanie nadtlenku wodoru utleniają jony tiocyjanowe

do hipotiocyjanianu, który to z kolei wykazuje silne działanie przeciw-

bakteryjne (rysunek poniżej).

𝑆𝐶𝑁− + 𝐻2𝑂2

𝑙𝑎𝑘𝑡𝑜𝑝𝑒𝑟𝑜𝑘𝑠𝑦𝑑𝑎𝑧𝑎 𝑂𝑆𝐶𝑁− + 𝐻2

Rysunek 3. Reakcja jonów tiocyjanowych z nadtlenkiem wodoru [opracowanie własne]

Piotr Żelazowski

132

Dowiedziono, że struktura LPS (laktoperoksydaza + jon tiocyjanianowy

+ nadtlenek wodoru) pozwala na nieodwracalne hamowanie hydrogenazy

D-mleczanowej, co doprowadza do śmierci komórek. Surowe mleko

zawiera wystarczające ilości laktoperoksydazy i jonów tiocyjanianowych,

jednakże mała ilość obecnego nadtlenku wodoru nie pozwala na

uaktywnienie systemu LPS. Jedna z metod utrwalania mleka wykorzystuje

obecność obu tych związków do zabezpieczania mleka przed zagrożeniami

mikrobiologicznymi. Metoda ta zwana „zimna sterylizacją” polega na

dodaniu do mleka surowego nadtlenku wodoru. Stosowana jest w krajach

niskorozwiniętych, gdzie sterylizacja lub pasteryzacja mleka jest utrudniona

[2, 15]. Ze względu na wyjątkowe właściwości laktoperoksydazy polska

firma GEA Process Engineering Sp. z o.o. wraz z Taradon Laboratory

podjęła prace nad wdrożeniem produkcji preparatu o nazwie laktenina.

Stanowi ona mieszaninę laktoferyny i laktoperoksydazy i jest otrzymywana

z mleka odtłuszczonego lub serwatki w procesie chromatografii

jonowymiennej. Co więcej, preparat ten może zostać ponownie rozdzielony

na laktoferynę i laktoperoksydazę. Według opracowanej dotąd technologii

z 500 000 litrów mleka można otrzymać 1500 litrów lakteniny, która po

oczyszczeniu i separacji pozwala na otrzymanie 10 kg laktoperoksydazy [16].

3.5. Laktaza

Laktaza, czyli β-galaktozydaza (EC.3.2.1.23) to enzym hydrolizujący

laktozę do cukrów prostych – glukozy i galaktozy.

𝑙𝑎𝑘𝑡𝑜𝑧𝑎𝛽−𝑔𝑎𝑙𝑎𝑘𝑡𝑜𝑧𝑦𝑑𝑎𝑧𝑎 𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑧𝑎 + 𝑔𝑎𝑙𝑎𝑘𝑡𝑜𝑧𝑎

Rysunek 4. Reakcja hydrolizy laktozy [opracowanie własne]

Enzym ten występuje powszechnie wśród zwierząt, ale dopiero

mikrobiologiczne metody otrzymywania pozwoliły na szersze jego

zastosowanie w technologii mleczarskiej. Enzym ten pozyskuje się między

innymi z wykorzystaniem gatunków: A. niger, A. oryzae, Candida

pseudotropicalis i Kluyveromyces lactis [2]. W technologii mleczarskiej,

znalazł on zastosowanie w produkcji mleka o obniżonej zawartości laktozy

oraz mleka bezlaktozowego. Problem nietolerancji laktozy, stanowi coraz

powszechniejsze zjawisko, dotykające zarówno dzieci jak i dorosłych.

Z pomocą przychodzi tu właśnie laktaza, dzięki której w kontrolowanych

warunkach dochodzi do hydrolizy tego disacharydu. Proces hydrolizy

przeprowadzany jest na mleku przed lub po obróbce termicznej.

W końcowym etapie stopień hydrolizy laktozy może zawierać się między

70-100%. Ze względu na ryzyko zachodzenia reakcji Maillarda w mleku

podanym wcześniej hydrolizie, proces enzymatyczny jest przeprowadzany


133

zazwyczaj po obróbce termicznej [17]. Na uwagę zasługuje fakt, że mleko

poddane działaniu laktazy wykazuje większą słodycz. Wynika to z trzykrotnie

wyższej słodyczy glukozy i galaktozy w stosunku do niezhydrolizowanej

laktozy [18]. Preparaty tego typu mogą służyć naturalnemu zwiększaniu

słodyczy mlecznych produktów np. jogurtu, kefiru, itp.

4. Podsumowanie

Jak łatwo można zauważyć, enzymy znalazły bardzo szerokie

zastosowanie w technologii mleczarskiej. Ich wykorzystanie pozwala m.in.

na zabezpieczenie produktów mlecznych przed szkodliwą mikroflorą,

podnoszenie ich jakości, jak również produkcję szerokiej gamy

asortymentu. Coraz wnikliwsze badania, a także innowacyjne podejście do

tego tematu, stwarza ogromne możliwości przy opracowywaniu nowych

technologii oraz udoskonalania tych już istniejących. Pozostaje jednak mieć

nadzieje, że potencjał jaki wynika z wykorzystania enzymów w technologii

mleczarskiej i idące za nim zmiany i modyfikacje, nie zdeklasują zupełnie

tradycyjnych metod produkcji, a jedynie doprowadzą do ich rozwoju

i udoskonalenia.

Literatura

1. Olempska-Beer Z. S., Merker R. I., Ditto M. D., DiNovi M. J. Food-

processing enzymes from recombinant microorganisms – a review, Regulatory

Toxicology and Pharmacology, 45 (2006), s. 144-158

2. Law Barry A. Enzymes in dairy product manufacture. W: Whitehurst R. J.,

van Oort M., Enzymes in Food Technology. 2010, 2nd edition, Blackwell

Publishing Ltd

3. Galan E., Prados F., Pino A., Tejada L., Fernandez-Salguero J. Influence

of different amount of vegetable coagulant from cardoon Cynara cardunculus

and calf rennet on the proteolysis and sensory characteristics of cheeses made

with sheep milk, International Dairy Journal, 18 (2008), s. 93-98

4. Tejada L., Abellan A., Cayuela J. M., Martinez-Cacha A., Fernandez-Salguero

J. Proteolysis in goats’ milk cheese made with calf rennet and plant coagulant,

International Dairy Journal., 18 (2008), s. 139-146

5. Milesi M. M., McSweeney P. L. H., Hynes E. R. Impact of Chymosin

and Plasmin-Mediated Primary Proteolysis on Groth and Biochemical

Activities of Lactobacilli in Miniature Cheddar-Type Cheeses, J. Dairy Sci.,

91 (2008), s. 3277-3290

6. Zaręba D., Ziarno M. Charakterystyka biologicznych czynników proteolizy

w serach podpuszczkowych. Ogólnopolski Informator Mleczarski. 2009,

13 (6-8), s. 9-19

7. Guinee T. P., O’Brien B. The Quality of Milk for Cheese Manufacture.

W: Law B. A., Tamime A. Y. Technology of Cheesemaking. 2010, 2nd

edition, Wiley-Blackwell, s. 1-67

Piotr Żelazowski

134

8. Harboe M., Broe M. L., Qvist K. B. The production, Action and Application

of Rennet and Coagulants. W: Law B. A., Tamime A. Y. Technology

of Cheesemaking. 2010, 2nd edition, Wiley-Blackwell, s. 98-129

9. Imelio N., Marini A., Spelzini D., Picó G., Farruggia B. Pepsin extraction

from bovine stomach using aqueous two-phase systems: Molecular mechanism

and influence of homogenate mass and phase volume ratio, Journal

of Chromatography B., 873 (2008), s. 133-138

10. Natural rennet KALASE®,

http://www.cskfood.com/assets/uploads/documents/CSK_kalase_A3_EN_v10

-14.pdf dostęp: 30.10.2015

11. Dembczyński R., Białas W., Jankowski T. Wykorzystanie dwufazowej

ekstrakcji wodnej do separacji lizozymu z białka jaja kurzego. ŻYWNOŚĆ.

Nauka. Technologia. Jakość. 2009, 5(66), s. 5-17

12. Gajda E., Bugla-Płoskońska G. Lizozym – występowanie w przyrodzie,

właściwości biologiczne i możliwości zastosowań. Postepy Hig Med Dosw

(online), 68 (2014), s. 1501-1515

13. Wszołek M., Filipiak-Fiutak M., Domagała J., Skład i właściwości mleka

oślego, ŻYWNOŚĆ. Nauka. Technologia. Jakość, 2014, 1(92), s. 29-40

14. Zimecki M., Artym J. Właściwości terapeutyczne białek i peptydów z siary

i mleka, Postępy Hig Med Dosw. (online), 59 (2005), s. 309-323

15. Seifu E., Buys E. M., Donkin E. F. Significance of the lactoperoxidase system

in the dairy industry and its potential applications: a review, Trends in Food

Science & Technology, 16 (2005), s. 137-154

16. Zander Z., Zander L., Mickiewicz D. Laktoferyna – multipotencjalne białko

mleka, Innowacyjne Mleczarstwo., 2014, 2(1), s. 18-21

17. Ziarno M. Nietolerancja laktozy i galaktozy, Przemysł Spożywczy, 3/2006,

s. 38-45

18. Horner T. W., Dunn M. L., Eggett D. L. Ogden L. V. β-Galactosidase activity

of commercial lactase samples in raw and pasteurized milk at refrigerated

temperatures, J. Dairy Sci., 94 (2011), s. 3242-3249


Streszczenie Enzymy znalazły szerokie zastosowanie w wielu gałęziach przemysłu. Celem tej pracy było

pokazanie jak dużą rolę odgrywają enzymy, takie jak: chymozyna, pepsyna, lizozym,

laktoperoksydaza, β-galaktozydaza w przemyśle mleczarskim. W głównej mierze stosuje sie

je w przypadku produkcji serów (chymozyna, pepsyna). Ich zadaniem jest koagulacja mleka i wytworzenie odpowiedniego skrzepu. Oprócz zwierzęcych źródeł tych związków, istnieją

również enzymy pochodzenia mikrobiologicznego, które charakteryzują się podobnymi

właściwościami. Chymozyna, jako enzym doprowadza do hydrolizy wiązań w κ-kazeinie co

prowadzi do odszczepienia glikomakropeptydu i agregacji pozostałej frakcji. Zjawisko to stanowi podpuszczkową metodę tworzenia skrzepu serowego. Lizozym to związek silnie

aktywny w stosunku do bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych. Enzym ten działa na

mikroorganizmy z rodzaju Staphylococcus i Streptococcus. Dzięki swoim właściwościom

w stosunku do Clostridium thyrobutyricum znalazł zastosowanie w produkcji serów długodojrzewających, gdzie ogranicza późne wzdęcia serów. Laktoperoksydaza dzięki

swoim bakteriobójczym właściwościom pozwala na zabezpieczanie mleka przed rozwojem


135

szkodliwej mikroflory. Dodatkowo istnieją prace dotyczące produkcji tego enzymu z mleka

lub serwatki. Jego opracowanie pozwoliłoby na zastosowanie nowych metod zabezpieczania

mleka (nie tylko obróbką termiczną). Laktaza (β-galaktozydaza) jako enzym, znaleźć może

zastosowanie w produkcji żywności o obniżonej ilości laktozy. Nietolerancja laktozy jest coraz bardziej nasilającym sie problemem w społeczeństwie, stąd też ważne jest

opracowanie nowych metod produkcji, z wykorzystaniem enzymów mających na celu

poprawę wygody życia ludzi obarczonych tego typu dolegliwościami.

Enzymes in dairy product manufacture

Abstract

Enzymes are widely used in the whole foodstuff industry. The aim of this study was to analyze the influence of selected enzymes (chymosin, pepsin, lysozyme, lactoperoxidase,

β-galactosidase) in dairy product manufacture. They are mainly used in cheese production

(chymosin, pepsin) where they coagulate milk and create the clot. Except for the animals’

sources of this enzyme, they might be also generate in a microbiological way, with retaining all the typical properties. Chymosin as enzyme hydrolyse κ-casein and leads to cleavage

of the glycomacropeptide and aggregation remaining fractions. This property is a method for

production of rennet cheese curd. Lysozyme is used against the Gram-positive i Gram-

negative bacteries. It is also used to deactivation Staphylococcus and Streptococcus microorganism. It’s active actions against Clostridium thyrobutyricum bacteries let to use

it in long ripening cheese production. Lactoperoxidase protects milk from growing an

damaging microflora because of its bactericidal properties. Moreover there are studies which

show that there are possibilities to product this enzyme from milk or even from whey.

It would help to evolve new, non-thermal, milk protecting methods. Lactase (β-galactosidase)

might be used in production food with low lactose content. Lactose intolerance is a growing

problem in nowadays society, that’s why studies about this subject are so important.

136

Daria Łuczak1, Alina Janocha

2

Enzymy jako doskonałe dodatki paszowe

w żywieniu kurcząt rzeźnych

1. Wprowadzenie

Dodatki paszowe stosowane w żywieniu kurcząt brojlerów to preparaty

bądź związki, których dodawanie do mieszanek nie jest obowiązkowe ani

niezbędne do właściwego rozwoju zwierzęcia. Jednakże ich stosowanie

w znaczącym stopniu udoskonala strawność składników odżywczych (między

innymi białka, tłuszczy, węglowodanów) oraz podnosi ogólną smakowitość

paszy. Dzięki używanym dodatkom kurczęta są zdrowsze, a sama pasza

może być dłużej magazynowana. Zatem ich użycie związane jest z wieloma

zaletami. Jednak warto pamiętać, że podporządkowane są bezwzględnym

kontrolom regulującym właściwe ich użycie.

2. Cel pracy

Celem niniejszej pracy było omówienie poszczególnych enzymów

paszowych używanych podczas sporządzania mieszanek dla kurcząt rzeźnych

oraz analiza ich wpływu w efektywnym odchowie brojlerów.

3. Enzymy paszowe

W 2006 roku został wprowadzony zakaz dodawania antybiotykowych

stymulatorów wzrostu do pasz dla wszystkich zwierząt. Fakt ten spowo-

dował większe zainteresowanie się innymi dodatkami paszowymi, między

innymi enzymami. Używanie antybiotyków podnosiło ryzyko wystąpienia

mikroflory o dużo większej odporności na leki wykorzystywane w leczeniu

zwierząt i ludzi, tym samym przyczyniało się do spadku odporności i ogól-

nej zdrowotności kurcząt [1]. Większość współczesnych programów

hodowlanych jest zwróconych ku maksymalizacji produkcji. Dlatego też

celem optymalnego żywienia wszystkich zwierząt jest nie tylko otrzymanie

jak najlepszych wyników produkcyjnych, ale także dbanie o ich dobrostan.

1 [email protected], Doktorantka w Katedrze Żywienia Zwierząt i Gospodarki Paszowej,

Wydział Przyrodniczy, Uniwersytet Przyrodniczo – Humanistyczny w Siedlcach, www.uph.edu.pl [email protected], Katedra Żywienia Zwierząt i Gospodarki Paszowej, Wydział

Przyrodniczy, Uniwersytet Przyrodniczo – Humanistyczny w Siedlcach, www.uph.edu.pl

Enzymy jako doskonałe dodatki paszowe w żywieniu kurcząt rzeźnych

137

Dodatki wprowadzane do pasz dla drobiu wykorzystywane są w produkcji

mieszanek zarówno typu starter [Rysunek 1], grover, jaki i finiszer.

Rysunek 1. Kurczęta rzeźne rasy Ross 308 w pierwszym tygodniu odchowu żywione mieszanką

typu starter [opracowanie własne]

Enzymy są świadomie dodawane do mieszanek w formie sypkiej bądź

do wody w celu otrzymania pozytywnego wpływu na wyniki produkcyjne

u zwierząt, uzupełnienia niedoborów na składniki odżywcze w dawce

pokarmowej, a także poprawy dobrostanu i zminimalizowania złego

wpływu odchowu kurcząt rzeźnych na środowisko [2]. Potwierdzają ten

fakt kolejni badacze twierdząc, że są to substancje minimalizujące

zagrożenia występowania dość gwałtownych biegunek u młodych ptaków,

ale także ograniczające lepkość materiału paszowego, po dotarciu do

przewodu pokarmowego [3].

Pośród dodatków paszowych stosowanych w żywieniu kurcząt rzeźnych

można wymienić: probiotyki, prebiotyki, synbiotyki, fitobiotyki, preparaty

deodorujące, konserwanty oraz enzymy paszowe.

Enzymy paszowe produkowane są poprzez fermentacje dzięki różnym

drobnoustrojom takim jak: grzyby strzępkowe, drożdże oraz bakterie.

Grzyby bowiem wydzielają enzymy do podłoża hodowlanego, co

powoduje, iż występują one w filtratach pohodowlanych. Preparaty

enzymatyczne w postaci płynnej to przeważnie właśnie surowe filtraty

hodowlane. Dla przykładu grzyby z gatunków Trichoderma viridae,

Trichoderma resei oraz Humicola insolens wytwarzają ksylanazy, celulazy,

a także ß-glukanazy, zaś Aspergillus oryzae i Aspergillus niger produkują

Daria Łuczak, Alina Janocha

138

enzymy z grupy fitaz. Z kolei bakterie Bacillus subtilis odpowiedzialne są

za powstawanie proteaz, a Bacillus amyloliquefaciens za α-amylazy [4].

3.1. Hydrolazy

Hydrolazy to klasa enzymów, która katalizuje rozszczepienie wiązań

chemicznych w przebiegu hydrolizy. Bardzo istotny jest fakt, iż jedynie do tej

grupy enzymów zaliczamy enzymy paszowe. Są one odpowiedzialne za

rozłożenie wielocząsteczkowych związków odżywczych do prostej postaci,

które z udziałem cząsteczek wody mogą przeniknąć przez błonę jelita

u ptaków.

Do hydrolaz najczęściej używanych podczas sporządzania mieszanek

dla drobiu możemy zaliczyć: fosfatazy (fitaza) oraz glikozydazy.

3.1.1. Fitaza

Fityna jest solą wapniowo – magnezową kwasu inozytolo-6-fosforowego

popularnie znajdującą się w świecie roślin. W dość dużych ilościach

występuje w nasionach roślin oleistych oraz zbóż, głównie w ziarnach

aleuronowych często stosowanych podczas sporządzania pasz dla drobiu.

Ten związek chemiczny ma szerokie właściwości, między innymi:

odpowiada za poprawę pracy układu nerwowego i krwionośnego, a także

podnosi wzrost oraz rozwój tkanki kostnej. Fitaza natomiast jest enzymem

paszowym najczęściej stosowanym w żywieniu kurcząt brojlerów. Warto

zwrócić uwagę na fakt, iż zwierzęta posiadające jeden żołądek

(monogastryczne) mają znikomą florę bakteryjną, a przez to nie są w stanie

trawić włókna surowego, substancji antyżywieniowych oraz fitynianów.

Z tego właśnie powodu w czasie komponowanie mieszanek paszowych

stosuje się fitazę. Dzięki niej możliwe jest rozłożenie fityny, która jest

substancją o charakterze antyżywieniowym. W materiałach roślinnych,

z których tworzona jest pasza dla drobiu, fosfor w postaci ciężko

przyswajalnych fityn występuje w ilości od 50 do 80%. Zatem dzięki

użyciu enzymu fitazy możliwe jest znacznie lepsze wykorzystanie nie tylko

białka i tłuszcza, ale także samego P fitynowego i pozostałych związków:

mikro- oraz makroelementów (na przykład: Mg, Ca, Cu, Fe, Zn). [5]. Fitaza

przyczynia się również do znacznie mniejszego pobierania paszy przy

wyższych dobowych przyrostach kurcząt. Jej użycie ponadto skutkuje

wyższą mięsnością kurcząt rzeźnych, a przy regularnym stosowaniu

pozwala na obniżenie ilości wydalanych związków mineralnych z kałem,

co umożliwia lepszą ochronę środowiska.

W odcinku pokarmowym drobiu występują trzy grupy fitaz. Pierwsza

z nich to ta, którą produkują mikroorganizmy odcinka pokarmowego.

Kolejna nosi miano natywnej. Jest ona składnikiem surowców roślinnych,


139

z których produkowana jest pasza. Charakteryzuje się różnym stopniem

aktywności, która zależy od rodzaju danego surowca, od warunków

poszczególnego sposobu technologicznego przetwarzania materiału

paszowego, jaki i od pH treści w jelitach. Zaś ostatnia nazywana jest fitazą

egzogenie mikrobiologiczną, którą dodaje się do mieszanki. W wielu

doświadczeniach udowodniono, iż użycie tej właśnie fitazy do mieszanek

składających się ze zbóż i soi, a także zbóż oraz rzepaku wpływa

pozytywnie na strawność związków pokarmowych, przyswajanie fosforu

ogólnego, a także podniesienie poziomu energii metabolicznej w paszach

używanych podczas żywienia kurzych brojlerów [6, 7]. Zastosowanie

fitazy umożliwia optymalne gospodarowanie fosforem oraz pozostałymi

związkami mineralnymi, ale również w znacznym stopniu wywiera wpływ

na cukry i aminokwasy. Należy jednak pamiętać o tym, aby enzym ten

dodawać w odpowiednich ilościach, tj. w przypadku drobiu 1000 PU fitazy

na 1 kg materiału paszowego [7].

Z kolei w innym doświadczeniu uzupełniono mieszankę paszową

mającą w swoim składzie makuch rzepakowy fitazą. Skutkowało to

zwiększeniem ilości suchej masy w uzyskanych na etapie końcowym

mięśniach nóg, a także pozytywnie wpłynęło na procentową zawartość

kwasu oleinowego oraz ogół kwasów jednonienasyconych w składzie

tłuszczowym tych mięśni [8].

Jednak w badaniach określających efektywność zastosowania

preparatów enzymatycznych podczas żywienia brojlerów dowiedziono,

iż użycie mikrobiologicznej fitazy istotnie poprawiło dostępność P ogólnego

o 2 punkty procentowe. Skutokowała ona podwyższeniem dostępności

fosforu strawnego z mieszanek o 0,4 g·kg-1

[6].

3.1.2. Glikozydazy

Do najczęstszych glikozydaz stosowanych w żywieniu drobiu należy

zaliczyć α-amylazę, ß-glukanazę oraz ksylanazę i endoksylanazę. α-amylaza to

enzym, który katalizuje wielocukry, głównie skrobię. ß-glukanaza

odpowiedzialna jest za rozkładanie polisacharydów, zwłaszcza ß-glukanów

występujących w ścianach komórkowych u roślin. Zastosowanie tego

enzymu w żywieniu kurcząt brojlerów umożliwia wcześniej niedostępnym

komponentom paszowym na całkowite strawienie ich przez zwierzęta.

Natomiast ksylanazy degradują ksylan i powodują zwiększenie dostępności

poszczególnych związków odżywczych w paszy oraz podwyższają wskaźnik

pobrania paszy dzięki ograniczeniu lepkości przewodu pokarmowego.

Endoksylanazy rozszczepiają skutecznie rozpuszczalne i nierozpuszczalne

łańcuchy arabionoksylanów (substancje antyżywieniowe). Ich zastoso-

wanie pozwala poprawić wyniki produkcyjne uwzględniając przy tym


140

mniejsze wykorzystanie surowców paszowych i tym samym dając moż-

liwość oszczędności dla hodowców.

Kurczęta brojlery skarmiane mieszanką zawierającą ksylanazę trawiły

o 10 punktów procentowych lepiej tłuszcz surowy oraz o 4,2-4,7 pkt

procentowych substancję organiczną i białko ogólne w porównaniu

z ptakami, które w swojej dawce nie posiadały tego enzymu. Odnotowano

także, iż ksylanaza wykazuje najwyższy wpływ na zboża takie jak żyto

oraz pszenżyto, zaś najniższy na pszenicę. Z kolei wprowadzenie do

mieszanki paszowej kompleksu enzymów endoksylanazy i ß-glukanazy

zwiększyło istotnie ilość energii metabolicznej o około 76 kcal·kg-1

[6].

W innych badaniach udowodniono, iż dodatek ksylanazy, jak również

kompleksu dwóch enzymów ksylanazy z celulazą istotnie oddziaływał na

poprawę indeksu strawności białka ogólnego w mieszankach z pszenicą

i 20% śruty rzepakowej z obłuszczonego oraz całego rzepaku. Natomiast

użycie enzymu ksylanazy albo kompleksu ksylanazy z glukanazą istotnie

wpłynęło na zwiększenie spożycia mieszanki paszowej oraz przyrosty

masy ciała u kurcząt rzeźnych. Aczkolwiek nie polepszyło to samego

wykorzystania paszy [9]. Jednakże z przeprowadzenia innych badań gdzie

użyto do mieszanki dwie odmiany rzepaku oraz dodatek enzymatyczny

w postaci ksylanazy wynika, że istotnie nie zróżnicowało to rezultatów

zarówno produkcyjnych jak i rzeźnych, a także zawartości głównych

składników odżywczych w mięsie drobiu [10]. Z kolei przy powiększającej

się ilości dodawanego preparatu enzymatycznego do paszy zawierającego

ksylanazę odnotowano skłonność do większego przyrostu masy ciała,

a także poprawy indeksu wykorzystania mieszanki paszowej przez ptaki

rzeźne. Wzrost ilości dodatku preparatu enzymatycznego do mieszanki

paszowej pozytywnie wpłynęło na umięśnienie brojlerów, ich otłuszczenie

oraz wydajność rzeźną. Najlepszym rozwiązaniem okazał się dodatek 0,3 g

ksylanazy na 1 kg paszy [11]. Inni naukowcy twierdzę, iż dodatnie do

mieszanki paszowej zawierającej w swoim składzie w różnej ilości

jęczmień oraz kompleks 4 enzymów paszowych takich jak: ß-glukanaza,

pentozanaza, hemiceluloza oraz pektynaza albo użycie mikrobiologicznej

fitazy w małym stopniu wpłynęło na organoleptyczną ocenę mięśni

piersiowych (mięso białe) oraz mięśni ud i podudzi (mięso czerwone) [6].

Analogicznie kolejni badacze nie odnotowali wpływu poszczególnych

preparatów enzymatycznych : pektynazy, hemicelulazy oraz ß-glukanazy

na wartości smakowo – zapachowe mięsa białego, a także czerwonego

u drobiu skarmianego paszą z zawartością owsa obłuszczonego [12].

W kolejnych badania zwrócono uwagę na możliwość zmniejszenia wys-

tąpienia negatywnych skutków kokcydiozy dzięki dodaniu enzymów paszo-

wych. Zastosowanie ziołowego kompleksu enzymatycznego z aktyw-nością


141

ksylanazy, proteazy oraz amylazy do diety kukurydziano-sojowej w ograni-

czonym zakresie podwyższyło odporność na zarażenie kokcydiozą [13].

Dzięki zastosowaniu wyżej omówionych preparatów enzymatycznych

staje się możliwe użycie podczas produkcji mieszanek z surowców

paszowych większej ilości niektórych komponentów ograniczających

wchłanianie związków odżywczych, czyli pasz pochodzenia roślinnego

zawierających dość dużą zawartość polisacharydów nieskrobiowych [6].

Jednakże niektórzy badacze nie odnotowali korzystnego oddziaływania

enzymów mających zdolność rozkładania polisacharydów nieskobiowych

– ksylanazy i ß-glukanazy na wykorzystanie mieszanki paszowej oraz lepsze

przyrosty u kurcząt rzeźnych [14]. Z kolei dodanie do mieszanki paszowej

składającej się z owsa oplewionego bądź obłuszczonego kompleksu enzy-

matycznego zawierającego amylazę, ß-glukanazę, proteazę, celulazę oraz

ksylanazę spowodowało znaczącą redukcję obecności nasyconych kwasów

tłuszczowych. Skutkowało to także spadkiem ilości tłuszczu w badanym

mięsie kurcząt, zarówno w mięśniach piersiowych, jak i udowych [15].

W praktyce żywieniowej zdarza się czasem, że pasza w swoim składzie

zawiera niepożądane elementy, którymi mogą być na przykład wszelkiego

rodzaju zanieczyszczenia zarówno botaniczne, jak i mineralne. Naukowcy

stwierdzili, iż dodanie do paszy zawierającej właśnie takie zanieczysz-

czenia w ilości 6% albo 9% preparatu enzymatycznego o nazwie Roxazyme G

składającego się z ß-glukanazy oraz ksylaznazy w znaczącym stopniu

przyczyniło się do poprawy wskaźników produkcyjnym [16].

4. Podsumowanie

Stosowanie preparatów enzymatycznych: α-amylazy, ksylanazy, ß-glu-

kaznazy oraz fitazy w żywieniu brojlerów kurzych przyczynia się do

spełnienia wielu bardzo ważnych funkcji. Przede wszystkim są odpo-

wiedzialne za kształtowanie proporcji w mikroflorze jelit ptaków oraz

poprawiają wykorzystanie składników odżywczych z paszy w przewodzie

pokarmowym.

Zatem enzymy paszowe to wartościowy dar nauki dla doświadczeń

związanych z efektywnym żywieniem kurcząt rzeźnych, ponieważ ich

produkcja nie potrzebuje zaangażowania bardzo dużej grupy pracowników,

wyposażenia sprzętowego oraz kapitału. Natomiast same enzymy są jak

najbardziej bezpieczne zarówno dla zwierząt jak i ludzi.


142

Literatura

1. Windisch W., Schedle K., Plitzner C., Kroismayr A., Use of phytogenic

products as feed additives for swine and poultry, Journal of Animal Science,

86 (2008), s. 140-148

2. Świątkiewicz S., Arczewska A., Koreleski J., Wpływ wybranych dodatków

paszowych na przebieg kokcydiozy u drobiu, Medycyna Weterynaryjna, 65,

nr 11, (2009) s. 758-761

3. Lipiński K., Kaliniewicz J., Tywończuk J., Stasiewicz M., Wpływ dodatków

probiotycznych i ziołowych na produkcyjność i jakość mięsa indyków,

Roczniki Naukowe Polskiego Towarzystwa Zootechnicznego, Tom 7, nr 2

(2011), s. 29-35

4. Janas P., Podgórska E., Mleko S., Pielecki J., Biosynteza enzymów

proteolitycznych i ich wpływ na aktywność celulaz Trichoderma reesei,

Annales UMCS, Secio E, 59, nr 1, (2004) s. 461-469

5. Huyghebaert G., Delezie E., Maertens L., De Gussem K., Vereecken M.,

The impact of phytase on zootechnical performances in laying hens, broiler

chickens and turkey poults, XXII International Poultry Symposion, PB WPSA,

Olsztyn 6-8 September, (2010)

6. Janocha A., Efektywność stosowania preparatów enzymatycznych w żywieniu

kurcząt brojlerów, Wydawnictwo UPH w Siedlcach. Rozprawa habilitacyjna,

nr 113, (2011), s.17-21, 36-72

7. Czech A., Efektywność fitazy w żywieniu zwierząt, Medycyna Weterynaryjna

63, nr 9 (2007), s. 1034-1039

8. Banaszkiewicz T., Kaszperuk K., Wysmyk J., Wpływ dodania fitazy

do mieszanki z dużą ilością makuchu rzepakowego na wyniki produkcyjne oraz

jakość mięsa kurcząt brojlerów, Postępy Nauki i Technologii Przemysłu

Rolno-Spożywczego T. 68 nr 4 (2013), s. 41-54

9. Fang Z. F., Liu Z. L., Dai J. J., Qian H. Y., Qi Z. L., Ma L. B., Peng J., Effects

of enzyme addition on the nutritive value of broiler diets containing hulled

or dehulled Chinese double-low rapeseed meals, Journal Animal Physiology

and Animal Nutrition, 93, 4 (2009), s. 467-476

10. Banaszkiewicz T., Ocena mieszanek zawierających makuchy z dwóch odmian

rzepaku uzupełnionych i nieuzupełnionych preparatem enzymatycznym

w żywieniu kurcząt brojlerów, Rośliny Oleiste – Oilseed Crops, T. XXXII

(2011), s. 269-279

11. Banaszkiewicz T., Stachurska K.,Borkowska K., Wysmyk J., Wpływ dodania

różnej ilości preparatu enzymatycznego na wartość pokarmową mieszanek dla

kurcząt brojlerów, Rośliny Oleiste – Oilseed Crops, T. XXXI (2010), s.159-168

12. Osek M., Milczarek A., Klocek B., Wpływ owsa nagoziarnistego i preparatu

enzymatycznego na wyniki odchowu, wartość rzeźną i jakość mięsa kurcząt

brojlerów, Roczniki Naukowe Polskiego Towarzystwa Zootechnicznego,

2,3 (2006), s. 93-101

13. Parker J., Oviedo-Rondon E. O., Clack B. A., Clemente-Hernandez S.,

Osborne J., Remus J. C., Kettunen H., Makivuokko H., Pierson E. M.,

Enzymes as feed additive to aid in responses against Eimeria species


143

in coccidia-vaccinated broilers fed corn-soybean meal diets with different

protein levels, Poultry Science, 86 (2007), s. 643-653

14. Yaghobfar A., Boldaji F., Strifi S. D., Effects of enzyme supplement

on nutrient digestibility, metabolizable energy, egg production, egg quality

and intestinal morphology of the broiler chicks and layer hens fed hull-less

barley based diets, Pakistan journal of biological sciences, 10 nr 14 (2007),

s. 2257-2266

15. Szymczyk B., Hanczakowski P., Szczurek W., Frys-Żurek M., Effect of naked

oat and enzymes in diets for broiler chickens on quality, fatty acid profile and

oxidative stability of breast muscle, Polish Journal Of Food And Nutrition

Sciences, Vol. 57, No. 4 (2007), s. 541-545

16. Świątkiewicz S., Koreleski J., Wpływ wybranych dodatków paszowych

w diecie zawierającej zanieczyszczenia zbożowe na wyniki odchowu kurcząt

brojlerów, Medycyna Weterynaryjna 61 (4), (2005), s. 462-465


Streszczenie Stosowanie dodatków do pasz nie jest obowiązkowe w żywieniu drobiu. Jednakże dzięki ich

użyciu wzrastają parametry związane z odchowem kurcząt, jaki i jakością uzyskanego

mięsa. Enzymy paszowe są dodatkiem wspierającym cykle trawienne zachodzące

w organizmie zwierzęcia. Głównie wspierają trawienie trudno strawnych składników pokarmowych w paszy, podnoszą odporność zwierząt na choroby oraz ograniczają czynność

substancji antyżywieniowych. Ich skuteczność jest jednak uwarunkowana wieloma

czynnikami, np.: pH środowiska, temperaturą, aktywnością, formą podania. Trzeba

dostarczać je młodym kurczętom rzeźnym, gdyż nie mają jeszcze dobrze rozbudowanej flory bakteryjnej. Najczęściej w żywieniu drobiu dodaje się substancje pochodzące z grupy

hydrolaz, m.in.: ksylanazy, ß-glukanazy oraz fitazy. Fitaza to białkowy enzym, którego

najwięcej występuje w pszenicy i życie. Dodanie jej do paszy skutkuje większym

wykorzystaniem fosforu fitynowego, tłuszczu, białka i związków mineralnych. Przyczynia się do mniejszego pobierania paszy, zwiększenia mięsności oraz zwiększonymi dziennymi

przyrostami. Natomiast użycie ksylanazy i ß-glukanazy powoduje poprawą mięsności

i wzrost wydajności rzeźnej. Używanie enzymów paszowych zatem nie tylko poprawia

zdrowotność zwierząt oraz podnosi wskaźniki produkcyjne kurcząt brojlerów, ale także gwarantuje podwyższony zysk dla hodowcy drobiu, ponieważ daje możliwość użycia

tańszych surowców paszowych zamiast drogich.

Enzymes as perfect fodder additives in chickens for slaughter nutrition

Abstract

The use of feed additives isn’t mandatory in poultry nutrition. However, with their help

increase parameters related to the breeding chickens and the quality of the resulting meat. Feed enzymes are in addition supporting the digestive cycles occurring in the animal body.

Mainly to support digestion difficult digestible nutrients in fodder and increase the

resistance to diseases of animals and limit the effect anti-nutritive substances. However,

their effectiveness, it is conditioned by many factors, for example: pH of the environment, temperature, activity, application form. We have to deliver them to young chickens for

slaughter, because they don’t have well-developed bacterial flora yet. Most often in poultry

nutrition is added to substances derived from the group hydrolase: xylanase, beta-glucanase

and phytase. Phytase is an enzyme protein which is present in most wheat and rye. The

https://scholar.google.com/citations?view_op=view_citation&hl=en&user=dajBQygAAAAJ&citation_for_view=dajBQygAAAAJ:NaGl4SEjCO4C





144

addition of her to fodder results in increased use of phytic phosphorus, fat, protein and

minerals. Contributes to lower fodder intake, to increase meatiness and to increased daily

increments. Whereas the use of xylanase and beta-glucanase is causing meatiness

improvement and productivity growth slaughter. Use of feed enzymes thus not only improves the health of the animals and increases the ratios of broiler chicken production, but

also guarantees the heightened profit for the poultry farmers, because it gives the ability

to use cheaper raw materials instead of expensive feeds.

145

Natalia Kopik1

Enzymy w służbie środowisku

– plastiki, bioplastiki i ich rozkład

1. Wprowadzenie

Główną wadą stosowania plastików jest ich długi okres pozostawania

w środowisku, już po tym jak spełnią swoją funkcję i zostaną wykorzystane.

Recykling plastików nie zawsze jest możliwy, m.in. z powodu zróżnico-

wanego składu polimerów oraz zanieczyszczeń organicznych, powstających

często podczas użytkowania. W celu rozwiązania tego problemu,

opracowano plastiki biodegradowalne, w skrócie zwane bioplastikami (ang.

BPs). Tworzywa te są łatwiej usuwane ze środowiska, ponieważ są bardziej

podatne na działanie mikroorganizmów: grzybów, glonów, bakterii.

Pierwotnymi substratami do wytwarzania bioplastików były celuloza i skrobia,

obecnie wykorzystywane są również kwas glikolowy, mlekowy i inne związki

[1]. Możliwość otrzymywania monomerów z surowców odnawialnych

(np. roślin) jest dodatkową zaletą bioplastików, ponieważ pozwala na redukcję

wydzielanych do atmosfery gazów cieplarnianych, a także szkodliwych zanie-

czyszczeń, które powstają podczas przetwarzania surowców kopalnych [2].

Celem niniejszej pracy jest scharakteryzowanie wybranych polimerów

biodegradowalnych wraz z ich dostępnością komercyjną i zastosowaniem,

a także przedstawienie enzymów i mikroorganizmów zdolnych do biodegra-

dacji zarówno bio-, jak i tradycyjnych plastików, uwzględniając ich powszech-

ność w środowisku, szybkość procesu i możliwe optymalizacje.

2. Plastik biodegradowalny

2.1. Charakterystyka ogólna

Obecnie wyróżnia się ponad siedemdziesiąt rodzajów poliestrów bio-

degradowalnych [2]. Wśród alifatycznych (AP) główną rolę odgrywają m.in.:

poli(ε-kaprolakton) (PCL);

poli(hydroksyalkanian) (PHA);

poli(hydroksymaślan) (PHB);

poli(3-hydroksymaślan-co-3-hydroksywalerianian) (PHBV);

1 [email protected], Studenckie Koło Naukowe Biochemików UMCS, Wydział Biologii

i Biotechnologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie

Natalia Kopik

146

poli(bursztynian butylenu) (PBS);

poli(bursztynian-co-adypinian butylenu) (PBSA);

poli(kwas glikolowy) (PGA);

polilaktyd (PLA).

Do poliestrów alifatyczno-aromatycznych (ACC) należą zaś np.:

poli(bursztynian-co-tereftalan butylenu) (PBTS);

kopolimer poli(tereftalanuetylenu) (co-PET);

poli(adypinian-co-tereftalan butylenu) (PBTA) [3].

Łańcuchy wyżej wymienionych polimerów są rozkładane w wyniku

procesów nieenzymatycznych, takich jak hydroliza chemiczna, ale także

enzymatycznych. Produktem ich degradacji najczęściej jest dwutlenek

węgla, metan, woda, biomasa oraz substancje nieorganiczne. Tym samym

BPs stają się częścią naturalnego, biologicznego recyklingu.

Wykorzystywanie bioplastików stale rośnie: są stosowane jako

opakowania (worki na śmieci, pojemniki na żywność, folie, torby),

produkty higieniczne (pieluchy, waciki), jednorazowe naczynia i sztućce,

zabawki, biżuteria, a także znalazły zastosowanie w przemyśle testylnym,

samochodowym, medycznym czy budownictwie [1]. Ogółem, wszędzie

tam gdzie to możliwe widać tendencję do zastępowania tradycyjnych

tworzyw korzystniejszymi dla środowiska bioplastikami. Jednak pomimo

wprowadzania nowych tworzyw biodegradowalnych, na rynku wciąż

brakuje materiałów, które mogłyby zastępować konwencjonalne tworzywa

sztuczne w tak szerokim spektrum ich stosowalności, jak to ma miejsce

obecnie. Głównymi barierami są tutaj: wysoka cena czy niedostateczne

właściwości użytkowe [2].

Do oceny potencjału degradacyjnego, kluczowej cechy bioplastików

stosuje się płytki agarozowe, zawierające zemulgowane polimery. Po

pewnym czasie można zaobserwować, że kolonie mikroorganizmów, które

posiadają zdolność do ich rozkładu są otoczone jasnym halo. Dzieje się tak,

ponieważ wydzielają one enzymy, które dyfundują w agarze i rozkładają

polimery do rozpuszczalnych produktów. Jest to jedna z łatwiejszych

metod oceny potencjału degradacyjnego mikroorganizmów [4, 5].

Na biodegradację plastików wpływają zarówno właściwości chemiczne,

jak i fizyczne polimerów, np. właściwości powierzchniowe (pole

powierzchni, jej hydrofilowość lub hydrofobowość), struktura chemiczna,

masa cząsteczkowa, temperatura zeszklenia i topnienia, moduł sprężystości

czy stopień krystaliczności. Zależność przedstawia się następująco: im większa

masa cząsteczkowa, stopień krystaliczności lub temperatura topnienia, tym

powolniejszy rozkład [6]. Hydrofobowość lub hydrofilowość wpływa na

skuteczność adhezji drobnoustrojów do powierzchni polimeru. Biodegra-

dowalność może zostać zwiększona w wyniku kopolimeryzacji, ponieważ

Enzymy w służbie środowisku – plastiki, bioplastiki i ich rozkład

147

obniża ona stopień krystaliczności i temperaturę topnienia – jedne z waż-

niejszych parametrów wpływających na proces rozkładu plastików [7].

2.2. Charakterystyka szczegółowa wybranych polimerów

biodegradowalnych

2.2.1. Poliestry biodegradowalne oparte na kwasie

bursztynowym, np. PBS, PBSA

Poliestry biodegradowalne oparte na kwasie bursztynowym, najlepiej

naśladują właściwości tradycyjnych termoplastów, a ich modyfikacje

pozwalają otrzymywać materiały o polepszonych właściwościach

mechanicznych i temperaturowych. Na rynku mogą się znajdować pod

handlową nazwą Bionolle firmy Showa Highpolymer Co. Ltd., EnPol firmy

IreChemical czy GS Pla japońskiego koncernu Mitsubishi Chemical [2].

Mikroorganizmy rozkładające polimery kwasu burtsztynowego są szeroko

rozpowszechnione w środowisku. Przykładowy poli(bursztynian tetra-

metylenowy) (PTMS) może być rozkładany przez 0,2-6,0% mikroorga-

nizmów glebowych, wśród nich m.in. przez pleśnie i promieniowce.

W zależności od szczepu oraz formy polimeru w przeciągu 10 dni następo-

wała degradacja od 40% do 90% PTMS w 30°C. Badane mikroorganizmy

wykazały również zdolność rozkładu PHB i PCL [8]. W warunkach

podwyższonej temperatury (50°C) PTMS może być degradowane przez

ciepłolubne Microbispora rosea (50% polimeru w ciągu 8 dni), Excello-

spora japonica i E. viridilutea [9].

2.2.2. PHA

Wśród poli(hydroksyalkanianów) najbardziej popularne są poli(hydroksy-

maślany) i poli(3-hydroksymaślan-co-3-hydroksywalerianiany). Dawniej

PHB było obecne na rynku pod nazwą handlową BIOPOL (firma ICI)

i NODAX (firma P&G), aktualnie dostępne jest jako Mirel (amerykańska

firma Telles). PHBV produkuje chiński Tianan pod nazwą ENMAT.

Poli(hydroksymaślan) stanowi polimer naturalny, wytwarzany przez wiele

bakterii, m.in. Alcaligenes (szczególnie z rodzaju Alcaligenes eutrophus),

Azotobacter, Bacillus, Nocardia, Pseudomonas, Rhizobium. Powstaje

w wyniku transformacji cukrów lub lipidów, jako sposób na przechowywanie

dwutlenku węgla i energii. Może być syntetyzowany z odnawialnych

i tanich surowców, a ich polimeryzacja na skalę przemysłową jest

prowadzona z minimalnym wpływem na środowisko. Szacowany odsetek

mikroorganizmów rozkładających PHB w środowisku to 0,5-9,6%

wszystkich drobnoustrojów [2, 6]. Biodegradacja PHA zachodzi zarówno

w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych, bez ubocznych produktów

Natalia Kopik

148

toksycznych. Mikroorganizmy rozkładające poli(hydroksymaślan) wyizolo-

wano z gleby (Pseudomonas lemoigne, Comamonas sp., Acidovorax

faecalis, Aspergillus fumigatus i Variovorax paradoxus), osadów

(Alcaligenes faecalis, Illyobacter delafieldi) oraz wody morskiej i słodkiej

(Comamonas testosterone, Pseudomonas stutzeri) [10]. Termofilowy

Streptomyces sp. degraduje 100% PHB w przeciągu 3 do 5 dni [11], zaś

Aspergillus sp. 90% po 5 dniach hodowli w 50°C [12].

2.2.3. PCL

Poli(ε-kaprolakton) na rynku występuje pod handlową nazwą CAPA

firmy Perstorp [2]. Jest rozkładany w wyniku działania tlenowych

i beztlenowych drobnoustrojów, które są szeroko rozpowszechnione

w różnych ekosystemach, np. wyizolowany z gleby Penicillium sp. (100%

degradacji w ciągu 12 dni w 30°C) czy termotoleranycjny Aspergillus sp.

(100% degradacji w ciągu 6 dni w 50°C). Ogólnie szacuje się, że odsetek

mikroorganizmów zdolnych do degradacji PCL wynosi 0,8-8,0% wszystkich

drobnoustrojów glebowych [6].

2.2.4. PLA

Polilaktyd może być wytwarzany w wyniku fermentacji z surowców

odnawialnych [13]. Na rynku występuje pod handlową nazwą Ingeo firmy

NatureWorks [2]. Jest jednym z najsłabiej rozkładanych polimerów

alifatycznych, a mikroorganizmy, które tego dokonują są rzadko spotykane

w środowiskach glebowych. Amycolatopsis sp. degraduje 60% PLA

w ciągu 14 dni [14]. Ogółem, większość mikroorganizmów rozkładających

PLA należy do rodziny Pseudonocardiaceae i pokrewnych rodzajów,

takich jak Amycolatopsis, Lentzea, Kibdelosporangium, Streptoalloteichus

i Saccharothrix [16, 17, 18].

3. Przykładowe enzymy biorące udział w rozkładzie polimerów

Pierwszym etapem enzymatycznej degradacji tworzyw sztucznych jest

ich depolimeryzacja, podczas której następuje rozpad łańcuchów na coraz

krótsze fragmenty: oligomery, dimery i monomery. Końcowa faza to

mineralizacja, której końcowymi produktami są dwutlenek węgla, woda

i/lub metan. Temperatura, wilgotność i ciśnienie to parametry fizyczne,

które mechanicznie uszkadzając polimery mogą inicjować i wspomagać

proces degradacji [19].


149

3.1. Enzymy rozkładające tradycyjne plastiki

Jednym z najczęściej badanych enzymów rozkładających tradycyjne

plastiki jest lakaza, wytwarzana m.in. przez promieniowca Rhodococcu

ruber (C208). Enzym ten wykazuje zdolność katalizy degradacji

polietylenu (PE). Płynna hodowla R. ruber w przeciągu 30 dni była

w stanie rozłożyć 8% PE. Stwierdzono, iż proces biodegradacji PE

zachodzi do 50% efektywniej po dodaniu do medium hodowlanego 0,05%

oleju mineralnego. Lipidy w optymalnym stężeniu, zwiększały tworzący

się na hydrofobowej powierzchni PE biofilm. Zastosowanie mniejszej

ilości oleju (0,02%) nie wywołało znaczącej zmiany, zaś większe stężenie

(1%) było mniej wydajne, prawdopodobnie z powodu preferowania tej

właśnie substancji jako źródła węgla zamiast polietylenu. Dodanie

niejonowego surfaktantu nie poprawiło zdolności biodegradacyjnej R. ruber,

co jest o tyle zaskakujące, że stymulował on adhezję i biodegradację

u Pseudomonas aeruginosa i wzrost u Penicllium simplicissimum. Wskazuje

to na hydrofobowość tego szczepu [20‚23].

Inne enzymy posiadające zdolność do rozkładu plastików to papaina

i ureaza – dwa enzymy proteolityczne, które współpracując ze sobą, degradują

poliuretanu poliestrowego. Degradacja polimeru przez papainę jest możliwa

dzięki katalizie przez ureazę wiązań mocznikowych, w wyniku czego

postają wolne grupy aminowe i hydroksylowe [19].

3.2. Enzymy rozkładające bioplastiki

Do enzymów odpowiedzialnych za rozkład bioplastików należy

m.in. lipaza z Cryptococcus sp. (S-2), która jest w stanie degradować

wysokocząsteczkowe PLA, a także PBS, PCL i PHB. Dojrzałe białko

składa się z 205 aminokwasów, a jego masa cząsteczkowa wynosi ok.

20,9 kDa [24]. Degradację niskocząsteczkowego PLA wykazały także

lipazy z Rhizopus delemer i esteraza poliuretanowa z Comamonas acido-

vorans (TB-35) [19, 25].

Pseudozyma antarctica (JCM 10317) wykazuje silnie degradacyjną

aktywność dla PBS oraz PBSA. Produkuje ona enzym PaE, który został

wyizolowany, a gen kodujący to białko (PaCLE1) z sukcesem

wprowadzony do genotypu Saccahromyces cerevisiae. PaE składa się z 198

aminokwasów, a jego masa cząsteczkowa to ok. 20,3 kDa. Pod względem

strukturalnym przypomina białka z rodziny kutynaz (61-68% zgodności).

Wykazuje aktywność katalityczną również dla PLA i PCL [26].

Depolimerazy PLA można podzielić na proteazy i lipazy, które

wykazują pewne preferencje substratowe. Depolimerazy typu proteaz

rozkładają głównie poli(L-kwas mlekowy) (PLLA), zaś typu lipaz hydro-

Natalia Kopik

150

lizują poli(D-kwas mlekowy) (PDLA). Do tej ostatniej grupy należą

kutynazo-podobne enzymy, jak CLE z Cryptococcus sp. [27].

Spośród przebadanych 56 komercyjnych proteaz, niektóre o charakterze

alifatycznym wykazały zdolności do degradacji PLA. Największą aktywnością

katalityczną cechowała się Savinase 16,0L i wynosiła ona 41,9 U/mg. Nas-

tępne były Protin A o aktywności 23,4 U/mg oraz Purafect 4000L – 15,8 U/mg.

Wszystkie te proteazy wyizolowano z Bacillus subtilus lub lentus [28].

Wśród proteaz serynowych rozkładających PLA można wymienić zarówno

te pochodzące od mikroorganizmów, jak i od ssaków: proteinaza K z Tritira-

chium album, subtylizynę, alfa-chymotrypsyna, trypsyna i elastaza [15, 29].

Wykazano, że obecność niektórych białek, np. elastyny, może stymulować

wytwarzanie enzymów degradujących polilaktyd u drobnoustrojów. W przy-

padku Amycolatopsis orientalis dodanie kazeiny powodowało 4x wzrost

aktywności, żelatyny 10x, zaś fibroiny 60x [30].

Wśród przebadanych komercyjnych lipaz największą biodegradację

w 37°C wykazała, wyizolowana z Chromobacterium viscosum, Lipaza

Asahi, która w ciągu 17 dni rozłożyła PBS, 4 dni PBSA i 6 dni PCL.

Oprócz niej kilka innych okazało się zdolnych do katalizy PBSA i PCL:

Lipaza F (PBSA – 6 dni, PCL – 11) oraz Lipaza-QL (odpowiednio 11 i 14 dni),

a także, chociaż nie całkowicie, M10 (36,1% PBSA i 23,8% PCL podczas

100 dni inkubacji). Lipaza F-AP15 i AY30 wykazały degradację jedynie

dla PBSA, pierwszy enzym w ciągu 22 dni rozłożył go całkowicie, drugi

podczas 100 dni – częściowo (21,9%). Lipaza PL, pozyskana z Alcaligenes

sp., w 55°C rozłożyła PLA w ciągu 20 dni, zaś w 37°C nie wykazała takiej

aktywności [31].

4. Podsumowanie

Problemy związane z rosnącą ilością odpadów z tworzyw sztucznych

przyczyniły się do intensywnego rozwoju badań nad materiałami, które

określa się mianem polimerów biodegradowalnych. Obecnie na rynku

istnieje wiele rodzajów tych tworzyw, różniących się bazą surowcową,

metodami produkcji, budową chemiczną i właściwościami. Wytwarzanie

i użytkowanie tworzyw pozyskiwanych z surowców odnawialnych i posia-

dających zdolność do biodegradacji doskonale wpisuje się w znaczenie

pojęcia zrównoważonego rozwoju. Wydaje się, że najłatwiej rozkładane

w warunkach glebowych są poli(hydroksyalkaniany), poli(ε-kaprolakton)

i polimery kwasu bursztynowego, najsłabiej zaś polilaktyd. Wiele mikro-

organizmów ma zdolność degradacji kilku rodzajów bioplastików.

Potencjał bioplastików, jako tworzyw alternatywnych dla tradycyjnych

pastików, jest bardzo wysoki, ale wciąż nie został całkowicie wykorzystany.

Potrzebne są dalsze badania dotyczące optymalizacji ich produkcji, szcze-


151

gólnie mogącej obniżyć jej koszty i zapewnić polepszenie właściwości

użytkowych polimerów przy jednoczesnym zachowaniu ich zdolności do

biodegradacji.

Istotne jest również dalsze pogłębianie wiedzy na temat mikroorga-

nizmów rozkładających plastiki i bioplastiki. Istnieje wiele enzymów

zaangażowanych w te procesy, które nie zostały jeszcze do tej pory wyizo-

lowane i zbadane. Poznanie zarówno kolejnych gatunków mikroorganizmów,

jak i konkretnych białek katalizujących reakcje umożliwi dalsze uspraw-

nianie procesu biodegradacji polimerów.

Literatura

1. Gross R. A., Kalra B., Biodegradable polymers for the environment, Science,

297(2002), s. 803-807

2. Kondratowicz F., Synteza i właściwości biodegradowalnych kopoliestrów

alifatyczno-aromatycznych, Szczecin: Zachodniopomorski Uniwersytet

Technologiczny w Szczecinie, 2010

3. Ukielski R., Kondratowicz F., Kotowski D., Produkcja, właściwości i kierunki

rozwoju biodegradowalnych poliestrów ze szczególnym uwzględnieniem

kopolimerów alifatyczno-aromatycznych, Polimery, 3 (2013), nr 3, s. 167-176

4. Mergaert J., Swings J., Biodiversity of microorganisms that degrade bacterial

and synthetic polyesters, Journal of Industrial Microbiology, 17 (1996), s. 463-469

5. Suyama T., Tokiwa Y., i in., Phylogenetic affiliation of soil bacteria that

degrade aliphatic polyesters available commercially as biodegradable

plastics, Applied and Environmental Microbiology, 64 (1998), s. 5008-5011

6. Tokiwa Y., Calabia B. P. i in., Biodegradability of Plastics, International

Journal of Molecular Sciences, 10 (2009), s. 3722-3742

7. Seretoudi G., Bikiaris D., Panayiotou C., Synthesis, characterization and

biodegradability of poly(ethylene succinate)/poly(ɛ-caprolactone) block

copolymers, Polymer, 43 (2002), s. 5405-5415

8. Pranamuda H., Tokiwa Y., Tanaka H., Microbial degradation of an aliphatic

polyester with a high melting point, poly(tetramethylene succinate), Applied

and Environmental Microbiology, 61 (1995), s. 1828-1832

9. Jarerat A., Tokiwa Y., Degradation of poly(tetramethylene succinate)

by thermophilic actinomycetes, Biotechnology Letters, 23 (2001), s. 647-651

10. Lee S. Y., Bacterial polyhydroxyalkanoates, Biotechnology and

Bioengineering, 49 (1996),s. 1-14

11. Calabia B. P., Tokiwa Y., Microbial degradation of poly(d -3-

hydroxybutyrate) by a new thermophilic streptomyces isolate, Biotechnology

Letters, 26 (2004), s. 15-19

12. Sanchez J. G., Tsuchii A., Tokiwa Y., Degradation of polycaprolactone

at 50°C by a thermotolerant Aspergillus sp., Biotechnology Letters, 22 (2000),

s. 849-853

Natalia Kopik

152

13. Maślanka S., Siołek M. i in., Zastosowanie odpadów z przemysłu

mleczarskiego do produkcji polimerów biodegradowalnych, Chemik,

68 (2014), s. 703-709

14. Pranamuda H., Tokiwa Y., Tanaka H., Polylactide degradation by an

Amycolatopsis sp., Applied and Environmental Microbiology. 63 (1997),

s. 1637-1640

15. Tokiwa Y., Calabia B. P., Biodegradability and biodegradation

of poly(lactide), Applied Microbiology, 72 (2006), s. 244-251

16. Jarerat A., Tokiwa Y., Poly(L-lactide) degradation by Saccharothrix

waywayandensis, Biotechnology Letters, 25 (2003), s. 401-404

17. Jarerat A., Tokiwa Y., Tanaka H., Poly(L-lactide) degradation

by Kibdelosporangium aridum, Biotechnology Letters, 25 (2003), s. 2035-2038

18. Tokiwa Y., Jarerat A., Biodegradation of poly(L-lactide), Biotechnology

Letters, 26 (2004), s. 771-777

19. Bhardwaj H., Gupta R., Tiwari A. Communities of microbial enzymes

associated with biodegradation of plastics, Journal of Polumers and the

Environment, 21 (2013), s. 575-579

20. Gilan (Orr) I., Hadar Y., Sivan A., Colonization, biofilm formation and

biodegradation of polyethylene by a strain of Rhodococcus ruber, Applied

Microbiology and Biotechnology, 65 (2004), s. 97-104

21. Albertsson A. C., Sares C., Karlsson S., Increased biodegradation of LDPE

with nonionic surfactants, Acta Polymerica, 44 (1993), s. 243-246

22. Yamada-Onodera K., Mukumoto H. i in., Degradation of polyethylene

by a fungus, Penicillium simplicissimum YK, Polymer Degradation and

Stability, 72 (2001), s. 323-327

23. Sivan A., Szanto M., Pavlov V., Biofilm development of the polyethylene-

degrading bacterium Rhodococcus ruber, Applied Microbiology and

Biotechnology, 72 (2006), s. 346-352

24. Masaki K., Kamini N. R., Ikeda H., Cutinase-like enzyme from the yeast

Cryptococcus sp. strain S-2 hydrolyzes polylactic acid and other

biodegradable plastics, Applied and Environmental Microbiology, 71 (2005),

s. 7548-7550

25. Akutsu Y., Nakajima-Kambe T. i in., Purification and properties

of a polyester polyurethane-degrading enzyme from Comamonas acidovorans

TB-35, Applied and Environmental Microbiology, 64 (1998), s. 62-67

26. Shinozaki Y., Morita T. i in., Biodegradable plastic-degrading enzyme from

Pseudozyma antarctica: cloning, sequencing, and characterization, Applied

Microbiology and Biotechnology, 97 (2013), s. 2951-2959

27. Kawai F., Nakadai K. i in., Different enantioselectivity of two types

of poly(lactic acid) depolymerases toward poly(l-lactic acid) and poly(d-lactic

acid), Polymer Degradation and Stability, 96 (2011), s. 1342-1348

28. Lim H. A., Raku T., Tokiwa Y., Hydrolysis of polyesters by serine proteases,

Biotechnology Letters, 27 (2005), s. 459-464

29. Oda Y., Yonetsu A. i in., Degradation of Polylactide by Commercial

Proteases, Journal of Polymers and the Environment, 8 (2000), s. 29-32


153

30. Jarerat A., Tokiwa Y., Tanaka H., Production of poly(L-lactide)-degrading

enzyme by Amycolatopsis orientalis for biological recycling of poly(L-lactide),

Applied Microbiology and Biotechnology, 72 (2006), s. 726-731

31. Hoshino A., Isono Y., Degradation of aliphatic polyester films by

commercially available lipases with special reference to rapid and complete

degradation of poly(l-lactide) film by lipase PL derived from Alcaligenes sp.,

Biodegradation, 13 (2002), s. 141-147


Streszczenie

Problemy związane z rosnącą ilością odpadów z tworzyw sztucznych spowodowały

intensywny rozwój badań nad materiałami, które określa się mianem polimerów biodegradowalnych (bioplastików). Są one łatwiej usuwane ze środowiska, ponieważ są

bardziej podatne na działanie mikroorganizmów: grzybów, glonów, bakterii. Produktem ich

degradacji może być dwutlenek węgla, metan, woda lub biomasa. Obecnie wyróżniono

kilkadziesiąt rodzajów takich polimerów, różniących się bazą surowcową, metodą produkcji, budową chemiczną i właściwościami. Ich biodegradacja zależy od właściwości

fizycznych i chemicznych, głównie masy cząsteczkowej, struktury, stopnia krystaliczności

i temperatury topnienia.

W przedstawionej pracy scharakteryzowano polimery biodegradowalne, przedstawiono ich rodzaje i zastosowania, wymieniono te dostępne komercyjnie, a następnie na wybranych

przykładach omówiono ich rozkład. Uwzględniono gatunki i rodziny przeprowadzających

degradację mikroorganizmów, ich powszechność w środowisku, szybkość procesu oraz

katalizujące te reakcje enzymy.

Enzymes in the service of the environment – plastics, bioplastics

and their degradation

Abstract

The problem of the growing number of plastic waste caused intense research on materials, which are defined as biodegradable polymers (bioplastics). They are easily removed from

the environment because they are more susceptible to the action of microorganisms: fungi,

algae, bacteria. The product of their degradation can be carbon dioxide, methane, water,

or biomass. Nowadays we have several dozen types of such polymers and they are different in raw material base, method of production, chemical structure and properties. Their

biodegradation depends on the physical and chemical properties, especially molecular

weight, structure, degree of crystallinity and melting temperature.

In this work, I characterized biodegradable polymers, prezented the types and applications, mentioned those commercially available and discussed their degradations on selected

examples. I included polymer-degrading microorganisms, their prevalence in the

environment, speed of the process and the enzymes that catalyze these reactions.

154

Małgorzata Margas1

Zastosowanie pomiaru aktywności peroksydazy

w analizie poziomu stresu oksydacyjnego u roślin

1. Wprowadzenie

Rośliny obecne w środowisku nieustannie narażone są na działanie różnych

czynników stresowych, związanych, m.in. z niekorzystnymi warunkami środo-

wiska, czy obecnością w glebie szkodliwych substancji. Wśród czynników

abiotycznych, znaczącą rolę odgrywają susza, zbyt wysoka lub niska

temperatura, promieniowanie UV, stres solny, a także związki związane

z działalnością człowieka. Należą tu pestycydy, metale ciężkie, oraz związki

metali z procesów przemysłowych, m.in. kadmu, fluoru, miedzi i selenu [1, 2].

Dodatkowy problem stanowią czynniki biotyczne, m.in. roślinożercy czy

patogeny roślin, niszczące ich tkanki [3, 4, 5].

Narażenie roślin na biotyczny i abiotyczny stres pociąga za sobą różne

negatywne skutki. Następstwami stresu są zaburzenia procesów bio-

chemicznych oraz fizjologicznych roślin, m.in. zatrzymanie wzrostu, spadek

suchej masy, hamowanie kiełkowania czy zaburzenie procesu fotosyntezy

[6, 7]. Skutkiem w rolnictwie jest przede wszystkim spadek wydajności

produkcji w wyniku obniżonego plonowania [8]. Każdego roku na świecie

notuje się szkody w rolnictwie wskutek działania czynników abiotycznych.

Szacuje się, że czynniki abiotyczne są przyczyną strat w uprawie sięga-

jących 50%. Przypuszcza się, że stresy środowiskowe nasilą się z powodu

globalnego ocieplenia [9, 10, 11].

Celem pracy jest przedstawienie zastosowania i roli prowadzenia badań

aktywności enzymów z grupy peroksydaz w ocenie poziomu stresu oksy-

dacyjnego. Analizami objęte zostały różne gatunki roślin, które poddano

działaniu czynników stresowych.

2. Reakcje roślin na stres

W tkankach roślin narażonych na działanie różnych czynników

środowiska, zachodzą zmiany, co jest aktualnie przedmiotem badań wielu

naukowców. W warunkach stresu rośliny zużywają mniej energii oraz

składników odżywczych do procesów wzrostu, więcej zaś w reakcje

obronne [12, 13]. 1 [email protected], Katedra Fizjologii, Genetyki i Biotechnologii Roślin,

Uniwersytet Warmińsko- Mazurski w Olsztynie, www.uwm.edu.pl



155

2.1. Stres oksydacyjny w komórkach

Abiotyczne stresy środowiskowe powodują wzmożoną produkcję reak-

tywnych form tlenu (RFT) w komórkach [14]. Wytwarzanie RFT związane

jest również z pojawieniem się patogenów lub jest odpowiedzią na zranienia

roślin. Wytwarzane w komórkach przez mitochondria, chloroplasty,

peroksysomy, czy ścianę komórkową RFT odgrywają rolę w rozwoju

roślin. Biorą udział w transdukcji sygnałów w różnych procesach

biologicznych, regulacji wzmocnienia ścian komórkowych. Ponadto

regulują wzrost elongacyjny korzeni, włośników w korzeniach oraz pędów,

kontrolują starzenie i produkcję fitoaleksyn [15, 16, 17, 18, 19]. W przypadku

stresu może wystąpić zjawisko tzw. wybuchu tlenowego i nadmiernego

gromadzenia reaktywnych form tlenu, co jest przyczyną uszkodzenia

komponentów komórkowych, m.in. DNA, białek, chlorofilu, a także

programowanej śmierci komórki (PCD) [20, 21]. W celu ograniczenia

negatywnych skutków obecności reaktywnych form tlenu rośliny wykształ-

ciły systemy antyoksydacyjne. Do drobnocząsteczkowych, nieenzyma-

tycznych antyoksydantów należą: askorbinian, glutation, poliaminy,

flawonoidy, związki fenolowe, alkaloidy, tokoferol oraz karotenoidy [22,

23, 24]. W antyoksydacyjnym systemie enzymatycznym wyróżniono m.in.

dysmutazę ponadtlenkową (SOD), katalazę (CAT), reduktazę glutationową

(GR) i peroksyadazy [25].

3. Peroksydazy jako przykłady enzymów antyoksydacyjnych

W tkankach roślinnych peroksydazy stanowią grupę kluczowych

enzymów, zaangażowanych w wiele procesów fizjologicznych. Mają

właściwości unieczynniania reaktywnych form tlenu. Ich działanie polega

na katalizowaniu reakcji rozkładu przede wszystkim nadtlenku wodoru,

a ich zastosowanie jest celem licznych badań [26, 27]. Wyróżnia się trzy

klasy peroksydaz, znacznie różniących się sekwencją aminokwasową,

mechanizmem katalizowanych reakcji, a także pełnioną funkcją w komór-

kach [28]. Tylko dwie klasy zidentyfikowano u roślin, tj. wewnątrz-

komórkowe peroksydazy klasy I oraz występujące w wakuoli i ścianie

komórkowej peroksydazy klasy III [24]. Peroksydazy klasy I, do których

zalicza się peroksydazę askorbinianową, obecne w żywych organizmach

prócz animalia, uznawane są za pierwotne, od których pochodzą pozostałe

dwie klasy peroksydaz [28]. Peroksydazy klasy III oprócz ochrony przed

skutkami stresu oksydacyjnego, zaangażowane są w wiele procesów

fizjologicznych, m.in. biorą udział w biosyntezie lignin i etylenu oraz

degradacji kwasu indolilooctowego [29].

Małgorzata Margas

156

3.1. Peroksydaza glutationowa (GPX)

Badania nad peroksydazą glutationową u roślin poprzedzone były

analizami nad GPX komórek ssaków. Porównanie enzymu z tkanek roślinnych

i zwierzęcych wykazało znaczne różnice w strukturze, lokalizacji wewnątrz

komórki oraz specyficzności substratowej GPX [30, 31, 32]. W najnowszych

doniesieniach wykazano podwójną rolę peroksydazy glutationowej,

tj. w wychwytywaniu cząsteczek nadtlenku wodoru oraz transdukcji sygnału

kwasu abscysynowego. Ponadto wskazuje się na znaczenie enzymu

w zapobieganiu programowanej śmierci komórki [31, 33, 34].

3.2. Peroksydaza askorbinianowa (APX)

Najnowsze badania wykazały bezpośrednią rolę peroksydazy w utrzy-

maniu procesu fotosyntezy w razie wystąpienia stresu. Ponadto u roślin, ze

zmutowanymi genami APX następowały zmiany w rozwoju, wzroście i meta-

bolizmie, co ujawniło, że APX mogą pełnić rolę w rozwoju roślin [35, 36, 37].

3.3. Peroksydaza gwajakolowa (GPOX)

Spośród wszystkich peroksydaz, o roli peroksydazy gwajakolowej

w odpowiedzi na czynniki stresowe informacje nie są tak liczne. Niemniej

jednak enzym ten uznany został przez Noctor i Foyer za jeden z najważ-

niejszych enzymów antyoksydacyjnych w komórkach roślin [38, 39].

4. Aktywność peroksydaz u roślin narażonych na czynniki

biotyczne i abiotyczne

Prowadzone są liczne badania, związane z wpływem stresorów na

aktywność enzymów stresu oksydacyjnego. Analizy dotyczą wielu gatunków

roślin po zastosowaniu czynników o różnym nasileniu.

4.1. Herbicydy

Herbicydy stosuje się powszechnie w celu zwalczania chwastów [40].

Przykładowo w Stanach Zjednoczonych w 2007 roku zużyto 84 mln kg

glifosatu [41].

Badania wykazały wpływ składników herbicydów na aktywność

enzymów stresu oksydacyjnego u roślin. Wiologen metylu (parakwat),

którego użycie w Uni Europejskiej zostało zakazane z powodu toksycznego

działania na ludzi i zwierzęta, wciąż jest najczęściej stosowanym środkiem

chwastobójczym w Azji i Ameryce Południowej [42]. Wzrost aktywności

APX, obok katalazy i dysmutazy ponadtlenkowej zaobserwowano

w siewkach tytoniu (Nicotiana tabaccum L.) pod wpływem wiologenu

metylu [43]. Efekt odwrotny uzyskano po zastosowaniu parakwatu



157

w uprawie soi (Glicyne max L.), gdzie zaobserwowano znaczny spadek

aktywności peroksydazy askorbinianowej [44].

4.2. Temperatura

Badania przeprowadzone przez Duan i wsp. na siewkach pomidorów,

poddawanych chłodzeniu w temperaturze 4°C przez 12 i 24 godziny

wykazały wzrost aktywności APX względem próby kontrolnej [45].

Ponadto He i wsp. przeprowadzili analizę enzymów stresu oksydacyjnego

w owocach wiśni poddawanych próżniowemu chłodzeniu – powszechnemu

zabiegowi w branży owocowo – warzywnej. W swoich badaniach

udowodnili wzrost aktywności m.in. peroksydazy gwajakolowej względem

próby kontrolnej, tj. owoców niechłodzonych [46].

Wzrost temperatury powietrza może utrudniać prawidłowy wzrost

i rozwój roślin, prowadząc do pogorszenia jakości i ilości plonu [47].

Przeprowadzono doświadczenia, w których udowodniono, że ekspozycja na

podwyższoną temperaturę skutkuje aktywacją enzymów stresu oksydacyj-

nego. Przykładowo aktywność peroksydazy askorbinianowej zwiększyła

się w nerkowcu (Anacardium occidentale L.) pod wpływem podwyższonej

temperatury (42°C) [48]. Podobny efekt zanotowano również w Jatropha

curcas L. w przypadku podwyższonej do 43°C temperatury [49].

4.3. Jony metali

Aktywność enzymów stresu oksydacyjnego pod wpływem jonów metali

zmienia się w zależności od gatunku rośliny, stężenia metalu, czasu

ekspozycji. Jony metali naturalnie występują w glebie, gdzie akumulują się

wskutek szybkiego rozwoju działalności przemysłowej [50].

Jakkolwiek w badaniach przeprowadzonych przez Saenen i wsp. [51]

z wykorzystniem rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana L.) nie

odnotowano znaczących różnic we wzroście aktywności enzymów GPX

oraz APX pod wpływem uranu, tak w doświadczeniach przeprowadzonych

przez innych naukowców wykazano wzrost aktywności enzymów stresu

oksydacyjnego pod wpływem uranu i innych metali ciężkich [52, 53, 54].

Przykładowo Vanhoudt i wsp. zaobserwowali wzrost aktywności

peroksydazy gwajakolowej i askorbinianowej w Arabidopsis thaliana L.

wraz ze wzrostem zastosowanego stężenia uranu trzeciego dnia ekspozycji

[50]. Z kolei Smeets i wsp. wykazali wzrost aktywności peroksydazy

gwajakolowej i peroksydazy askorbinianowej w rzodkiewniku pospolitym,

poddawanych działaniu kadmu. Co ciekawe, w badaniach nie odnotowano

wpływu kadmu na aktywność innych enzymów stresu oksydacyjnego,

tj. dysmutazy ponadtlenkowej i katalazy [55].

Małgorzata Margas

158

Wpływ arsenu na aktywność APX w siewkach rukwi wodnej (Nasturtium

officinale R.) zanotował Namdjoyana i wsp., przy czym generalnie wyższe

wartości aktywności zaobserwował w korzeniach siewek w porównaniu do

łodyg [56]. Ponadto zwiększenie aktywności peroksydazy askorbinianowej

udowodniono w siewkach Lablab purpureus L. pod wpływem jonów

cynku [57].

4.4. Niedobór pierwiastków

Niedobór pierwiastków, niezbędnych w rozwoju i procesach fizjo-

logicznych roślin może przyczyniać się do wystąpienia stresu oksy-

dacyjnego u roślin. W badaniach przeprowadzonych przez Rubio-Wilhelmi

i wsp. niedobór azotu spowodował wzrost aktywności peroksydazy gwaja-

kolowej w liściach tytoniu (Nicotiana tabaccum L.) [58]. Wzrost aktywności

peroksydazy gwajakolowej odnotowano również przy niedoborze jonów

żelaza. Niedobór tego pierwiastka spowodowany był obecnością NaHCO3,

tworzącego z Fe związek chelatowy [59].

4.5. Stres solny

Nadmierne zasolenie jest jedną z głównych przyczyn spadku

wydajności upraw [60, 61]. Szacuje się, że około 7% gruntów rolnych na

świecie wykazuje nadmierne zasolenie [62]. Za szczególnie wrażliwe na

stres solny uznano rośliny strączkowe [63, 64]. W badaniach z wyko-

rzystaniem liści fasolki mung (Vigna radiata L.) zanotowano spadek

aktywności enzymów stresu oksydacyjnego, w tym APX pod wpływem

NaCl [65]. Odmienny efekt zanotowano w przypadku liści siewek fasoli

zwyczajnej Phaseolus vulgaris L. Howladar zaobserwował wzrost

aktywności enzymów stresu oksydacyjnego, w tym peroksydazy

gwajakolowej pod wpływem chlorku sodu [66]. Podobny wynik uzyskano

w siewkach sałaty siewnej (Lactuca sativa L.), gdzie zanotowano wzrost

aktywności APX pod wpływem stresu solnego [67].

4.6. Leki

W ostatnich latach obecność farmaceutyków w środowisku stanowi

narastający problem, ich obecność wykrywa się w wodzie i glebie [68, 69,

70, 71]. Udowodniono zdolność do pobierania przez różne gatunki roślin

chemioterapeutyków z gleby [72, 73, 74, 75].

W badaniach przeprowadzonych na siewkach pałki szerokolistnej

(Typha latifolia L.) wykazano, że pod wpływem diklofenaku aktywność

peroksydazy gwajakolowej w korzeniach wzrosła już pierwszego dnia po

ekspozycji na chemioterapeutyk i podnosiła się w kolejnych dniach analizy.

W liściach siewek natomiast zanotowano wzrost aktywności GPOX tylko



159

po pierwszym dniu ekspozycji. Dla porównania, poziom aktywności APX

w korzeniach pod wpływem diklofenaku nie zmienił się, zaś podniósł się

w łodygach siewek [76].

An i wsp. zaobserwowali wzrost aktywności peroksydazy w liściach

siewek (Triticum aestivum L.) pod wpływem paracetamolu po 14 dniach

ekspozycji. Wykazano zależność między stężeniem paracetamolu a poziomem

aktywności enzymu [77].

5. Pomiar aktywności peroksydazy w badaniach tolerancji roślin

na stres

Pomiaru aktywności enzymów stresu oksydacyjnego dokonuje się

w celu ustalenia, czy dany czynnik odgrywa rolę w nabywaniu odporności

na niektóre stresory.

Chongchatuporn i wsp. wykazali, że w ekstraktach z owoców mango,

odmian bardziej odpornych na stres poziom aktywności POX był znacznie

wyższy w porównaniu z ekstraktem otrzymanym z odmian wrażliwszych [78].

Wzrost poziomu ekspresji genu peroksydazy askorbinianowej notuje się

w przypadku wystąpienia niekorzystnych czynników jak susza, zbyt duże

zasolenie. Doniesienia wskazują na wzrost odporności na niską temperaturę

i nadmierne zasolenie związane z nadekspresją genu APX w pomidorze

oraz ryżu [79, 80].

Wzrost odporności na stres solny roślin wykazał Kaur i Nayyar [64].

W doświadczeniu aplikacja selenu do uprawy Vigna radiata L. poddanej

uprzednio działaniu NaCl spowodowała wzrost aktywności APX oraz GPX

w liściach.

Z tolerancją na stres solny może być związana również obecność

symbiotycznych bakterii brodawkowych. W badaniach przeprowadzonych

przez Garcia–Cristobal i wsp. wykazano związek ryzobakterii (PGPR

– Plant Growth Promoting Rhizobacteria) z tolerancją na stres solny siewek

Oryza sativa L. Zanotowano szczególny wzrost aktywności peroksydazy

askorbinianowej pod wpływem szczepów PGPR, czym można

wytłumaczyć wzrost odporności roślin na podwyższone zasolenie [81].

Podobny efekt wpływu PGPR na odporność roślin na stres solny na

podstawie pomiaru aktywności APX wykazali Morad i Ismail [82].

W badaniach nad wpływem bakterii na tolerancję roślin względem

toksycznego działania cynku wykazano wzrost aktywności GPX w kukurydzy

(Zea mays L.) pod wpływem jonów cynku i Proteus mirabilis [83].

Odporność bobiku (Vicia faba L.) na herbicydy mogą wzmagać niektóre

gatunki symbiotycznych grzybów arbuskularnych. Udowodniono, że szczepy

Glomus intraradices spowodowały wzrost aktywności APX w bobiku,

traktowanego uprzednio parakwatem. Odmienny wynik uzyskano w przy-

Małgorzata Margas

160

padku Glomus mosseae, który nie spowodował zmian w aktywności

peroksydazy askorbinianowej [84].

Podwyższoną aktywność peroksydazy askorbinianowej wykazano

w liściach Cistus salviifolius L. rosnących w ekstremalnie trudnych warunkach

naturalnych. Region, z którego pobrano rośliny (Castelnuovo Val di Cecina,

prowincja Piza, Włochy) bogaty jest w kratery wulkanów, z dużą zawartością

H2S oraz CO2, kwasu borowego, pary wodnej, o bardzo niskim pH (pH = 1,13)

i wysoką temperaturą gleby. Wzrost aktywności APX oraz innych enzymów

antyoksydacyjnych autor tłumaczy rolą ochronną, jaką pełnią w przysto-

sowaniu do niekorzystnych warunków środowiska [65].

W przypadku indukcji suszy oraz podwyższonej temperatury w Jatropha

curcas L. uzyskano dla każdego przypadku dwukrotny wzrost aktywności

APX. Co więcej, w przypadku zastosowania obu stresorów równocześnie,

poziom aktywności APX podniósł się w liściach o 300% [49].

6. Wady stosowania pomiaru aktywności peroksydazy

Istnienie różnych cząstek zakłócających i modyfikujących aktywność

peroksydazy gwajakolowej w ekstraktach roślinnych może zaburzać prawid-

łową interpretację wyników pomiaru aktywności tego enzymu. Przykładowo,

egzogenne utleniacze, takie jak kwas askorbinowy, powodują hamowanie

aktywności peroksydazy. Badania wykazały zahamowanie aktywności perok-

sydazy do 90% po dodaniu różnych stężeń kwasu askorbinowego do ekstraktu

z korzenia pomidora [85, 86]. Stosowanie dodatku jonów metali, np. miedzi,

tworzących kompleks z kwasem askorbinowym w pewnych warunkach

przywraca efektywny i skuteczny pomiar aktywności peroksydazy [87, 88].

Wzrost poziom aktywności enzymów stresu oksydacyjnego nie musi być

równoznaczne ze wzrostem natężenia czynnika wywołującego stres oksy-

dacyjny. Przykładowo w badaniach z wykorzystaniem liści cytryny wykazano,

iż pod wpływem długotrwałego przechowywania w tempe-raturze 4°C poziom

aktywności peroksydazy gwajakolowej w liściach młodych był znacznie

wyższy w porównaniu do liści starszych. Co więcej, aktywność POX

w liściach starszych spadała wraz ze wzrostem czasu przechowywania [89].

Islam i wsp. wykazali wzrost aktywności niektórych enzymów stresu

oksydacyjnego, tj. dysmutazy ponadtlenkowej oraz katalazy po traktowaniu

Zea mays bakterią Proteus mirabilis po uprzedniej ekspozycji roślin na jony

cynku. Wzrost aktywności tych enzymów świadczy o nabyciu tolerancji na

toksyczne działanie cynku przez roślinę. Aktywność peroksydazy gwaja-

kolowej nie uległa jednak w przeciwieństwie do innych enzymów zmianie pod

wpływem drobnoustroju, nie była więc w tym przypadku dobrym wskaź-

nikiem oceny nabycia tolerancji na stres [83].



161

7. Wnioski

Pomiar aktywności enzymów z grupy peroksydaz w badaniach naukowych

jest w większości przypadków skuteczną metodą oceny poziomu stresu

w roślinie. Jako wskaźnik stresu oksydacyjnego z powodzeniem może być

stosowany dla różnych gatunków roślin poddawanych działaniu wielu

stresorom o różnorodnym natężeniu i w różnych warunków.

Analiza aktywności peroksydazy bywa metodą niewystarczającą do

oceny tolerancji roślin na stresory. W celu uzyskania wiarygodnych

wyników badań z użyciem tkanek roślinnych pomiar peroksydaz wymaga

uzupełnienia analizami innych enzymów stresu oksydacyjnego.

Sztucznie indukowany stres roślin w warunkach laboratoryjnych może

stanowić częściowe odzwierciedlenie rzeczywistego stanu fizjologicznego

roślin, rosnących w warunkach naturalnych.

Literatura

1. Gill S. S., Tuteja N., Polyamines and abiotic stress tolerance in plants, Plant

Signal & Behavior, 5 (1) (2010), s. 26-33

2. Jaspers P., Kangasjärvi J., Reactive oxygen species in abiotic stress signaling,

Physiologia Plantarum, 138 (2010), s. 405-413

3. Mordecai E. A., Pathogen impacts on plant communities: Unifying theory,

concepts, and empirical work, Ecological Monographs, 81 (2011), s. 429-441

4. Maron J. L.; Crone E., Herbivory: Effects on plant abundance, distribution

and population growth, Proceedings of the Royal Society B: Biological

Science, 273 (2006), s. 2575-2584

5. Maron J. L.; Kauffman M., Habitat-specific consumer impacts on plant

population dynamics, Ecology, 87 (2006), s. 113-124

6. Li P. M., Ma F. W., Different effects of light irradiation on the photosynthetic

electron transport chain during apple tree leaf dehydration, Plant Physiology

and Biochemistry, 55 (2012), s. 16-22

7. Liu F., Ying G. G., Tao R., Zhao J. L., Yang J. F., Zhao L. F., Effects of six

selected antibiotics on plant growth and soil microbial and enzymatic

activities, Environmental Pollution, 157 (2009), s. 1636-1642

8. García-Cristobal J., García-Villaraco A., Ramos B., Gutierrez-Manero J.,

Lucas J. A., Priming of pathogenesis related-proteins and enzymes related

to oxidative stress by plant growth promoting rhizobacteria on rice plants

upon abiotic and biotic stress challenge, Journal of Plant Physiology,

188 (2015), s. 72-79

9. Mahajan S., Tuteja N., Cold, salinity and drought stresses: An overview,

Archives of Biochemistry and Biophysics, 444 (2005), s. 139-58

10. Fujita M., Fujita Y., Noutoshi Y., Takahashi F., Narusaka Y., Yamaguchi-

Shinozaki K., Shinozaki K., Crosstalk between abiotic and biotic stress

responses: a current view from the points of convergence in the stress

signaling networks, Current Opinion in Plant Biology, 9 (2006), s. 436-42

Małgorzata Margas

162

11. Alcázar R., Marco F., Cuevas J. C., Patron M., Ferrando A., Carrasco P.,

Tiburcio A. F., Altabella T., Involvement of polyamines in plant response

to abiotic stress, Biotechnology Letters, 28 (2006), s. 1867-1876

12. Cramer G. R., Urano K., Delrot S., Pezzotti M., Shinozaki K., Effects

of abiotic stress on plants: a systems biology perspective, BMC Plant Biology,

11 (2011), s. 163

13. Krasensky J., Jonak C., Drought, salt, and temperature stress-induced

metabolic rearrangements and regulatory networks, Journal of Experimental

Botany, 63 (2012), s. 1593-1608

14. Møller I. M., Sweetlove L. J., ROS signalling – specificity is required, Trends

in Plants Science, 15 (2012), s. 370-374

15. Dimitrov Petrov V., van Breusegem F., Hydrogen peroxide- a central hub

for information flow in plant cells, AoB Plants, pls 014 (2012), s. 1-13

16. Cona A., Rea G., Angelini R., Federico R., Tavladoraki P., Functions of amine

oxidases in plant development and defense, Trends in Plants Science,

11 (2006), s. 80-88

17. Gapper C., Dolan L., Control of plant development by reactive oxygen species,

Plant Physiology, 141 (2006), s. 341-345

18. Kim M. S., Kim H. S., Kim Y. S., Baek K. H., Oh H. W., Hahn K. W., Bae R.

N., Lee I. J., Joung H., Jeon J. H., Superoxide anion regulates plant growth

and tuber development of potato, Plant Cell Reports, 26 (2007), s. 1717-1725

19. Mittler R., Vanderauwera S., Suzuki N., Miller G., Tognetti V. B., Vandepoele

K., Gollery M., Shulaev V., Van Breusegem, F., ROS signaling: the new

wave?, Trends in Plants Science, 16 (2011), s. 300-309

20. Kartashov A. V., Radyukina N. L., Ivanov Y. V., Pashkovskii P. P.,

Shevyakova N. I., Kuznetsov V. V., Role of antioxidant systems in wild plant

adaptation to salt stress, Russian Journal of Plant Physiology, 55 (2008),

s. 463-468

21. Gechev T. S., Hille L., Hydrogen peroxide as a signal controlling plant

programmed cell death, The Journal of Cell Biology, 168 (2005), s. 17-20

22. Groppa M. D., Benavides M. P., Polyamines and abiotic stress: recent

advances, Amino Acids, 34 (2008), s. 35-45

23. Gratão P. L., Polle A., Lea P. J., Azevedo R. A., Making the life of heavy

metal-stressed plants a little easier, Functional Plant Biology, 32 (2005),

s. 481-494

24. Halliwell B., Gutteridge M. J. C., Free Radicals in Biology and Medicine,

Oxford University Press, London 2007

25. Sherwin H. W., Farrant J. M., Protection mechanism against excess light in

the resurrection plants Craterostigma wilmsii and Xerophyta viscose, Plant

Growth Regulation, 24 (1998), s. 203-210

26. Ray C., Dutta S., Sarkar S., Sahoo R., Roy A., Pal T., Intrinsic peroxidase-

like activity of mesosporus nickel oxide for selective cysteine sensing, Journal

of Materials Chemistry. B, 2 (2014), s. 6097-6105

27. Martínez A. T., Ruiz-Dueñas F. J., Martínez M. J., del Río J. C., Gutíerrez A.,

Enzimatic delignification of plant cell wall: from nature to mill, Current

Opinion in Biotechnology, 20 (2009), s. 348-357



163

28. Passardi F., Bakalovic N., Teixeira F. K., Pinheiro-Margis M., Penel C.,

Dunand C., Prokaryotic origins of the peroxidase superfamily and organellar-

mediated transmission to eukaryotes, Genomics, 89 (2007), s. 567-579

29. Almagro L., Gomez Ros L. V., Belchi-Navarro S., Bru R., Ros Barcelo A.,

PedreÑo M. A., Class III peroxidases in plant defencereactions, Journal

of Experimental Botany, 60(2) (2009), s. 377-390

30. Bae Y. A., Cai G. B., Kim S. H., Zo Y. G., Kong Y., Modular evolution

of glutathione peroxidase genes in association with different biochemical

properties of their encoded proteins in invertebrate animals, BMC

Evolutionary Biology, 9 (2009), s. 1-13

31. Miao Y. C., Lv D., Wang P. C., Wang X. C., Chen J., Miao C., Song C. P.,

An Arabidopsis glutathione peroxidase functions as both a redox-transducer

and a scavenger in abscisic acid and drought stress responses, Plant Cell,

18 (2006), s. 2749-2766

32. Yang X. D., Dong C. J., Liu J. Y., A plant mitochondrial phospholipid

hydroperoxide glutathione peroxidase: its precise localization and higher

enzymatic activity, Plant Molecular Biology, 62(2006), s. 951-962

33. Chen S., Vaghchhipawala Z., Li W., Asard H., Dickman M. B., Tomato

phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase inhibits cell death induced

by Bax and oxidative stresses in yeast and plants, Plant Physiology,

135 (2004), s. 1630-1641

34. Slesak I., Libik M., Karpinska B., Karpinski S., Miszalski Z., The role of hydrogen

peroxide in regulation of plant metabolism and cellular signalling in response

to environmental stresses, Acta Biochimica Polomica, 54 (2007), s. 39-50

35. De Pinto M. C., Locato V., Sgobba A., Romero-Puertas M. D.C., Gadaleta C.,

Delledonne M., de Gara, L., S- nitrosylation of ascorbate peroxidase is part

of programmed cell death signaling in tobacco Bright Yellow-2 cells, Plant

Physiology, 163 (2013), s. 1766-1775

36. Caverzan A.; Passaia G.; Rosa S. B.; Ribeiro C. W.; Lazzarotto F.; Margis-

Pinheiro M., Plant responses to stresses: Role of ascorbate peroxidase in the

antioxidant protection, Genetics and Molecular Biology, 35 (2012), s. 1011-1019

37. Foyer C. H.; Shigeoka S., Understanding oxidative stress and antioxidant

functions to enhance photosynthesis, Plant Physiology, 155 (2011), s. 93-100

38. Noctor G., Foyer C. H., Ascorbate andglutathione: keeping active

oxygenunder control, Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular

Biology, 49 (1998), s. 249-279

39. Doorna W. G., Ketsa S., Cross reactivity between ascorbate peroxidase

and phenol (guaiacol) peroxidase, Postharvest Biology and Technology,

95 (2014), s. 64-69

40. Garcia-Reyes J. F., Ferrer C., Thurman E. M., Fernandez-Alba A. R., Analysis

of Herbicides in Olive Oil by Liquid Chromatography Time-of-Flight Mass Spec-

trometry, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54 (2006), s. 6493-6500

41. U.S.E.P.A., Pesticides and Industry Sales and Usage - 2006 and 2007 Market

Estimates, Bulletin #EPA., 733-R-11-001, 2011

42. Roberts J., Kumar A., Du J., Hepplewhite C., Ellis D. J., Christy A. G., Beavis

S. G., Pharmaceuticals and personal care products (PPCPs) in Australia's

Małgorzata Margas

164

largest inland sewage treatment plant, and its contribution to a major

Australian river during high and low flow, Science of the Total Environment,

541 (2016), s. 1625-1637

43. Hana V., Chena Y., Yina S., Hanga M., Wanga W., Over-expression

of TaEXPB23, a wheat expansin gene, improves oxidative stress tolerance

in transgenic tobacco plants, Journal of Plant Physiology, 173 (2015), s. 62-71

44. Bressano M., Curetti M., Giachero L., Vargas Gil S., Cabello M., March G.,

Ducasse D. A., Luna C. M., Mycorrhizal fungi symbiosis as a strategy against

oxidative stress in soybean plants, Journal of Plant Physiology, 167 (2010),

s. 1622-1626

45. Duan M., Feng H. L., Wang L. Y., Li D., Meng Q. W., Overexpression

of thylakoidal ascorbate peroxidase shows enhanced resistance to chilling

stress in tomato, Journal of Plant Physiology, 169 (2012), s. 867-877

46. He S. Y., Zhang G. C., Yu Y. Q., Li R. G., Yang Q. R., Effects of vacuum

cooling on the enzymatic antioxidant system of cherry and inhibition

of surface-borne pathogens, International Journal of Refrigeration, 36 (2013),

s. 2387-2394

47. Högy P., Poll C., Marhan S., Kandeler E., Fangmeier A., Impacts

of temperature increase and change in precipitation pattern on crop yield

and yield quality of barley, Food Chemistry, 136 (2013), s. 1470-1477

48. Ferreira-Silvaa S. L., Voigt E. L., Silvaa E. N., Maia J. M., de Vasconcelos

Fontenelea A., Silveira J. A. G., High temperature positively modulates

oxidative protection in salt-stressed cashew plants, Environmental and

Experimental Botany, 74 (2011), s 162-170

49. Silvaa E. N., Ferreira- Silvaa S. L., de Vasconcelos Fontenelea A., Ribeiro R.

V., Viégas R. A., Silveiraa J. A. G., Photosynthetic changes and protective

mechanisms against oxidative damage subjected to isolated and combined

drought and heat stresses in Jatropha curcas plants, Journal of Plant

Physiology, 167 (2010), s. 1157-1164

50. Vanhoudt N., Cuypers A., Horemans N., Remans T., Opdenakker K., Smeets

K., Bello D. M., Havaux M., Wannijn J., Van Hees M., Vangronsveld J.,

Vandenhove H., Unraveling uranium induced oxidative stress related

responses in Arabidopsis thaliana seedlings. Part II: responses in the leaves

and general conclusions, Journal of Environmental Radioactivity, 102

(2011a), s. 638-645

51. Saenen E., Horemans N., Vanhoudt N., Vandenhove H., Biermans G.,

van Hees M., Wannijn J., Vangronsveld J., Cuypers A., Oxidative stress

responses induced by uranium exposure at low pH in leaves of Arabidopsis

thaliana plants, Journal of Environmental Radioactivity, 150 (2015), s. 36-43

52. Cuypers A., Smeets K., Ruytinx J., Opdenakker K., Keunen E., Remans T.,

Horemans N., Vanhoudt N., Sanden S. V., Belleghem F. V., Guisez Y.,

Colpaert J., Vangronsveld J., The cellular redox state as a modulator in

cadmium and copper responses in Arabidopsis thaliana seedlings, Journal

of Plant Physiology, 168 (2011), s. 309-316

53. Saenen E., Horemans N., Vanhoudt N., Vandenhove H., Biermans G.,

van Hees M., Wannijn J., Vangronsveld J., Cuypers A., Effects of pH



165

on uranium uptake and oxidative stress responses induced in Arabidopsis

thaliana, Environmental Toxicology and Chemistry, 32 (2013), s. 2125-2133

54. Vanhoudt N., Vandenhove H., Smeets K., Remans T., Van Hees M., Wannijn

J., Vangronsveld J., Cuypers A., Effects of uranium and phosphate

concentrations on oxidative stress related responses induced in Arabidopsis

thaliana, Plant Physiology Biochemistry, 46 (2008), s. 987-996

55. Smeets K., Ruytinx J., Semane B., Van Belleghem F., Remans T., Van Sanden

S., Vangronsveld J., Cuypers A., Cadmium-induced transcriptional

and enzymatic alterations related to oxidative stress, Environmental

and Experimental Botany, 63 (2008), s. 1-8

56. Namdjoyan S., Kermanian H., Exogenous nitric oxide (as sodium

nitroprusside) amelioratesarsenic-induced oxidative stress in

watercress(Nasturtium officinale R. Br.), Scientia Horticulturae, 161 (2013),

s. 350-356

57. Myrene R., Souza D., Devaraj V. R., Induction of oxidative stress

and antioxidative mechanism in Hyacinth bean under zinc stress, African Crop

Science Journal, 20 (1) (2012), s. 17-29

58. Rubio-Wilhelmi M. M., Sanchez-Rodriguez E., Rosales M. A., Begona B.,

Rios J. J., Romeroa L., Blumwaldb E., Ruiz J. M., Effect of cytokinins on

oxidative stress in tobacco plants under nitrogen deficiency, Environmental

and Experimental Botany, 72 (2011), s. 167-173

59. Molassiotis A. N., Diamantidis G. C., Therios I. N., Tsirakoglou V., Dimassi

K. N., Oxidative stress, antioxidant activity and Fe(III)-chelate reductase

activity of five Prunus rootstocks explants in response to Fe deficiency, Plant

Growth Regulation, 46 (2005), s. 69-78

60. Parida A. K., Das A. B., Salt tolerance and salinity effects on plants: a review,

Ecotoxycology and Environmental Safety, 60 (2005), 324-349

61. Gupta B., Huang B., Mechanism of salinity tolerance in plants: physiological,

biochemical, and molecular characterization, International Journal

of Genomics, 2014 (2014), s 1-18

62. Panta S., Flowers T., Lane P., Doyle R., Haros G., Shabala S., Halophyte

agriculture: success stories, Environmental and Experimental Botany,

107(2014), s.71-83

63. Turner N. C., Colmer T. D., Quealy J., Pushpavalli R., Krishnamurthy L.,

Kaur J., Singh G., Siddique K. H. M., Vadez V., Salinity tolerance and ion

accumulation in chickpea (Cicer arietinum L.) subjected to salt stress, Plant

Soil, 365 (2013), s. 347-361

64. Kaur S., Nayyar H., Selenium fertilization to salt-stressed mungbean (Vigna

radiata L. Wilczek) plants reduces sodium uptake, improves reproductive

function, pod set and seed field. Scientia Horticulturae,

doi:10.1016/j.scienta.2015.09.048

65. Bartoli G., Bottega S., Forino L. M. C., Ciccarelli D., Spano C., Plant adaptation

to extreme environments: The example of Cistus salviifolius of an active

geothermal alteration field, C. R. Biologies, 337 (2014), s. 101-110

Małgorzata Margas

166

66. Howladar S. M., A novel Moringa oleifera leaf extract can mitigate the stress effects of salinity and cadmium in bean (Phaseolus vulgaris L.) plants, Ecotoxicology and Environmental Safety, 100 (2014), s. 69-75

67. Leyva R., Sánchez-Rodríguez E., Ríos J. J., Rubio-Wilhelmi M. M., Romero L., Ruiz J. M., Blanco B., Beneficial effects of exogenous iodine in lettuce plants subjected to salinity stress, Plant Science, 181 (2011), s. 195-202

68. Kummerrer K., Pharmaceuticals in environment, Annual Review of Environment, 35 (2010), s. 57-75

69. Daghrir R., Drogui P., Tetracycline antibiotics In the environment: a review, Environmental Chemistry Letters, 11 (2013), s. 209-227

70. Ma Y., Li M., Wu M., Li Z., Liu X., Occurrences and regional distributions of 20 antibiotics in water bodies during groundwater recharge, Science of the Total Environment, 518-519 (2015), s. 498-506

71. Roberts J., Kumar A., Du J., Hepplewhite C., Ellis D. J., Christy A. G., Beavis S. G., Pharmaceuticals and personal care products (PPCPs) in Australia's largest inland sewage treatment plant, and its contribution to a major Australian river during high and low flow, Science of the Total Environment, 541 (2016), s. 1625-1637

72. Wu C., Spongberg A. L., Witter J. D., Fang M., Czajkowski K. P., Uptake of pharmaceutical and personal care products by soybean plants from soils applied with biosolids and irrigated with contaminated water, Environmental Science and Technology, 44 (2010), s. 6157-6161

73. Tanoue R., Sato Y., Motoyamam M, Nakagawam S, Shinohara R., Nomiyama K., Plant uptake of pharmaceutical chemicals detected in recycled organic manure and reclaimed wastewater, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 60 (2012), s. 10203-11021

74. Dodgen L. K., Li J., Parker S., Gan J. J., Uptake and accumulation of four PPCP/ EDCs in two leafy vegetables, Environmental Pollution, 182 (2013), s. 150-156

75. Dolliver H., Kumar K., Gupta S., Sulfamethazine uptake by plants from manure-amended soil, Journal of Environmental Quality, 36 (2007), s.1224-1230

76. Bartha B., Huber C., Schröder P., Uptake and metabolism of diclofenac in Typha latifolia – How plants cope with human pharmaceutical pollution, Plant Science, 227 (2014), s. 12-20

77. An J., Zhoua Q., Suna F., Zhanga L., Ecotoxicological effects of paracetamol on seed germination and seedling development of wheat (Triticum aestivum L.), Journal of Hazardous Materials, 169 (2009), s. 751-757

78. Chongchatuporn U., Ketsa S., van Doorn, W. G., Chilling injury in mango (Mangifera indica) fruit peel: relationship with ascorbic acid concentrations and antioxidant enzyme activities, Postharvest Biology and Technology, 86 (2013), s. 409-417

79. Wang Y., Wisniewski M., Meilan R., Cui M., Webb R., Fuchigami L., Overexpression of cytosolic ascorbate peroxidase in tomato confers tolerance to chilling and salt stress, Journal of the American Society for Horticultural Science, 130 (2005), s. 167-173

80. Sato Y., Masuta Y., Saito K., Murayama S., Ozawa K., Enhanced chilling tolerance at the booting stage in rice by transgenic overexpression of the ascorbate peroxidase gene OsAPXa, Plant Cell Reports, 30 (2011), s. 399-406



167

81. García-Cristobal J., García-Villaraco A., Ramos B., Gutierrez-Manero J., Lucas J.A., Priming of pathogenesis related-proteins and enzymes related to oxidative stress by plant growth promoting rhizobacteria on rice plants upon abiotic and biotic stress challenge, Journal of Plant Physiology, 188 (2015), s. 72-79

82. Moradi F., Ismail A. M., Responses of photosynthesis, chlorophyll fluorescence and ROS-scavenging systems to salt stress during seedling and reproductive stages in rice, Annals of Botany, 99 (2007), s. 1161-1173

83. Islam F., Yasmeen T., Riaz M., Arif M., Ali S., Raza S. H., Proteus mirabilis alleviates zinc toxicity by preventing oxidative stress in maize (Zea mays) plants, Ecotoxicology and Environmental Safety, 110 (2014), s. 143-152

84. Bressano M., Curetti M., Giachero L., Vargas Gil S., Cabello M., March G., Ducasse D. A., Luna C. M., Mycorrhizal fungi symbiosis as a strategy against oxidative stress in soybean plants, Journal of Plant Physiology, 167 (2010), s. 1622-1626

85. Talano M. A., Agostini E., Wevar Oller A. N., Medina M. I., Milrad de

Forchetti S. R., Modulator role of ascorbic acid on coniferyl alcohol oxidation by a basic peroxidase from tomato hairy roots, Plant Science, 175 (2008), s. 724-730

86. Reszka K. J., Wagner B. A., Burns C. P., Britigan B. E., Effects of peroxidase substrates on the Amplex red/peroxidase assay: antioxidant properties of anthracyclines, Analytical Biochemistry, 342 (2005), s. 327-337

87. Unaleroglu C., Mert H., Zumreglu-Karan B., Synthesis and Characterization of Copper Ascorbate, Synthesis and Reactivity in Inorganic, Metal- Organic and Nano- Metal Biochemistry, 31 (2001), s. 1531-1543

88. Samocha-Bonet D., Dov Lichtenberg I., Ilya Pinchuk J., Kinetic studies of copper-induced oxidation of urate, ascorbate and their mixtures, Journal of Inorganic Biochemistry, 99 (2005), s. 1963-1972

89. Wongsheree T., Ketsa S., van Doorn W. G., The relationship between chilling injury and membrane damage in lemon basil (Ocimum citriodorum) leaves, Postharvest Biology and Technology, 51 (2009), s. 91-96

Zastosowanie pomiaru aktywności peroksydazy w analizie poziomu

stresu oksydacyjnego u roślin)

Streszczenie

Stresy środowiskowe powodują wzmożoną produkcję reaktywnych form tlenu (RFT) w komórkach. Nagromadzenie RFT w komórkach może być przyczyną uszkodzenia

komponentów komórkowych, m.in. DNA, białek, chlorofilu, czy programowanej śmierci

komórki. W tkankach roślinnych peroksydazy stanowią grupę kluczowych enzymów,

zaangażowanych w wiele procesów fizjologicznych. Mają właściwości unieczynniania reaktywnych form tlenu. Prowadzone są liczne badania, związane z wpływem stresorów na

aktywność peroksydazy. Analizy dotyczą wielu gatunków roślin po zastosowaniu

czynników o różnym nasileniu, m.in. temperatury, stresu solnego, jonów metali, leków, czy

herbicydów. Pomiar aktywności enzymów z grupy peroksydaz w badaniach naukowych jest w większości przypadków skuteczną metodą oceny poziomu stresu w roślinie, a także oceny

tolerancji roślin na stres. W celu uzyskania wiarygodnych wyników badań z użyciem tkanek

roślinnych pomiar peroksydaz wymaga uzupełnienia analizami innych enzymów stresu

oksydacyjnego.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kinetic%20studies%20of%20copper-induced%20oxidation%20of%20urate%20ascorbate%20and%20their%20mixtures

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kinetic%20studies%20of%20copper-induced%20oxidation%20of%20urate%20ascorbate%20and%20their%20mixtures

Małgorzata Margas

168

The role of peroxidase activity measurement in analyses of oxidative

stress level in plant tissues

Abstract

Environmental stresses cause an increased production of reactive oxygen species (ROS) in cells. The accumulation of ROS in the cells can cause damage to cellular components,

including DNA, proteins, chlorophyll, or programmed cell death in plant tissues.

Peroxidases are a group of key enzymes involved in many physiological processes. They

have the properties of inactivation of reactive oxygen species. There are numerous studies about the effects of stressors on the peroxidase activity. Analysis of the various species

of plants after exposition to the stress factors of varying severity, including temperature, salt

stress, metal ions, medicines, or herbicides. In most cases measurement of the activity from

the group of peroxidases in research is an effective method to assess the level of stress in a plant, and to estimete the tolerance of plants to stress. In order to obtain reliable results

of studies on plant tissue, measurement of peroxidases activity requires the complete

analysis of other enzymes of oxidative stress.

169

Małgorzata Jurak1, Agnieszka Ewa Wiącek, Emil Chibowski

Rola cholesterolu w enzymatycznej hydrolizie

modelowych membran zbudowanych

z fosfolipidu DOPC

1. Wstęp

Membrany biologiczne opisuje model płynnej mozaiki, który uwzględnia

swobodną dyfuzję lateralną składników w obrębie błony. Determinuje ona

powstanie obszarów (domen, tratw) wzbogaconych lub zubożonych

w poszczególne komponenty w wyniku separacji faz. Domeny należy

rozumieć jako obszary uporządkowania cząsteczek, w których dominują

lipidy jednego rodzaju. Tworzenie domen lipidowych stanowi kluczową

rolę w przebiegu wielu procesów biologicznych, takich jak ekspresja

genów, biogeneza i podział komórek, czy wiązanie i aktywacja enzymów.

Poznanie zależności pomiędzy właściwościami domen, a funkcjami

enzymów działających w obszarze błon stanowi wyzwanie w dziedzinie

biologii membran.

Zastosowanie modelowych układów błon biologicznych utworzonych

z jednorodnych lipidów, jak również ich mieszanin, jest pomocne

w określaniu organizacji (struktury) membran i domen lipidowych w skali

nanometrów [1]. Zależnie od rodzaju lipidów i ich wzajemnej proporcji

rozmiary domen mogą ulegać zmianie. Istotnym składnikiem może być tu

cholesterol, który moduluje fizyczne właściwości modelowych błon biolo-

gicznych. Jest regulatorem uporządkowania membran oraz ich płynności.

Obecność cholesterolu w biologicznych membranach zwiększa ich

stabilność, a jednocześnie zmniejsza przepuszczalność w stosunku do wody

i innych cząsteczek [2, 3]. Jeśli jednak zawartość cholesterolu przekracza

jego maksymalną rozpuszczalność w biwarstwie, nadmiar cholesterolu

wytrąca się [4, 5]. Domeny cholesterolowe odgrywają ważną rolę fizjo-

logiczną, np. utrzymują przezroczystość soczewek ocznych chroniąc przed

zaćmą [6]. W soczewkach, w następstwie starzenia się organizmu,

następuje wzrost ilości cholesterolu w stosunku do ilości fosfolipidów [7].

Segregacja lipidów w domeny wydaje się istotna dla optymalnego

funkcjonowania protein, regulowania ich aktywności, wskazując na poten-

1 [email protected], Zakład Zjawisk Międzyfazowych, Katedra Chemii

Fizycznej, Wydział Chemii UMCS, www.umcs.pl

Małgorzata Jurak, Agnieszka Ewa Wiącek, Emil Chibowski

170

cjalną rolę domen w przekazywaniu sygnałów międzykomórkowych.

Dlatego też stechiometria składu lipidowego istotnie wpływa na separację

faz w modelowych membranach. Tworzenie domen może determinować

biochemiczną hydrolizę lipidów katalizowaną przez enzymy, dla których

granice domen odgrywają rolę punktów inicjujących ich pracę [8].

Przedstawicielami enzymów aktywnych na granicach faz są fosfolipazy

należące do grupy enzymów lipolitycznych. W zależności od specy-

ficzności hydrolizy wiązań estrowych wyróżnia się fosfolipazę A1, A2, C

i D. Szczególnym zainteresowaniem badaczy cieszy się fosfolipaza A2

(PLA2), która katalizuje hydrolizę fosfolipidów w pozycji sn-2 prowadząc

do uwolnienia kwasu tłuszczowego i lizofosfolipidu, zmieniając tym

samym skład membrany (rys. 1).

Rysunek 1. Schemat reakcji hydrolizy biwarstwy fosfolipid/cholesterol (DOPC/Chol)

zachodzącej w obecności fosfolipazy A2 (PLA2), gdzie DOPC oznacza 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę, Chol – cholesterol, OA – kwas oleinowy, Lizo-PC – 1-oleoilo-2-hydroksy-sn-

glicero-3-fosfocholinę. Lizo-PC przenika do roztworu, podczas gdy kwas oleinowy OA pozostaje

w biwarstwie [opracowanie własne]

Fosfolipazy A2 przyciągają uwagę naukowców ze względu na ich rolę

w metabolizmie lipidów czy przekazywaniu sygnałów; procesów specy-

ficznych dla danego rodzaju tkanek. Fosfolipazy A2 uczestniczą w różnego

rodzaju stanach patologicznych występujących u ludzi, włączając stany

zapalne czy zmiany nowotworowe. Odkryto podwyższony poziom

ekspresji i aktywności wydzielniczej PLA2 w tkankach nowotworowych, co

sugeruje kluczową rolę tego enzymu w progresji guza, jak również

w terapii antynowotworowej [9, 10]. Ponadto, nadmierne wydzielanie

PLA2 towarzyszy zmianom miażdżycowym [11]. W tym kontekście,

cholesterol wydaje się być kluczowym lipidem w regulacji aktywacji PLA2

w biomembranach, choć sam nie ulega rozkładowi. Jednakże hydroliza

Rola cholesterolu w enzymatycznej hydrolizie modelowych membran

zbudowanych z fosfolipidu DOPC

171

fosfolipidów katalizowana PLA2 prowadzi do zmian struktury domen

i sprzyja tworzeniu błon o podwyższonej zawartości cholesterolu.

2. Cel pracy

Celem niniejszej pracy było określenie wpływu ilości cholesterolu

(Chol) w biwarstwie fosfolipidu 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny

(DOPC) na przebieg procesu jej hydrolizy w obecności fosfolipazy A2

w dwóch różnych temperaturach 20˚C i 37˚C. Warstewki utworzono

metodą Langmuira-Blodgett/Schaefera (LB/S) [12, 13] na powierzchni

miki. Zmiany w strukturze membran wywołane hydrolizą śledzono poprzez

wartości swobodnej energii powierzchniowej i jej składowych. Powyższe

parametry wyznaczono w oparciu o pomiary wstępujących i cofających

kątów zwilżania cieczy różniących się polarnością (wody, formamidu

i dijodometanu) stosując dwa modele oddziaływań międzyfazowych,

tj. model histerezy kąta zwilżania (CAH) [14] oraz model van Ossa i współ.

(LWAB) [15].

Charakterystykę topograficzną warstewek przeprowadzono na podstawie

replik powierzchni filmów otrzymanych techniką mikroskopii sił ato-

mowych (AFM). Uzyskane obrazy analizowano pod względem zmian

chropowatości i innych parametrów topograficznych. Badania umożliwiły

uzyskanie szczegółowych informacji dotyczących procesu hydrolizy

badanych fosfolipidów przy wykorzystaniu międzyfazowej aktywności

fosfolipazy A2 oraz zmian w topografii filmów, które powiązano ze

zmianami parametrów termodynamicznych powierzchni.

3. Materiały i metody

3.1. Materiały

W pracy wykorzystano związki zakupione w firmie Sigma, których

użyto bez dodatkowego oczyszczania: fosfolipid 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-

fosfocholinę (DOPC, syntetyk, 99%), cholesterol (Chol, 99%) oraz

fosfolipazę A2 (PLA2, EC 3.1.1.4) wydzielaną z trzustki wieprzowej,

o aktywności właściwej 31,3 U/mg. Lipidy rozpuszczano w chloroformie

(CHCl3, czysty, POCH S.A.). Sproszkowaną PLA2 rozpuszczano w buforze

TRIS o składzie: 10 mM tris(hydroksymetylo)aminometanu (HOCH2)3CNH2

(99,8 %, Sigma-Aldrich), 5 mM CaCl2 (POCH S.A.) i 10 mM NaCl (POCH

S.A.), który doprowadzano niewielkimi porcjami 1 M HCl lub NaOH

(POCH S.A.) do wartości pH = 8,0. Wartość pH buforu korespondowała

z optymalnym pH, w którym enzym wykazuje największą aktywność.

W ten sposób otrzymano roztwór PLA2 o stężeniu 0,02 U/ml. Roztwory

przygotowano stosując wodę dejonizowaną, otrzymaną z systemu Milli-Q


172

Plus (Millipore) charakteryzującą się przewodnictwem elektrycznym

18,2 MΩcm oraz pH 5,6. Taką samą wodę stosowano jako subfazę dla

monowarstw oraz jako ciecz wzorcową do pomiarów kątów zwilżania.

Pozostałymi cieczami pomiarowymi były formamid (98%, Aldrich)

i dijodometan (99 %, Aldrich). Jako podłoże stałe użyto płatków miki

(Continental Trade) o wymiarach 38 mm x 26 mm x 0,5 mm.

3.2. Preparatyka biwarstw lipidowych na podłożu stałym

Biwarstwy lipidowe jednoskładnikowe i mieszane DOPC/Chol

otrzymano techniką Langmuira-Blodgett/Schaefera (LB/LS) na mice przy

użyciu wanny Langmuira-Blodgett (KSV 2000, Finlandia) wyposażonej

w dwie symetryczne barierki i płytkę Wilhelmiego do pomiaru ciśnienia

powierzchniowego. Najpierw sporządzono chloroformowe roztwory

lipidów (DOPC i Chol) o stężeniu 1 mg/ml. Roztwory dwuskładnikowe

DOPC/Chol o określonym składzie (xChol = 0,25; 0,5; 0,75) przygotowano

z odpowiednich roztworów wyjściowych. Temperatura subfazy (20°C lub

37°C) była utrzymywana przy użyciu termostatu cyrkulacyjnego. Po

doczyszczeniu powierzchni wody nośnik (płytkę miki) umieszczano

w zacisku mechanizmu zanurzającego w pozycji pionowej, prostopadle do

kierunku ruchu barier. Po zanurzeniu nośnika w subfazie w specjalnej

studzience wanny, nanoszono kroplami roztwór lipidu za pomocą

mikrostrzykawki (Hamilton), a po odparowaniu chloroformu (ok. 10 min)

sprężano monowarstwę dzięki ruchom symetrycznych barierek z prędkością

10 mm/min do osiągnięcia zadanej wartości ciśnienia powierzchniowego,

tj. 35 mN/m, które odpowiada ciśnieniu błon biologicznych. Skompresowaną

monowarstwę rozpostartą na granicy faz woda-powietrze przenoszono na ciało

stałe w trakcie wynurzania płytki z wody ze stałą szybkością 5 mm/min

zachowując jednocześnie stałą wartość ciśnienia powierzchniowego.

W celu uzyskania biwarstwy płytkę z uprzednio naniesioną mono-

warstwą (LB) pozostawiono na 15 min w powietrzu, następnie po zamo-

cowaniu próbki w pozycji horyzontalnej, obniżano ją aż do zetknięcia się

z powierzchnią monowarstwy rozpostartej na subfazie wodnej, zachowując

stałą wartość ciśnienia powierzchniowego (technika Langmuira-Schaefera,

LS). Uzyskane biwarstwy LS suszono w suszarce próżniowej (Binder) pod

ciśnieniem 117 mbar w temperaturze 20oC lub 37

oC przez 18-20 h przed

pomiarami kątów zwilżania lub bezpośrednio po przygotowaniu

kontaktowano z roztworem enzymu. W tym celu biwarstwy lipidowe

osadzone na nośniku umieszczano w ściśle zamkniętych pojemnikach

zawierających buforowy roztwór fosfolipazy A2. Próbki inkubowano

w wybranych okresach czasowych, tj. 5 min, 15 min, 30 min, 1 h i 2 h w 20oC

i 37oC. Po wyjęciu badanej próbki z roztworu zanurzano ją trzykrotnie



173

w świeżych porcjach wody z Milli-Q i suszono w suszarce próżniowej

(ok. 117 mbar, 18-20 h), po czym mierzono na niej kąty zwilżania.

Wykonano trzy niezależne serie pomiarowe kątów dla poszczególnych

powierzchni.

3.3. Pomiary kątów zwilżania

Wstępujące i cofające kąty zwilżania zmierzono przy wykorzystaniu

aparatu Contact Angle Meter firmy GBX (Francja) sprzężonego z kompu-

terem i wyposażonego w kamerę oraz oprogramowanie WinDrop++ do

wyznaczania kątów zwilżania z kształtu postawionej kropli. Wstępujące

kąty zwilżania cieczy próbnych: wody, formamidu i dijodo-metanu,

mierzono po postawieniu 3 µL kropel na powierzchni, następnie odciągano

z kropli objętość 1 µL do mikrostrzykawki i mierzono cofające kąty

zwilżania. Pomiary prowadzono w temperaturze 20oC i 37

oC, w atmo-

sferze azotu, w zamkniętej celi pomiarowej o kontrolowanej wilgotności.

Kąty zwilżania odczytywano po lewej i prawej stronie profili kropel

wszystkich trzech cieczy próbnych. Przeprowadzono trzy niezależne serie

pomiarów kątów zwilżania.

3.4. Wyznaczanie swobodnej energii powierzchniowej

Swobodną energię powierzchniową biwarstw nie modyfikowanych

i modyfikowanych enzymatycznie wyznaczono z podejścia zaproponowanego

przez Chibowskiego (histerezy kąta zwilżania, CAH) [14]:

𝛾𝑆𝑡𝑜𝑡 =

𝛾𝐿 1+𝑐𝑜𝑠𝜃𝑎 2

2+𝑐𝑜𝑠𝜃𝑟+𝑐𝑜𝑠𝜃𝑎 (1)

gdzie: γL jest napięciem powierzchniowym cieczy pomiarowej, ζa

określa wstępujący kąt zwilżania, zaś ζr oznacza cofający kąt zwilżania.

W celu weryfikacji wartości obliczonych z modelu CAH zastosowano

także model LWAB opisany przez van Ossa i współ. [15]:

𝛾𝑆𝑡𝑜𝑡 = 𝛾𝑆

𝐿𝑊 + 2 𝛾𝑆−𝛾𝑆

+ (2)

𝑊𝐴 = 𝛾𝐿 1 + 𝑐𝑜𝑠𝜃𝑎 = 2 𝛾𝑆𝐿𝑊𝛾𝐿

𝐿𝑊 + 2 𝛾𝑆+𝛾𝐿

− + 2 𝛾𝑆−𝛾𝐿

+ (3)

gdzie: WA oznacza pracę adhezji cieczy do powierzchni ciała stałego, γL jest

napięciem powierzchniowym cieczy, γSLW

apolarną składową Lifshitza-van der

Waalsa, γS- parametrem elektrono-donorowym, γS

+ parametrem elektrono-

akceptorowym, indeks dolny S oznacza ciało stałe, zaś L ciecz.


174

3.5. Określanie topografii powierzchni

Topografię powierzchni określono przy pomocy mikroskopu sił

atomowych NanoScope V firmy Veeco (USA) dostępnego w Laboratorium

Analitycznym Wydziału Chemii UMCS. Obrazowanie prowadzono

w temperaturze pokojowej w trybie kontaktu przerywanego (tapping mode)

stosując standardowe igły krzemowe (Digital Instruments). Otrzymane

obrazy poddano obróbce i analizie topograficznej korzystając z ogólnie

dostępnego oprogramowania WSxM 5.0 (Develop 8.0 Scanning Probe

Microscope software) [16].

4. Analiza wyników

4.1. Swobodna energia powierzchniowa filmów lipidowych

Wpływ różnej zawartości cholesterolu w biwarstwach DOPC na ich

hydrolizę opisano ilościowo w aspekcie zmian swobodnej energii

powierzchniowej. W celu oszacowania swobodnej energii powierzchniowej

filmów lipidowych nie modyfikowanych i modyfikowanych fosfolipazą A2

(PLA2) w temperaturze 20oC i 37

oC zmierzono wstępujące i cofające kąty

zwilżania cieczy próbnych, oraz zastosowano dwa teoretyczne modele,

tj. model histerezy kąta zwilżania (CAH) zaproponowany przez

Chibowskiego (rów. 1) [14] oraz model van Ossa i współ. (LWAB) (rów.

2, 3) [15]. Jak można zauważyć na rysunkach 2 i 3, całkowita swobodna

energia powierzchniowa i jej składowa elektrono-donorowa określone dla

filmów DOPC/Chol zależą od obecności cholesterolu w biwarstwie

fosfolipidowej i jego ilości względem fosfolipidu.



175

Rysunek 2. Zmiany swobodnej energii powierzchniowej biwarstw DOPC/Chol w wyniku

hydrolizy katalizowanej PLA2 w 20oC i 37oC, obliczone z podejścia CAH i LWAB. Wartości całkowitej energii powierzchniowej oszacowane z modelu CAH są średnią arytmetyczną

wartości obliczonych z histerezy kątów zwilżania wody, formamidu i dijodometanu

Badania eksperymentalne mieszanych monowarstw DOPC/Chol na

granicy faz powietrze/woda wykazały, że cholesterol powoduje wzrost

kondensacji monowarstw [17]. W wyniku kondensacji następuje zwięk-

szenie gęstości upakowania cząsteczek, co indukuje mniejszą przepusz-

czalność biwarstwy. Dlatego też, swobodna energia powierzchniowa

biwarstwy zawierającej xChol = 0,25 jest mniejsza niż określona dla

biwarstwy DOPC (rys. 2). Z drugiej strony rozpuszczalność cholesterolu

w biwarstwach DOPC jest ograniczona do ułamka molowego 0,67±0,02

[18]. Ze wzrostem ilości cholesterolu zmniejsza się kąt nachylenia jego

cząsteczek względem normalnej do biwarstwy i następuje skompresowanie

łańcuchów acylowych fosfolipidu [19]. W konsekwencji, grubość

biwarstwy początkowo rośnie aż do xChol = 0,35, a następnie przy wyższym

ułamku molowym, maleje w efekcie zmian w ułożeniu polarnych grup

DOPC. Gdy maksymalna rozpuszczalność Chol w biwarstwie DOPC

zostanie osiągnięta, łańcuchy acylowe cząsteczek DOPC stają się bardziej

nieuporządkowane [19]. Ponadto po osiągnięciu maksymalnej rozpusz-

czalności, nadmiar Chol wytrąca się z biwarstwy. Wówczas upakowanie

lipidów w biwarstwie staje się mniej uporządkowane [18]. W związku

z tym, zależnie od zawartości Chol w filmach DOPC, zmiany w upako-

waniu, uporządkowaniu i nachyleniu cząsteczek [19] wpływają na

przepuszczalność biwarstwy. Biwarstwy bardziej przepuszczalne są lepiej


176

penetrowane przez cząsteczki cieczy użytych do pomiarów. Dlatego też

ciecze polarne, woda i formamid, mogą łatwiej oddziaływać z cząsteczkami

lipidów poprzez wiązania wodorowe i siły polarne. Dzięki temu obserwuje

się wzrost swobodnej energii powierzchniowej przy xChol = 0,5 i 0,75

w porównaniu do xChol = 0,25.

Na rysunku 2 zaprezentowano wartości całkowitej swobodnej energii

powierzchniowej biwarstw lipidowych w funkcji czasu ich katalizy

enzymatycznej przeprowadzonej w temperaturze 20oC i 37

oC.

Ze wzrostem czasu ekspozycji biwarstw na działanie enzymu obserwuje

się stopniowy wzrost swobodnej energii powierzchniowej. Najwyraźniejsze

zmiany występują w ciągu pierwszych 30 min hydrolizy. Najwyższe

wartości energii otrzymano dla membran DOPC/Chol przy xChol = 0,25

i 0,75, co nie koresponduje z energią nie modyfikowanych filmów, dla

których najniższą wartość energii uzyskano przy niskiej zawartości Chol

(xChol = 0,25) (rys. 2). W celu wyjaśnienia takiego zachowania należy

rozważyć, że w temperaturach prowadzenia eksperymentu DOPC

występuje w nieuporządkowanej fazie ciekłokrystalicznej, ponieważ

temperatura głównego przejścia fazowego (żel/ciekły kryształ) dla tego

fosfolipidu wynosi -18oC [20]. Dodanie Chol do biwarstwy DOPC

prowadzi do zwiększenia uporządkowania łańcuchów węglowodorowych

fosfolipidu, przekształcając tym samym stan ciekłokrystaliczny

nieuporządkowany biwarstwy w ciekłokrystaliczny uporządkowany [21].

Zatem, cholesterol oddziałując z fosfolipiami moduluje konformacje

łańcuchów acylowych fosfolipidów. Natomiast zmiany w upakowaniu

membran mogą odgrywać istotną rolę w regulowaniu aktywności PLA2

i tworzeniu produktów hydrolizy DOPC, tj. kwasu oleinowego i 1-oleoilo-

2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholiny (lizofosfolipidu).

Badania nad rozkładem produktów katalizy enzymatycznej w obszarze

międzyfazowym membrana/roztwór wskazują, że lizofosfolipid rozpuszcza

się w fazie objętościowej (opuszcza membranę), natomiast kwas

tłuszczowy gromadzi się w membranie [22] (rys. 1). Kumulowanie się

nierozpuszczalnych produktów hydrolizy w membranie może mody-

fikować aktywność enzymatyczną na dwa sposoby. Mianowicie, produkty

reakcji mogą utrudniać dostęp enzymu do cząsteczek fosfolipidu, z drugiej

zaś strony reorganizacja struktury membrany i segregacja produktów

hydrolizy w domeny mogą wręcz poprawiać zdolność wiązania enzymu

z membraną [23]. Obecność polarnych produktów reakcji w biwarstwie

można oszacować na podstawie wzrostu swobodnej energii powierz-

chniowej. W naszych badaniach najwyższe wartości swobodnej energii

powierzchniowej uzyskano dla biwarstw przy xChol = 0,25 i 0,75 hydro-

lizowanych w temperaturze 20oC. Ponadto pojawiają się znaczne różnice

pomiędzy wartościami swobodnej energii powierzchniowej wyznaczonymi



177

w temperaturze 20oC i 37

oC (rys. 2). Swobodna energia powierzchniowa

biwarstw w 37oC okazuje się być niższa niż w 20

oC. Maksymalna zmiana

w energii obliczonej z modelu CAH wynosi 4 mJ/m2, zaś z modelu LWAB

aż 12,7 mJ/m2. Z powyższego porównania wynika, że w tym przypadku

model LWAB jest bardziej odpowiedni do opisu właściwości energe-

tycznych membran, ponieważ w większym stopniu odzwierciedla wpływ

temperatury. Poza tym należy podkreślić, że trend zmian swobodnej energii

powierzchniowej wyznaczonej z obu podejść zależnie od składu biwarstwy

i czasu hydrolizy jest podobny. Jednakże, wartości energii wyznaczone

z modelu CAH są nieco wyższe. Prawdopodobnie podczas pomiaru

cofającego kąta zwilżania, który jest zawsze mniejszy niż wstępujący, ciecz

penetruje membranę głębiej. Dlatego, wyższe wartości energii wydają się

być związane z oddziaływaniami wyznaczonymi z mniejszych odległości.

Ten problem omówiono w poprzednich pracach [24, 25].

4.2. Oddziaływania elektrono-donorowe

W celu pełniejszej charakterystyki badanych układów przed i po

zastosowaniu enzymu, szczególnie w aspekcie oddziaływań między-

cząsteczkowych, pomocne może być oszacowanie parametru elektrono-

donorowego (γS-). Oddziaływania elektrono-donorowe wynikają głównie

z obecności na powierzchni elektrono-donorowych grup polarnych

składników membrany, które są zdolne do tworzenia mostków wodo-

rowych z cieczami wzorcowymi. Zmiany wartości składowej γS- energii

powierzchniowej okazują się być bardziej miarodajne niż całkowita jej

wartość.

Analizując oddziaływania elektrono-donorowe oszacowane z modelu

LWAB (rys. 3) można zauważyć, że w obu temperaturach (20oC and 37

oC)

częściowe zastąpienie cząsteczek DOPC przez Chol (xChol = 0,25) prowadzi

do znacznego wzrostu parametru γS- (ok. 20 mJ/m

2). Przy większej

zawartości cholesterolu (xChol = 0,5 i 0,75) oddziaływania te również rosną,

ale w znacznie mniejszym stopniu. W przeciwieństwie do wartości

całkowitej swobodnej energii powierzchniowej, oddziaływania elektrono-

donorowe membran hydrolizowanych w 37oC są większe niż w 20

oC (rys. 3).

Nasze poprzednie badania nad hydrolizą enzymatyczną warstw

lipidowych pokazały, że zmiany parametru elektrono-donorowego podczas

procesu degradacji warstewek mogą wskazywać na obecność polarnych

produktów katalizy w membranie [26]. Produkty mogą oddziaływać

z polarnymi cieczami poprzez wiązania wodorowe i siły polarne. Wzrost γS-

podczas hydrolizy przypisuje się tworzeniu i gromadzeniu polarnych

produktów w strukturze membrany, zaś zmniejszanie się γS- stanowi dowód

na opuszczanie obszaru membrany przez produkty, które na skutek


178

niestabilności rozpuszczają się w fazie objętościowej po osiągnięciu

odpowiedniego stężenia w membranie. Niestety, z modelu CAH nie jest

możliwe określenie wartości parametru elektrono-donorowego, ponieważ

koncepcja służy do określania całkowitej swobodnej energii powierz-

chniowej i nie uwzględnia podziału energii na składowe.

Rysunek 3. Zmiany parametru elektrono-donorowego biwarstw DOPC/Chol w wyniku hydrolizy

katalizowanej PLA2 w 20oC i 37oC obliczone z podejścia LWAB

4.3. Topografia filmów lipidowych

Obrazy AFM biwarstwy DOPC traktowanej i nie traktowanej

roztworem PLA2 w różnych przedziałach czasowych zaprezentowano na

rysunku 4. Zamieszczono także odpowiadające rozkłady wysokości

w postaci histogramów i parametry wysokości (średnia chropowatość – Ra,

średnia kwadratowa chropowatości – Rq, średnia wysokość – Ha).

Ha oznacza średnią arytmetyczną wysokość profilu pików i dolin

(wertykalnych współrzędnych punktów pomiarowych), Ra to średnie

arytmetyczne odchylenie profilu chropowatości, zaś Rq stanowi odchylenie

standardowe wartości średniej wertykalnych współrzędnych punktów

pomiarowych. Parametr Rq jest bardziej wrażliwy na obecność wzniesień

i dolin niż parametr Ra, ponieważ w obliczeniach Rq uwzględnia się

kwadrat amplitudy [27].



179

Rysunek 4. Obrazy AFM biwarstwy DOPC przed hydrolizą oraz po 5, 15, 30, 60 i 120 min kontaktowania z roztworem PLA2 (0,02 U/ml, pH 8,0). Poniżej zamieszczono rozkład wysokości

i parametry topograficzne (Rq - odchylenie standardowe wartości średniej wertykalnych

współrzędnych punktów pomiarowych, Ra - średnia chropowatość, Ha - średnia wysokość).

Wielkość skanowanej powierzchni wynosi 10 x 10 μm2

Chropowatość biwarstwy DOPC jest niewielka (Rq = 0,14 nm, Ra = 0,10

nm), co może wynikać z płynności łańcuchów węglowodorowych.

Ponadto, chociaż zasadnicze zmiany swobodnej energii powierzchniowej

biwarstw występują w ciągu 15 min hydrolizy, analiza parametrów

topograficznych i rozkładu wysokości nierówności wskazują, że średnia

chropowatość i średnia wysokość podczas kontaktu biwarstwy DOPC

z roztworem PLA2 zmieniają się tylko nieznacznie. Jednakże, po 30 min

reakcji hydrolizy pojawiają się małe wysepki. Są one raczej homogenicznie

rozłożone na powierzchni, następnie znikają w miarę prowadzenia procesu,

i ostatecznie po 120 min biwarstwa ulega całkowitej degradacji. Widoczne

są jedynie bardzo małe agregaty rozsiane po całej powierzchni. Maksimum

chropowatości biwarstwy DOPC występuje po 60 min działania enzymu,

co prawdopodobnie wynika z gromadzenia się produktów hydrolizy

w strukturze membrany.

Rysunek 5 prezentuje repliki biwarstwy DOPC/Chol (1:1) razem z odpo-

wiadającym rozkładem wysokości i parametrami topograficznymi po różnym

czasie kontaktowania membrany z roztworem PLA2. Powierzchnia

biwarstwy jest homogeniczna i gładka (Rq = 0,07 nm, Ra = 0,05 nm).

Obecność cholesterolu w biwarstwie DOPC zmienia uporządkowanie


180

cząsteczek DOPC powodując przejście z nieuporządkowanej do

uporządkowanej fazy ciekłokrystalicznej. Przejawia się to w mniejszych

wartościach parametru Rq i Ra w porównaniu z jednoskładnikową

biwarstwą DOPC (rys. 4).

Rysunek 5. Obrazy AFM biwarstwy DOPC/Chol (1:1) przed hydrolizą oraz po 5, 15, 30, 60 i 120

min kontaktowania z roztworem PLA2 (0.02 U/ml, pH 8,0). Poniżej zamieszczono rozkład wysokości i parametry topograficzne (Rq - odchylenie standardowe wartości średniej

wertykalnych współrzędnych punktów pomiarowych, Ra - średnia chropowatość, Ha - średnia

wysokość). Wielkość skanowanej powierzchni wynosi 10 x 10 μm2

Obrazy AFM biwarstwy po określonym czasie hydrolizy i odpo-

wiadające im wartości parametrów topograficznych pokazują wyraźne

zmiany w strukturze biwarstwy już po 5 min hydrolizy. Jest to widoczne

w znacznym wzroście chropowatości powierzchni w tym czasie (rys. 5). Na

podstawie rozkładu wysokości można wnioskować, że proces hydrolizy jest

inicjowany w zewnętrznej monowarstwie, ponieważ grubość (ok. 1,0-1,5 nm)

nie odpowiada grubości biwarstwy. Po 15 min struktura filmu ulega

dramatycznej zmianie. Obserwuje się piki i doliny, które ulegają dalszym

zmianom podczas procesu. Po 30 min chropowatość powierzchni jest

maksymalna. Ostatecznie, jedynie fragmenty niezhydrolizowanego filmu

pozostają na powierzchni nośnika. Ogólnie, parametr Ha odpowiada

wysokości, dla której uzyskano maksymalną liczbę zliczeń.

Ponadto, podobny wzrost w chropowatości powierzchni otrzymano po

5 min hydrolizy DOPC/Chol (1:1) (rys. 5) oraz po 30 min hydrolizy DOPC

(rys. 4). Sugeruje to, że obecność cholesterolu w biwarstwie DOPC



181

przyspiesza jej hydrolizę. Proces przebiega stopniowo, obejmując

w pierwszej kolejności zewnętrzną warstwę, a następnie wewnętrzną.

W wyniku hydrolizy w biwarstwie tworzą się dziury, których głębokość

odpowiada grubości biwarstwy.

Powyższe zależności bardzo dobrze korelują ze zmianami parametru

elektrono-donorowego odpowiednich powierzchni (rys. 3). Na tej podstawie

można stwierdzić, że analiza obrazów topograficznych otrzymanych za

pomocą mikroskopu sił atomowych pozwala uzasadnić zmiany zachodzące

na powierzchni w trakcie procesu, które wyznaczono w oparciu o pomiary

kątów zwilżania i zastosowanie odpowiedniego modelu obliczania

swobodnej energii powierzchniowej.

5. Podsumowanie i wnioski

Przedstawione badania dostarczają informacji na temat zmian

właściwości energetycznych filmów lipidowych podczas ich hydrolizy

w obecności fosfolipazy A2. Do oszacowania swobodnej energii powierz-

chniowej zastosowano dwa uzupełniające się podejścia teoretyczne, które

pozwoliły na wysunięcie bardzo zbliżonych wniosków. Uzyskane wyniki

demonstrują, że ilość cholesterolu w biwarstwie DOPC i temperatura

eksperymentu regulują pracę enzymu. Można to zaobserwować na

podstawie zmian parametrów termodynamicznych płaskich biwarstw

lipidowych oraz topografii ich powierzchni. Wartości swobodnej energii

powierzchniowej i oddziaływań elektrono-donorowych, jak również

zmiany parametrów topograficznych powierzchni, świadczą o tym, że

polarne produkty hydrolizy DOPC (kwas oleinowy i 1-oleoilo-2-hydroksy-

sn-glicero-3-fosfocholina) mogą gromadzić się w membranie i/lub

rozpuszczać w fazie objętościowej w zależności od czasu hydrolizy

i temperatury. Wartości badanych parametrów pozwalają śledzić zmiany

w polarności filmów wywołane działaniem PLA2. Z uwagi na fakt, iż

aktywność PLA2 zależy od składu membrany i jej struktury, proces

hydrolizy może być kontrolowany. Dzięki temu można otrzymywać

membrany o zdefiniowanych właściwościach hydrofilowo-hydrofobowych.

Natomiast zastosowanie techniki AFM do określania struktury mode-

lowych błon biologicznych może wnieść istotny wkład w zrozumienie

procesów rozpoznania molekularnego z udziałem enzymów, co w dalszej

perspektywie daje możliwość ich użycia jako katalizatorów, sensorów

i nośników do kontrolowania reakcji zachodzących w organizmach żywych.

Badania tego typu są istotne ze względu na ich potencjalne zastosowania

w medycynie, farmacji i biotechnologii.


182

Podziękowania

Badania częściowo finansowane ze środków na prowadzenie badań

naukowych i prac rozwojowych służących rozwojowi młodych naukowców

(nr projektu BS-M-03-002-14-D-01), a częściowo ze środków projektu

Marie Curie Initial Training Network „Complex Wetting Phenomena”

(nr projektu 607861).

Literatura

1. Mouritsen O. G., Jorgensen K., Small-scale lipid-membrane structure:

simulation versus experiment, Current Opinion in Structural Biology,

7 (1997), s. 518-527

2. Ohvo-Rekilä H., Ramstedt B., Leppimäki P., Slotte J. P., Cholesterol

interactions with phospholipids in membranes, Progress in Lipid Research,

41 (2002), s. 66-97

3. Rog T., Pasenkiewicz-Gierula M., Vattulainen I., Karttunen M., Ordering

effects of cholesterol and its analogues, Biochimica et Biophysica Acta,

1788 (2009), s. 97-121

4. Huang J., Feigenson G. W., Microscopic interaction model of maximum

solubility of cholesterol in lipid bilayers, Biophysical Journal, 76 (1999),

s. 2142-2157

5. Subczynski W. K., Raguz M., Widomska J., Mainali L., Konovalov A.,

Functions of cholesterol and the cholesterol bilayer domain specific to the

fiber-cell plasma membrane of the eye lens, Journal of Membrane Biology,

245 (2012), s. 51-68

6. Jacob R. F., Cenedella R. J., Mason R. P., Direct evidence for immiscible

cholesterol domains in human ocular lens fiber cell plasma membranes,

Journal of Biological Chemistry, 274 (1999), s. 31613-31618

7. Huang L., Grami V., Marrero Y., Tang D., Yappert M. C., Rasi V., Borchman

D., Human lens phospholipid changes with age and cataract, Investigative

Ophthalmology & Visual Science, 46 (2005), s. 1682-1689

8. Mouritsen O. G., Andresen T. L., Halperin A., Hansen P. L., Jakobsen A. F.,

Jensen U. B., Jensen M. Ø., Jørgensen K., Kaasgaard T., Leidy C., Simonsen

A. C., Peters G. H., Weiss M., Activation of interfacial enzymes at membrane

surfaces, Journal of Physics: Condensed Matter, 18 (2006), s. 1293-1304

9. Laye J. P., Gill J. H., Phospholipase A2 expression in tumours: a target

for therapeutic intervention?, Drug Discovery Today, 8 (2003), s. 710-716

10. Cummings B. S., Phospholipase A2 as targets for anti-cancer drugs,

Biochemical Pharmacology, 74 (2007), s. 949-959

11. Rosenson R. S., Hurt-Camejo E., Novel therapeutic concepts: Phospholipase

A2 enzymes and the risk of atherosclerosis, European Heart Journal, 33 (2012),

s. 2899-2909

12. Blodgett K. B., Langmuir I., Built-up films of barium stearate and their optical

properties, Physical Review, 51 (1937), s. 964-982



183

13. Langmuir I., Schaefer V. J., Activities of urease and pepsin monolayers, Journal of the American Chemical Society, 60 (1938), s. 1351-1360

14. Chibowski E., Contact angle hysteresis due to a film present behind the drop, in Contact Angle, Wettability and Adhesion, K.L. Mittal (Ed.), Part 2, VSP, Utrecht, vol. 2 (2002), s. 265-288

15. van Oss C. J., Chaudhury M. K., Good R. J., Interfacial Lifshitz-van der Waals and Polar Interactions in Macroscopic Systems, Chemical Reviews, 88 (1988), s. 927-941

16. Horcas I., Fernandez R., Gomez-Rodriguez J. M., Colchero J., Gomez-Herrero J., Baro A. M., WSxM: A software for scanning probe microscopy and a tool for nanotechnology, Review of Scientific Instruments, 78 (2007), s. 013705-1-013705-8

17. Jurak M., Thermodynamic aspects of cholesterol effect on properties of phospholipid monolayers: Langmuir and Langmuir-Blodgett monolayer study, Journal of Physical Chemistry B, 117 (2013), s. 3496-3502

18. Parker A., Miles K., Cheng K. H., Huang J., Lateral distribution of cholesterol in dioleoylphosphatidylcholine lipid bilayers: cholesterol-phospholipid interactions at high cholesterol limit, Biophysical Journal, 86 (2004), s. 1532-1544

19. Alwarawrah M., Dai J., Huang J., A molecular view of the cholesterol condensing effect in DOPC lipid bilayers, Journal of Physical Chemistry B, 114 (2010), s. 7516-7523

20. Lewis R. N. A. H., Sykes B. D., McElhaney R. N., Thermotropic phase behavior of model membranes composed of phosphatidylcholines containing cis-monounsaturated acyl chain homologues of oleic acid. Differential scanning calorimetric and 31P-NMR spectroscopic studies, Biochemistry, 27 (1988), s. 880-887

21. Eeman M., Deleu M., From biological membranes to biomimetic model membranes, Biotechnology, Agronomy, Society and Environment, 14 (2010), s. 719-736

22. Wacklin H. P., Tiberg F., Fragneto G., Thomas R. K., Distribution of reaction products in phospholipase A2 hydrolysis, Biochimica et Biophysica Acta, 1768 (2007), s. 1036-1049

23. Mircheva K., Minkova I., Ivanova Tz., Panaiotova I., Proust J. E., Verger R., Comparative study of lipolysis by PLA2 of DOPC substrates organized as monolayers, bilayer vesicles and nanocapsules, Colloids and Surfaces B, 67 (2008), s. 107-114

24. Jurak M., Chibowski E., Surface free energy and topography of mixed lipid layers on mica, Colloids and Surfaces B, 75 (2010), s. 165-174

25. 25. Jurak M., Chibowski E., Influence of (phospho)lipases on properties of mica supported phospholipid layers, Applied Surface Science, 256 (2010), s. 6304-6312

26. Jurak M., Szcześ A., Chibowski E., Physicochemical properties of phospholipid model membranes hydrolyzed by phospholipase A2 (PLA2) in the presence of cholesterol at different temperatures, Applied Surface Science, 266 (2013), s. 426-432

27. Gadelmawla E. S., Koura M. M., Maksoud T. M. A., Elewa I. M., Soliman H. H., Roughness parameters, Journal of Materials Processing Technology, 123 (2002), s. 133-145


184



Streszczenie

W naszych badaniach wykorzystano międzyfazową aktywność fosfolipazy A2 do modyfikacji biwarstw lipidowych osadzonych na stałym nośniku. Biwarstwy utworzono

z fosfolipidu 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DOPC) i cholesterolu (Chol). Składniki

zmieszano uzyskując układy o różnej zawartości cholesterolu, tj. xChol = 0,25; 0,5; i 0,75.

Płaskie biwarstwy lipidowe uzyskano techniką Langmuira-Blodgett/Schaefera na mice. Zmiany w strukturze membran wywołane hydrolizą śledzono poprzez wartości swobodnej

energii powierzchniowej i jej składowych. Powyższe parametry wyznaczono w oparciu

o pomiary wstępujących i cofających kątów zwilżania wody, formamidu i dijodometanu,

stosując różne modele oddziaływań międzyfazowych. Uzyskane wyniki demonstrują, że obecność cholesterolu w biwarstwie DOPC reguluje pracę

enzymu. Odzwierciedla się to w zmianach parametrów termodynamicznych płaskich

biwarstw lipidowych oraz ich topografii. Wartości badanych parametrów pozwalają śledzić

zmiany w polarności filmów wywołane działaniem PLA2. Dzięki temu można otrzymywać membrany o zdefiniowanych właściwościach hydrofilowo-hydrofobowych.

Role of cholesterol in the enzymatic hydrolysis of model membranes

constituted by phospholipid DOPC

Abstract Our studies were focused on exploiting the interfacial activity of phospholipase A2 (PLA2)

for modification of solid supported lipid bilayers formed by phospholipid 1,2-dioleoyl-sn-

glycero-3-phosphocholine (DOPC) and cholesterol (Chol) which were mixed at different

cholesterol molar fractions, i.e. xChol = 0.25; 0.5; and 0.75. The planar lipid bilayers were obtained by means of Langmuir-Blodgett/Schaefer technique on mica plates from the

surface of pure water. The changes in the membrane properties caused by PLA2 action were

tracked via values of the surface free energy and its components. These parameters were

determined from the advancing and receding contact angle measurements of water, formamide and diiodomethane, and using different models of the interfacial interactions.

The obtained results demonstrate that the presence of cholesterol in DOPC bilayers regulates

the enzyme action. This reflects in changes of thermodynamic parameters of the supported

lipid bilayers and their topography. The changes of these thermodynamic parameters allow tracking the changes in film polarity under the PLA2 action. Therefore the membrane

surfaces of defined hydrophilic-hydrophobic properties can be produced.

185

Aneta Białkowska1, Joanna Krysiak

2, Katarzyna M. Szulczewska

3

Metagenom jako źródło unikatowych

i ekstremofilnych biocząsteczek

1. Definicja i cele metagenomiki

Termin „metagenom” został wprowadzony do literatury przez

Handelsman, Rondon, Brady, Clardy i Goodman w 1998 r. dla określenia

ogólnej różnorodności genów obecnych w danym mikrośrodowisku [1].

W obecnym rozumieniu metagenomika jest dyscypliną, która pozwala

badać świat bakterii poprzez informatyczną i funkcjonalną analizę ich

informacji genetycznej zawartej w całkowitym DNA (environmental DNA,

eDNA), przy wykorzystaniu do tego celu wiedzy i metod z zakresu

genomiki, proteomiki, biologii molekularnej, inżynierii genetycznej

i biotechnologii molekularnej [2, 3, 4]. Metagenomika pozwala więc na

badanie mikroorganizmów bez konieczności ich izolowania ze środowiska

i namnażania w warunkach laboratoryjnych. Pod pojęciem metagenomiki

kryją się również badania dotyczące różnorodności genetycznej świata

wirusów, dostarczające informacji na temat ich ewolucji i ekologii. Coraz

częściej stosuje się podejście metagenomiczne także w odniesieniu do

organizmów eukariotycznych, chociaż jego wykorzystanie jest ograniczone

ze względu na obecność w materiale genetycznym tych organizmów

stosunkowo długich, niekodujących odcinków DNA, co znacznie utrudnia

analizę oraz zwiększa koszty sekwencjonowania [5].

Głównym i najbardziej ambitnym celem metagenomiki jest zrekon-

struowanie całkowitych genomów mikroorganizmów trudno hodowalnych

poprzez identyfikację, wcześniej zebranych w bibliotece metagenomowej

zachodzących na siebie, fragmentów genów. Dzięki tym badaniom jest

możliwe bardziej precyzyjne określenie rzeczywistej bioróżnorodności

danego mikrośrodowiska. Rekonstrukcja genomów otwiera także dostęp do

poznania unikatowych szlaków metabolicznych, wykorzystywanych przez

trudno hodowalne drobnoustroje, przede wszystkim te, które żyją w ekstre-

malnych biotopach. Pozwala to na identyfikację i ekspresję pojedynczych 1 [email protected], Instytut Biochemii Technicznej, Wydział Biotechnologii i Nauk

o Żywności, Politechnika Łódzka, http://www.p.lodz.pl 2 [email protected], Instytut Biochemii Technicznej, Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności, Politechnika Łódzka, http://www.p.lodz.pl 3 [email protected], Instytut Biochemii Technicznej, Wydział

Biotechnologii i Nauk o Żywności, Politechnika Łódzka, http://www.p.lodz.pl

Aneta Białkowska, Joanna Krysiak, Katarzyna M. Szulczewska

186

genów, a także ich klastrów, umożliwiając otrzymanie na użytek gospodarki

nowych związków, w tym także unikatowych biokatalizatorów. Szcze-

gólnie poszukiwane są obecnie geny warunkujące oporność na antybiotyki

[6, 7], metale ciężkie [8, 9], czy też pestycydy [10], a także szlaki degra-

dacji trudno rozkładalnych związków organicznych (węglowodory aroma-

tyczne i ich halogenopochodne, pestycydy, i in.) [11, 12] czy akumulacji

metali [13, 14].

2. Etapy i metody w badaniach metagenomowych

Od strony metodologicznej metagenomika wykorzystuje podstawowe

techniki inżynierii genetycznej i biologii molekularnej, takie jak: ekstrakcja

kwasów nukleinowych ze środowiska, ich amplifikacja za pomocą reakcji

PCR oraz bezpośrednie klonowanie DNA środowiskowego w celu

konstrukcji tzw. bibliotek metagenomowych. W celu ekstrakcji DNA

z próbek środowiskowych stosuje się dwie metody: pierwsza polega na

bezpośrednim izolowaniu DNA z drobnoustrojów znajdujących się

w próbie środowiskowej, natomiast druga na odseparowaniu drobnoustrojów

od materii glebowej przed właściwą ekstrakcją. Stosując bezpośrednią

ekstrakcję z wykorzystaniem wirowania i mikrofiltracji otrzymuje się

znaczne ilości materiału genetycznego, ale tylko druga metoda pozwala

uzyskać czyste i stosunkowo duże fragmenty DNA [15]. Dlatego też

sposób, w jaki przeprowadzana jest ekstrakcja wybierany jest w zależności

od tego, czy celem poszukiwań jest pojedynczy gen wielkości 1-2 kpz, czy

też operon lub zespół genów kodujący wielofunkcyjny kompleks

wieloenzymowy, np. syntazę poliketydową, o wielkości 100 kpz [3].

Największą trudnością w klasycznym podejściu do izolowania

metagenomu z gleby, jest obecność w pobranych próbach kwasów

humusowych (huminowych i fulwowych) oraz polifenoli utrudniających

jego ekstrakcję [15]. Kwasy humusowe mogą hamować działanie

polimerazy DNA podczas reakcji PCR, niekorzystnie wpływać na trawione

enzymami restrykcyjnymi DNA i obniżać wydajność transformacji

materiału genetycznego. Kwasy humusowe można w dużym stopniu

usunąć, jeśli ekstrahuje się DNA buforem z dodatkiem detergentów

jonowych, takich jak SDS (dodecylosiarczan sodu), CTAB (bromek

heksadecylometyloamoniowy), a także PVPP (poliwinylopyrrolidon).

W rezultacie jednak konstruowanie bibliotek z dużymi wstawkami DNA

jest zazwyczaj ograniczone niską jakością izolowanego materiału. Dlatego

też obecnie coraz częściej izolację DNA poprzedza wstępne namnożenie

obecnych w glebie mikroorganizmów. Uzyskuje się wówczas ograniczoną

bioróżnorodność materiału genetycznego, ale wyizolowany DNA cechuje

się lepszą jakością i odpowiednią długością [16].

Metagenom jako źródło unikatowych i ekstremofilnych biocząsteczek

187

W celu uzyskania większej reprezentatywności genomów badanych

populacji, uzyskanych zwłaszcza pośrednimi metodami ekstrakcji materiału

genetycznego, przy konstrukcji bibliotek genomowych wprowadza się

dodatkowe etapy prowadzące do otrzymania tzw. bibliotek submeta-

genomowych [17]. Wykorzystuje się wówczas procedurę tzw. normalizacji,

która polega na separacji genotypów w oparciu o wirowanie w gradiencie

chlorku cezu w obecności czynnika interkalującego (np. bis-benzimidu), co

umożliwia frakcjonowanie metagenomowego DNA wg zawartości par

G+C [18]. Taki sposób postępowania okazał się właściwy chociażby dla

poszukiwania materiału genetycznego wydajnych producentów meta-

bolitów wtórnych, w tym np. Actinomycetes zawierającego w genomie

więcej tychże par zasad niż inne gatunki bakterii [19]. Innym sposobem

normalizacji jest denaturacja wyizolowanego DNA, następnie jego

renaturacja w określonych warunkach i oddzielenie jednoniciowego DNA

(ssDNA), reprezentującego materiał genetyczny mniej licznych członków

konsorcjum mikroorganizmów, a następnie jego amplifikacja i sekwen-

cjonowanie. W celu konstrukcji bibliotek submetagenomowych stosuje się

także izolację DNA poprzedzoną inkubacją próby środowiskowej ze

specyficznym substratem znakowanym stabilnym izotopem, takim jak 13

C,18

O, 15

N (SIP, stable-isotope probing), co umożliwia późniejszą

separację znakowanej frakcji na drodze różnicowego wirowania. Przykład

może stanowić inkubacja próbki leśnej gleby z 13

CH3OH, która dopro-

wadziła do identyfikacji metylotrofowych α-proteobakterii i znalezienia

genu kodującego unikatową dehydrogenazę metanolową wśród Acido-

bacteria [17]. Do znakowania metabolicznie aktywnych komórek wyko-

rzystuje się często 5-bromo-2-deoksyurydynę (BrdU), a znakowany DNA

oddziela się za pomocą filtracji żelowej, wirowania w gradiencie gęstości

lub serologicznego wyłapywania (ang. immunocapture) [20]. Biblioteki

metagenomowe tworzone są analogicznie do bibliotek genomowych

z wykorzystaniem odpowiednich wektorów DNA i szczepów-gospodarzy.

Istnieje możliwość konstruowania bibliotek z małymi wstawkami (<10 kb)

przy użyciu standardowych wektorów plazmidowych (np. plazmidowe

wektory serii pUC) oraz bibliotek tzw. wielko-wstawkowych, stosujących

jako wektory DNA: (a) kosmidy z wstawkami o wymiarach między 25-35 kpz,

(b) sztuczne chromosomy bakteryjne BAC z wstawkami o wielkości

dochodzącej do 200 kpz. W literaturze pojawiają się również dane

dotyczące konstruowania bibliotek opartych o wyko-rzystanie fosmidów,

wektorów DNA pozwalających na wklonowanie w ich obrębie wstawek

DNA o rozmiarach do 45 kpz [3, 21, 22, 23].

Najczęściej stosowanym szczepem-gospodarzem do ekspresji genów

zdeponowanych w bibliotekach metagenomowych jest nadal bakteria


188

E. coli, choć coraz częściej pojawiają się publikacje o wykorzystywaniu

w tym charakterze Streptomyces lividans, Pseudomonas putida, Bacillus

subtilis czy Ralstonia metallidurans [2]. Ten ostatni szczep jest szczególnie

przydatny do ekspresji klastrów genów, np. zaangażowanych w biosyntezę

antybiotyków.

W ostatnim czasie coraz większym zainteresowaniem cieszą się enzymy

pochodzące ze środowisk ekstremalnych. Niestety praca z tego rodzaju

biokatalizatorami niesie ze sobą wiele utrudnień związanych z hodowlą

organizmów je produkujących, m.in. niski przyrost biomasy, długi czas

wzrostu, czy trudne do osiągnięcia bez specjalistycznych urządzeń warunki

hodowli. Dlatego w ostatnich latach opracowano wyspecjalizowane

systemy ekspresyjne do produkcji tego rodzaju białek. Przykładem może

być szczep E. coli Arctic Express (Agilent Technologies), który został

stworzony z myślą o syntezie białek aktywnych w niskich temperaturach

poprzez ich koekspresję z chaperonami pochodzącymi z psychrofilnych

bakterii Oleispira antarctica [24]. Poza modyfikacją istniejących już

systemów ekspresyjnych powstają także nowe oparte o mikroorganizmy

wyizolowane ze środowisk ekstremalnych. Wśród nich wymienić można

szczep Gram-ujemnych bakterii psychrofilnych Pseudoalteromonas

haloplanktis TAC125 wykorzystywany do ekspresji genów kodujących

zimnolubne białka [25], czy szczep bakterii Thermus thermophilus

wykorzystywany do ekspresji genów kodujących białka termofilne [26].

Stworzenie biblioteki genomowej jest dopiero początkiem drogi do

otrzymania pożądanego enzymu. Wśród ogromnej liczby klonów trzeba

znaleźć te, które posiadają gen kodujący interesujące nas białko. Obecnie

istnieją dwa podejścia do tego problemu:

metoda bezpośrednia – poszukiwanie określonej aktywności enzy-

matycznej poprzez selekcję klonów opartą na oznaczeniach

biochemicznych;

metoda pośrednia – poszukiwanie pewnych charakterystycznych dla

danego genu sekwencji (np. tzw. kotwic filogenetycznych, silnie

zakonserwowanych regionów) poprzez selekcję klonów opartą na

użyciu sond hybrydyzacyjnych [2, 3, 27].

Zasadniczą wadą pierwszej metody jest trudność w identyfikacji

poszukiwanej aktywności enzymatycznej, mimo obecności genu kodu-

jącego dane białko w odpowiednim klonie, wynikająca ze zbyt niskiego

poziomu jego ekspresji na skutek braku czynników transkrypcyjnych, czy

też z trudności w prawidłowym sfałdowaniu białkowego produktu

ekspresji, na skutek nieobecności specyficznych czaperonin oraz enzymów

koniecznych do potranslacyjnych modyfikacji. W celu zwiększenia

poziomu ekspresji białka wykorzystuje się jako gospodarzy bakterie E. coli

Rosetta (Novagen), które zawierają geny tRNA dla rzadkich kodonów


189

aminokwasów oraz umożliwiają koekspresję białek opiekuńczych,

np. GroES, GroEL czy też innych białek szoku cieplnego wspomagających

proces prawidłowego fałdowania eksprymowanego białka [28]. W celu

zwiększenia poziomu ekspresji białka coraz częściej stosuje się wektory

wahadłowe umożliwiające przenoszenie metagenomowego DNA do różnych

gatunków gospodarzy [2]. Kolejnym, ale równie ważnym wyzwaniem dla

badaczy jest opracowanie wydajnej i czułej metody selekcji klonów

o poszukiwanej aktywności, których ostateczna liczba w dużych biblio-

tekach metagenomowych jest najczęściej bardzo niewielka. Statystycznie,

aby znaleźć 1 klon z małym insertem biblioteka genomowa powinna liczyć

105-10

6 klonów i właśnie dlatego próbki środowiskowe powinny być

wzbogacane przed izolacją DNA.

W metodzie pośredniej znalezienie genu kodującego nową aktywność

enzymatyczną opiera się na analizie silnie zakonserwowanych fragmentów

sekwencji DNA kodujących epitopy białek charakterystyczne dla drobno-

ustrojów spokrewnionych rodzajowo. W metodzie tej konstruuje się sondy

hybrydowe i startery PCR monitorujące biblioteki metagenomowe, których

zadaniem jest wyszukiwanie klonów zawierających zakon-serwowaną

sekwencję DNA. Powtarzające się sekwencje, tzw. markery filogenetyczne

w białkach, umożliwiają ich wyizolowanie bez uprzedniej znajomości

budowy całego genu kodującego ten produkt [29, 30]. Wiadomo, że istnieje

kilka klas enzymów, których geny zawierają wystarczająco niezmienione

regiony, żeby analizować ich sekwencje podczas przeszukiwania bibliotek

genomowych zamiast poszukiwania danej aktywności enzymatycznej,

np. geny kodujące syntazę poliketydową i syntazę peptydową (obie wchodzą

w skład szlaku biosyntezy anty-biotyków) [3].

Oczywiście najlepszym rozwiązaniem w podejściu metagenomowym

jest zastosowanie jednocześnie obydwu metod poszukiwania klonów

o pożądanych właściwościach katalitycznych.

3. Wybrane osiągnięcia metagenomiki

Znaczenie badań metagenomowych potwierdza zwiększająca się z roku

na rok liczba genów, których identyfikacja była i jest możliwa, dzięki

genetycznym i biochemicznym informacjom zgromadzonym na podstawie

analiz całkowitego DNA izolowanego z danego środowiska. Liczba

zdeponowanych w bazach danych genów w porównaniu do początku lat 90.

znacznie wzrosła i na koniec 2008 r. wyniosła 40 x 106, przewyższając

o 9x105 liczbę sekwencji nukleotydowych uzyskanych przy użyciu

tradycyjnych technik klonowania molekularnego [31].

O rosnącej randze badań metagenomowych świadczy także istnienie

specjalnych komitetów narodowych, np. w USA został powołany przed


190

kilkoma laty przez Narodową Radę ds. Badań (National Research Council)

Komitet ds. Metagenomiki (Committee on Metagenomics), który przygotował

obszerny raport omawiający osiągnięcia i perspektywy tej dyscypliny [32].

Większość dużych projektów metagenomowych dotyczy obecnie

identyfikacji genów prokariontów w próbach środowiskowych, ponieważ

ich genomy są mniejsze i przez to łatwiejsze do sekwencjonowania,

a ponadto bioróżnorodność prokariontów jest największa w całym świecie

żywym i co więcej, zasiedlają one wszystkie środowiska ziemskie, nawet

najbardziej ekstremalne. W styczniu 2009 r. odnotowano realizację prawie

137 kompleksowych projektów metagenomowych, z których 72% dotyczyło

analizy próbek środowiskowych, 23% próbek endobiotycznych, a 5%

– syntetycznych [33].

Celem jednego z takich projektów było zbadanie metagenomu acido-

filnego metalotolerancyjnego różowego biofilmu, pobranego z powierzchni

wód w nieczynnej kopalni w Iron Mountain w Richmond (Virginia, USA)

pod kątem określenia taksonów i szlaków metabolicznych. Założono, że

uzyskane wyniki wyjaśniłyby przyczyny wysokiej tolerancji na

ekstremalne środowisko, np. na wysokie stężenia metali i pozwoliłyby

określić wpływ konsorcjum mikrobiologicznego na procesy geochemiczne.

W wyniku zsekwencjonowania 76,2 mln pz DNA i zdefiniowania 103462

uporządkowanych odczytów, stwierdzono w badanym biofilmie obecność

6 taksonów, a następnie określono pełne genomy bakterii rodzaju

Leptospirillum typ II oraz archeona rodzaju Ferroplasma typ II, które były

dominującymi mikroorganizmami. Łącznie zidentyfikowano w genomach

tychże drobnoustrojów ok. 4 tys. genów wielu szlaków metabolicznych,

m.in. biosyntezy głównych koenzymów, cyklu Krebsa, przenośników

łańcucha oddechowego, glikolizy itd. Na tej podstawie zaproponowano

model cyklu biogeochemicznego, który ustalał, że energia dostarczana jest

na drodze utleniania żelaza przez obydwa dominujące rodzaje, natomiast

azot z powietrza wiążą nieliczni przedstawiciele biofilmu, należący do typu

III Leptospiryllum. Te wnioski oparte o badania metagenomowe, zaprzeczały

wcześniejszym przypuszczeniom o wiązaniu azotu przez szczep Lepto-

spiryllum typ II. Z tego względu po zakończeniu projektu podjęto się

hodowli szczepu Leptospiryllum typ III i udowodniono, że właśnie ten

szczep wykazuje zdolność wiązania azotu atmosferycznego, co potwier-

dzało wcześniejsze wnioski dotyczące działania biofilmu, opracowane

w oparciu o badania metagenomu tego mikrośrodowiska [34, 35]. Wzrost

tego ekstremofilnego i trudno hodowalnego w warunkach laboratoryjnych

szczepu był możliwy dzięki nowej metodzie hodowli opartej o osiągnięcia

mikrofluidyki. Jest to innowacyjna dziedzina nauki opracowująca systemy

zbudowane z miniaturowych kanałów zwykle o wielkości 10-100 m,

operujących objętościami płynów rzędu od 10-9 do 10-18 litra. Dzięki


191

zminiaturyzowaniu makroskopowych systemów do wyżej wymienionych

wielkości oraz umiejscowieniu ich na czipach (tzw. mikroukłady

hodowlane kierujące maleńkie objętości płynów, tj. od nano- do attolitrów

kanałami o wielkości rzędu dziesiątek bądź setek mikrometrów do małych

przestrzeni reakcyjnych określanych jako kanały pomiarowe), wyko-

rzystując jednocześnie możliwość równoległego prowa-dzenia znacznej

ilości eksperymentów, procesy biologiczne osiągnęły niezwykłą wydajność

[36, 37]. W jednym termostatowanym chipie może działać równolegle

kilka mikroreaktorów zbudowanych głównie z poli-dimetylosiloksanu,

w których możliwy jest pomiar stężenia gazów, pH, temperatury, a także

pobieranie prób dla oznaczeń zmiany stężeń składników podłoża, czy też

metabolitów wydzielanych przez rosnącą kulturę. Dzięki możliwości

bardzo dokładnego kontrolowania warunków przebiegu hodowli możliwe

są szczegółowe badania zachowań komórek organizmów i osiągnięcie

wysokiej czułości i rozdzielczości, przy użyciu bardzo niewielkiej ilości

badanej próbki [38]. Ustalono, w oparciu o modelowy organizm – trans-

formowane szczepy E. coli, że wydajność ekspresji podczas hodowli

w takich mikroreaktorach jest podobna jak w hodowlach o co najmniej

1000-krotnie większej skali.

Badania metagenomu biofilmu kwaśnego drenażu kopalnianego wykazały,

że procesy rekombinacji genetycznej zdarzają się znacznie częściej niż

przypuszczano i są prawdopodobnie główną ewolucyjną siłą kształtującą

populację tego środowiska i prawdopodobnie też wielu innych [39].

W marcu 2004 r. zakończyła się realizacja innego projektu, dotyczącego

badania metagenomu Morza Sargassowego, które uważane jest za "morską

pustynię", skrajnie ubogą w nutrienty, w której pomimo krystalicznej,

ciepłej wody, życie jest znacznie ograniczone. W wyizolowanym z mikro-

flory morskiej całkowitym DNA zsekwencjonowano w sumie ponad 1 mld

pz i znaleziono 1,2 mln genów, aczkolwiek dla ok. 790 tys. nie udało się

ustalić funkcji. Spośród zidentyfikowanych genów 70 tys. jest zaanga-

żowanych w procesy transdukcji energii, w tym aż 782 geny kodują

proteorodopsynę – helikalne białko transbłonowe, które jest pompą

protonową zdolną do akumulacji energii. Białko to jest produkowane przez

większość z 1826 opisanych w mikrobiomie badanego akwenu morskiego

gatunków bakterii, w tym także przedstawicieli typu Bacteroides, którym

wcześniej nie przypisywano zdolności akumulacji energii świetlnej. Dzięki

temu projektowi odkryto nie tylko wiele nowych sekwencji genów

kodujących proteorodopsynę, ale także wykazano, że ich zróżnicowanie

w eDNA Morza Sargassowego spowodowane jest prawdopodobnie hory-

zontalnym transferem genów. Ponadto grupa J.G. Ventera znalazła w tym

ekstremalnie ubogim w fosfor środowisku geny, które są prawdopodobnie

zaangażowane w pobieranie fosfonianów i/lub wykorzystanie polifos-


192

foranów oraz pirofosforanów, co daje nadzieję, że w najbliższej przyszłości

będzie możliwe poznanie dokładnego mechanizmu obiegu fosforu w wodzie

morskiej [40].

Uzupełnienie informacji o bioróżnorodności życia i unikatowych

mechanizmach metabolicznych odgrywających istotną rolę w morskich

środowiskach dostarczył kolejny kompleksowy projekt, zajmujący się

badaniem metagenomu globalnego oceanu. W tym celu izolowano próbki

drobnoustrojowego DNA z wód oceanicznych od sierpnia do maja 2004 r.

i w sumie pobrano 44 próbki powierzchniowych wód z 41 miejsc, co

320 km, począwszy od Halifax w Kanadzie, poprzez wschodnie wybrzeże

USA, Zatokę Meksykańską, Wyspy Galapagos, środkowy i południowy

Pacyfik u wybrzeży Australii, Ocean Indyjski, południowe wybrzeża

Afryki i następnie przez Atlantyk, aż do wybrzeży USA. Dla porównania

zbadano też kilka próbek z wodnych, ale nie morskich środowisk.

Zastosowano technikę sekwencjonowania „shot-gun” i po złożeniu

sekwencji 4,12 mln kontigów zidentyfikowano ponad 6,1 mln genów

kodujących białka, czyli więcej niż wynosiła liczba sekwencji białkowych,

zdeponowanych w owym czasie w bazie NCBI. Na podstawie otrzymanych

sekwencji określono 60 najczęstszych rybotypów drobnoustrojowych,

a także znaleziono 148 genów kodujących bakteryjną cyklazę skwalen-

hopen, enzym charakterystyczny dla najstarszych ewolucyjnie populacji,

zawierających terpenoidowe lipidy. Badania metagenomowe dowiodły

ponadto, że najobfitszym gatunkiem oceanicznych wód powierzchniowych

jest fotosyntetyzująca cyjanobakteria Prochlorococcus marinus, która

zawiera liczne wyspy genomowe (z ang. „genomic islands”) o dużej

zmienności sekwencji nukleotydowych. Zostały one nabyte w dużej części

na drodze poziomego transferu genów i stanowią gorące punkty dla

genetycznych innowacji [41, 42].

Szczególnie interesującym, zwłaszcza dla biotechnologii okazał się

metagenom przewodu gastrojelitowego przeżuwaczy, w którym zidenty-

fikowano nowe, unikatowe gatunki drobnoustrojów, co pozwoliło na opracowanie specyficznych metod izolacji i hodowli nowych, korzystnych

szczepów i ich wykorzystanie jako probiotyków w diecie zwierząt. Duże

zainteresowanie budzą metanogeny pochodzące z archeonów, które planuje się

wykorzystać poprzez odpowiednie manipulacje genetyczne w kierunku

zmniejszenia emisji metanu oraz opracowanie szczepionek przeciw tego typu

drobnoustrojom. W przewodzie pokarmowym przeżuwaczy stwierdzono także

obecność genów kodujących różne substancje antybakteryjne, np. bakterio-

cyny, enzymy restrykcyjne i inne wartościowe białka. Zidentyfikowano

także wiele plazmidów, które w przyszłości mogą stanowić cenne narzędzie

dla inżynierii genetycznej flory jelitowej i innej. Z technologicznego

punktu widzenia metagenomy przeżuwaczy zawierają unikatowe i ważne


193

biokatalizatory, np. nowe hydrolazy fibrolityczne (wielofunkcyjne,

hybrydowe endo- i egzoglukanazy, esterazy acetyloksylanu, oksydazy

fenolowe), które mogą być potencjalnie wykorzystane do produkcji

żywności i pasz, a także w przemyśle celulozowo-papierniczym,

tekstylnym, czy też do rozkładu biomasy roślinnej w biorafineriach [43].

Podstawowe narzędzie w procesach biorafineryjnych, stanowią enzymy

należące głównie do podklasy hydrolaz glikozydowych (GH) i to one stały

się w ostatnich latach obiektem intensywnych poszukiwań m.in.

metagenomiki. Znalezienie nowych enzymów z tej grupy może bowiem

zapewnić znacznie wyższą efektywność hydrolizy surowców celulozowych,

co przekłada się na lepsze wyniki ekonomiczne. Proces enzymatycznego

przetwarzania surowców roślinnych jest bowiem pod względem techno-

logicznym znacznie korzystniejszy od hydrolizy kwasowej, ponieważ nie

generuje niepożądanych produktów ubocznych, takich jak kwas

mrówkowy, furfural (pochodna pentoz) i 5-hydroksymetylofurfural (pochodna

heksoz), które są toksyczne nie tylko dla człowieka, ale także dla

większości drobnoustrojów, czego efektem jest obniżona wydajność

fermentacji. Efektywność enzymatycznej hydrolizy surowców zależy od

doboru odpowiednich preparatów enzymatycznych oraz warunków pH

i temperatury. Preparaty takie powinny zawierać enzymy rozkładające nie

tylko celulozę, ale także inkrustujące ją hemicelulozy i pektynę, co ułatwia

dostęp celulaz do włókien celulozy. Obecnie dostępnych jest szereg

handlowych preparatów enzymatycznych, zawierających enzymy celulo-

lityczne, hemicelulazy, pektynazy i inwertazę, rozkładającą pozostałości

sacharozy, niemniej jednak ogromne nadzieje pokłada się w badaniach

metagenomowych, które często prowadzą do znalezienia białek enzyma-

tycznych o szczególnie interesujących, zwłaszcza z technologicznego

punktu widzenia właściwościach lub całkowicie nowych, których funkcja

nie została dotąd opisana. W związku z tym przeanalizowano wyniki

43 kompleksowych projektów metagenomowych i znaleziono w nich 7338

genów GH, z których 4874 wykazywały homologię, m.in. do rodzin GH 13

(α-amylazy, pululanazy, cyklomaltodekstrynazy, glikozylotransferazy

cyklomaltodekstryn, neopululanazy, α-amylazy maltogeniczne, syntazy

trehalozy, syntazy izomaltulozy, fosforylazy sacharozy, glukodekstranazy,

α-glikozydazy, i in.); GH 23 (lizozym typu G, liaza peptydoglikanu),

GH 2 i 3 (celobiazy, β-galaktozydazy, β-mannozydazy, β-glukuronidazy,

endo-β-mannanazy, egzo-β-glukozaminidazy); GH 5, 6, 9, 16 i 94 (β-1,4-endo-

glukanazy o różnej specyficzności, β-1,4-endoksylanazy, β-1,4-endo-

mannanazy, licheninazy, celobiohydrolazy, fosforylazy celobiozy, fosfo-

rylazy celodekstryn, fosforylazy chitobiozy i inne); GH 43 (β-1,4-ksylozydazy,

α-arabinofuranozydazy, α-endoarabanazy, β-1,4-endoksylanazy); CBM 2a

(enzymy wiążące krystaliczną celulozę) oraz CBM 6 (hydrolazy wiążące


194

łańcuchy β-glikanów: celulozy, ksylanu). Wśród hydrolaz glikozydowych

z rodzin CBM występujących np. u bakterii żołądka przeżuwaczy

zidentyfikowano domenę katalityczną, kotwiczącą moduł w ścianie

komórki bakteryjnej, domenę homologiczną do pilin, które są białkami

włókienkowymi, odpowiadającymi u innych bakterii m.in. za procesy

koniugacji i inne interakcje komórka-komórka oraz domenę „fibro-slime”,

umożliwiającą przesuwanie się kompleksu po włóknie celulozy. Pozostałe

2564 geny koduje hipotetyczne GH o strukturze modularnej, łączącej

w cząsteczce elementy strukturalne GH z różnych rodzin; są to nowe,

atypowe warianty enzymów [44, 45].

Do najbardziej bogatych w hydrolazy glikozydowe metagenomów

należą np. metagenom jelita człowieka, w którym znaleziono 705 poten-

cjalnych glikozydaz; mata z salterny – 786 GH; gleba z silosa na farmie

–1078 GH oraz jelito termita zawierające ok. 1267 tych białek.

W mikrobiomie jelita termita Nasutitermes spp. szczególną rolę w produkcji

hydrolaz glikozydowych odgrywają bakterie Fibrobacter i Spirochaetae

[46]. Jeden z tych szczepów należący do gatunku Fibrobacter

succinogenes, uznany za szczep hodowalny, produkuje najbardziej aktywną

β-1,3 –1,4-endoglukanazę o aktywności 10 800 U/mg białka. Mikrobiom

małego kangura australijskiego Macropus eugenii wytwarza natomiast

800 GH i związanych z nimi modułów, w tym 41 modułów dokeryn

należących do GH z rodziny CBM 6 i 4 [47]. Badania metagenomów

zwierząt roślinożernych wykazały brakcelulosomów, a także małą liczbę

albo nieobecność egzo-β-1,4-celulaz (GH 6, 7 i 48), uważanych wcześniej

za niezbędne dla solubilizacji celulozy. Są za to obecne w ich

metagenomach „procesujące” endo-celulazy (GH 5 i 9), co sugeruje, że

rozkład celulozy zachodzi na innej drodze niż dotychczas sądzono.

Znalezienie unikatowych genów hydrolaz glikozydowych w ramach

badań metagenomowych budzi ogromne nadzieje związane z możliwością

opracowania i wykorzystania w praktyce kompleksowych technologii

mikrobiologicznych przetwarzających surowce roślinne oraz odpadowe

z przemysłu rolno-spożywczego do wytwarzania energii oraz w celu

dalszego przerobu dla przemysłu chemicznego, farmaceutycznego, chemii

gospodarczej i pokrewnych. Oprócz hydrolaz glikozydowych badania

metagenomów zarówno środowisk morskich, jak i glebowych zaowo-

cowały już pozyskaniem wielu innych enzymów o dużym znaczeniu

użytkowym: lipaz [48, 49, 50] i esteraz [51, 52], (np. esteraz o aktywności

laktonazy lub esteraz hydrolizujących insektycydy, takie jak pyretroidy

i pyretryny [53]), proteaz, nitrylaz i oksydoreduktaz (np. bifunkcyjna

hydroksylaza, reduktaza kwasu di-keto-D-glukonowego, dehydrogenaza

4-hydroksymaślanu, dioksygenaza rozszczepiająca katechole, enancjo-

selektywna monooksygenaza styrenowa) [54]. Badania metagenomowe


195

doprowadziły także do poznania nowych szlaków metabolicznych, m.in.

szlaku biosyntezy biotyny, 1,3-propano-diolu, antybiotyków czy leków

[3, 4, 55]. Poszukiwanie w metagenomach różnych środowisk genów tej

ostatniej grupy związków odbywało się na drodze funkcjonalnego lub

sekwencyjnego przeszukiwania bibliotek metagenomowych. Znacznie większą

szansę znalezienia enzymu o unika-towej specyficzności daje druga metoda

przeszukiwania bibliotek meta-genomowych oparta o skrining sekwencji

homologicznych do: (a) genów kodujących syntazy poliketydowe lub (b)

klastrów genów, np. klastru Oxy C, czyli grupy genów zaangażowanych

w syntezę antybiotyków gliko-peptydowych. Dzięki tym pierwszym

przyrównaniom sekwencyjnym znaleziono już w metagenomach gleby dwa

zupełnie nowe antybiotyki – izomery dienowych długołańcuchowych

alkoholi, a dzięki drugim – nowe pochodne wankomycyny i teikoplaniny.

Oczywiście skrining klonów prowadzony metodą płytkową w oparciu

o hamowanie wzrostu szczepów patogennych również zaowocował

znalezieniem w metagenomach gleby wielu antybiotyków, np. turbo-

mycyny A i B, wiolaceiny i deoksywiola-ceiny, terraginy, acylotyrozyny,

acyloargininy i acylotryptofanu [3]. Niemniej jednak w przypadku

skriningu funkcjonalnego szansa sukcesu i znalezienie aktywnego klonu jest

niezwykle mała, chociaż warto podkreślić, że dzięki tej metodzie

opracowano ostatnio nowy, wydajniejszy system ekspresji genów kodu-

jących antybiotyki w Ralstonia metallidurans [56, 57].

Obecnie wiele uwagi poświęca się badaniom metagenomowym

środowisk ekstremalnych, które stanowią bardzo obiecujące źródło

enzymów o dużym potencjale biotechnologicznym. Tabela 1 przedstawia

wybrane biokatalizatory zidentyfikowane dzięki prowadzonym badaniom

metagenomowym. Jak widać prace te dotyczyły bardzo różnorodnych

środowisk, od gleby z rejonów okołobiegunowych i górskich, osadów

morskich, gorących źródeł, aż po odpady przemysłowe. Wśród opisanych

enzymów dominują esterazy i lipazy, głównie ze względu na łatwość

detekcji tego rodzaju aktywności enzymatycznej. Uzyskane w ramach

prowadzonych badań wyniki w sposób jednoznaczny wskazują na

konieczność dalszego rozwoju alternatywnych systemów ekspresyjnych

dedykowanych ekspresji genów kodujących białka ekstremofili, a także

opracowania nowych metod pozwalających na łatwy i wydajny skrining

innego rodzaju aktywności enzymatycznych. Tego rodzaju prace z pewnością

przyczynią się do zwiększenia ilości eksprymowanych unikatowych białek

pochodzących ze środowisk ekstremalnych.


196

4. Otrzymanie „idealnego enzymu” dla przemysłu

Ważne jest, aby przeszukiwanie metagenomu było racjonalne i uwzględ-

niało zapotrzebowanie przemysłu na określony enzym. Dlatego też

w pierwszym etapie na drodze zautomatyzowanego wysokowydajnego

skriningu funkcjonalnego poszukuje się klonów o właściwościach najbardziej

zbliżonych do wymagań procesowych i na tej podstawie wybiera się wstępne

warianty genu poszukiwanego białka. W następnym etapie geny poddaje się

ukierunkowanej ewolucji in vitro np. z wykorzystaniem tasowania genów

(z ang. DNA-shuffling) czy też „error prone PCR”, po czym otrzymane klony

poddaje się weryfikacji w warunkach procesowych. Ostateczny wariant

enzymu sprawdza się w skali pilotowej. W ten sposób otrzymano już

zoptymalizowane procesowo nitrylazy (Diversa) [58], alkoholową dehydro-

genazę (Schering Plough) i liczne glikozylohydrolazy (BRAIN AG, Diversa),

wykorzystywane obecnie w przemyśle [59].

Takie też podejście wykorzystała m.in. firma Diversa Corporation dla

otrzymania wykorzystywanej do upłynniania skrobi kukurydzianej α-amylazy

o podwyższonej optymalnej temperaturze działania i termostabilności,

obniżonym optimum pH (4,5) oraz obniżonych wymaganiach względem

stężenia jonów Ca2+

. W pierwszym etapie 2000 bibliotek metagenomowych

ze środowisk zakwaszonych i gorących poddano funkcjonalnemu i sekwen-

cyjnemu przeszukiwaniu, wykorzystując zautomatyzowany wysokowydajny

skrining (HTS, high through screening) w celu poszukiwania klonów

o aktywności amylolitycznej w pH 4,5 i w temp. 95oC, jednocześnie nie

wymagających jonów wapnia. 15 klonów wytypowanych w pierwszym

kroku poddano bliższej charakterystyce, z uwzględnieniem termo-

stabilności i wymagań odnośnie wapnia, zawężając wybór do 3 najlepszych

wariantów. Poprzez tasowanie genów tych trzech wyselekcjonowanych

w drugim kroku α-amylaz otrzymano 210 tys. chimerycznych wariantów,

spośród których wybrano dwa o najlepszym fenotypie dla upłynniania

skrobi kukurydzianej w założonych warunkach procesowych (pH 4,5; 95oC,

niskie stężenie wapnia). Następnie sprawdzono przydatność obu wariantów

enzymu w skali pilotowej i wybrano ostateczny wariant α-amylazy – BD

5088 [60]. Z technologicznego punktu widzenia otrzymanie metodą

ukierunkowanej ewolucji enzymu o tak specyficznych wymaganiach

procesowych jest niezwykle korzystne. Wstępne frakcjonowanie kolb

kukurydzianych na frakcję białek, olei, włóknika i skrobi jest bowiem

prowadzone w kwaśnym pH, w rezultacie czego frakcja skrobi ma pH 4,5,

natomiast stosowana do tej pory w upłynnianiu skrobi α-amylaza

B. licheniformis wykazuje optimum pH 6 i optimum temp. 90oC (naj-

bardziej korzystna dla procesu upłynniania temp. wynosi 105oC) oraz ma

ograniczoną termostabilność, zatem jej aktywne działanie wymaga


197

alkalizacji roztworu skrobi i dodania jonów Ca2+

. Kolejny stosowany

enzym – glukoamylaza scukrzająca upłynnioną skrobię wykazuje optimum

pH 4,2-4,5, tak więc niezbędne jest zakwaszenie środowiska. Działanie

następnego enzymu – izomerazy glukozy, konwertującej glukozę do

fruktozy, wymaga usunięcia jonów wapnia i jest to najdroższy etap całej

technologii.

5. Podsumowanie

Badania metagenomowe pozwalają określić taksony dominujące

w danym środowisku i mikroheterogenność genetyczną tego środowiska,

przy czym aby określić pełny genom dominującego taksonu potrzeba

minimum 6 mld pz sekwencji, zaś w przypadku gatunku występującego

w badanej próbie w małej ilości wymagana wielkość sekwencji jest

znacznie większa. Metagenomika daje ponadto wgląd w mechanizmy

ewolucji mikroorganizmów, w ich mikrobiologiczną różnorodność (dzięki

możliwości określenia w badanym środowisku liczby wariantów genów

16S rRNA) oraz różnorodność kodowanych przez nie białek. Meta-

genomika pozwala także lepiej poznać bioróżnorodność wirusów, które jak

już wiadomo dzięki informacjom z zakończonych projektów dotyczących

metagenomów „wirusowych” odgrywają większą rolę w ewolucji i ekologii

mikroorganizmów niż wcześniej sądzono. Oprócz aspektu poznawczego,

dostęp do metagenomów środowiskowych ma ogromne znaczenie

biotechnologiczne, dając dostęp do genów kodujących użyteczne molekuły,

np. enzymy, metabolity wtórne i inne małe cząsteczki.


198

Tabela 8. Wybrane enzymy adaptowane do działania w ekstremalnych warunkach pozyskane

w wyniku badań metagenomowych

Enzym Właściwości Źródło Referencje

Esteraza (EstIM1) enzym psychrofilny Gleba, Góra Ibam,

Korea [61]

Esteraza (Est97) enzym psychrofilny

Osady ze strefy międzypływowej,

archipelag Svalbard,

Arktyka

[62]

Esteraza (EstWSD) enzym halofilny Gleba, Tienszan, Chiny [63]

Esteraza (EstEP16) enzym termostabilny Osady denne z

wschodniego Pacyfiku [64]

Esterazy enzym termofilny

Woda, osady denne i

biofilm, gorące źródła,

Portugalia

[26]

Esteraza (ScsEst01) enzym psychrofilny Osady denne, Morze

Południowo Chińskie [65]

Esteraza (Est1) enzym termostabilny

Woda, gorące źródła,

Tajlandia [66]

Fosfolipaza (PLP)

Lipaza enzym psychrofilny Osady pływowe, Korea [67]

Hydrolazy

glikozydowe brak danych

Osady z dna

morskiego, Zatoka Suruga, Chiny

[68]

β-glukozydaza enzym termostabilny Jelito termita [69]

β-glukozydaza enzym alkalofilny Gleba rolna,

Gembloux, Belgia [70]

Endoglukanaza enzym acidofilny Brak danych [71]

Endocelulaza

(CEL8M)

enzym acido- i

psychrofilny

Zimna pustynia,

Himalaje [72]

Ksylanaza enzym psychrofilny Odpady z zakładów

mleczarskich [73]

α-amylaza enzym psychrofilny

Złoża kalcytu,

Grenlandia [74]

β-galaktozydaza

Proteaza alkaliczna enzym halo- i

alkalofilny Gleba, Okha-Madhi,

Indie [75]

Literatura

1. Handelsman J., Rondon M. R., Brady S. F., Clardy J., Goodman R. M.,

Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new

frontiers for natural products, Chemistry & Biology, 5 (1998), s. R245-249

2. Schloss P. D., Handelsman J., Biotechnological prospects from metagenomics,

Current Opinion in Biotechnology, 14:3 (2003), s. 303-310

3. Streit W. R., Daniel R., Jaeger K. E., Prospecting for biocatalysts and drugs

in the genomes of non-cultured microorganisms, Current Opinion in

Biotechnology, 15 (2004), s. 285-290

4. Daniel R., The soil metagenome – a rich resources for the discovery of novel

natural products, Current Opinion in Biotechnology, 15 (2004), s. 199-204

5. Hugenholtz P., Tyson G. W., Metagenomics, Nature, 455 (2008), s. 481-483


199

6. Nesme J., Cecillon S., Delmont T. O., Monier J. M., Vogel T. M., Simonet P.,

Large-scale metagenomic-based study of antibiotic resistance in the

environment, Current Biology, 24:10 (2014), s. 1096-1100

7. Su J. Q., Wei B., Xu C. Y., Qiao M., Zhu Y. G., Functional metagenomic

characterization of antibiotic resistance genes in agricultural soils from

China, Environmental International, 65 (2014), s. 9-15

8. Gonzalez-Pastor J. E., Mirete S., Novel metal resistance genes from

microorganisms: a functional metagenomic approach, Methods in Molecular

Biology, 668 (2010), s. 273-285

9. Hemme C. L., Deng Y., Gentry T. J., Fields M. W., Wu L., Barua S., Barry K.,

Tringe S. G., Watson D. B., He Z., Hazen T. C., Tiedie J. M., Rubin E. M.,

Zhou J., Metagenomic insights into evolution of a heavy metal-contaminated

groundwater microbial community, ISME Journal, 4:5 (2010), s. 660-672

10. Ortiz-Hernandez M. L., Sanchez-Salinas E., Dantan-Gonzalez E., Castrejon-

Godinez M. L., Pesticide biodegradation: mechanisms, genetic and strategies

to enhance the process, W: Biodegradation - Life of Science, Chamy R.,

Rosenkranz F., (Redaktorzy), InTech, (2013), s. 251-287

11. Loviso C. L., Lozada M., Guibert L. M., Sarango Cardenas S., Kuin R. V.,

Marcos M. S., Dionisi H. M., Metagenomics reveals the high polycyclic

aromatic hydrocarbon-degradation potential of abundant uncultured bacteria

from chronically polluted subantarctic and temperate coastal marine

environments, Journal of Applied Microbiology, 119:2 (2015), s. 411-424

12. Suenaga H., Koyama Y., Miyakoshi M., Miyazaki R., Yano H., Sota M.,

Ohtsubo Y., Tsuda M., Miyazaki K., Novel organization of aromatic

degradation pathway genes in a microbial community as revealed by

metagenomic analysis, ISME Journal, 3:12 (2009),. 1335-1348

13. Pehrsson E. C., Forsberg K. J., Gibson M. K., Ahmadi S., Dantas G., Novel

resistance functions uncovered using functional metagenomic investigations

of resistance reservoirs, Frontiers in Microbiology, 4 (2013), s. 145

14. Li A. D., Li L. G., Zhang T., Exploring antibiotic resistance genes and metal

resistance genes in plasmid metagenomes from wastewater treatment plants,

Frontiers in Microbiology, 6 (2015), s. 1025

15. Lorenz P., Schleper C., Metagenome - a challenging source of enzyme discovery,

Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 19-20 (2002), s. 13-19

16. Singh J., Behal A., Singla N., Joshi A., Birbian N., Singh S., Bali V., Batra N.,

Metagenomics: Concept, methodology, ecological inference and recent

advances, Biotechnology Journal, 4 (2009), s. 480-494

17. Cowan D., Meyer Q., Stafford W., Muyanga S., Cameron R., Wittwer P.,

Metagenomic gene discovery: past, present and future, TRENDS in

Biotechnology, 23:6 (2005), s. 321-329

18. Short J. M., Mathur E. J., Production and use of normalized DNA libraries.

USA Patent US6001574, (1999)

19. Buckley D. H., Huangyutitham V., Hsu S. F., Nelson T. A., Stable isotope

probing with 15N achieved by disentangling the effects of genome G+C

content and isotope enrichment on DNA density, Applied and Environmental

Microbiology, 73:10 (2007), s. 3189-3195


200

20. Gray N. D., Head I. M., Linking genetic identity and funtion in communities

of uncultured bacteria, Environmental Microbiology, 3:8 (2001), s. 481-492

21. Terron-Gonzalez L., Medina C., Limon-Mortes M. C., Santero E., Heterologous

viral expression systems i fosmid verctors increase the funtional analysis potential

of metagenomic libraries, Scientific Reports, 3 (2013), s. 1107

22. Martinez A., Osburne M. S., Preparation of fosmid libraries and functional

metagenomic analysis of microbial community DNA, Methods in Enzymology,

531 (2013), s. 123-142

23. Felczykowska A., Dydecka A., Bohdanowicz M., Gąsior T., Soboń M., Kobos

J., Bloch S., Nejman-Faleńczyk B., Węgrzyn G., The use of fosmid

metagenomic libraries in preliminary screening for various biological

activities, Microbial Cell Factories, 13 (2014), s. 105

24. Vester J. K., Glaring M. A., Stougaard P., Improved cultivation and

metagenomics as a new tools for bioprospecting in cold environments,

Extremophiles, 19 (2015), s. 17-29

25. Cusano A. M., Parrilli E., Marino G., Tutino M. L., A novel genetic system

for recombinant protein secretion in the Antarctic Pseudoalteromonas

haloplanktis TAC125, Microbial Cell Factories, 5 (2006), s. 40

26. Leis B., Angelov A., Mientus M., Li H., Pham V. T., Lauinger B., Bongen P.,

Pietruszka J., Goncalves L. G., Santos H., Liebl W., Identification of novel

esterase-active enzymes from hot environments by use of the host bacterium

Thermus thermophilus, Frontiers in Microbiology, 6 (2015), s. 275

27. Ferrer M., Martinez-Abarca F., Golyshin P. N. Minig genomes and

'metagenomes' for novel catalysts, Current Opinion in Biotechnology,

16 (2005), s. 588-593

28. Wall J. G., Pluckthun A., Effects of overexpressing folding modulators on the

in vivo folding of heterologous proteins in Escherichia coli, Current Opinion

in Biotechnology, 6:5 (1995), s. 507-16

29. Ferrer M., Golyshina O. V., Chernikova T. N., Khachane A. N., Reyes-Duarte

D., Santos V. A., Strompl C., Elborough K., Jarvis G., Neef A., Yakimov M.

M., Timmis K. N., Golyshin P. N., Novel hydrolase diversity retrieved from

a metagenome library of bovine rumen microflora, Environmental

Microbiology, 7 (2005), s. 1996-2010

30. Jin H., Li B., Peng X., Chen L., Metagenomi analyses reveal phylogenetic

diversity of carboxypeptidase gene sequences in activated sludge

of a wastewater treatment plant in Shanghai, China, Annals of Microbiology,

64 (2014), s. 689-697

31. Guazzaroni M. E., Beloqui A., Golyshin P. N., Ferrer M., Metagenomics

as a new technological tool to gain scientific knowledge, World Journal

of Microbiology and Biotechnology, 25 (2009), s. 945-954

32. National Research Council (US) Committee on Metagenomics: Challenges and

Functional Applications, The New Science of Metagenomics Revealing the Secrets

of Our Microbial Planet, National Academies Press, Washington, (2007)

33. Li L. L., McCorkle S. R., Monchy S., Taghavi S., van der Lelie D.,

Bioprospecting metagenomes: glycosyl hydrolases for converting biomass,

Biotechnology for Biofuels, 2 (2009), s. 10


201

34. Handelsman J., Metagenomics: application of genomics to uncultured

microorganisms, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 68:4 (2004),

s. 669-685

35. Wilmes P., Bond P. L., Metaproteomics: studying functional gene expression

in microbial ecosystems, TRENDS in Microbiology, 14:2 (2006)

36. Lee P. J., Ghorashian N., Gaige T. A., Hung P. J., Microfluidic system for

automated cell-based assays, JALA Charlottesv Va, 12:6 (2007), s. 363-367

37. Cardenas E., Tiedje J. M., New tools for discovering and characterizing

microbial diversity, Current Opinion in Biotechnology, 19 c(2008), s. 544-549

38. Velve-Casquillas G., Le Berre M., Piel M., Tran P. T., Microfluidic tools

for cell biological research, Nano Today, 5:1 (2010), s. 28-47

39. Yelton A. P., Comolli L. R., Justice N. B., Castelle C., Denef V. J., Thomas B.

C., Banfield J. F., Comparative genomics in acid mine drainage biofilm

communities reveals metabolic and structural differentiation of co-occurring

archaea, BMC Genomics, 14 (2013), s. 485

40. DeLong E. F., Microbial community genomics in the ocean, Nature Reviews

Microbiology, 3 (2005), s. 459-468

41. Coleman M. L., Sullivan M. B., Martiny A. C., Steglich C., Barry K., DeLong

E. F., Chisholm S. W., Genomic islands and the ecology and evolution

of Prochlorococus, Science, 311:5768 (2006), s. 1768-1770

42. Zaneveld J., Turnbaugh P., Lozupone C., Ley R., Hamady M., Gordon J.,

Knight R., Host-bacterial coevolution and the search for new drug targets,

Current Opinion in Chemical Biology, 12 (2008), s. 109-114

43. Singh B., Gautam S. K., Verma V., Kumar M., Singh B., Metagenomics

in animal gastrointestinal ecosystem: potential biotechnological prospects,

Anaerobe, 14 (2008), s. 138-144

44. Mori T., Kamei I., Hirai H., Kondo R., Identification of novel glycosyl

hydrolases with cellulolytic activity against crystalline cellulose from

metagenomic libraries constructed from bacterial enrichment cultures,

SpringerPlus, 3 (2014), s. 365

45. Li L. L., McCorkle S. R., Monchy S., Taghavi S., van der Lelie D.

Bioprospecting metagenomes: glycosyl hydrolases for converting biomass,

Biotechnology for Fuels, 2 (2009), s. 10

46. He S., Ivanova N., Kirton E., Allgaier M., Bergin C., Scheffrahn R. H.,

Kyrpides N. C., Warnecke F., Tringe S. G., Hugenholtz P., Comparative

Metagenomic and Metatranscriptomic Analysis of Hindgut Paunch Microbiota

in Wood- and Dung-Feeding Higher Termites, PLOS One, 8 (2013), s. 61126

47. Pope P., Denman S., Jones M., Tringe S., Barry K., Malfatti S., McHardy A.,

Cheng J., Hugenholtz P., McSweeney C., Morrison M., Adaptation to

herbivory by the Tammar wallaby includes bacterial and glycoside hydrolase

profiles different from other herbivores, PNAS, 107 (2010), s. 14793-14798

48. Wei P., Bai L., Song W., Hao G., Characterization of two soil metagenome-

derived lipases with high specificity for p-nitrophenyl palmitate, Arch

Microbiol, 191 (2008), s. 233-240

49. Elend C., Schmeisser C., Hoebenreich H., Stelle H. L., Streit W. R., Isolation

and characterization of a metagenome-derived and cold active lipase with


202

high stereospecificity for (R)-ibuprofen esters, Journal of Biotechnology,

130 (2007), s. 370-377

50. Kim E. Y., Oh K. H., Lee M. H., Kang C. H., Oh T. K., Yoon J. H., Novel

cold-adapted alkaline lipase from an intertidal flat metagenome and proposal

for a new family of bacterial lipases, Applied and Environmental

Microbiology, 75:1 (2009), s. 257-260

51. Elend C., Schmeisser C., Leggewie C., Babiak P., Carballeira J. D., Steele H.

L., Reymond J. L., Jaeger K. E., Streit W. R., Isolation and biochemical

characterization of two novel metagenome-derived esterases, Applied and

Environmental Microbiology, 72:5 (2006), s. 3637-3645

52. Jeon J. H., Kim J. T., Kang S. G., Lee J. H., Kim S. J., Characterization and

its potential application of two esterases derived from the Arctic sediment

metagenome, Marine Biotechnology, 11:3 (2008), s. 307-316

53. Li G., Wang K., Liu Y. H., Molecular cloning and characterization of a novel

pyrethroid-hydrolyzing esterase originating from the metagenome, Microbial

Cell Factories, 7 (2008), s. 38

54. Ahm J., Schroeder S., Beer M., McIlroy S., Bayly R. C., May J. W., Vasiliadis

G., Seviour R. J., Ecology of the microbial community removing phosphate

from wastewater under continuously aerobic conditions in sequencig batch

reactor, Applied and Environmental Microbiology, 73:7 (2007), s. 2257-2270

55. Gillespie D. E., Brady S. F., Bettermann A. D., Cianciotto N. P., Liles M. R.,

Rondon M. R., Clardy J., Goodman R. M., Handelsman J., Isolation of

antibiotics Turbomycin A and B from metagenomic library of soil microbial

DNA, Applied and Environmental Mocrobiology, 68:9 (2002), s. 4301-4306

56. Mergeay M., Monchy S., Vallaeys T., Auquier V., Benotmane A., Bertin P.,

Taghavi S., Dunn J., van der Lelie D., Wattiez R., Ralsonia metallidurans,

a bacterium specifically adapted to toxic metals: towards a catalogue of

metal-responsive genes, FEMS Microbiology Reviews, 27 (2003), s. 385-410

57. Shunsuke S. Plasmid vector and transformant stably retaining plasmid, USA

Patent US 9051589 B2, (2006)

58. Robertson D. E., Chaplin J. A., DeSantis G., Podar M., Madden M., Chi E.,

Richardson T., Milan A., Miller M., Weiner D. P., Wong K., McQuaid J.,

Farwell B., Preston L. A., Snead M. A., Keller M., Mathur E., Kretz P. L.,

Burk M. J., Short J. M., Exploring nitrilase sequence space form

enantioselective catalysis, Applied and Environmental Microbiology, 70:4

(2004), s. 2429-2436

59. Lorenz P., Eck J., Metagenomics and industrial applications, Nature Reviews

Microbiology, 3 (2005), s. 510-516

60. Richardson T. H., Tan X., Frey G., Callen W., Cabell M., Lam D,. Macomber

J., Short J. M., Robertson D. E., Miller C., A novel, high performance enzyme

for starch liquefaction - Discovery and optimization of a low pH, thermostable

α-amylase, The Journal of Biological Chemistry, 277 (2002), s. 26501-26507

61. Ko K. C., Rim S. O., Han Y., Shin B. S., Kim G. J., Choi J. H., Song J. J.

Identification and characterization of a novel cold-adapted esterase from

a metagenomic library of mountain soil, Journal of Industrial Microbiology

and Biotechnology, 39 (2012), s. 681-689


203

62. Fu J., Leiros H. K., de Pascale D., Johnson K. A., Blencke H. M., Landfald B.,

Functional and structural studies of a novel cold-adapted esterse from

an Arctic intertidal metagenomic library, Applied Microbiology and

Biotechnology, 97 (2013), s. 3965-3978

63. Wang S., Wang K., Li L., Liu Y., Isolation and characterization of a novel

organic solvent-tolerant and halotolerant esterase from a soil metagenomic

library, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 95 (2013), s. 1-8

64. Zhu Y., Li J., Cai H., Ni H., Xiao A., Hou L., Characterization of a new

and thermostable esterase from a metagenomic library, Microbiological

Research, 168 (2013), s. 589-597

65. Zhang H., Li F., Chen H., Zhao J., Yan J., Jiang P., Li R., Zhu B., Cloning,

expression and characterization of a novel esterase from a South China Sea

sediment metagenome, Chinese Journal of Oceanology an Limnology, 33:4

(2015), s. 819-827

66. Tirawongsaroj P., Sriprang R., Harnpicharnchai P., Thongaram T., Champreda

V., Tanapongpipat S., Pootanakit K., Eurwilaichitr L., Novel thermophilc

and thermostable lipolytic enzymes from a Thailand hot spring metagenomic

library, Journal of Biotechnology, 133 (2008), s. 42-49

67. Lee M. H., Oh K. H., Kang C. H., Kim J. H., Oh T. K., Ryu C. M., Yoon J. H.,

Novel metagenome-derived, cold-adapted alkaline phospholipase with

superior lipase activity as an intermediate between phospholipase and lipase,

Applied and Environmental Microbiology, 78 (2012), s. 4959-4966

68. Klippel B., Sahm K., Basner A., Wiebusch S., John P., Lorenz U., Abe F.,

Takahashi K., Kaiser O., Goesmann A., Jaenicke S., Grote R., Horikoshi K.,

Antranikian G., Carbohydrate-active enzymes identified by metagenomic

analysis of deep-sea sediment bacteria, Extremophiles, 18 (2014), s. 853-863

69. Wang Q., Qian C., Zhang X. Z., Liu N., Yan X., Zhou Z., Characterization

of a novel thermostable b-glucosidase from a metagenomic library of termite

gut, Enzyme and Microbial Technology, 51 (2012), s. 319-324

70. Biver S., Stroobants A., Portetelle D., Vandenbol M., Two promising alkaline

β-glucosidases isolatede by functional metagenomics from agricultural soil,

including one showing high tolerance towards harsch detergents, oxidants

and glucose, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,

41 (2014), s. 479-488

71. Xiang L., Li A., Tian C., Zhou Y., Zhang G., Ma Y., Identification

and characterization of new acid-stable endoglucanase from metagenomic

library, Protein Expression and Purification, 102 (2014), s. 20-26

72. Bhat A., Riyaz-Ul-Hassan S., Ahmad N., Srivastava N., Johri S., Isolation

of cold-active, acidic endocellulase from Ladakh soil by functional

metagenomics, Extremophiles, 17 (2013), s. 229-239

73. Lee C. C., Kibblewhite-Accinelli R. E., Wagschal K., Robertson G. H., Wong

D. W., Cloning and characterization of cold-active xylanase enzyme from

an environmental DNA library, Extremophiles, 10 (2006), s. 295-300

74. Vester J. K., Glaring M. A., Stougaard P., Discovery of novel enzymes with

industrial potential from a cold and alkaline environment by a combination


204

of functional metagenomics and culturing, Microbial Cell Factories,

13 (2014), s. 72

75. Purohit M., Singh S., A metagenomic alkaline protease from saline habitat:

cloning, over-expression and fuctional attributes, International Journal

of Biological Macromolecules, 53 (2013), s. 138-143


Streszczenie

Bioróżnorodność środowiska naturalnego jest ogromna, jednak jedynie ok. 1% mikro-

organizmów wykazuje zdolność wzrostu w warunkach laboratoryjnych. Metagenomika pozwala analizować świat mikroorganizmów niehodowalnych lub trudno hodowalnych bez

konieczności ich izolowania i namnażania. Dzięki metagenomice możliwe jest nie tylko

poznanie składu populacyjnego danego środowiska poprzez izolację całkowitego DNA

(eDNA) i sekwencjonowanie fragmentów zmiennych, np. 16S rDNA dla bakterii lub 18S rDNA dla eukariotów, ale także poznanie różnorodności białek drobnoustrojów oraz

bioróżnorodności wirusów. Oprócz znaczenia poznawczego, dostęp do metagenomów

środowiskowych ma znaczenie biotechnologiczne i umożliwia zidentyfikowanie genów

kodujących użyteczne molekuły, np. enzymy, metabolity wtórne i inne małe cząsteczki. Badania metagenomów środowisk ekstremalnych pozwoliły na znalezienie licznych

enzymów o dużym potencjale biotechnologicznym. W niniejszym opracowaniu

przedstawiono techniki oraz wybrane efekty badań metagenomowych, m.in. poznanie

bioróżnorodności skrajnie ubogiego w substancje odżywcze i z tego powodu uważanego za „morską pustynię” Morza Sargassowego.

Metagenome as a source of unique and extremophilic biomolecules

Abstract

The biodiversity of natural environments is huge, but only 1% of microorganisms have the

ability to grow under laboratory conditions. Metagenomics allows us to analyse the world

of non-culturable or ‘viable but nonculturable’ microorganisms without isolation and cultivation. With metagenomics it is possible to get to know the composition of the

environmental population by total DNA (eDNA) isolation and then sequencing of the

variable fragments such a 16S rDNA gene for bacteria and 18S rDNA gene for eukaryotes.

Moreover, metagenomics helps acquire knowledge about microbial proteins and biodiversity of viruses. In addition to the cognitive importance, access to environmental metagenomes

has biotechnological significance and gives access to the genes encoding the useful

molecules, such as enzymes, secondary metabolites and other small molecules.

Metagenomic research of extreme environments made it possible to find a great number of enzymes with a high biotechnological potential. This study presents basic methods and

selected results of metagenomics research, for example recognition of biodiversity of the

Sargasso Sea which is extremely poor in nutrients.

205

Agnieszka Ewa Wiącek1, Małgorzata Jurak, Renata Kalisio

Badanie wpływu pH i siły jonowej

na efektywność enzymu PLA2

w układach emulsyjnych

z udziałem liposomów DPPC

1. Wstęp

Emulsje znajdują szerokie zastosowanie w wielu dziedzinach życia

człowieka, jak i gałęziach przemysłu. Codziennie przemysł światowy

wytwarza różnego typu emulsje i mikroemulsje, których celem jest znaczna

poprawa życia człowieka. W skład emulsji wchodzą surfaktanty, nazywane

środkami powierzchniowo-czynnymi, obniżające napięcie międzyfazowe

i stabilizujące układ. Surfaktanty syntetyczne oprócz zalet posiadają

również wady, do których zaliczyć można działanie szkodliwe i drażniące

na organizm człowieka, a także destrukcyjne działanie na środowisko

naturalne. Dlatego też wielkim sukcesem okazało się zastąpienie

w niektórych przypadkach surfaktantów biosurfaktantami. Biosurfaktanty

to środki powierzchniowo czynne pochodzenia naturalnego. Należy do nich

dipalmitylofosfatydylocholina (DPPC), która wchodzi w skład żywych

komórek (naturalnych błon biologicznych) oraz nie wykazuje szkodliwego

działania na organizm ludzki i środowisko. Dipalmitylofosfatydylocholina

w emulsjach typu o/w spełnia głównie rolę emulgatora. Jest ważnym

surowcem dla przemysłu kosmetycznego, spożywczego oraz chemii

gospodarczej, może być również wykorzystana w medycynie i farmacji.

Z perspektywą tych wielorakich zastosowań wiąże się badanie wpływu

enzymu na cząsteczki DPPC zaadsorbowane na powierzchni n-tetradekanu

w postaci warstwy, jak i wpływu enzymu na liposomy DPPC obecne

w emulsji. Liposomy to układy sferyczne zbudowane z dwumolekularnej

warstwy lipidowej. Badania struktur agregacyjnych cząsteczek fosfatydylo-

choliny omówione w tej pracy można odnieść do układów biologicznych,

gdyż tworzące się na kropelkach emulsji n-tetradekan/etanol warstwy

lipidowe, mają strukturę analogiczną jak błony biologiczne występujące

w każdym żywym organizmie. Istotne wydaje się również badanie wpływu

siły jonowej na warstwy fosfolipidowe i liposomy obecne w emulsji przed

1 [email protected] Zakład Zjawisk Międzyfazowych, Katedra Chemii Fizycznej,

Wydział Chemii UMCS www.umcs.pl

Agnieszka Ewa Wiącek, Małgorzata Jurak, Renata Kalisio

206

i po modyfikacji enzymatycznej w aspekcie ich przepuszczalności

i transportu jonów lub cząsteczek polarnych. Badania te są szczególnie

ważne, gdyż liposomy mogą być doskonałym nośnikiem leków, enzymów,

jak również substancji czynnych kosmetycznie [1‚3].

2. Cel pracy

Celem niniejszej pracy było określenie wpływu liposomów DPPC na

właściwości elektrokinetyczne emulsji n-tetradekan/etanol. Alkohol etylowy

spełnia w tego typu emulsjach rolę kosurfaktantu. Badano wpływ pH oraz

siły jonowej elektrolitu (NaCl lub CaCl2) bez i w obecności enzymu

fosfolipazy A2 na zmiany potencjału elektrokinetycznego (zeta) i wielkości

kropelek emulsji.

W przypadku emulsji n-tetradekan/etanol, liposomy DPPC prowadzono

badania przy pH=4, pH naturalnym (tj. właściwym dla danej emulsji,

zmierzonym zaraz po homogenizacji bez ustalania pH), 8 i 10 w celu

pełniejszej charakterystyki układów emulsyjnych. Dalszym etapem tych

badań było określenie wpływu enzymu występującego w organizmie

ludzkim fosfolipazy A2 na właściwości emulsji, które można wprowadzić

do układu krwionośnego lub trawiennego. Badania te przeprowadzano

tylko w pH naturalnym i pH=8, gdzie enzym ten jest najbardziej

efektywny.

Zachowanie się emulsji badano poprzez pomiary rozkładu wielkości

kropelek, ich średnicy efektywnej oraz potencjału zeta. Badania te

w funkcji czasu dla tej samej próbki emulsji, w zależności od pH, stężenia

emulgatora oraz kosurfaktantu pozwalają na poznanie jej właściwości i są

dobrą bazą do badań właściwości fizykochemicznych układów emul-

syjnych z udziałem enzymów jako nanonarzędzi. Enzym wykorzystywany

w badaniach należy do grupy fosfolipaz. Fosfolipazy A2 to enzymy z klasy

acetylohydrolaz, które hydrolizują wiązanie estrowe w pozycji sn-2

glicerofosfolipidów, w ten sposób uwalniają wolny kwas tłuszczowy

i lizofosfolipid [1, 2]. Fosfolipaza A2 bierze udział w syntezie wielu

efektorów przekazywania sygnałów w komórce, jak również jest bardzo

ważnym enzymem regulującym metabolizm komórki. Wyróżniamy trzy

grupy fosfolipaz ssaków: wydzielnicze, wewnątrzkomórkowe zależne od

jonów Ca2+

i wewnątrzkomórkowe niezależne od jonów Ca2+

. Fosfolipazy

wydzielnicze charakteryzują się małą masą cząsteczkową (13-16 kDa),

dużą ilością wiązań disiarczkowych oraz obecnością jonów Ca2+

, rzędu

milimoli niezbędnych do przeprowadzenia procesu katalizy (Rys. 1). Nie są

specyficzne względem kwasu tłuszczowego. Fosfolipazy A2 zależne od

jonów Ca2+

występują w tkankach ssaków, w tym także w organizmie

ludzkim (m.in. mózg, płuca, nerki, serce, trzustka). Enzymy te mają

Badanie wpływu pH i siły jonowej na efektywność enzymu PLA2

w układach emulsyjnych z udziałem liposomów DPPC

207

stosunkowo dużą masę cząsteczkową i wykazują specyficzność w stosunku

do kwasu arachidonowego, co sprawia, że odgrywają znaczącą rolę

w tworzeniu prozapalnych mediatorów lipidowych. Fosfolipazy A2

niezależne od jonów Ca2+

są szeroko rozpowszechnione u różnych

gatunków zwierząt i w różnych komórkach (ludzkie limfocyty B, trzustka

szczura, komórki nerki królika). Mają udział w tworzeniu błon

cytoplazmatycznych oraz w schorzeniach takich, jak niedokrwienie mięśnia

sercowego [1‚3].

Rysunek 1. Budowa cząsteczki enzymu – fosfolipazy A2 [2].

Badania z udziałem enzymów opisane w literaturze są głównie

prowadzone na podłożu stałym. Dużo mniej doniesień dotyczy natomiast

pomiarów z udziałem enzymów w układach emulsyjnych, stąd zasadność

badań przeprowadzonych w ramach tej pracy. Dodatkowo charakterystyka

układów emulsyjnych z uwzględnieniem rozmiarów liposomów fosfo-

lipidowych jest szczególnie istotna ze względu na wielkość transportowanych

przez nie cząsteczek substancji aktywnych i potencjalne możliwości

aplikacyjne.


3.1. Materiały

W badaniach wykorzystywano następujące odczynniki: n-tetradekan

(99% Fluka), etanol (96% POCH), fosfolipid DPPC (1,2-dipalmitylo-sn-

glicero-3-fosfocholina, 99% Sigma), enzym fosfolipazę A2 (fosfolipaza A2,

Sigma-Aldrich), elektrolity: NaCl, CaCl2, HCl, NaOH (POCH) oraz wodę

redestylowaną z systemu Milli-Q Plus.


208

3.1.1. Otrzymywanie liposomów

Liposomy fosfolipidowe otrzymywano z dyspersji fosfolipidu, DPPC

w etanolu. W tym celu odważono 0,23 g DPPC i rozpuszczano w 10 ml

96% etanolu. Tak przygotowaną dyspersję wstrzykiwano szybko i równo-

miernie (po 1 ml za pomocą mikrostrzykawki Hamiltona) do 90 ml

ogrzanej do temperatury 45°C wody z Milli-Q Plus i mieszano

w homogenizatorze. Liposomy przygotowuje się w temperaturze

nieznacznie przewyższającej temperaturę przejścia fazowego dla danego

fosfolipidu (dla DPPC temperatura przejścia wynosi 41 oC). Każdą porcję

mieszano 1 minutę przy szybkości 10000 obr./min. Po dokładnym

wymieszaniu całość przenoszono do foliowych rurek dializacyjnych

i przeprowadzano przynajmniej 3-krotną dializę wobec 1 litra czystej fazy

wodnej w celu usunięcia resztek etanolu. Przed każdą zmianą wody

sprawdzano przewodnictwo, aż do uzyskania przewodnictwa zbliżonego do

przewodnictwa wody z systemu Milli-Q Plus, tj. max. 18 µS/cm.

3.1.2. Emulsja n-tetradekan/etanol, liposomy DPPC

Aby sporządzić emulsje n-tetradekan, etanol/liposomy DPPC do kolby

miarowej na 100 ml odmierzano 0,1 ml n-tetradekanu, odpowiednią ilość

etanolu w zależności od stężenia oraz 1,12 ml dyspersji liposomów

przygotowanych zgodnie z opisem w punkcie 3.1.1. Następnie kolbę

uzupełniano do kreski wodą redestylowaną z systemu Milli-Q Plus lub

roztworem soli (NaCl lub CaCl2) o odpowiednim stężeniu i homo-

genizowano 10 minut przy szybkości 10000 obr./min.

3.1.3. Emulsja n-tetradekan, etanol/liposomy DPPC + fosfolipaza A2

Aby sporządzić emulsje z enzymem postępowano analogicznie, jak

w wyżej wymienionych punktach, z tą różnicą, że po 9 minutach

homogenizacji dodawano 1 mg enzymu fosfolipazy A2 i włączano

homogenizator ponownie na 1 minutę.

W przypadku badania wpływu pH, przygotowywano cztery analogiczne

emulsje w kolbach o pojemności 100 cm3. Do pierwszej kolby dodawano

0,01 M HCl w celu uzyskania pH=4, w drugiej kolbce nie regulowano

wartości pH (pH naturalne), do trzeciej i do czwartej kolbki dodawano

0,01 M NaOH, aby otrzymać pH=8 i pH=10. Dalej z próbkami postępo-

wano analogicznie, jak we wcześniejszych punktach.



209

3.2. Metody

W badaniach stosowano następujące aparaty: zetametr (ZetaPlus,

Brookhaven), homogenizator (SilentCrusher M, Heidolph) wannę ultra-

dźwiękową (Unima UM4, Unitra), wagę laboratoryjną (Precisa 125A,

Medicat LTD), pH-metr (pH-metr CP-501, Elmetron). Do pomiaru wielkości

liposomów i/lub kropelek układów emulsyjnych stosowano metodę DLS

wykorzystującą zjawiska oparte na dynamicznym rozpraszaniu światła.

Metoda dynamicznego rozpraszania światła (DLS) służy do pomiarów

wielkości cząstek w zakresie od kilku nanometrów do 1 mikrometra.

W literaturze pojawiają się również inne określenia dla tej metody:

hydrodynamiczne rozpraszanie światła (HLS), spektroskopia korelacji

fotonów (PLS) czy quasi-elastyczne rozpraszanie światła (QELS). Badania

polegają na pomiarach zmiany długości fali świetlnej oraz czasowych

zmian w ilości rozproszonego przez cząstki światła [4, 5]. Schemat układu

pomiarowego wykorzystywanego w metodzie DLS przedstawiono na Rys. 2.

Rysunek 2. Schemat układu pomiarowego DLS [6].

Źródłem światła w układzie jest laser, który daje spójną wiązkę. Wiązka

światła jest kierowana systemem soczewek i zwierciadeł na kuwetę

pomiarową, utrzymywaną w stałej zadanej temperaturze. Światło rozpro-

szone przez cząstki wyłapywane jest przez fotopowielacz ustawiony pod

pewnym kątem w stosunku do wiązki padającej. Analiza oscylograficzna

sygnału fotopowielacza wykazuje, że intensywność sygnału nie jest stała

i zmienia się wraz z ruchem cząstek. Dodatkowo fale świetlne mogą ulec

interferencji i w konsekwencji otrzymywany jest sygnał zmienny w czasie.

Gdy cząstki są małe to wykazują szybkie ruchy dyfuzyjne i w związku

z tym szybkie fluktuacje. Natomiast, gdy w próbce znajdują się cząstki

o większym rozmiarze dyfundują one wolniej, a co za tym idzie powodują

wolniejsze fluktuacje. Zmiany w intensywności światła docierają do


210

detektora niosąc informacje o wielkości cząstek. Aby uzyskana informacja

była użyteczna należy użyć funkcji korelacyjnej. Komputer, sprzężony

z urządzeniem (dzetametr Zeta Plus/Plus) automatycznie kontroluje przebieg

funkcji, włączając w to wybór czasu próbkowania oraz czas pomiaru [4, 6].

Przy pomocy techniki DLS łatwo opisuje się cząstki sferyczne,

natomiast problem pojawia się przy opisie cząstek niesferycznych. Dla

gładkich sztywnych kul rozproszonych w cieczy używa się równania

Stokesa-Einsteina, dzięki któremu można wyznaczyć promień hydro-

dynamiczny cząstki [6]:

C

BH

T

TkR

6

(1)

gdzie: RH – promień hydrodynamiczny, kB – stała Boltzmana, T – tem-

peratura ośrodka, – lepkość ośrodka, Tc – współczynnik ruchu

translacyjnego.

Do pomiaru potencjału elektrokinetycznego najczęściej stosowanym

zjawiskiem elektrokinetycznym jest elektroforeza. Polega ona na ruchu

cząstek w kierunku dodatniej lub ujemnej elektrody pod wpływem pola

elektrycznego o stałym natężeniu E. Naładowane cząstki wędrują ku

elektrodom o przeciwnym do nich ładunku, czemu przeciwstawiają się siły

lepkości. Gdy siły przyciągania elektrostatycznego i siły lepkości osiągną

stan równowagi, to cząsteczki poruszają się ruchem jednostajnym [6‚8].

Rysunek 3. Schemat procesu elektroforezy [9].

Według Henry’ego ruchliwość elektroforetyczną cząstek o dowolnej

wielkości można wyrazić wzorem:



211

)( afU e

(2)

gdzie: Ue – ruchliwość elektroforetyczna, ε – przenikalność elektryczna,

δ –potencjał elektrokinetyczny, ε – lepkość ośrodka, f(κa) – funkcja

Henry’ego (a – promień cząstki, κ – parametr Debaya– Hückela zależny od

stężenia elektrolitu, 1/κ – miara efektywnej grubości podwójnej warstwy

elektrycznej). Dla małych wartości κa (κa ≤1) funkcja Henry’ego przyjmuje postać równania Hückela:

3

2eU

(3)

Dla dużych wartości κa (κa ≥ 103) stosuje się równanie

Smoluchowskiego:

eU (4)

Pomiary średnicy efektywnej, jak również potencjału zeta emulsji

przeprowadzano w funkcji czasu, tj. po 5 minutach, 15 minutach,

30 minutach, po godzinie i 2 godzinach od momentu przygotowania

emulsji. Zaletą stosowanego przyrządu (zetametr ZetaPlus, firmy

Brookhaven) jest możliwość zbadania średnicy średniej lub efektywnej

oraz potencjału zeta dla tej samej porcji emulsji lub suspensji. Po

zmierzeniu średnicy w kuwecie pomiarowej umieszcza się elektrodę

i metodą mikroelektroforezy mierzy się ruchliwość elektroforetyczną.

4. Analiza wyników

4.1. Wpływ pH na potencjał zeta i średnicę efektywną emulsji

n-tetradekan/ etanol, liposomy DPPC

Na Rys. 4 przedstawiono zależności potencjału zeta i średnicy efektywnej

emulsji n-tetradekan, 0,5 M etanol/liposomy DPPC dla 4 różnych wartości pH.

W badaniach roztwór etanolu został użyty w funkcji kosurfaktantu. W pH=4

zanotowano duży skok potencjału od wartości początkowej -59,2 mV do

-47,3 mV, spowodowany gromadzeniem jonów H+ na powierzchni liposomów

wraz z upływem czasu. Dla pH naturalnego (5,9) stan równowagi ustalił się już

po 15 minutach od homogenizacji, a wartość średnia potencjału wyniosła

-38,6 mV. Niewielkie zmiany potencjału odnotowano również w pH=8, zakres

zmian od -62,4 mV do -58,6 mV sugeruje, że emulsja jest stabilna, a na

powierzchni liposomów znajdują się jony OH-. Wysoki ujemny potencjał


212

zeta może pochodzić również od dipoli wody i etanolu na powierzchni

liposomów i/lub kropelek emulsji (Rys. 4a).

0 20 40 60 80 100 120

-68

-64

-60

-56

-52

-48

-44

-40

-36

-32

-28

-24

pH=4

pHnat

=5,9

pH=8

pH=10P

ote

ncja

ł d

zeta

[m

V]

Czas [min]

a)

0 20 40 60 80 100 120200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

pH=4

pHnat

=5,9

pH=8

pH=10

Śre

dn

ica

efe

kty

wn

a [

nm

]

Czas [min]

b)

Rysunek 4. Wpływ pH na: a) potencjał zeta b) średnicę efektywną kropelek emulsji n-tetradekan,

0,5 M etanol/liposomy DPPC

W pH alkalicznym (pH=10) zakres zmian pH jest większy od -69,6 mV

do -57,4 mV. Początkowy wysoki potencjał tłumaczy się obecnością jonów

OH-, które w miarę ustalania się równowagi adsorpcyjnej w mniejszym

stopniu generują potencjał elektrokinetyczny. W pH=10 ładunek może

pochodzić również od naładowanych fragmentów DPPC.



213

Porównując średnice efektywne emulsji z liposomami (Rys. 4b)

stwierdzono, że w środowisku kwaśnym układ n-tetradekan, 0,5M

etanol/liposomy DPPC najszybciej osiąga stan równowagi, początkowo

wysokie średnice efektywne rzędu 748 nm maleją do 596 nm. Spowodowane

jest to prawdopodobnie opadaniem większych liposomów na dno kuwety.

Analogicznie dzieje się w przypadku pH naturalnego (5,9) z tym, że średnice

efektywne są tu mniejsze i przyjmują wartości w zakresie od 517 nm do

351 nm. W pH=8 również obserwowano spadek średnicy efektywnej emulsji

w czasie, wartości te zmieniają się w przedziale od 705,8 nm do 581,7 nm.

Stan równowagi zostaje osiągnięty w 60 minucie od zakończenia

homogenizacji. W środowisku silnie zasadowym (pH=10) średnice efektywne

w ciągu 2 godzin maleją od 616 nm do 397 nm. Wszystkie układy są dość

stabilne w czasie, o czym mogą świadczyć wysokie ujemne wartości

potencjału zeta nieznacznie zmieniające się w czasie.

Na podstawie uzyskanych wyników można wysnuć wniosek, iż

struktury agregacyjne DPPC w postaci liposomów w nieznacznym stopniu

adsorbują się na powierzchni kropelek n-tetradekanu i ich dodatek do

emulsji w niewielkim stopniu zmniejsza ujemną wartość potencjału zeta

emulsji bez fosfolipidu. Wpływ pH jest słabo widoczny w przypadku

emulsji z liposomami, zwłaszcza na wartości średnicy efektywnej.

Prawdopodobnie jony pochodzące z ustalania pH, jak również same

liposomy w niewielkim stopniu generują potencjał zeta kropelek emulsji

n-tetradekan, etanol/liposomy DPPC. Na charakterystykę fizykochemiczną

emulsji najbardziej wpływają dipole wody i etanolu, a w mniejszym

stopniu liposomy.

Kolejnymi badanymi układami były emulsje n-tetradekanu w roztworze

etanolu o wyższym stężeniu (1 M) z dodatkiem liposomów DPPC.

W układach emulsyjnych cząsteczki DPPC skierowane są grupą –N+(CH3)3

do ujemnie naładowanej powierzchni kropelek emulsji, natomiast na

zewnątrz pozostaje ładunek ujemny pochodzący od grupy fosforanowej

fosfatydylocholiny i to on może generować powstanie wyższego potencjału

ujemnego. W pH naturalnym cząsteczki DPPC nie są obdarzone

ładunkiem. W pH alkalicznym głównym czynnikiem determinującym

wysoki potencjał jest obecność jonów OH- oraz dipoli wody i alkoholu.

Rozkład potencjału w czasie w pH kwaśnym waha się w granicach od

-35,7 mV do -28,9, po 30 min od homogenizacji potencjał stabilizuje się

(Rys. 5a). Wartości potencjału dla pH naturalnego (pH=4,6) są zbliżone do

wartości potencjału w pH=4. Wynika to z bardzo małej różnicy pH,

pomiędzy badanymi układami. Przechodząc do pH alkalicznego równego 8

obserwowano wyraźny wzrost potencjału do bardziej ujemnych wartości,

układ ten wykazuje dużą stabilność. Potwierdzają to bardzo stabilne

średnice rzędu 270 nm. Średnia wartość potencjału zeta wynosi -50 mV.


214

W silnie zasadowym środowisku (pH=10), potencjał zeta emulsji

przyjmuje wartości znacznie niższe mieszczące się w granicach od -69 mV

do -74 mV. Tu analogicznie, jak dla emulsji z 0,5 M etanolem, DPPC

w postaci liposomów nieznacznie redukuje ujemny potencjał zeta

i w niewielkim stopniu wpływa na wartości średnicy efektywnej.

0 20 40 60 80 100 120-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

pH=4

pHnat

=4,6

pH=8

pH=10

Pote

ncja

ł zeta

[m

V]

Czas [min]

a)

0 20 40 60 80 100 120

200

400

600

800

1000

1200

pH=4

pHnat

=4,6

pH=8

pH=10

Śre

dn

ica

efe

kty

wn

a [

nm

]

Czas [min]

b)

Rysunek 5. Wpływ pH na: a) potencjał zeta b) średnicę efektywną kropelek emulsji 0,1 ml

n-tetradekan, 1 M etanol/liposomy DPPC



215

Rozpatrując wpływ pH na średnice efektywne emulsji 0,1 ml n-tetra-

dekanu w roztworze 1 M etanolu z dodatkiem liposomów stwierdzono, że

układ wykazuje dużą stabilność w środowisku kwaśnym (pH=4), jak

i lekko zasadowym (pH=8). Średnice efektywne tych dwóch układów mają

zbliżone wartości rzędu 250 nm. Natomiast w przypadku pH naturalnego

(4,6) i pH=10 zaobserwowano znaczny spadek średnicy efektywnej wraz

z upływem czasu. Zakres zmian w pH naturalnym od 1155 nm do 555,8 nm

jest dużo większy, niż w pH zasadowym od 680 nm do 256 nm. Najniższa

bezwzględna wartość potencjału w pH naturalnym rzędu 20 mV nie

zapewnia stabilności, co wpływa na duże fluktuacje średnicy efektywnej

w tym pH (Rys. 5 a, b). Na podstawie otrzymanych wyników można

wysnuć wniosek, że najbardziej stabilną emulsją jest emulsja n-tetradekan,

1 M etanol/liposomy DPPC w pH 8.

4.2. Badanie wpływu siły jonowej na potencjał zeta i średnicę

efektywną emulsji n-tetradekan, etanol/liposomy DPPC

Jony wapnia wykazują specyficzne działanie w stosunku do fosfa-

tydylocholiny. Cząsteczka fosfatydylocholiny posiada grupy fosforanową

i trimetyloamonową oddzielone dwiema grupami metylowymi (Rys. 6).

Taka struktura wiąże się z występowaniem dwóch form fosfatydylocholiny:

jedna polega na maksymalnym odsunięciu ładunków, druga zaś na

częściowym rozdzieleniu ładunków, które jest wynikiem występowania

wewnętrznego wiązania między grupą fosforanową a trimetyloamonową

analogicznie jak w solach.

Rys. 6 przedstawia model Fisher-Hirschfelder-Taylora warstwy fosfolipidu

dla różnych rodzajów fosfatydylocholiny i ich interakcje z jonami wapnia.

Wraz ze wzrostem nienasycenia tłuszczowych łańcuchów acylowych wzrasta

przestrzeń efektywna cząsteczki (Rys. 6 a), ze wzrostem nasycenia tłusz-

czowych łańcuchów wzmacnia się wiązanie z jonami wapnia (Rys. 6 b) [10].


216

Rysunek 6. Model Fisher-Hirschfelder-Taylora a) warstwy polarnej, liczone od lewej:

dioleoilofosfatydylocholiny, fosfatydylocholiny z jaja kurzego i dipalmitylofosfatydylocholiny;

b) Interakcje jonu wapnia z odpowiednią fosfatydylocholiną. Kolorem pomarańczowym zaznaczono jony wapnia [10].

Fosfatydylocholina dioleoilowa wykazuje wewnętrzne wiązanie typu

soli pomiędzy grupami: fosforanową a trimetyloamonową (lewa strona).

Przerywana linia w fosfatydylocholinie z jaja kurzego symbolizuje słabe

interakcje grupy fosforanowej z jonami wapnia i z grupą trimetylo-

amonową (środkowy schemat). Ciągła linia pomiędzy jonami wapnia

a grupą fosforanową w fosfatydylocholinie dipalmitynowej oznacza mocne

oddziaływanie (prawa strona) [10].

Wpływ siły jonowej badano w emulsji n-tetradekan, 0,5 M eta-

nol/liposomy DPPC w roztworze NaCl lub CaCl2 o określonych stężeniach.

Potencjał zeta kropelek emulsji n-tetradekan, 0,5 M etanol/liposomy DPPC

mieści się w granicach od -45,5 mV do -37,9 mV (Rys. 7). Prawdo-

podobnie potencjał zeta jest generowany głównie przez dipole wody

i alkoholu zgromadzone na powierzchni liposomów DPPC. Wpływ elektrolitu

na emulsję z liposomami jest łatwo zauważalny. Dla wszystkich trzech

badanych emulsji uzyskano średnią wartość potencjału w pobliżu 0 mV.



217

0 20 40 60 80 100 120-50

-45

-40

0

10

woda

10-3M NaCl

3,33*10-4M CaCl

2

10-3M CaCl

2

Po

ten

cja

ł d

zeta

[m

V]

Czas [min]

a)

0 20 40 60 80 100 120

1000

2000

3000

4000

5000

woda

10-3M NaCl

3,33*10-4M CaCl

2

10-3M CaCl

2

Śre

dnic

a e

fekty

wna [

nm

]

Czas [min]

b)

Rysunek 7. Wpływ siły jonowej na: a) potencjał zeta b) średnicę efektywną kropelek emulsji n-tetradekan, 0,5 M etanol/liposomy DPPC w pH naturalnym

Dla układu, w którym elektrolitem był roztwór wodny NaCl wartość

średnia potencjału wynosi 1,6 mV, dla układu z CaCl2 o stężeniu 3,33x10-4 M

wartość średnia to 1,3 mV, natomiast dla emulsji z CaCl2 o stężeniu 10-3

M

potencjał waha się w granicach od -2,51 mV do 4,31 mV i ten układ można

uznać za stabilny, gdyż zarówno potencjał elektrokinetyczny jest stabilny,


218

jak i średnice efektywne (Rys. 7). Przy małej sile jonowej roztworu

elektrolitu potencjał zeta jest ujemny, ponieważ grupy fosfatydylowe, które

posiadają ładunek ujemny są odsłonięte. Gdy zwiększa się siła jonowa

roztworu, grupy polarne przyjmują ułożenie wzdłuż osi cząsteczki i na

powierzchni warstwy znajdują się grupy cholinowe, posiadające dodatni

ładunek elektryczny.

W układzie n-tetradekan, 0,5 M etanol/liposomy DPPC bez dodatku

elektrolitu obserwowano spadek wartości średnicy efektywnej od 562 nm

do 351 nm w czasie 2 godzin. Badając wpływ siły jonowej na średnice

efektywne emulsji można stwierdzić, że elektrolit CaCl2 powoduje jej

znaczący wzrost, trzy- a nawet pięciokrotny. Uzyskano wartości średnicy

efektywnej rzędu 2400 nm dla CaCl2 o stężeniu 3,33x10-4

M oraz 1500 nm

dla 10-3

M CaCl2. Wyższe stężenie jonów wapnia w tych układach

gwarantuje pewną stabilizację utworzonych struktur DPPC zaadsorbo-

wanych na kropelkach emulsji lub występujących samodzielnie w emulsji.

Zaobserwowano, że jony sodu nie posiadają właściwości stabilizujących,

średnice efektywne emulsji z NaCl zmieniają się w zakresie od 2584 nm do

3781 nm wraz z upływem czasu. Prawdopodobnie w emulsji tworzą się

większe agregaty w obecności jonów Na+, a niski potencjał zeta kropelek

emulsji w pobliżu 0 mV sprzyja agregacji (Rys. 7 a, b).

Kolejnym badanym układem była emulsja n-tetradekan, 1 M eta-

nol/liposomy DPPC. Stwierdzono, że dodatek elektrolitu do układu

powoduje spadek bezwzględnych wartości potencjału zeta emulsji (Rys. 8)

w stosunku do wartości uzyskanych dla emulsji n-tetradekan, 1 M eta-

nol/liposomy DPPC w wodzie, gdzie zmierzony potencjał zeta przyjmował

wartości od -23,7 mV do -31,9 mV.



219

0 20 40 60 80 100 120

-36

-32

-28

-24

-12

-8

-4

0

4

8

woda

10-3M NaCl

3,33*10-4M CaCl

2

10-3M CaCl

2

Po

ten

cja

ł ze

ta [

mV

]

Czas [min]

a)

0 20 40 60 80 100 120

600

750

900

1050

1200

1350

1500

woda

10-3M NaCl

3,33*10-4M CaCl

2

10-3M CaCl

2

Śre

dnic

a e

fekty

wna [

nm

]

Czas [min]

b)

Rysunek 8. Wpływ siły jonowej na: a) potencjał zeta b) średnicę efektywną kropelek emulsji n-tetradekan, 1 M etanol/liposomy DPPC w pH naturalnym

Niewielką zmianę potencjału zeta odnotowano dla emulsji n-tetradekan,

1 M etanol/liposomy DPPC w roztworze NaCl, a wartość średnia

potencjału zeta dla tej emulsji wyniosła -5 mV. Wartości bliskie 0 mV

przyjmują emulsje, w których elektrolitem był roztwór CaCl2. Dla emulsji

z CaCl2 o stężeniu 3,33x10-4 M wartość średnia potencjału wynosi -1,32 mV,

natomiast dla układu z 10-3

M CaCl2 potencjał zeta waha się w granicach

od -1,4 mV do -2,73 mV. Na tej podstawie można stwierdzić, że na


220

powierzchni liposomów (Rys. 8) adsorpcja jonów z roztworu zachodzi

w niewielkim stopniu. Dzieje się tak, dlatego że duża część ładunku

pochodzącego od cząsteczek DPPC zgromadzona jest we wnętrzu

liposomów, zaś w generowaniu potencjału zeta bierze udział ładunek

zgromadzony na zewnątrz liposomów.

W układzie n-tetradekan, 1 M etanol/liposomy DPPC w wodzie średnica

efektywna przyjmuje dość wysoką wartość początkową równą 1150 nm,

która sukcesywnie maleje w czasie i po 2h od zakończenia homogenizacji

przyjmuje wartość 555,7 nm (Rys. 8). W trakcie ustalania równowagi

adsorpcyjnej w układzie duże kropelki emulsji gromadzą się na

powierzchni i nie są w zasięgu promienia lasera. Najbardziej stabilnym

układem, okazała się emulsja z NaCl o stężeniu 10-3

M, potwierdza to nie

tylko wartość potencjału zeta utrzymywana na stałym poziomie, ale

również dość stabilna średnica efektywna wynosząca średnio 750 nm.

Natomiast w przypadku emulsji w roztworze CaCl2 o stężeniu 3,33x10-4

M

odnotowano duży spadek średnicy efektywnej od 1235 nm do 904 nm.

Podobnie w przypadku emulsji z CaCl2 o stężeniu 10-3

M, gdzie średnica

emulsji maleje od wartości 1051 nm po 5 min. homogenizacji do 750 nm.

Niezależnie od tego, czy cząsteczki DPPC występują w postaci

liposomów czy ułożone są w postaci warstwy na kropelkach n-tetradekanu

to jony z roztworu mają wpływ na zmianę potencjału zeta i średnicy

efektywnej. Gdy w roztworze znajdują się cząsteczki DPPC i jony wapnia

rośnie prawdopodobieństwo utworzenia w emulsji liposomów.

4.3. Badanie wpływu siły jonowej na efektywność enzymu PLA2

Badano wpływ siły jonowej na efektywność enzymu w układzie

n-tetradekan, etanol/liposomy DPPC. Jako kosurfaktant został użyty

alkohol o stężeniu 1 M, składniki emulsji dopełniano roztworem

elektrolitu: 10-3

M NaCl i CaCl2 o stężeniu 3,33x10-4

M lub 10-3

M. Do

każdego układu dodawano fosfolipazę A2 po 9 minutach homogenizacji.

Porównywano, jaki wpływ na efektywność enzymu mają elektrolity w pH

naturalnym oraz w pH=8. Literatura podaje, że fosfolipaza A2 (PLA2)

wykazuje największą aktywność w pH8, a jest to związane z ładunkiem

jej miejsca aktywnego w skład, którego wchodzi histydyna [11]. Histydyna

w pH=6,0 posiada ładunek dodatni +1, po zakwaszeniu środowiska

(pH=2,3) ładunek histydyny zwiększa się do +2. Punkt izoelektryczny dla

histydyny występuje przy pH=7,8, zaś w środowisku zasadowym (pH=10)

jej ładunek wynosi -1 (Rys. 9). Takie zachowanie się cząsteczek enzymu

w zależności od pH środowiska pozwala na wniosek, że obniżenie

potencjału zeta w emulsjach z dodatkiem 1 mg PLA2, w pH naturalnym



221

może wynikać z dodatkowego ładunku pochodzącego od cząsteczek

histydyny.

Rysunek 9. Wpływ pH na ładunek histydyny: a) pH=2,3 b) pH=6 c) pI=7,8 d) pH=10 [11].

Pierwszym badanym układem była emulsja n-tetradekan, 1 M eta-

nol/liposomy DPPC w roztworze wodnym 10-3

M NaCl w pH naturalnym

wynoszącym około 6,1 (Rys. 10). Zaobserwowano, że dodatek elektrolitu

do układu powoduje zmianę potencjału z wartości średniej -30,5 mV (wartość

zaznaczona strzałką na wykresie) do wartości -69,15 mV. Po dodaniu do

układu 1,12 ml dyspersji liposomów odnotowano spadek potencjału zeta do

wartości bliskich -10 mV.

0 20 40 60 80 100 120-80

-60

-40

-20

0

20

40

LIPOSOMY

H2O

10-3M NaCl

10-3M NaCl+liposomy

10-3M NaCl+Fosfolipaza A

2

10-3M NaCl+liposomy+Fosfolipaza A

2

Pote

ncja

ł zeta

[m

V]

Czas [min]

Rysunek 10. Wpływ siły jonowej na efektywność fosfolipazy A2 w układzie: n-tetradekan, 1M

etanol/liposomy DPPC w 10-3 M NaCl w pH naturalnym (pH=6,1)


222

Stwierdzono, że na powierzchni liposomów adsorpcja jonów z roztworu

może zachodzić w mniejszym stopniu niż w układach, gdzie cząsteczki

DPPC układają się na powierzchni kropelek emulsji w postaci mono- lub

biwarstwy. Możliwa jest też sytuacja nagromadzenia dużej części ładunku

we wnętrzu liposomów, natomiast tylko ładunki „obecne” na zewnątrz

liposomów biorą udział w generowaniu potencjału zeta.

Dla emulsji n-tetradekan, 1M etanol, 10-3

M NaCl po dodaniu

liposomów potencjał zeta jest dość stabilny i przyjmuje średnie wartości

około -19,3 mV. Gdy do analogicznego układu n-tetradekan, etanol

(1M)/liposomy DPPC dodano 1 mg enzymu odnotowano obniżenie

potencjału zeta, potencjał wahał się w granicach od 5,2 mV do -4,6 mV.

W tym pH enzym jest naładowany dodatnio od dodatniego ładunku

histydyny, która buduje miejsce aktywne cząsteczki PLA2, co daje

w efekcie mniejszy potencjał zeta.

Ten sam układ zbadano również w pH=8 (Rys. 11), aby sprawdzić jak

zmiana siły jonowej wpływa na działanie fosfolipazy A2 w maksimum jej

aktywności.

0 20 40 60 80 100 120-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

LIPOSOMY

H2O

10-3M NaCl

10-3M NaCl+liposomy

10-3M NaCl+Fosfolipaza A

2

10-3M NaCl+liposomy+Fosfolipaza A

2

Po

ten

cja

ł ze

ta [

mV

]

Czas [min]

Rysunek 11. Wpływ siły jonowej na efektywność fosfolipazy A2 w układzie: n-tetradekan,

1M etanol/liposomy DPPC w 10-3 M NaCl w pH=8

Odnotowano bardzo wysoką wartość potencjału zeta w zakresie od

-88 mV po 5 min. po zakończeniu homogenizacji do -70,11 mV po 2 h dla

emulsji n-tetradekan/etanol (1 M), 10-3

M NaCl. Po wprowadzeniu do



223

układu dyspersji liposomów potencjał zeta zmieniał się w zakresie od

-1,44 mV do -7,44 mV (Rys. 11). Na powierzchni zamkniętych struktur

liposomowych rozmieszczenie ładunków jest inne niż na powierzchni

kropelek emulsji i w efekcie uśredniony potencjał jest inny.

Dla emulsji n-tetradekan, 1M etanol, 10-3

M NaCl + fosfolipaza A2

w pH=8 odnotowano wartość średnią potencjału zeta równą -28,3 mV.

Zakres zmian potencjału zeta dla układu n-tetradekan, 1 M etanol

/liposomy DPPC bez enzymu waha się w granicach od -1,44 mV do

-7,44 mV, dodanie fosfolipazy A2 powoduje zmianę potencjału zeta do

wartości średniej -34 mV, która utrzymuje się na stałym poziomie w miarę

upływu czasu od zakończenia homogenizacji (Rys. 11). Prawdopodobnie

w układzie z elektrolitem jednowartościowym struktury liposomowe nie są

już tak trwałe i enzym łatwiej może wniknąć. W tym pH, jak podaje

literatura [11] PLA2 jest najbardziej aktywna, więc wniosek jest zasadny.

Natomiast w przypadku emulsji z liposomami różnica wartości potencjału

zeta pomiędzy emulsją z dodatkiem enzymu i bez była znacząca.

Na Rys. 12 przedstawiono porównanie wpływu elektrolitu jedno-

i dwuwartościowego na zachowanie się enzymu fosfolipazy A2 w pH

naturalnym. Zastosowano elektrolity o tej samej sile jonowej. Stwierdzono,

że w pH naturalnym (5,9) dodanie 1 mg enzymu do układu n-tetra-

dekan/etanol (1 M) w 10-3

M NaCl powoduje obniżenie bezwzględnych

wartości potencjału zeta z wartości średniej -70 mV do wartości równej

-17,2 mV. Dodatek enzymu generuje obniżenie potencjału zeta aż

2,5-krotnie. Natomiast dla analogicznej emulsji w roztworze wodnym

3,33x10-4

M CaCl2 wprowadzenie enzymu praktycznie nie zmienia

potencjału zeta tego układu. Zakres zmian potencjału dla układu

z fosfolipazą A2 od -5,62 mV do -19,82 mV jest bardzo zbliżony do zmian

zachodzących w układzie bez dodatku enzymu (od 1,96 mV do -20,46 mV).


224

0 20 40 60 80 100 120-40

-30

-20

-10

0

10

3,33*10-4M CaCl

2+liposomy

10-3M CaCl

2+liposomy

3,33*10-4M CaCl

2+Fosfolipaza A

2

10-3M CaCl

2+Fosfolipaza A

2

3,33*10-4M CaCl

2+liposomy+Fosfolipaza A

2

10-3M CaCl


2

Po

ten

cja

ł ze

ta [

mV

]

Czas [min]

Rysunek 12. Wpływ siły jonowej na efektywność fosfolipazy A2 w układzie n-tetradekan,

1M etanol/liposomy DPPC w 3,33x10-4 M lub 10-3 M CaCl2 w pH naturalnym (pH=5,9)

W przypadku emulsji n-tetradekan, 1M etanol/liposomy DPPC wartości

potencjału zeta są znacznie niższe i wynoszą odpowiednio: -1,2 mV

w roztworze 3,33x10-4

M CaCl2 i -2 mV dla układu w 10-3

M roztworze

CaCl2. Potwierdza to wniosek, że adsorpcja jonów z roztworu zachodzi

w mniejszym stopniu na liposomach, niż w układach gdzie DPPC układa

się w warstwy na kropelkach n-tetradekanu. Ładunek cząsteczki DPPC

w dużym stopniu zlokalizowany jest we wnętrzu liposomów, a ładunek na

zewnątrz generuje potencjał zeta. Gdy do emulsji z dyspersją liposomów

wprowadzono 1 mg fosfolipazy A2 potencjał zeta ustabilizował się dopiero

po 30 minutach od zakończenia homogenizacji i przyjął wartość średnią

równą 6,3 mV dla elektrolitu o stężeniu 3,33x10-4

M CaCl2 oraz -1,95 mV

dla emulsji z elektrolitem o stężeniu 10-3

M CaCl2.



225

0 20 40 60 80 100 120-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20 3,33*10-4M CaCl

2+liposomy

10-3M CaCl

2+liposomy

3,33*10-4 MCaCl

2+Fosfolipaza A

2

10-3M CaCl

2+Fosfolipaza A

2

3,33*10-4M CaCl


2

10-3M CaCl


2

Pote

ncja

ł zeta

[m

V]

Czas [min]

Rysunek 13. Wpływ siły jonowej na efektywność fosfolipazy A2 w układzie n-tetradekan,

1M etanol/liposomy DPPC w 3,33x10-4 M lub 10-3 M CaCl2 w pH=8

Na Rys. 13 przedstawiono wpływ siły jonowej na efektywność

fosfolipazy A2 w układzie n-tetradekan, 1M etanol/liposomy DPPC

w roztworze wodnym 3,33x10-4

M lub 10-3

M CaCl2 w pH=8. Enzym

katalizuje hydrolizę wiązań estrowych fosfatydylocholiny już w trakcie

homogenizacji, gdyż w pH=8 PLA2 wykazuje maksimum aktywności.

Literatura podaje, że jony Ca2+

są niezbędne dla PLA2 zarówno w procesie

katalizy, jak i w wiązaniu enzymu do powierzchni substratu [11].

Gdy wprowadzono elektrolit o stężeniu 3,33x10-4

M CaCl2 potencjał

zeta emulsji z liposomami ustabilizował się po 30 minutach, a jego wartość

średnia wynosiła -7 mV (Rys. 13). Potencjał zeta przyjmuje wartość równą

-2,05 mV dla układu, do którego wprowadzono chlorek wapnia o wyższym

stężeniu. Po dodaniu enzymu do układu, w którym elektrolitem był roztwór

wodny 3,33x10-4

M CaCl2 potencjał zeta przyjmuje wartości od -12,82 mV

do -15,6 mV. Stwierdzono, że w pH=8 im mniejsza siła jonowa elektrolitu

tym potencjał zeta kropelek emulsji bez enzymu ma większą wartość

bezwzględną, prawdopodobnie dzieje się tak, ponieważ grupy fosfa-

tydylowe cząsteczek DPPC na powierzchni n-tetradekanu, które posiadają

ładunek ujemny są odsłonięte. Natomiast po dodaniu enzymu do emulsji

sytuacja ulega zmianie i większy bezwzględny potencjał zeta ma układ

o większej sile jonowej. Efektywna w tym pH fosfolipaza A2 w obecności


226

jonów Ca2+

o stężeniu 10-3

M katalizuje hydrolizę liposomów,

a pojawiające się w układzie produkty hydrolizy generują bardziej ujemny

potencjał zeta emulsji (Rys. 13). W pH naturalnym wpływ fosfolipazy A2

na liposomy DPPC był dużo mniejszy (Rys. 12).

5. Wnioski

Badania układów emulsyjnych typu olej/woda z udziałem fosfolipidów

są wciąż atrakcyjne ze względu na ich wszechstronne wykorzystanie

w przemyśle kosmetycznym, farmaceutycznym czy przy produkcji

detergentów. Układy te jednak są dość skomplikowane ze względu na

możliwość występowania cząsteczek fosfolipidów w postaci różnorodnych

struktur. Jedną z form, jaką mogą tworzyć fosfolipidy są liposomy. Badania

nad liposomami i ich wpływem na właściwości elektrokinetyczne emulsji

mają na celu poprawę ich właściwości użytkowych, a także komponowanie

układów o określonych właściwościach i wydłużonym okresie ważności.

Pomocne mogą okazać się również badania z enzymem fosfolipazą A2,

gdyż specyficzność substratowa fosfolipazy daje możliwość oszacowania

struktur DPPC występujących w emulsjach.

Przeprowadzone badania i otrzymane wyniki pozwoliły na wyciągnięcie

następujących wniosków.

Większość badanych emulsji n-tetradekan/etanol wykazywała zwiększenie

stabilności po dodaniu do nich fosfolipidu DPPC, mimo spadku bezwzględnej

wartości potencjału zeta. Cząsteczka DPPC jest obojnacza w szerokim

zakresie pH, ale dodatni ładunek pochodzący od grupy –N+(CH3)3 może

powodować zmniejszenie potencjału elektrokinetycznego. Na tej podstawie

nasuwa się wniosek o mechanizmie stabilizacji sterycznej w układach

z dodatkiem DPPC oprócz stabilizacji kropelek emulsji siłami podwójnej

warstwy elektrycznej.

Zazwyczaj zmiany potencjału zeta korelowały ze zmianami średnicy

efektywnej kropelek emulsji. Im wyższa bezwzględna wartość potencjału

tym uzyskiwano niższe wartości średnicy efektywnej. Na podstawie tych

dwóch parametrów pośrednio można wnioskować o stabilności układu

emulsyjnego.

W emulsjach typu olej/woda z liposomami DPPC rola jonów

pochodzących z elektrolitu, a zwłaszcza jonów wapnia polegała na

stabilizacji utworzonych struktur DPPC zaadsorbowanych na kropelkach

emulsji lub występujących samodzielnie w emulsji. Większe zmiany

potencjału zeta w emulsjach z liposomami obserwowano w przypadku

elektrolitu dwuwartościowego zgodnie z teorią Gouy-Chapmana. Adsorpcja

jonów z roztworu na powierzchni liposomów zachodzi w mniejszym

stopniu niż w emulsjach, gdzie cząsteczki DPPC tworzą warstwę na



227

powierzchni kropelek n-tetradekanu. Dzieje się tak, dlatego że duża część

ładunku pochodzącego od cząsteczek DPPC zgromadzona jest we wnętrzu

liposomów, a tylko ładunek na powierzchni liposomów bierze udział

w generowaniu potencjału zeta układu.

Zmiana potencjału zeta emulsji n-tetradekan, etanol/liposomy DPPC po

dodaniu fosfolipazy A2 była zależna od pH, jak również siły jonowej

układu. W pH naturalnym (pH=6,1) histydyna zlokalizowana w miejscu

aktywnym enzymu posiada ładunek -1, gdyż jej punkt izoelektryczny

występuje przy pH=7,8, dlatego dodatkowo może generować ujemny

potencjał zeta.

Potwierdzono, że jony Ca2+

są niezbędne dla PLA2 zarówno w procesie

katalizy, jak i w wiązaniu enzymu do cząsteczki substratu. Odpowiednie

stężenie jonów Ca2+

zwiększa aktywność fosfolipazy A2 w układzie.

Czasami reakcja enzymatyczna zachodzi już w trakcie homogenizacji. Po

zajściu reakcji enzymatycznej, wartość potencjału zeta odznaczała się

zazwyczaj dużą stabilnością na skutek pojawiających się w układzie

obdarzonych ładunkiem produktów hydrolizy.

Działanie fosfolipazy A2 polega na katalizowaniu w obecności jonów

Ca2+

hydrolizy wiązań estrowych cząsteczki DPPC, w wyniku czego traci

ona swe właściwości stabilizujące. Dodatek elektrolitu do układu

z liposomami DPPC powoduje łatwiejsze wnikanie enzymu do ich struktur.

Efektywna w pH=8 fosfolipaza A2 katalizuje hydrolizę liposomów

DPPC, a pojawiające się w układzie produkty hydrolizy generują bardziej

ujemny potencjał zeta emulsji i mogą przejąć w układzie funkcje

stabilizatora.


228

Literatura

1. Sonntag H., Koloidy, PWN Warszawa 1982

2. http://pl.wikipedia.org/wiki/Wikipedia:Tłumaczenie_miesiąca/Enzym

3. Hames D., Hooper N. M., Biochemia. Krótkie wykłady, PWN Warszawa 2002

4. http://www.cobrabid.poznan.pl/brookhaven_instruments_pl.pdf

5. http://www.staff.amu.edu.pl/~zbm/dls_pl.html

6. www.staff.amu.edu.pl/~zbm/ZSFBiofizyka/PCS.docs

7. Pigoń K., Ruziewicz Z., Chemia fizyczna, PWN Warszawa 1980

8. Górski A., Chemia fizyczna, WNT Warszawa 1966

9. http://ebiotechnologia.pl/index.php?module=Strony&func=display&pageid=10

10. Shah O. D., Schulman J. H., The ionic structure of lecithin monolayers,

J. Lipid Research, 8 (1967) 227-233

11. Bacha A., Gargouri Y., Bezzine S., Mejdoub H., Purification and biochemical

characterization of phospholipase A2 from dromedary pancreas, Biochimica

et Biophysica Acta, 1760 (2006) 1202-1209

12. Patra M., Karttunen M., Hyvonen M. T., Flack E., Lindqvist P., Vattulainen I.,

Molecular Dynamics Simulations of Lipid Bilayers: Major Artifacts Due

to Truncating Electrostatic Interactions,Biophysic J. 84 (2003) 3636-3645

13. Pinisetty D., Moldovan D., Devireddy R., The Effect of Methanol on Lipid

Bilayers: An Atomistic Investigation, Annals of Biomedical Engineering,

Vol. 4 No. 4 (2006) 1442-1451



Streszczenie

Badano wpływ pH i siły jonowej na efektywność enzymu PLA2 oraz zmiany potencjału elektrokinetycznego (zeta) i wielkości kropelek w układach emulsyjnych n-tetradekan/etanol

z udziałem liposomów DPPC. Większość badanych emulsji n-tetradekan/etanol wykazywała

zwiększenie stabilności po dodaniu do nich fosfolipidu DPPC, mimo spadku bezwzględnej

wartości potencjału zeta. Badania udowodniły, że w układach emulsyjnych z liposomami DPPC występują dwa rodzaje stabilizacji: elektrostatyczna (siłami podwójnej warstwy

elektrycznej) i steryczna. Badania wielkości liposomów są istotne ze względu na wielkość

transportowanych przez nie cząsteczek substancji aktywnych. W emulsjach typu olej/woda

z liposomami DPPC rola jonów pochodzących z elektrolitu polegała na stabilizacji utworzonych struktur DPPC zaadsorbowanych na kropelkach emulsji lub występujących

samodzielnie w emulsji. Większe zmiany potencjału zeta w emulsjach z liposomami

obserwowano w przypadku elektrolitu dwuwartościowego. Obecność jonów Ca2+

w układzie zwiększa aktywność fosfolipazy A2. Badania udowodniły, że bardzo istotnym parametrem stabilności emulsji z liposomami DPPC jest pH środowiska (optymalne pH=8).

Po zajściu reakcji enzymatycznej, wartość potencjału zeta odznaczała się dużą stabilnością

na skutek pojawiających się w układzie obdarzonych ładunkiem produktów hydrolizy, które

mogą przejąć w układzie funkcje stabilizatora. Przeprowadzona szczegółowa analiza właściwości układów emulsyjnych typu olej/woda z udziałem fosfolipidów (i/lub enzymu)

zwiększa ich możliwości aplikacyjne w przemyśle kosmetycznym, farmaceutycznym czy

przy produkcji detergentów.



229

Investigation of pH and ionic strength effect on PLA2 efficiency

in emulsion systems with DPPC liposomes

Abstract

The influence of pH and ionic strength on efficiency of the enzyme PLA2 in the emulsion systems of n-tetradecane/ethanol with liposomal DPPC was investigated. Studies have

shown that in the emulsion systems with DPPC liposomes are two types of stabilization:

electrostatic (forces of the electrical double layer), and steric. Investigations of the liposome

size are important because of the size of particles of active substances transported by them. The role of ions from the electrolyte in the oil/water emulsions with DPPC liposomes

consisted in stabilization of the created DPPC structures adsorbed on the emulsion droplets

or occurring alone in the emulsion. Major changes in the zeta potential of emulsions with the

liposomes were observed in the divalent electrolyte. The presence of Ca2+ ions in the system increases the activity of phospholipase A2. Studies have shown that very important

parameter of the stability of emulsion with DPPC liposomes is pH (optimal pH=8). After

finishing the enzyme reaction, the value of zeta potential increases, indicating for higher

system stability due to appearing charged hydrolysis products which act as stabilizers. Performed detailed characterization of emulsion systems oil/water involving phospholipids

(and/or enzyme PLA2) enhances the possibilities of their applications in the cosmetic

industry, pharmaceutical, or in the production of detergents.

230

Łukasz Łopusiewicz1

Analiza determinantów katalitycznego optimum

pH wybranych alfa-amylaz pochodzących

z bakterii z rodzaju Bacillus

1. Wstęp

Alfa-amylaza (4-glukanohydrolaza-α-1,4-glukanu;EC 3.2.1.1), jest

enzymem, który katalizuje rozkład hydrolityczny skrobi. Dzięki swoim

właściwościom znalazła szerokie zastosowanie w procesach przemys-

łowych. Szczególnie duże znaczenie mają alfa-amylazy produkowane przez

bakterie, w tym przez rodzaj Bacillus. Dzięki rozwojowi metod

bioinformatycznych możliwe stało się skuteczniejsze przewidywanie

struktur i właściwości enzymów. Metody te pozwalają na podstawie

sekwencji aminokwasowych, za pomocą różnych narzędzi i algorytmów,

przewidzieć wiele istotnych cech enzymów, takich jak np. optimum pH,

aktywność czy stabilność, co w przypadku alfa-amylazy ma niezwykle

duże znaczenie w optymalizacji procesów przemysłowych takich jak

upłynnianie skrobi czy produkcja detergentów. pK aminokwasów

wchodzących w skład sekwencji jest wartością, która wpływa na wartość

optimum pH enzymów. Teoretyczna interpretacja oraz przewidywanie

wartości pK białek jest pomocne w zrozumieniu wielu biochemicznych

problemów. Obliczenia pK aminokwasów i ich łańcuchów bocznych są

często wykorzystywane w modelowaniu molekularnym białek oraz biologii

obliczeniowej. Dzięki metodom szybkiego przewidywania wartości pK

aminokwasów w strukturze białek, np. metody PROPKA, możliwe stało się

bardziej skuteczne poszukiwanie nowych leków czy białek o pożądanych

właściwościach.

2. Cel pracy

Celem pracy była analiza reszt aminokwasowych kształtujących

katalityczne optimum pH wybranych alfa-amylaz pochodzących z bakterii

z rodzaju Bacillus.

[email protected], Centrum Bioimmobilizacji i Innowacyjnych Materiałów

Opakowaniowych, Wydział Nauk o Żywności i Rybactwa, Zachodniopomorski Uniwersytet

Technologiczny w Szczecinie, www.cbimo.zut.edu.pl

Analiza determinantów katalitycznego optimum pH wybranych alfa-amylaz

pochodzących z bakterii z rodzaju Bacillus

231

3. Ogólna charakterystyka alfa-amylazy oraz możliwości jej

zastosowania

Alfa-amylaza należąca do rodziny 13 glikohydrolaz jest enzymem,

który hydrolizuje w sposób przypadkowy wiązania α-(1,4)-glikozydowe

w polisacharydach takich jak skrobia, glikogen, amyloza, czy amylo-

pektyna. Jest główną formą amylaz występującą u ludzi i innych ssaków.

Alfa-amylazy mają duże znaczenie, ponieważ odpowiedzialne są za

rozpuszczanie skrobi. Skrobia składa się z dwóch polimerów glukozy:

amylozy, która połączona jest wyłącznie wiązaniami α-(1-4), oraz

amylopektyny, która poza wiązaniami α-(1-4) zawiera również

odgałęzienia połączone wiązaniami α-(1-6).Alfa-amylazy są produkowane

zarówno przez organizmy prokariotyczne, jak i eukariotyczne,

charakteryzują się szeroką specyficznością substratową oraz posiadają

optima pH i temperaturowe w szerokim zakresie [1, 2].

Bakteryjne alfa-amylazy są ewolucyjnie odległe od tych produ-

kowanych przez organizmy eukariotyczne. Ich identyczność ze świńską

trzustkową alfa-amylazą PPA (ang. Pig Pancreatic Alpha-amylase) zawiera

się w przedziale od 15% do 20%. Wyjątkiem jest alfa-amylaza

produkowana przez bakterię Alteromonas haloplanctis, która ma

podobieństwo z PPA na poziomie ok. 50% [3]. Większość amylaz

produkowanych przez promieniowce Streptomycetes ma podobieństwo do

PPA w zakresie od 40% do 50%. Spośród alfa-amylaz, enzymy

pochodzenia bakteryjnego są najbardziej zróżnicowane pod względem

właściwości fizykochemicznych. Różnice dotyczą przede wszystkim

optimum temperaturowego, które zawiera się w przedziale od ok. 25°C (dla

alfa-amylazAlteromonas haloplanctis) do ok. 90°C (dla alfa-amylaz

Bacillus licheniformis). Optimum pH, w jakim białka te zachowują swoją

aktywność enzymatyczną jest zawarte pomiędzy 1,0 a ok. 11,5.

Zróżnicowana jest także specyficzność substratowa, zależna od długości

łańcucha skrobi oraz możliwości hydrolizy rozgałęzień α-(1-6)

w amylopektynie a także innych rozgałęzionych polimerów glukozy [4].

Alfa-amylazy pochodzenia grzybowego oraz bakteryjnego (szczególnie

wytwarzane przez bakterie z rodzaju Bacillus), ze względu na swoją

wysoką termostabilność oraz łatwość otrzymywania, znalazły powszechne

zastosowanie w procesach przemysłowych, takich jak produkcja

hydrolizatów skrobiowych,np. maltodekstryn, syropów skrobiowych,

glukozy i maltozy. Syropy glukozowe i fruktozowe są stosowane

w przemyśle browarniczym (zamiast słodu), w piekarnictwie (do polep-

szania własności mąki), oraz w przemyśle papierniczym (do produkcji

zmodyfikowanej skrobi). Poza tym, alfa-amylazy stosowane są do usuwania

skrobi w przemyśle tekstylnym, a także jako dodatki do detergentów [5].

Łukasz Łopusiewicz

232

Obecnie, na rynku jest dostępnych wiele enzymatycznych preparatów

handlowych zawierających alfa-amylazy np. Termamyl, Kreon, Neo-

Pancreatinum, HSAA40L. W zależności od specyfiki przemysłu stosowane

są różne rodzaje alfa-amylazy. W związku z tym niezwykle istotny jest

rozwój metod bioinżynieryjnych umożliwiających optymalizację enzymów

do zadanych procesów. Optymalizacja alfa-amylazy jest procesem

czasochłonnym i skomplikowanym, dlatego wiele gałęzi przemysłowych

ciągle jeszcze korzysta z "nieoptymalnych" enzymów. Znaczący postęp

został dokonany w dziedzinie optymalizacji właściwości alfa-amylaz

w zakresie termostabilności do procesów upłynniania skrobi oraz produkcji

detergentów [1].

Badania rentgenograficzne alfa-amylaz pochodzenia zwierzęcego

i bakteryjnego wykazały, że alfa-amylazy posiadają 3 domeny zwane A, B

i C. Centralna domena A o kształcie (β/α)8 beczułki (zwanej również

beczułką TIM – izomeraza triozofosforanowa; EC 5.3.1.1) stanowi rdzeń

cząsteczki i zawiera trzy aminokwasy budujące centrum aktywne enzymu:

kwas asparaginowy (Asp) będący katalitycznym nukleofilem, kwas

glutaminowy (Glu) będący donorem lub akceptorem protonów oraz kwas

asparaginowy (Asp), który stabilizuje stan przejściowy. Domeny B i C

położone są po przeciwnych stronach domeny A. Domena B ulokowana

jest na "wystającej" trzeciej helisie domeny A, do której przyłącza się na

obszarze swojego trzeciego pasma. Domena B nie ma ściśle konser-

watywnej struktury i rozmiaru, co sprawia, że może różnić się pomiędzy

różnymi gatunkami, wpływając na specyficzność substratową. Ponadto,

domena ta buduje dużą część szczeliny katalitycznej, do której przyłączają

się substraty, przez co może być wykorzystana do badania różnic między

różnymi formami alfa-amylaz. Domena C stanowi C-terminalną część

sekwencji i ma strukturę typu β-kanapki, w której zwarty jest motyw

„klucza greckiego" (rozbudowany motyw „szpilki do włosów”, w którym

jeden łańcuch polipeptydowy tworzy cztery antyrównoległe struktury β-

harmonijki). Szczelina katalityczna jest ulokowana w przestrzeni między

domenami A i B, i znajduje się na C-terminalnym końcu pasma β-beczułki

TIM. Badania rentgenograficzne wykazały, że szczelina katalityczna

różnych alfa-amylaz może wiązać oligosacharydy o długości od 4do 10

cząsteczek. Alfa-amylazy ssaków zawierają kilka mostków dwusiarczkowych,

które z reguły nie występują w alfa-amylazachbakteryjnych. Choć istnieją

pewne wyjątki, np. alfa amylaza Alteromonas haloplanctiszawiera cztery

mostki dwusiarczkowe [6].

W strukturze znanych alfa-amylaz wyróżnia się 4 konserwatywne

ewolucyjnie regiony, które znajdują się w beczułce TIM na 3, 4 i 5 β-paśmie

oraz na pętli łączącej. Region I umiejscowiony jest na C-terminalnym

końcu 3 β-pasma beczułki TIM (β3). U bakterii Bacillus licheniformis



233

region ten zawiera trzy aminokwasy: Asp100, Asn104 oraz His105.

Asp100 jest ważny dla integralności centrum aktywnego, łączy się

wiązaniem wodorowym z Arg229. Asn104 nie uczestniczy bezpośrednio

w stabilizacji centrum aktywnego, ale ma istotny wpływ na jon wapnia

usytuowany pomiędzy domenami A i B. His105 stabilizuje interakcje

pomiędzy końcem C-terminalnym pasma β3 i resztą beczułki TIM. Region

II położony jest w 4 β-paśmie i reszty aminokwasowe, które są

najprawdopodobniej niezbędne do zachowania aktywności katalitycznej,

tj. Asp231 oraz Arg229. Również w tym regionie położone są Lys234

i His235, które łączą redukowany łańcuch glukozowy w szczelinie enzymu.

Region III zawiera Glu261, katalityczny donor protonu i jest położony

w C-terminalnej części 5 β-pasma beczułki TIM. Glu261 jest jedyną resztą

aminokwasową obecną w tej pozycji u wszystkich znanych alfa-amylaz.

Reszty aminokwasowe tworzące region IV są ulokowane na pętli łączącej

7 β-pasmo z 7 α-helisą i ochraniają centrum aktywne przed rozpusz-

czalnikami [6].

Wszystkie znane alfa-amylazy zawierają w swojej strukturze jon

wapnia, który znajduje się między domenami A i B. Jest jednym

z głównych czynników stabilizujących strukturę enzymu. Jon wapnia nie

uczestniczy bezpośrednio w procesie katalitycznym, ponieważ jest

położony zbyt daleko od centrum aktywnego. U niektórych bakterii

(np. Bacillus licheniformis) występuje również drugi jon wapnia, który

wraz z jonem sodu tworzy strukturę Ca-Na-Ca [6].

Niektóre alfa-amylazy zawierają jon chlorkowy w centrum aktywnym.

Jon ten pełni funkcję wzmacniającą proces katalityczny. Przypuszcza się,

że podnosi on wartość pK reszty będącej donorem wodoru w centrum

aktywnym. Jony chlorkowe występują głównie w alfa-amylazach u ssaków,

ale również wykryto je w strukturze alfa-amylazy pochodzącej z psychro-

filnej bakterii Alteromonas haloplanctis [3, 7].

Aghajari i wsp.[3] zauważyli, że dla alfa-amylaz posiadających jon

chlorkowy charakterystyczna jest obecność specyficznej triady amino-

kwasowej składającej się z Glu-His-Ser. Motyw ten jest zloka-lizowany

w przestrzeni między domeną A i C. Najprawdopodobniej jest to miejsce,

w którym dochodzi do autoproteolizy na drodze hydrolizy.

Glikohydrolazy, do których należy alfa-amylaza, przeprowadzają

rozkład polisacharydów na drodze zachowawczego mechanizmu katali-

tycznego zaproponowanego przez Koshlanda [8]. Proces ten przebiega

etapowo. W pierwszym etapie (zwanym etapem glikozylacji) jedna z reszt

aminokwasowych pełni rolę aminokwasu kwasowego. Aminokwas ten

przenosi ładunek dodatni w postaci protonu na wiązanie o-glikozydowe,

które ulega zerwaniu. W wyniku tego powstaje oksyanion z dodatnio

naładowanym jądrem atomu węgla. W tym samym czasie następuje atak


234

nukleofilowy przeprowadzany przez resztę asparaginianową i powstaje

kompleks enzym-substrat, stabilizowany przez wiązaniem kowalencyjnym.

Druga część substratu ulega dysocjacji. Cząsteczka wody rozpada się na

proton i grupę hydroksylową. Grupa hydroksylowa bierze udział

w hydrolizie wiązania glikozydowego powstałego między enzymem

a częścią substratu. Proton przyłączany jest do grupy karboksylowej

glutaminianu. Wartość pK reszt aminokwasowych biorących udział w akcie

katalitycznym oscyluje podczas aktu katalitycznego pomiędzy niskimi

a wysokimi wartościami w celu optymalizacji działania enzymu [9].

Alfa-amylaza rozcina wiązania 1,4-glikozydowe przy anomerycznym

węglu w cząsteczce oligosacharydu. Po rozcięciu substratu, jest uwalniany

jego zredukowany koniec w postaci atomu tlenu w konfiguracji alfa.

U bakterii Bacillus licheniformis akt katalityczny przebiega w 3 etapach.

W pierwszym etapie Glu261 protonuje tlen. Kolejnym krokiem jest atak

nukleofilowy przez Asp231 na odsłonięty węgiel C1 w cząsteczce cukru.

Podczas ostatniego etapu, pozbawiony protonu Glu261 aktywuje

cząsteczkę wody, która hydrolizuje wiązanie kowalencyjne pomiędzy

tlenem a węglem C1, co kończy akt katalityczny [6].


Materiał badawczy stanowiły zdeponowane w bazie PDB (Protein Data

Bank) [10] rekordy alfa-amylaz pochodzących z różnych szczepów bakterii

z rodzaju Bacillus o następujących kodach: 1hvx z B. stearotheromphilus

[11], 1w9x z B. halmapalus[12], 3dc0 z Bacillus sp. KR8104, 3bh4

z B. amyloliquefaciens [13], 1bli z B. licheniformis [14] oraz 2die z Bacillus

sp. KSM-1378 [15].

Optimum pH ustalano na podstawie informacji zawartych w bazie

danych BRENDA [16].

Struktury poddawano analizie w programie do modelowania mole-

kularnego UCSF Chimera (wersja 1.7) [17].

Z bazy PDB pobrano rekordy badanych alfa-amylaz do programu

SPDBV i zapisano ich sekwencje aminokwasowe w formacie FASTA.

Porównywanie sekwencji aminokwasowych wykonywano w programie

Clustal W [18], będącym częścią oprogramowania do analizy sekwencji

nukleotydowych i aminokwasowych BioEdit 7.1.11 [19].

Wartości pK aminokwasów przewidywano z wykorzystaniem metody

PROPKA. Struktury krystaliczne enzymów pozbawione ligandów (cukrów,

jonów wapnia i sodu) przesyłano do serwera PROPKA. W programie tym

analizie można poddać bezpośrednio rekordy z bazy danych PDB podając

ich kod lub przesłane przez użytkownika struktury krystaliczne. Jest to

metoda heurystyczna, która pozwala na wyznaczanie stałych dysocjacji



235

grup jonizujących w białkach. Opiera się o znane, ustalone eksperymen-

talnie zależności związane z wpływem środowiska zewnętrznego, jak

i samej struktury białek [20].

5. Analiza wyników i dyskusja

Przewidziane wartości pK dla poszczególnych aminokwasów

odpowiedzialnych za proces rozcinania substratu w centrum aktywnym nie

były identyczne u analizowanych alfa-amylaz (Tab. 1).

Tabela 1. Wykorzystane w pracy enzymy, ich optimum pH oraz aminokwasy centrów aktywnych

Bakteria

Kod

struktury

w PDB

Aminokwasy i ich pKa Optimum

pH1

B.stearo-

thermophilus 1hvx D 234 7,83 D 331 5,92 E 264 6,65 H106 7,74 6,5

B. halmapalus 1w9x D 236 7,42 D 333 0,99 E 266 3,38 H 107 3,29 >9,0

Bacillus sp.

Kr8104 3dc0 D 176 8,37 D 269 3,02 E 208 5,39 H 102 3,35 4,0

B.amylo-liquefaciens

3bh4 D 232 8,57 D 329 7,41 E 262 4,97 H 104 3,39 7,6

B. licheniformis 1bli D 231 6,96 D 328 4,84 E 261 7,81 H 105 3,77 7,0

Bacillus sp.

Ksm-1378 2die D 236 6,92

D 333

10,38 E 266 2,78 H 107 2,81 6,8

1– wartości ustalone przy użyciu bazy BRENDA

Zaproponowany przez Nilsena i Borcherta [6] schemat katalizy

przeprowadzany przez alfa-amylazy sugeruje, że aminokwasem proto-

nującym jest glutaminian a odpowiedzialnym za atak nukleofilowy jest

asparaginian. Oznacza to, że w momencie rozcinania substratu wartość pK

glutaminianu powinna być wyższa od wartości pK asparaginianu. Ten

warunek spełniają jedynie dwie z analizowanych alfa-amylaz: z B. licheni-

formis (PDB, 1bli) oraz z B. halmapalus (PDB, 1w9x).

Dla pozostałych badanych obiektów wartości pK dla reszt asparaginia-

nowych są wyższe od wartości pK reszt glutaminianowych. Wskazywać to

może na odwrócenie roli reszt aminokwasowych podczas katalizy

enzymatycznej. W przypadku alfa-amylazy 1bli z B. licheniformis, pK

asparaginianu (6,96) jest najprawdopodobniej wartością determinującą


236

optimum pH katalitycznego dla tego enzymu, które wynosi 7,0 [21].

Wartość pK Glu261 wynosi 7,8, co oznacza, że powyżej niej, aminokwas

nie będzie uprotonowany, więc nie zajdzie pierwszy etap katalizy. Wartość

pK Asp231 wynosi 6,91 co oznacza, że poniżej niej aminokwas będzie

ciągle uprotonowany i również nie będzie mógł pełnić swojej roli jako

aminokwasu odpowiedzialnego za atak nukeofilowy. Do analogicznych

wniosków doszli Alikhajeh i wsp. [13], którzy porównywali alfa-amylazę

pochodzącą ze szczepu Bacillus KR-8104 (KRA) z alfa-amylazami

pochodzącymi z B. licheniformis (BLA) i B. amyloliquefaciens (BAA),

wykorzystując modele homologiczne. Uzyskali oni podobny trend

w wartościach pK reszt katalitycznych. Wykazali oni również, że

przesunięcie optimum pH alfa-amylazy KRA w kierunku pH kwasowego

w porównaniu do alfa-amylazy BLA wynikaz obecności dodatkowego

wiązania wodorowego pomiędzy katalitycznym Glu261 a Arg229

(zachowując numerację BLA). Ponadto, wiązanie to miało wpływ na

zmianę kształtu całej cząsteczki enzymu.

Poszczególne reszty biorące bezpośredni udział w rozcinaniu substratu

i ich otoczenie zostały podzielone na tzw. klastry (Tab. 2). Dla reszt

asparaginianowych z klastra 1 u wszystkich badanych alfa-amylaz istotny

wpływ mają konserwatywne ewolucyjnie argininy. Argininy poprzez

oddziaływania wiązań wodorowych z grupą karboksylową reszt

asparaginianowych obniżają ich wartości pK w zakresie od -0,49 do -0,59.

Znaczący wpływ na wartość pK mają również reszty asparaginianowe

oddziaływujące na aminokwasy klastra 1 interakcjami kulombowskimi

(np. na Asp231 z alfa-amylazy PDB, 1bli wpływa Asp100). Reszty te

podwyższają wartości pK w zakresie od 0,42 do 1,14. Zaobserwowano

również niewielki wpływ alanin (w zakresie pK od -0,01 do -0,06) przez

tworzenie wiązań wodorowych w obrębie atomów łańcucha głównego.

Jednakże, nie występuje on u wszystkich analizowanych enzymów.

W klastrze 2 największy wpływ na analizowane aminokwasy centrów

aktywnych mają oddziaływania kulombowskie. Na dwie reszty

asparaginianowe (tj. Asp229 z alfa-amylazy PDB, 3bh4 i Asp328 z alfa-

amylazy PDB, 1bli) oddziaływają reszty asparaginianowe Asp100 i Asp99

podwyższając ich pK. Na pozostałe reszty aminokwasowewpływ mają

argininy, które obniżają wartości pK w zakresie od -0,61 do -0,83. Nie

stwierdzono oddziaływań w postaci tworzenia wiązań wodorowych

w łańcuchu głównym na aminokwasy w klastrze 2, natomiast ich wpływ

obserwowano w łańcuchach bocznych. Na aminokwasy Asp269 z alfa-

amylazy o kodzie PDB, 3dc0 i Asp328 z alfa-amylazy o kodzie PDB, 1bli

oddziaływują asparaginy Asn326 i Asn273, obniżając ich pK. Natomiast

pK aminokwasu Asp333 z alfa-amylazy PDB, 2die jest podwyższane przez

glutaminian Glu266.



237

W klastrze 3 zaobserwowano wpływ alanin umieszczonych w łańcuchu

głównym na reszty glutaminianowe centrów aktywnych. Oddziaływanie to

odbywa siępoprzez utworzenie wiązań wodorowych reszt alaninowych

z resztami glutaminianowymi. Nie są one jednak ewolucyjnie konser-

watywne i nie wpływają na wszystkie analizowane aminokwasy. Widoczny

jest słaby wpływ przez wiązania wodorowew łańcuchach bocznych arginin

(np. Arg229 na Glu261 w alfa-amylazie PDB, 1bli) oraz asparaginianu

(Asp232 na Glu262 w alfa-amylazie PDB, 2die).

Najbardziej konserwatywne są oddziaływania kulombowskie. Na

prawie wszystkie glutaminiany oddziaływają lizyny (w zakresie pK od

-0,13 do -0,40), np. Lys237 na Glu264 u alfa-amylazy PDB, 1hvx. Na

jedną resztę glutaminianową (Glu261 z alfa-amylazyPDB, 1bli) wpływa

arginina Arg229, obniżając jej wartość pK o -1,93. Różnica ta nie jest

jednak znacząca, ponieważ zarówno lizyna jak i arginina są aminokwasami

zasadowymi i oba obniżają wartość pK.

W 4 klastrze największy wpływ na wartości pK reszt histydynowych

mają reszty tyrozynowe. Reszty tyrozynowe oddziaływują wiązaniami

wodorowymi w łańcuchu głównym na reszty histydynowe, podwyższając

ich pK w zakresie od 0,04 do 0,85. His107 z alfa-amylazy PDB, 2die jest

konserwatywnai wywiera znikomy wpływ na swoją wartość pK.

W łańcuchu bocznym tylko na His106 z PDB, 1hvx wpływa asparaginian

Asp105, podwyższając pK o 1,60. Oddziaływania kulombowskie

zaznaczone są tylko w jednym przypadku: Lys108 obniża pK histydyny

His107 w PDB, 1w9x o -0,06.

Położenie reszty aminokwasowej w strukturze enzymu, które w użytej

metodzie opisywane jest jako efekt desolwatacji, miało zróżnicowany

wpływ na wartości pK między klastrami. Jednakże w obrębie samych

klastrów zwykle czynnik ten kształtował się na podobnym poziomie

u wszystkich badanych alfa-amylaz. Jednakże, w drugim i trzecim klastrze

dla alfa-amylaz PDB, 1bli z B. licheniformisi PDB, 2die z Bacillus sp.

Ksm-1378 widoczne było odchylenie w stosunku do reszty analizowanych

enzymów. Różnice te wynikają zapewne z odmiennej lokalnie topologii

szczeliny katalitycznej.

Mimo obecności atomu wapnia w cząsteczce alfa-amylazy PDB, 1w9x

z bakterii B. halmapalus przeprowadzone obliczenia nie wykazały wpływu

jonu wapnia przez oddziaływania kulombowskie.


238

6. Podsumowanie

Struktura centrów aktywnych analizowanych alfa-amylaz jest podobna,

zawiera reszty asparaginianowe, glutaminianowe i histydynowe. Pomimo

tego podobieństwa, badane obiekty różniły się między sobą optimum pH.

Obserwowane różnice mogą wynikać z odmiennych częściowo topologii

centrów aktywnych, mimo zachowawczości determinantów. Optima pK

badanych reszt są zbliżone do wartości ich optimów pH katalitycznych,

jednakże rola poszczególnych aminokwasów nie jest jednoznaczna.

Wartości pK reszt asparaginianowych i glutaminianowych w centrach

aktywnych wpływają na to, w jakim zakresie pH będą one mogły pełnić

swoją rolę, czyli czy akt katalityczny będzie możliwy. Ewentualne

substytucje w obrębie sekwencji, a w szczególności w sąsiedztwie reszt

katalitycznych, mogą powodować zmianę sumarycznego ładunku, co

również ma wpływ na stan jonizacji aminokwasów wchodzących w skład

centrum aktywnego alfa-amylaz.

Podziękowania

Składam serdeczne podziękowania p. dr inż. Radosławowi Drozdowi

za pomoc i cenne uwagi.

Literatura

1. de Souza P., de Oliveira e Magalhes P., Application of Microbial α-Amylase

in Industry – A Review, Brasilian Journal of Microbiology, 41 (2010), s. 850-861

2. Sivaramakrishnan S., Gangadharan D., Nampoothiri K., Soccol C., Pandey A.,

α-Amylases from Microbial Sources – An Overwiew on Recent Developments,

Food Technology and Biotechnology, 44 (2) (2006), s. 173-184

3. Aghajari N., Feller G., Gerday C., Haser R., Crystal structures of the

psychrophilic alpha-amylase from Alteromonas haloplanctis in its native form

and complexed with an inhibitor, Protein Science, 7(3) (1998), s. 564-72

4. Avwioroko O., Tunukari N., Asagba S., Biochemical Characterization

of Crude α-Amylase of Aspergillus spp. Associated with the Spoilage

of Cassava (Manihot esculenta) Tubers and Processed Products in Nigeria,

Advances in Biochemistry, 3(1) (2015), s. 15-23

5. Sundarram A., Murthy T., α-Amylase Production and Applications: A Review,

Journal of Applied & Enviornmental Microbiology Vol. 2, No. 4 (2014), s. 166-175

6. Nielsen J., Borchert T., Protein engineering of bacterial α-amylases,

Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular

Enzymology, Volume 1543, Issue 2, (2000), s. 253-274

7. Vengadaramana A., Balakumar S., Arasaratnam V., Stimulation of thermal

stability of α-amylase from Bacillus licheniformis ATCC 6346 by treating with

cations, Ceylon Journal of Science, 41(1) (2012), s. 35-44

8. Vuong T. V., Wilson D. B., Glycoside hydrolases: catalytic base/nucleophile

diversity, Biotechnology and Bioengineering, 107(2) (2010), s. 195-205



239

9. McIntosh L., Hand G., Johnson P., Joshi M., Körner M., Plesniak L., Ziser L.,

Wakarchuk W., Withers S., The pKa of the general acid/base carboxyl group

of a glycosidase cycles during catalysis: a 13C-NMR study of Bacillus

circulans xylanase, Biochemistry, 35(31) (1996), s. 9958-66

10. Parasuraman S., Protein data bank, Journal of Pharmacology and

Pharmacotherapeutics, (2012), s. 351-2

11. Suvd D., Fujimoto Z., Takase K., Matsumura M., Mizuno H., Crystal structure

of Bacillus stearothermophilus alpha-amylase: possible factors determining the

thermostability, Journal of Biochemistry, 129(3) (2001), s.461-8

12. Davies G., Brzozowski A., Dauter Z., Rasmussen M., Borchert T., Structure

of a Bacillus halmapalus family 13 α-amylase, BHA, in complex with an

acarbose-derived nonasaccharide at 2.1 Å resolution, Acta Crystallographica

D,(2005), s. 190-193

13. Alikhajeh J., Naderi-Manesh M., Ranjbar B., Hassan Sajedi R., Naderi-

Manesh H., Kinetic analysis, structural studies and prediction of pKa values

of Bacillus KR-8104 α-amylase: The determinants of pH-activity profile,

Enzyme and Microbial Technology, 47 (2010), s. 337-345

14. Machius M., Declerck N., Huber R., Wiegand G., Activation of Bacillus

licheniformis alpha-amylase through a disorder —>order transition of the

substrate-binding site mediated by a calcium-sodium-calcium metal triad,

Structure 3 (1998), s. 281-92

15. Shirai T., Igarashi K., Ozawa T., Hagihara H., Kobayashi,T., Ozaki K., Ito S.,

Ancestral sequence evolutionary trace and crystal structure analyses

of alkaline alpha-amylase from Bacillus sp. KSM-1378 to clarify the alkaline

adaptation process of proteins, Proteins 66 (2007), s. 600-610

16. Schomburg I., Chang A., Placzek S., Söhngen C., Rother M., Lang M.,

Munaretto C., Ulas S., Stelzer M., Grote A. Scheer M., Schomburg D.,

BRENDA in 2013: integrated reactions, kinetic data, enzyme function data,

improved disease classification: new options and contents in BRENDA,

Nucleic Acids Research 41 (2013), s. 764-772

17. Johansson, M. U., Zoete V., Michielin O., Guex N., Defining and searching

for structural motifs using DeepView/Swiss-PdbViewer, BMC Bioinformatics,

13 (2012), s. 173

18. Thompson J., Gibson T., Higgins D., Multiple sequence alignment using

ClustalW and ClustalX, Current Protocols in Bioinformatics (2002)

19. Hall T., BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor

and analysis program for Windows 95/98/NT, Nucleic Acids Symposium

Series 41 (1999)

20. Li H., Robertson A., Jensen J.,Very Fast Empirical Prediction and

Interpretation of Protein pKa Values, Proteins 61(2005), s. 704-721

21. Kindle K., Characterization and production of thermostable alpha-amylase,

Applied Biochemistry and Biotechnology 8 (1983), s. 153-170


240

Analiza determinantów katalitycznego optimum pH wybranych alfa-

amylaz pochodzących z bakterii z rodzaju Bacillus

Streszczenie

Alfa-amylazy to enzymy o niezwykle ważnym zastosowaniu w wielu gałęziach przemysłu. W pracy podjęto próbę analizy reszt aminokwasowych kształtujących katalityczne optimum

pH wybranych alfa-amylaz. Materiał badawczy stanowiły alfa-amylazy pochodzące

z bakterii z rodzaju Bacillus, charakteryzujące się różnymi wartościami optimum pH.

Wartości pK aminokwasów budujących centra aktywne enzymów i ich determinanty określono na podstawie metody PROPKA. W wyniku przeprowadzonych badań

stwierdzono, że przewidziane wartości pK dla poszczególnych aminokwasów

odpowiedzialnych za proces rozcinania substratu w centrum aktywnym nie były identyczne

u analizowanych obiektów pomimo podobieństw w budowie obszarów katalitycznych. Różnice te mogą wynikać z odmiennej lokalnej topologii i substytucji w otoczeniach reszt

katalitycznych.

Analysis of the determinants of catalytic pH optimum of the selected

alpha-amylases from Bacillusspecies

Abstract

Alpha-amylases are enzymes with a very important application in various branches

of industry. The paper attempts to analyze the influence of amino acid residues on the pH

catalytic optimum of the selected alpha-amylases derived from Bacillus species. The tested alpha-amylases were characterized by different values of pH optimum. pK values of amino

acids that build the active sites of enzymes and their determinants were determined on the

basis of the PROPKA method. The results showed that the pK values for amino acids

responsible for the catalytic process are not identical despite the similarity in the composition of catalytic sites. These differences may result from different local topology

and substitutions in environment of catalytic residues.



241

Tabela 2. Porównanie przewidzianych wartości pK aminokwasów odpowiedzialnych za rozcinanie substratu w centrach aktywnych analizowanych alfa-amylaz i ich determinantów

AA – aminokwas, K – numer klastra, DE – efekt desolwatacji, pKs – przesunięcie wartości pKa,

SHB – wiązania wodorowe łańcuchów bocznych, BHB – wiązania wodorowe łańcucha

głównego, CI – oddziaływania kulombowski

242

Matylda Mielcarska1, Magdalena Bossowska

2

Cięcie proteolityczne TLR3 przez katepsyny

jest istotne dla jego stabilności oraz sygnalizacji

1. Wstęp

TLR3 (Toll-like receptor 3) jest konserwowanym ewolucyjnie

receptorem wielkości ok. 100 kDa, związanym z wrodzoną odpowiedzią

immunologiczną [1, 2]. Należy on do rodziny białek rozpoznających

wzorce molekularne patogenów (PAMPs – pathogen-associated molecular

patterns), jego ligandem jest dwuniciowy kwas rybonukleinowy (dsRNA

– doublestranded RNA), stanowiący materiał genetyczny wirusów [3].

Niewielka ilość cząsteczek TLR3 zlokalizowana jest w większości

komórek człowieka, wysoką ekspresję receptora obserwuje się w łożysku

oraz trzustce, a także w niedojrzałych komórkach dendrytycznych

(CD11c(+)) oraz fibroblastach [4]. Podwyższoną ekspresję TLR3 zauważa

się również w komórkach mózgu – astrocytach, oligodendrocytach,

neuronach i komórkach mikroglejowych [5], gdzie poza obroną

przeciwwirusową receptor pełni funkcje związane z neurogenezą i może

brać udział w patogenezie chorób neurodegeneracyjnych [6, 7]. Wysoka

ekspresja TLR3 w wybranym typie komórek może wskazywać na

szczególną rolę tego receptora w określonym środowisku [8]. Receptor ten

występuje na powierzchni komórek oraz, podobnie jak w przypadku TLR7,

TLR8 i TLR9, w wewnątrzkomórkowych pęcherzykach – endosomach.

W endosomach zlokalizowane są proteazy odpowiedzialne za cięcie

TLR3, jak również TLR7 i TLR9 [9], które pozostają aktywne

w odpowiednim pH [10, 11]. Katepsyny cysteinowe, biorące udział

w przetwarzaniu powyższych receptorów, w pHneutralnym są w większości

niestabilne – poza lizosomami lub komórką pH obojętne może szybko

doprowadzić do ich nieodwracalnej dezaktywacji.

Dowiedziono, że proteolizaTLR3 nie jest wymagana dla przekazywania

sygnałuprzez ten receptor w odpowiedzi na syntetyczny analog

dwuniciowego RNA – poly(I:C) (polyinosinic-polycytydylicacid). Ponieważ

jednak wszystkie postacie TLR3 mogą oddziaływać z poly(I:C) [12],

[email protected], Zakład Immunologii, Katedra Nauk Przedklinicznych, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego, www.sggw.pl [email protected], Zakład Immunologii, Katedra Nauk Przedklinicznych,

Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego, www.sggw.pl

Cięcie proteolityczne TLR3 przez katepsyny jest istotne dla jego stabilności oraz sygnalizacji

243

stwierdzono, że proteolityczne przetwarzanie receptora może regulować

jego stabilność i funkcjonowanie – modulować stopień odpowiedzi

przeciwwirusowej w komórkach.

2. TLR3

Receptory Toll-like (Toll-likereceptors, TLRs) należą do rodziny białek

związanych z błonami komórkowymi, które, rozpoznając molekularne

wzorce związane z patogenami, uczestniczą we wrodzonej odpowiedzi

immunologicznej. TLRs należą do wysoce konserwowanych białek,

spotykanych wśród kręgowców i bezkręgowców, np. u muszki owocowej

Drosophilamelanogaster. Białka te wykazują wiele podobieństw

strukturalnych oraz funkcjonalnych [13].

Są one glikoproteinami, które składają się z ektodomeny wiążącej

ligand [14], fragmentu przechodzącego przez błonę komórkową

o strukturze helisy oraz domeny TIR (Toll-interleukin-1 receptor domain)

[13]. Mogą występować na powierzchni lub we wnętrzu komórki

w endosomach. Do TLRs występujących wewnątrz komórek zaliczamy

TLR3, TLR7, TLR8, TLR9. W tej grupie domena TIR usytuowana jest

wewnątrz endosomu i odpowiada za przekazywanie sygnału od

aktywowanego receptora do cytoplazmy [15]. W przypadku TLR3 kaskada

sygnałowa prowadzi do aktywacji czynnika transkrypcyjnego NF-κB

(nuclearfactor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) oraz IRF3

(interferon regulatory factor 3) [16]. Konsekwencją tego jest stymulacja

produkcji interferonów typu I oraz cytokin prozapalnych, jak IL-6 i IL-8,

które odpowiedzialne są za aktywację odpowiedzi przeciwwirusowej

gospodarza [17]. Aktywacja szlaku sygnałowego TLR3 może również

indukować apoptozę komórek nowotworowych dzięki stymulacji

aktywności kaspaz 8 i 9 [18].

Badania genetyczne u dzieci z autosomalnym dominującym niedoborem

TLR3 pozwoliły stwierdzić, że receptor ten ma kluczowe znaczenie

w obronie organizmu przed zakażeniem wirusem opryszczki (herpes

simplex virus 1, HSV-1), a szczególnie zapaleniem mózgu wywoływanym

przez ten wirus [19]. Niedobór funkcjonalnego TLR3 był pierwszym

zbadanym ludzkim niedoborem odporności, a jego odkrycie pozwoliło na

ustalenie, że prawidłowe funkcjonowanie TLR3 jest niezbędne dla

prawidłowej odpowiedzi przeciwwirusowej w centralnym układzie

nerwowym (CUN) przeciw HSV-1 [19]. Znaczenie TLR3 w odpowiedzi

przeciwwirusowej podkreśla również fakt, że niektóre wirusy, jak wirus

zapalenia wątroby typu C, wirus grypy czy wirus gorączki zachodniego

Nilu wykształciły specyficzne mechanizmy w celu ominięcia stymulacji

TLR3 [20].

Matylda Mielcarska, Magdalena Bossowska

244

Nowozsyntetyzowany TLR3 transportowany jest do retikulum

endoplazmatycznego (ER), następnie aparatu Golgiego i kolejno do

endosomów, gdzie ulega przetworzeniu przez proteazy.Ponieważ ligandem

dla TLR3 jest wirusowy dsRNA, cząsteczka pośrednicząca w replikacji

wielu wirusów, ważną rolę w jego funkcjonowaniu oraz regulacji pełnią

endolizosomy, które są miejscem separacji kwasów nukleinowych

patogenów [21, 22].

3. Katepsyny cysteinowe

Katepsyny są proteazami wewnątrzkomórkowymi aktywnymi w lekko

kwaśnym środowisku. Należą do nich proteazy serynowe – katepsyny A,

G, proteazy asparaginianowe – katepsyny D, E, oraz lizosomalne katepsyny

cysteinowe, do których należą katepsyny B i H, kluczowe enzymy

pośredniczące w degradacji i przetwarzaniu białek, wśród nich TLR3 [23].

Katepsyny cysteinowe należą do rodziny papainopodobnych proteaz

cysteinowych i posiadają wzór ekspresji specyficzny dla różnych tkanek

[24]. Ponieważ uczestniczą one w przemianach białek, stanowią ważne

ogniwo związane z przetwarzaniem antygenów i ich prezentacją. Stale

poszerzana jest wiedza na temat ich znaczenia w procesach nowotworzenia,

reumatoidalnym zapaleniu stawów i innych chorobach [25, 26].

4. Białko opiekuńcze Unc93b1

Obserwując wzrost poziomu TNF-α wewnątrz komórek po stymulacji

ligandem TLR3, Ewald i wsp. [27] dowiódł, że w mysich makrofagach

proteolityczne cięcie TLR3 przyczynia się do aktywacji receptora. Dla

prawidłowego przekazywania sygnału w komórce przez TLR3 wymagana

jest obecność białka opiekuńczego (chaperonowego) Unc93b1.

Zlokalizowane w retikulumendoplazmatycznym, odpowiada za prawidłową

translokację TLR3 do endolizosomów w komórce [28]. Dowiedziono, że

w ludzkich liniach komórkowych oddziaływanie Unc93b1 z TLR3 jest

niezbędne dla prawidłowego przetwarzania receptora przez katepsyny.

Zapobiega również wiązaniu ubikwityny i w konsekwencji degradacji

receptora [12].

5. Proteolityczne przetwarzanie TLR3

W genie TLR3, znajdującym się u człowieka na chromosomie 4,

obserwuje się wiele alternatywnych miejsc poliadenylacji, które mogą

generować różnej długości transkrypty [13]. Białko TLR3 u człowieka

składa się z 904 aminokwasów i może ulegać proteolitycznemu

przetworzeniu w endosomach, gdzie stwierdzono obecność zarówno jego

przetworzonych fragmentów, jak i receptora pełnej długości.


245

Cięcie TLR3 przez katepsyny B i H następuje między 252 a 346 amino-

kwasem receptora [29]. Ponieważ proteazy te posiadają szeroką specy-

ficzność substratową, nie jest możliwe bardziej precyzyjne określenie miejsca

cięcia [30]. Fragmenty TLR3 powstałe po cięciu są dominującą postacią

receptora, jaką można znaleźć w endosomach po jego stymulacji [29].

Podobnie jak w przypadku TLR9, w pierwszym etapie przetwarzania

TLR3 uczestniczą katepsyny dokonujące cięcia w pobliżu asparaginy

znajdującej się przy C-końcu białka. Powstaje wówczas N-końcowy

fragment (NTF) oraz C-końcowy fragment (CTF). Fragment CTF może

ulegać dalszej obróbce przez katepsyny w celu wytworzenia jego postaci

aktywnej [27]. W ludzkich liniach komórkowych HEK293T i Huh7.5,

TLR3 występuje w postaci pełnej długości oraz w postaciach CTF i NTF.

Pełnej długości TLR3 może wiązać dsRNA jako dimer [31], natomiast

badania strukturalne TLR3 wskazują na dwa przypuszczalne miejsca

wiązania ligandu: jedno znajduje się w pobliżu N-końca białka, a drugie na

jego C-końcu [31]. Analiza mutacyjna wykazała, że oba te miejsca

zawierają reszty aminokwasowe niezbędne dla aktywacji czynników

NF-κB i IRF3 po przyłączeniu poly(I:C) przez receptor [31]. Dowiedziono,

że cięcie TLR3 przez katepsyny stymuluje rozpoznawanie ligandu przez

ten receptor w mysiej linii komórkowej RAW264.7 i zarówno w ludzkich,

jak i mysich liniach komórkowych proteolityczne cięcie TLR3 może

wpływać na rozpoznawanie liganda i przekazywanie sygnału w komórce

przez ten receptor [12].

Produkty proteolizy TLR3 różnią się okresem półtrwania (t½)

– w komórkach linii HEK293T, TLR3 pełnej długości posiada t½

wynoszący ok 3 godziny, podczas gdy t½ fragmentów powstałych po

cięciu przekracza 7 godzin [12].

Zahamowanie cięcia TLR3 poprzez dodanie inhibitora katepsyn lub

wystąpienie mutacji w miejscu, w którym zachodzi proteoliza, obniża

w endosomach ilość cząsteczek receptora przeznaczonych do lizosomalnej

degradacji. Wydaje się zatem, że produkty cięcia TLR3 posiadają większą

stabilność w porównaniu do receptora nieprzetworzonego, szczególnie

w subpopulacji endolizosomów, biorących udział w regulacji funkcjo-

nowania TLR3. Podejrzewa się również, że w różnych tkankach, w których

TLR3 ulega wysokiej ekspresji, postaci receptora przed i po proteo-

litycznym przetworzeniu występują w endosomach w różnych proporcjach.


246

6. Podsumowanie

Podsumowując, fragmenty TLR3 powstałe po cięciu przez katepsyny,

tak jak i receptor pełnej długości, mogą uczestniczyć w przekazywaniu

sygnału w komórce. Kwaśne środowisko w endosomach sprzyja nie tylko

przetwarzaniu TLR3, ale też zwiększa powinowactwo przeciętych

fragmentów receptora do liganda. Podejrzewa się, że kwaśne pH może

również indukować zmianę konformacyjną tych fragmentów, wymaganą

dla przekazania sygnału [23]. Co więcej, aktywność katepsyn

odpowiedzialnych za przecinanie TLR3 hamowana jest, gdy w odczyn

w endosomach zmieni się na obojętny.

Wiązanie liganda przez TLR3 prowadzi do jego zwiększonej ekspresji,

co wskazuje na dodatnie sprzężenie zwrotne regulujące ekspresję receptora.

Jest to istotne, ponieważ mechanizm ten podtrzymuje odpowiedź

przeciwwirusową komórki w czasie zakażenia.

Za przetwarzanie TLR3 odpowiedzialne są katepsyny B i H, natomiast

przekazywanie sygnału w komórce zależne od wiązania TLR3 z ligandem

jest hamowane, gdy wyciszana jest ekspresja obu katepsyn [23]. Można

zatem postawić hipotezę, że katepsyny odgrywają istotną rolę w proteo-

litycznym przetwarzaniu czyli „dojrzewaniu” TLR3 w różnych typach

komórek. Przetwarzanie TLR3 przez endosomalne proteazy może

odzwierciedlać wspólny mechanizm regulacji dla całej podrodziny TLR

występujących w endosomach – TLR3, TLR7, TLR8, TLR9 [11, 17, 28].

Pozwalałby on na ograniczenie możliwości sygnalizacji przez określony

TLR tylko do komórkowego przedziału endosomalnego, gdzie mogą znaleźć

się kwasy nukleinowe patogenów, ligandy powyższych receptorów [27].

Literatura

1. Kumar H., Kawai T., Akira S., Toll-like receptors and innate immunity,

Biochemical and biophysical research communications 388 (2009), s. 621-625

2. Trinchieri G., Sher A., Cooperation of Toll-like receptor signals in innate

immune defence, Nature reviews. Immunology, 7 (2007), s. 179-190

3. Medzhitov R., Janeway C. A., Innate immunity: the virtues of a nonclonal

system of recognition, Cell 91 (1997), s. 295-298

4. UniProtKB/Swiss-Prot entry O15455, http://www.expasy.org/uniprot/O15455,

Accessed February 2, 2007

5. Lafaille F. G.,Pessach I. M., Zhang S. Y.,Ciancanelli M. J., Herman M.,

Abhyankar A., Ying S. W.,Keros S., Goldstein P. A.,Mostoslavsky G., Ordovas-

Montanes J., Jouanguy E.,Plancoulaine S.,Tu E.,Elkabetz Y., Al-Muhsen

S.,Tardieu M., Schlaeger M. T., Daley G. Q., Abel L.,Casanova J. L., Studer L.,

Notarangelo L. D., Impaired intrinsic immunity to HSV-1 in human iPSC-

derived TLR-3 deficient CNS cells, Nature 491 (2012), s. 769-773

http://www.expasy.org/uniprot/O15455

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lafaille%20FG%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Pessach%20IM%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhang%20SY%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ciancanelli%20MJ%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Herman%20M%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Abhyankar%20A%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ying%20SW%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Keros%20S%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Goldstein%20PA%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mostoslavsky%20G%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ordovas-Montanes%20J%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ordovas-Montanes%20J%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Jouanguy%20E%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Plancoulaine%20S%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tu%20E%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Elkabetz%20Y%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Al-Muhsen%20S%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Schlaeger%20TM%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Daley%20GQ%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Abel%20L%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Casanova%20JL%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Studer%20L%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Notarangelo%20LD%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Notarangelo%20LD%5Bauth%5D


247

6. Trudler D., Farfara D., Frenkel D., Toll-like receptors expression and

signaling in glia cells in neuro-amyloidogenic diseases: towards future

therapeutic application, Mediators of Inflammation, 2010 (2010)

7. Bsibsi M., Persoon-Deen C., Verwer R. W., Meeuwsen S., Ravid R.,

van Noort J. M., Toll-like receptor 3 on adult human astrocytes triggers

production of neuroprotective mediators, Glia 53 (2006), s. 688-695

8. Muzio M., Polentarutti N., Bosisio D., Prahladan M. K., Mantovani A., Toll-

like receptors: a growing family of immune receptors that are differentially

expressed and regulated by different leukocytes, Journal of leukocyte biology

67 (2000), s. 450-456

9. Park B., Brinkmann M. M., Spooner E., Lee C. C., Kim Y. M., Ploegh H. L.,

Proteolytic cleavage in an endolysosomal compartment is required for

activation of Toll-like receptor 9, Nature immunology, 9 (2008), s. 1407-1414

10. Chaturvedi A., Pierce S. K., How location governs Toll like receptor

signaling, Traffic 10 (2009), s. 621-628

11. Sepulveda F. E., Maschalidi S., Colisson R., Heslop L., Ghirelli C., Sakka E.,

Lennon-Duménil A. M., Amigorena S., Cabanie L., Manoury B., Critical role

for asparagine endopeptidase in endocytic Toll-like receptor signaling in

dendritic cells, Immunity 31(2009), s. 737-748

12. Qi R., Singh D., Kao C. C., Proteolytic processing regulates Toll-like receptor

3 stability and endosomal localization, The journal of biological chemistry

287 (2012), s. 32617-32629

13. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7098

14. Fukuda K., Tsujita T., Matsumoto M., Seya T., Sakiyama H., Nishikawa S.,

Hasegawa T., Analysis of the interaction between human TLR3 ectodomain

and nucleic acids, Nucleic acids symposium series 50 (2006), s. 249-250

15. Blasius A. L., Beutler B., Intracellular toll-like receptors, Immunity 32

(2010), s. 305-315

16. Jiang Z., Mak T. W., Sen G., Li X., Toll-like receptor 3-mediated activation

of NF-kappaB and IRF3 diverges at Toll-IL-1 receptor domain-containig

adapter inducing IFN-beta, Proceedings of the National Academy of Sciences

USA 101 (2004), s. 3533-3538

17. Takeda K, Akira S., TLR signaling pathways, Seminars in immunology,

16 (2004), s. 3-9

18. Sun R., Zhang Y., Lv Q., Liu B., Jin M., Zhang W., He Q., Deng M., Liu X.,

Li G., Li Y., Zhou G., Xie P., Xie X., Hu J., Duan Z., Toll-like receptor 3

(TLR3) induces apoptosis via death receptors and mitochondria by up-

regulating the transactivating p63 isoform alpha (TAP63alpha), The Journal

of biological chemistry 286 (2011), s. 15918-15928

19. Zhang S. Y. et al., TLR3 deficiency in patients with herpes simplex

encephalitis, Science 317 (2007), s. 1522-1527

20. Lai Y., Yi G., Chen A., Bhardwaj K., Tragesser B. J., Valverde R. A., Zlotnick

A., Mukhopadhyay S., Ranjith-Kumar C. T., Kao C. C., Viral double-strand

RNA-binding proteins can enhance innate immune signaling by toll-like

receptor 3, PLoS One 6 (2011), e25837

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7098


248

21. Chaturvedi A., Pierce S. K., How location governs toll-like receptor signaling, Traffic 10 (2009), s. 621-628

22. McGettrick A. F., O'Neill L. A., Localization and trafficking of Toll-like receptors. An important mode of regulation, Current opinion in immunology 22 (2010), s. 20-27

23. Garcia-Cattaneo A., Gobert F. X., Muller M., Toscano F., Flores M., Lescure A., Del Nery E., Benaroch P., Cleavage of Toll-like receptor 3 by cathepsins B and H is essential for signaling, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 109 (2012), s. 9053-9058

24. Barrett A. J., Rawlings N.D., Woessner J.F., Handbook of proteolytic enzymes, wydanie 2 (2004), Elsevier, Amsterdam

25. Vasiljeva O., Reinheckel T., Peters C., Turk D., Turk V., Turk B., Emerging roles of cysteine cathepsins in disease and their potential as drug targets, Current pharmaceutical design 13 (2007), s. 387-403

26. Lecaille F., Kaleta J., Bromme D., Human and parasitic papain-like cysteine proteases: their role in physiology and pathology and recent developments in inhibitor design, Chemical reviews 102 (2002), s. 4459-4488

27. Ewald S. E., Engel A., Lee J., Wang M., Bogyo M., Barton G. M., Nucleic acid recognition by Toll-like receptors is coupled to stepwise processing by cathepsins and asparagine endopeptidase, Journal of experimental medicine 208 (2011), s. 643-651

28. Kim Y. M., Brinkmann M. M., Paquet M. E., Ploegh H. L. UNC93B1 delivers nucleotide-sensing toll-like receptors to endolysosomes, Nature 452 (2008), s. 234-238

29. http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=TLR3 30. De Bouteiller O., Merck E., Hasan U. A., Hubac S., Benguigui B., Trinchieri G.,

Bates E. E., Caux C., Recognition of double-stranded RNA by human toll-like receptor 3 and downstream receptor signaling requires multimerization and an acidic pH, The journal of biological chemistry 280 (2005), s. 38133-38145

31. Turk V., Turk B., Turk D., Lysosomal cysteine proteases: Facts and opportunities, The EMBO journal 20 (2001), s. 4629-4633

32. Liu L., Botos I., Wang Y., Leonard J. N., Shiloach J., Segal D. M., Davies D. R., Structural basis of toll-like receptor 3 signaling with double-stranded RNA, Science 320 (2008), s. 379-381

33. Toscano F., Estornes Y., Virard F., Garcia-Cattaneo A., Pierrot A., Vanbervliet B., Bonnin M., Ciancanelli M. J., Shang S. Y., Funami K., Seya T., Matsumoto M., Pin J. J., Casanova J. L., Renno T., Lebecque S., Cleaved/associated TLR3 represents the primary form of the signaling receptor, Journal of immunology 190 (2013), s. 764-773

34. De Zoete M. R., Bouwman L. I., Keestra A. M., Van Putten J. P., Cleavage and activation of a Toll-like receptor by microbial proteases, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 108 (2011), s. 4968-4973

35. Zhang S. Y., Jouanquy E., Sancho-Shimizu V., Von Bernuth H., Yang K., Abel L., Picard C., Puel A., Casanova J. L., Human Toll-like receptor-dependent induction of interferons in protective immunity to viruses, Immunological reviews 220 (2007),s. 225-236

36. Uematsu S., Akira S., Innate immune recognition of viral infection, Uirusu 56 (2006), s. 1-8

http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=TLR3


249

Cięcie proteolityczne TLR3 przez katepsyny jest istotne dla jego

stabilności oraz sygnalizacji

Streszczenie

TLR3 (Toll-like receptor 3) należy do rodziny receptorów rozpoznających wzorce

(PatternRecognitionReceptors) i jego ligandem jest dwuniciowy RNA wirusowy (dsRNA, double-stranded RNA). Receptor ten pełni ważną funkcję w odporności wrodzonej i wraz

z TLR7, TLR8 oraz TLR9 należy do podrodziny TLR zlokalizowanych w błonie endosomów.

Ludzki TLR3 przetwarzany jest w endosomach komórkowych do dwóch fragmentów dzięki

proteazom cysteinowym - katepsynom B i H. Choć stwierdzono, że udział tego procesu w odpowiedzi na syntetyczny dsRNA – poly(I:C) (polyinosinic:polycytidylicacid) nie jest

wymagany, prawdopodobnie proteolityczne przetwarzanie receptora TLR3 może

modulować stopień odpowiedzi przeciwwirusowej. Zahamowanie aktywności katepsyn B

i H, zdolnych do cięcia TLR3, wpływa na obniżenie w endosomach ekspresji tego receptora przeznaczonego do degradacji w lizosomach. Ekspresja TLR3 stymulowana jest przez

ligandy tego receptora, co prowadzi do akumulacji jego postaci powstałych po

proteolitycznym przetworzeniu przy udziale katepsyn.

Poznanie zależności łączących TLR3 oraz katepsyny B i H pozwoli w przyszłości na dokładniejsze poznanie regulacji wewnętrznego transportu oraz procesu dojrzewania

cząsteczek tego receptora.

The proteolytic cleavage of TLR3 by cathepsins is important for its

stability and intracellular signaling

TLR3 (Toll-like receptor 3) belongs to the family of pattern recognition receptors (PRR) and

recognizes the double-stranded viral RNA (dsRNA). TLR3 plays an important role in the

innate immunity and, together with receptors TLR7, TLR8 and TLR9, is localized

in endosomes. Human TLR3 is converted in cytoplasmic endosomes into two fragments by cysteine

proteases – cathepsins B and H. Although it was discovered that during the response to the

poly(I:C) stimulation this conversion was not required. However, it is possible that the

proteolytic TLR3 processing may modulate the degree (intensity) of the antiviral response. Inhibition of cathepsins B and H, that are able to cleave TLR3, reduces the amount of the

receptor in the endosomes, destined for degradation in lysosomes. TLR3 expression

is stimulated by the presence of their ligands and it leads to the accumulation of the forms

produced after cathepsins proteolytic processing. Recognition of the correlation that links TLR3 and cathepsins B and H will lead in the future

to the better understanding of the internal regulations of the transport and maturation process

of the TLR3 molecules.

250

Iwona Kowalczyk1

Molekularne narzędzia do edycji genomów

wykorzystujące endonukleazy: ZFNs, TALENs

i CRISPR/Cas9 – porównanie

1. Wprowadzenie

Intrygującym pytaniem w świecie nauki od zawsze pozostawał sposób,

w jaki genotyp organizmu determinuje jego fenotyp. Od czasu

opublikowana pracy definiującej strukturę trójwymiarową DNA mija

obecnie 62 lata. Postęp nauki i odkrycia jakie miały miejsce od tamtej pory,

poza udzielaniem odpowiedzi na nurtujące pytania, jednocześnie

generowały wiele nowych [1]. W ten sposób, lista możliwości technologii

genetycznych wydłużała się, a wraz z nią lista osób nagrodzonych za swoje

odkrycia.

Jednym z wielu przykładów jest Nagroda Nobla w 2007 roku

w dziedzinie Medycyny lub Fizjologii dla trójki naukowców: Mario R.

Capecchiego, Sir Martina J. Evansa oraz Olivera Smithiesa, za osiągnięcia

w odkryciu podstaw wprowadzania specyficznych modyfikacji

genetycznych myszy z użyciem mysich komórek zarodkowych [2]. Dekadę

wcześniej oczy świata naukowego zwrócone były w stronę pierwszego

sklonowanego ssaka, owcy rasy Finn Dorset, za narodziny której

odpowiedzialni byli naukowcy z Roslin Institute w Edynburgu.

Wykorzystaną metodą był transfer jądrowy komórki somatycznej (SCNT

– somatic cell nuclear transfer) [3]. Uwagę poświęcano również samym

genom, których definicja ewoluowała przez lata, nabierając coraz

pełniejszego znaczenia od podstawowej jednostki dziedziczności do

nowatorskiego ujęcia podprogramu, dla którego systemem operacyjnym

będzie genom organizmu [4]. W roku 2015 mija też 25 lat od czasu

rozpoczęcia projektu mającego na celu poznanie ludzkiego genomu (HGP

– Human Genome Project) [5]. Efektem prac przedsięwzięcia było

ogłoszenie w roku 2003 wyników, według których ponad 98% sekwencji

części kodującej genomu ludzkiego została poznana z dokładnością do

99,99% [6]. Ten sam rok to jednocześnie data początku innego projektu,

ENCODE (akronim od Encyclopedia of DNA Elements) , celem którego 1 [email protected], Studenckie Koło Naukowe Genetyki Nowotworów przy

Zakładzie Genetyki Nowotworów z Pracownią Cytogenetyczną, Katedra Genetyki Medycznej,

I Wydział Lekarski z Oddziałem Stomatologicznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie

Molekularne narzędzia do edycji genomów wykorzystujące endonukleazy:

ZFNs, TALENs i CRISPR/Cas9 – porównanie

251

było pójście o krok dalej niż miało to miejsce przy HGP. Naukowcy

postanowili bowiem zidentyfikować szeroko pojęte, ważne funkcjonalnie

regiony genomu człowieka, dla przykładu geny czy regiony regulatorowe

transkrypcji [7]. Wyniki konsorcjum opublikowane w 2012 roku rzuciły

nowe światło na te fragmenty DNA, które dawniej uważano za

„śmieciowe”. Okazało się, że znaczenie funkcjonalne ma około 80%

genomu, zwłaszcza leżącego poza dobrze poznanymi regionami kodu-

jącymi białka, cechy wzmacniaczy wykazuje blisko 400 000 regionów,

cechy promotorów – ponad 70 000, a liczba regulatorowych miejsc

niekodujących jest co najmniej taka sama, jak znanych genów [8]. Coraz

lepiej poznawany, genom otwierał przed naukowcami nowe możliwości.

Jedną z nich była jego edycja, której próby nierozerwalnie wiążą się

z typem enzymów restrykcyjnych, jakimi są endonukleazy. Historia ich

odkrycia sięga lat 50. ubiegłego stulecia, kiedy to dwójka naukowców,

Salvador Luria i Mary Human zauważyli, że fenotyp wirusa pozostaje pod

wpływem genotypu komórki gospodarza, jednak jeden cykl komórkowy

we „właściwym” gospodarzu przywraca wirusowi pierwotny wygląd [9].

To intrygujące zjawisko znane było wówczas pod angielską nazwą host-

controlled modification of bacteriophages (modyfikacja bakteriofagów pod

kontrolą gospodarza). Zależność tę badał szwajcarski mikrobiolog Werner

Arber, a wyniki jego badań potwierdziły obecność u bakterii Escherichia

coli szczepu B enzymu modyfikującego zależnego od S-adenozylo-

metioniny, który chronił materiał genetyczny faga przed wewnątrz-

komórkową degradacją [10]. Dziś wiemy, że enzymem tym była metylaza,

zaś enzymem niszczącym okazała się endonukleaza R, przemianowana

z czasem na EcoB [11]. Kolejne lata tylko potwierdzały wcześniejsze

doniesienia: w roku 1970, Hamilton Smith i Kent Wilcox wyizolowali

pierwszy enzym restrykcyjny z bakterii Haemophilus influenzae szczep Rd,

znany obecnie pod nazwą HindII [12]. Enzym ten wykorzystali przy

pracach nad genomem wirusa onkogennego SV40 Daniel Nathans

i Kathleen Danna. Otrzymali 11 fragmentów, które po rozdziale

elektroforetycznym na żelu poliakrylamidowym okazały się zróżnicowane

pod względem masy. Badacze słusznie przewidywali, że enzymy

restrykcyjne mogą mieć względem DNA swoistość analogiczną do

proteinowych proteaz i że ułatwią poznawanie lokalizacji genów

w genomach organizmów [13,14]. Zwieńczeniem wysiłków Arbera,

Nathansa i Smitha było zdobycie w 1978 roku Nagrody Nobla w dziedzinie

Medycyny lub Fizjologii, za odkrycie enzymów restrykcyjnych oraz ich

zastosowanie w problemach genetyki molekularnej [15].

Odkrycia i badania na poziomie molekularnym pozostają w czołówce

naukowych dążeń dnia dzisiejszego. O tym, że tematyka biologii komórki

pozostaje jak najbardziej aktualna, świadczy przytoczona trzecia już,

Iwona Kowalczyk

252

tegoroczna Nagroda Nobla, tym razem w dziedzinie Chemii. Jej zdobywcy,

Tomas Lindahl, Paul Modrich oraz Aziz Sancar zostali docenieni za prace

nad komórkowymi mechanizmami naprawy DNA, które to zagadnienie

pozostaje kluczowym zarówno w tematyce edycji genomów, jak

i enzymów restrykcyjnych [16].

2. Cel pracy

Celem pracy jest zestawienie w analizie porównawczej trzech narzędzi

służących do modyfikacji DNA i wykorzystujących nukleazy bakteryjne

oraz wybór najbardziej obiecującego z nich. Są nimi nukleazy palców

cynkowych (Zinc - Finger Nucleases, ZFNs), TALENs (Transcription

Activator-Like Effector Nucleases, dosłownie „nukleazy efektorowe

o charakterze aktywatorów transkrypcji”) oraz te działające w systemie

CRISPR/Cas9 (akronim od Clustered Regularly Interspaced Short

Palindromic Repeats/CRISPR-associated). Zestawione zostaną fakty

dotyczące ich budowy, działania i zastosowania w praktyce, z zazna-

czeniem przewagi sposobu ostatniego nad pozostałymi dwoma.

3. Enzymy restrykcyjne

3.1. Wiadomości ogólne

Jak wspomniano we wstępie, enzymy restrykcyjne są wynikiem

ewolucyjnego przystosowania bakterii do zwalczania inwazji bakterio-

fagów. Należą one do grupy nukleaz (enzymów tnących DNA),

a dokładniej do endonukleaz, czyli enzymów wprowadzających cięcie

wewnątrz cząsteczki kwasu deoksyrybonukleinowego. W odróżnieniu od

nich, egzonukleazy, zależnie od specyficzności, będą ciąć cząsteczkę od

strony jej N- lub C-końca.

Nazwa „enzymy restrykcyjne” wzięła się z obserwacji przez badaczy

faktu, że enzymy te ograniczają (ang. restrict) rozwój wirusa w komórce

bakterii. Jak zostało to zaznaczone wcześniej (patrz Wstęp w tym

rozdziale), enzymy te występują zawsze w parze z innym enzymem,

metylazą, zadaniem której jest dokonanie metylacji DNA w miejscu

identycznym z tym, w którym enzym restrykcyjny ma dokonać cięcia.

Wyłącza to materiał genetyczny bakterii z puli potencjalnych substratów

dla endonukleaz, co stanowi mechanizm zabezpieczający przed

uszkodzeniem [17]. Jest to jednocześnie sposób ochrony niektórych

wirusów, tłumaczący ich zdolność do sukcesywnej replikacji w wybranych

szczepach [11].

3.2. Nazewnictwo i typy



253

Nazwy enzymów są tworzone w ściśle określony sposób. Pierwsza litera

nazwy pochodzi od rodzaju bakterii, z której dany enzym został pozyskany.

Następujące po niej dwie kolejne to dwie pierwsze litery nazwy

gatunkowej. Czwarta litera z kolei wskazuje na szczep, a ewentualna

rzymska cyfra za nią – na kolejność odkrycia [17]. Dla przykładu, zarówno

HindII, jak i HindIII pochodzą z bakterii Haemophilus influenzae szczepu

d, zaś izolacja HindII bezpośrednio poprzedziła w czasie izolację HindIII.

Różnorodność enzymów restrykcyjnych jest ogromna. Przyjęto ogólny

podział na cztery typy, wśród których wyróżnić można wiele podtypów.

Podział ten opiera się na różnicach w budowie, wymaganych kofaktorach

oraz otrzymywanych produktach reakcji. Wybrane informacje na temat

typów enzymów zebrane są w Tabeli 1.

Tabela 1. Typy enzymów restrykcyjnych z przykładami

TYP ENZYMU

ILOŚĆ

PODJEDNOSTEK SKŁADOWYCH

I FORMA

AKTYWNA

WYMAGANE KOFAKTORY

PRZYKŁADOWE ENZYMY

TYP I

3: HsdM, HsdS,

HsdR

HsdM2HsdS2HsdR

jony magnezu, ATP, S-

adenozylometionina

EcoKI, EcoR124I,

EcoAI

TYP II

duże zróżnicowanie

w obrębie podgrup zwykle homodimer

lub homotetramer

jony magnezu (znaczna większość), nie jest

wymagane ATP/GTP

FokI, HindII, HindIII

TYP III 2: Mod, Res

Mod2Res2

jony magnezu, ATP,

S-adenozylometionina EcoP1I, EcoP15I

TYP IV 2, tnąca i

rozpoznająca jony magnezu, GTP McrBC

Źródło: Opracowanie własne na podstawie [18]

Serwis internetowy REBASE (The Restriction Enzyme Database) jest

ogólnodostępnym źródłem prezentującym zbiór szczegółowych informacji

o dotychczas poznanych enzymach restrykcyjnych i białkach o podobnej

funkcji. Według obecnych informacji (stan na dzień 07.11.2015, dane

aktualizowane są codziennie), znanych jest ponad 70 tysięcy restryktaz:

34692 należące do typu I, 19960 do typu II, 8773 do typu III i 7085 do typu

IV [19].

Z uwagi na specyfikę działania, jedynie typ II znajduje praktyczne

zastosowanie w inżynierii genetycznej, dlatego też przy omawianiu

budowy wykorzystani będą reprezentanci tej grupy.

3.3. Budowa i zasada działania

Iwona Kowalczyk

254

Porównywane w niniejszym opracowaniu narzędzia umożliwiające

edycję genomów wykorzystują enzym restrykcyjny FokI, dlatego też to

właśnie on zostanie tu szczegółowo omówiony.

3.3.1. Enzym FokI: budowa

Dla enzymów restrykcyjnych charakterystyczną cechą jest specy-

ficzność rozpoznawanej sekwencji (innymi słowy wiązanie DNA

w określonym miejscu) oraz przecinanie DNA w określonym miejscu

w dany sposób.

Enzym FokI jest pozyskiwany z bakterii Flavobacterium okeanokoites.

W 1989 roku wyizolowano fragment DNA, zawierający geny metylazy

i endonukleazy bakterii, odpowiednio MFokI i RFokI. Ustalono, że gen

metylazy koduje 1 941 par zasad, gen endonukleazy 1 749, a oddziela je od

siebie 69 par zasad [20]. Poznanie genu restryktazy umożliwiło namnażanie

go z dużą wydajnością w klonach Escherichia coli, a otrzymany enzym

poddano trawieniu trypsyną w obecności i pod nieobecność DNA. [21]

Uzyskane wyniki pozwoliły wyodrębnić w strukturze 66 – kilodaltonowego

enzymu N- końcową domenę wiążącą DNA o masie 41 kDa i C-końcową

domenę niespecyficznie tnącą DNA o masie 25 kDa. Badania nad strukturą

krystaliczną enzymu wykazały, że domena odpowiedzialna za rozpoznanie

odpowiedniej sekwencji DNA składa się z 3 poddomen oznaczanych D1,

D2 i D3 [22]. Dokładne dane dotyczące budowy molekularnej poddomen

zestawiono w Tabeli 2.



255

Tabela 2. Struktura drugorzędowa domen funkcjonalnych FokI

STRUKTURA DRUGORZĘDOWA DOMEN FUNKCJONALNYCH ENZYMU FokI D

OM

EN

A R

OZ

PO

ZN

AJĄ

CA

(D

NA

-

SP

EC

YF

ICZ

NA

)

PO

DD

OM

EN

Y S

KŁ

AD

OW

E

D1 8 - helis: 1- 8; 2 pętle: L1, L2; 3 –harmonijki: 1- 3;

ramię N - końcowe

D2

6 -helis: 1- 6; 3 -harmonijki: , 2, 5; 2 -spinki do

włosów: 3, 4; krótka pętla L1; krótki odcinek T1 łączy 4

z 5

D3

najbardziej zbliżone budową do białek CAP

(aktywatorowych białek katabolicznych o strukturze helisa-

skręt-helisa): 3 -helisy i 3-harmonijki

DOMENA WYKONUJĄCA

CIĘCIE (DNA

– NIESPECYFICZNA)

przypomina podjednostkę endonukleazy BamHI, po 6

-helis i -harmonijek w następującej kolejności: 1, 2,

3, 1, 2, 3, 4, 4, 5, 5, 6, 6

Źródło: opracowanie własne na podstawie [22]

Analiza struktury krystalicznej enzymu dostarczyła też wielu innych

zaskakujących danych. Choć ogólna konformacja FokI w formie wolnej

(monomeru) i kompleksu po związaniu DNA jest podobna, okazało się, że

po przyłączeniu DNA dochodzi do zmian strukturalnych w obrębie

poddomen D1, D2 czy segmentu łączącego, których brak w monomerze

wyklucza przestrzenne dopasowanie obydwu molekuł [22, Rys.1].

Rysunek 1. Wyniki analizy krystalograficznej enzymu FokI umożliwiają dokładne poznanie

budowy cząsteczki. Choć ogólna konformacja wydaje się niemal identyczna, po związaniu DNA

zachodzą dyskretne, ale mające ważne implikacje zmiany strukturalne [22, za zgodą Autora]

Iwona Kowalczyk

256

Zakładając, że enzym funkcjonuje jako monomer, zastanawiające było

to, w jaki sposób jest w stanie przeciąć obydwie nici DNA. Zastąpienie

reszt asparaginowych domeny wykonującej cięcie resztami alaninowymi

całkowicie pozbawiało enzym jego funkcji, nie wpływając na zdolność

wiązania, co pozwalało przypuszczać, że w obrębie jednej cząsteczki

enzymu znajduje się pojedyncze centrum katalityczne [23]. Za dimeryzacją

przemawiała analiza kinetyki reakcji, zmian stężeń substratów i produktów

oraz wykorzystanie mieszanin enzymu typu dzikiego z formami

zmodyfikowanymi [24]. Analiza struktury krystalicznej poparła tę

hipotezę: dwa wiązania wodorowe wytwarzane są między resztą

argininową (R) a resztą kwasu asparaginowego (D) monomerów w każdej

z helis 4 należących do domen wykonujących cięcie [22, Rys.2].

Rysunek 2. Wizualizacja wiązań wodorowych tworzących się między dwiema domenami katalitycznymi monomerów [21, za zgodą Autora]

3.3.2. Enzym FokI: działanie

Enzym FokI jest najlepiej poznanym przedstawicielem podtypu IIS

restryktaz. Litera S w nazwie podtypu wskazuje na fakt, że miejsce,

w którym enzym dokonuje cięcia, jest przesunięte (ang. shifted away) na



257

jedną stronę względem domeny rozpoznawanej przez enzym [25]. Cechy

wspólne enzymów w tej podgrupie są następujące [26]:

miejsce, w którym dochodzi do cięcia nici, znajduje się poza

(„na zewnątrz od’’) sekwencji rozpoznawalnej;

jesteśmy w stanie wyodrębnić funkcjonalne domeny enzymu jako

osobne cząsteczki białek (enzym dwuczęściowy; u niektórych

podgrup funkcje te nakładają się na siebie w obrębie jednej domeny);

domena N-końcowa rozpoznaje określoną sekwencję DNA, domena

C-końcowa odpowiada za cięcie nici, łączy je fragment zwany

„ramieniem” (ang. arm lub linker);

sekwencja rozpoznawalna jest zwykle asymetryczna (niepalindro-

mowa), co warunkuje przeprowadzanie cięcia po jednej jej stronie;

zwykle współtowarzyszy im para metylaz, zadaniem których jest

metylacja adeniny lub cytozyny na każdej z nici.

W przypadku ostatniego punktu, enzym FokI cechuje obecność jednego

białka o zróżnicowanych funkcjonalnie domenach [20].

Analiza krystalograficzna wykazała, że w przypadku nieobecności

jonów dwuwartościowych, domena wykonująca cięcie jest związana

(w pewien sposób zablokowana) przez domenę rozpoznającą i tym samym

nieaktywna. Udało się też ustalić, że do dimeryzacji niezbędne jest

uprzednie rozpoznanie sekwencji przez obie dimeryzujące cząsteczki.

Prawdopodobnie jest to ewolucyjny mechanizm, zabezpieczający materiał

genetyczny przed cięciami w niepożądanych miejscach (brak swoistości

domen tnących) [27].

Aktualna koncepcja, według której działa endonukleaza FokI głosi, że

enzym wiąże nić DNA jako monomer, jednakże jego pojedyncze centrum

aktywne wymusza dimeryzację, tak by możliwe było przecięcie obydwu

nici [24]. Nie bez znaczenia pozostaje drugi z pary współtworzących dimer

enzymów. Wykazano, że w przypadku, gdy na nici DNA znajduje się tylko

jedna sekwencja swoista dla FokI, druga cząsteczka z pary będzie musiała

wiązać DNA nieswoiście lub też tworzyć wiązanie wyłącznie za

pośrednictwem domeny katalitycznej. Do dimeryzacji dojdzie, jednak

dimer taki będzie niestabilny, a reakcja zajdzie z małą wydajnością [27].

Pełna aktywacja części katalitycznych obydwu enzymów i tym samym

utworzenie stabilnych dimerów skutkuje największą wydajnością reakcji

i jest możliwe na tych cząsteczkach DNA, które zawierają co najmniej

dwie sekwencje swoiste dla FokI [20, 24, 28]. Cząsteczka DNA, która

wcześniej zawierała dwie sekwencje swoiste dla enzymu, po zakończeniu

reakcji może ulec podziałowi na dwie części z pojedynczymi sekwencjami

i wówczas każda będzie reagować z mniejszą wydajnością [27]. Miejsca

wiązania DNA nie muszą występować względem siebie w konkretnym

Iwona Kowalczyk

258

ustawieniu, a jeśli oddzielone są sekwencją zasad, to rozdzielający odcinek

DNA zwijany jest w pętlę [29, 30]. Dochodzi do utworzenia pewnego

rodzaju „synapsy”, w której sekwencje rozpoznawalne są utrzymywane

w położeniu równoległym, które z kolei warunkuje kształt przestrzenny

pętli [31].

Dokładnego mechanizmu przeprowadzania cięcia nie udało się

udowodnić w sposób naoczny, stąd potrzeba opierania się na modelu.

Zakłada on, że do aktywacji uprzednio związanej domeny katalitycznej

dochodzi przez obrót ramienia łączącego domeny o około 180 stopni,

a zmiana ta wywołana jest rozpoznaniem odpowiedniej sekwencji przez

domenę rozpoznającą [26].

Zapis sekwencji rozpoznawanej przez FokI przedstawia się następująco:

‘GGATG 9/13’ i oznacza, że enzym odcina 9 zasad następujących po

sekwencji 5’-GGATG-3’ oraz 13 zasad po sekwencji 5’-CCTAC-3’,

pozostawiając wolne końce 5’ („lepkie końce”) w obydwu niciach [22, 26].

Schematycznie zostało to przedstawione na poniższym rysunku.

Rysunek 3. Sekwencja rozpoznawana przez FokI i zaznaczone strzałkami miejsca cięcia,

opracowanie własne na podstawie [22]

4. Endonukleaza Cas9

4.1. Endonukleaza Cas9 - budowa

System CRISPR/Cas jest jednym z mechanizmów obronnych przed

bakteriofagami i wirusami, jakie w toku ewolucji wykształciła znaczna

część bakterii i archeonów [32]. Enzymem odpowiedzialnym za cięcie

DNA w systemie CRISPR/Cas jest białko Cas. Na podstawie różnic

w genach kodujących białka Cas, a co za tym idzie – różnic w działaniu

systemów, wyróżniono wśród nich trzy główne typy (I-III) [33]. Poniżej

opisany zostanie typ II, którego charakterystycznym genem jest cas9,

kodujący białko o tożsamej nazwie, w omawianym przykładzie

pozyskiwane z bakterii Streptococcus pyogenes [33].

Szczegółowy plan budowy na podstawie analizy krystalograficznej

przedstawia Tabela 3.



259

Tabela 3. Budowa białka Cas9 Streptococcus pyogenes -analiza krystalograficzna B

UD

OW

A B

IAŁ

KA

Cas

9 (

Str

epto

cocc

us

pyogen

es)

PŁAT REC

(recognition)

DŁUGA -HELISA

pojedyncza -helisa

DOMENA

REC1 25 -helis: - oraz -; 2-harmonijki:

i , -

DOMENA

REC2 6 -helis: 6-11

PŁAT NUC

(nuclease)*

DOMENA

RuvC

6-niciowa -harmonijka: , 2, , , , ;

oflankowana -helisami: , , -;

2 dodatkowe, ułożone antyrównolegle -harmonijki:

/ i /

DOMENA

HNH 2-niciowe, ułożone antyrównolegle -harmonijki:

, ; oflankowane 4 -helisami: -

DOMENA

PI (PAM-interacting)

7 -helis: -; -harmonijki 3-niciowe,

ułożone antyrównolegle (-); -harmonijka

5-niciowa: -, , ; -harmonijka

2-niciowa: -

Źródło: opracowanie własne na podstawie [34] * - nie uwzględniono współtworzących płat NUC:

regionu bogatego w argininę (Arginine - rich), regionu o homologii topoizomerazy (Topo) oraz

domeny C-końcowej (CTD) [35]

Funkcja poszczególnych domen przedstawia się następująco: płat REC

odpowiada za rozpoznanie i związanie odpowiedniej cząsteczki, domena

RuvC przecina nić komplementarną dwuniciowego DNA, zaś domena

HNH – komplementarną [34]. Szczególną funkcję pełni domena PI,

odpowiedzialna za rozpoznanie i związanie sekwencji znanej jako PAM

(proto - spacer adjacent motif). W genomie fagów istnieją bowiem

sekwencje znane jako proto - spacery i przyległe do nich na końcu 3’ lub 5’

sekwencje PAM [36]. Sekwencje te różnią się między typami systemów

CRISPR/Cas [37]. Różnice między nimi stwierdzono też między

gatunkami bakterii: SpCas9 ze Streptoccus pyogenes wykorzystuje

trójnukleotydową sekwencję 5’-NGG-3’ (N-nukleotyd), która w ludzkim

genomie występuje średnio co 8 par zasad [38]. Dla przykładu, PAM

w NmCas9 (Neisseria meningitidis) przedstawia się następująco:

5’-NNNNGATT-3’, co tłumaczy powszechne wykorzystywanie właśnie

SpCas9 [39].

4.2. Endonukleaza Cas9 – działanie

Iwona Kowalczyk

260

Specyfika działania systemu CRISPR/Cas uniemożliwia opis funkcji

białka w oderwaniu od pozostałych jego elementów, dlatego też w tym

miejscu opisane zostanie funkcjonowanie systemu jako całości.

4.2.1. System CRISPR/Cas9 – mechanizm działania

Odkrycie zasad działania systemu wiąże się z obserwacją obecności

wśród genomów prokariontów powtarzalnych sekwencji długości

kilkudziesięciu nukleotydów, poprzedzielanych zróżnicowanymi

sekwencjami o zbliżonej długości [40]. Dziś wiemy, że powtórzenia

rozdzielają od siebie tzw. spacery, które razem tworzą loci zwane CRISPR

(akronim od clustered regularly interspaced short palindromic repeats)

[36]. Powyżej locus CRISPR znajduje się odcinek długości do kilkuset par

zasad, którego cechą charakterystyczną jest wysoka zawartość par A-T,

tzw. leader region o funkcji promotora transkrypcji [41]. Po jednej stronie

locus leży też kilka genów cas, kodujących odpowiednie białka [41].

Znaczenie CRISPR zaczęto poznawać, gdy po raz pierwszy wykazano, że

insercja i delecja w obrębie tego locus oraz inaktywacja genów cas wpływa

na odporność bakterii Streptococcus thermophilus [42].

Zasadę działania systemu można przedstawić w trzech kolejnych

etapach:

włączenie do genomu nowego fragmentu spacer-powtórzenie: ma to

miejsce zwykle bezpośrednio obok leader region, w związku z czym

nabyte spacery leżą zgodnie z kolejnością, z jaką były nabywane

w czasie [36, 43, 44];

transkrypcja spacerów pod postacią pre-crRNA, ciętego następnie na

krótkie RNA (crRNA, CRISPR-RNA) oraz genów cas, która

w większości poznanych przypadków zachodzi konstytutywnie [43,

45]; w dojrzewaniu pierwotnego transkryptu udział bierze RNA

kodowany również przez CRISPR (tracrRNA, trans-activating

CRISPR RNA), komplementarny do regionów powtórzeniowych

w pre-crRNA, enzymem obrabiającym transkrypt jest RNAza III [46];

crRNA łączą się z białkami Cas9 w kompleks, który sprawdza

materiał genetyczny gospodarza pod kątem zgodności z crRNA

i jeśli dopasowanie takie ma miejsce, fragment DNA zostaje wycięty

[36, 45, 47a].

Prawidłowe przeprowadzenie procesu umożliwiają między innymi:

sekwencja PAM, która zapewnia przyjęcie odpowiedniej

konformacji białka a także jest oznaczeniem, które umożliwia

kompleksowi odróżnienie własnego DNA od obcego [48];

tracrRNA, którego obecność ma wpływ na prawidłowe

przeprowadzenie cięcia i przestrzenne ustawienie crRNA [49];



261

Naukowcom udało się opracować chimeryczny sgRNA (single guide

RNA), który z powodzeniem zastępuje funkcję kompleksu tracr:crRNA.

Cel osiągnięto, łącząc koniec 3’ crRNA z końcem 5’-tracrRNA za

pośrednictwem regionu łączącego [49].

Zaproponowany w 2014 roku model cięcia przedstawia się następująco:

początkowo Cas9 rozpoznaje region docelowy, który leży proksymalnie od

sekwencji PAM, oraz łączy się z sgRNA w podwójny kompleks. SgRNA

rozpoznaje sekwencję docelową o długości 20 nukleotydów, domena PI

– sekwencję PAM na nici niekomplementarnej. Powstaje kompleks

poczwórny, w którym zmiany konformacyjne umożliwiają domenie HNH

przecięcie nici komplementarnej, zaś domenie RuvC – niekomple-

mentarnej, na poziomie 3 nukleotydów powyżej PAM [34]. Schematycznie

zostało to przedstawione na poniższym rysunku.

Rysunek 4. Graficzna ilustracja sposobu działania systemu CRISPR/Cas9. Guide RNA (single-

guideRNA wraz z crRNA) rozpoznaje docelową sekwencję w genomie, dochodzi do związania motywu PAM i każda z domen białka SpCas9 przecina po jednej z nici DNA na wysokości

trzech par zasad powyżej PAM Źródło: [50, publikacja za pozwoleniem]

W tym miejscu należy zwrócić uwagę na zasadnicze różnice między

FokI i Cas9. Poza różnicami w budowie (patrz: wcześniejsze podrozdziały),

wyraźnie różnią się sposobami działania. FokI, jako enzym restrykcyjny,

przeprowadza cięcie w określonym miejscu. Endonukleazie Cas9 brakuje

takiej specyficzności. Pośrednio zyskuje ją ona poprzez tworzenie

kompleksu z sgRNA oraz wiązanie motywu PAM. W przypadku Cas9 nie

musi również dochodzić do dimeryzacji.

Iwona Kowalczyk

262

Elementem, do którego sprowadza się wykorzystanie zarówno systemu

CRISPR oraz cząsteczek wykorzystujących enzym FokI jest wprowadzenie

w komórce pęknięcia każdej z dwóch nici DNA (DSB – double – stranded

brake), będące punktem wyjścia do dalszych działań.

5. Sposoby naprawy uszkodzeń DNA w komórce

W ciągu życia komórki, jej materiał genetyczny może ulec wielu uszko-

dzeniom, z których wyjątkowo niekorzystnymi, bo potencjalnie dla niej

śmiertelnymi oraz niosącymi ryzyko kancerogenezy są wspomniane jedno-

czesne pęknięcia obydwu nici, DSBs [47b, 51]. Dochodzić do nich może

zarówno pod wpływem czynników uszkadzających endo-, jak i egzo-

gennych [52, 53]. W nielicznych sytuacjach mamy do czynienia z pęknię-

ciami o tle fizjologicznym. U wszystkich organizmów eukariotycznych

zachodzą one w czasie mejozy, umożliwiając rekombinację materiału gene-

tycznego [52, 54]. W komórkach kręgowców, obydwie nici DNA nacinane są

u dojrzewających limfocytów T i B, jako część procesu zwanego

rekombinacją segmentów V(D)J oraz później u dojrzałych limfocytów

B celem zmiany klasy syntetyzowanych przeciwciał [52, 54, 55, 56].

Istnieją dwie główne drogi, jakimi uszkodzenie takie może zostać

naprawione. Jedna z nich, zwana rekombinacją homologiczną (homologous

recombination, HR), wymaga ‘wzoru’ (np. siostrzanej chromatydy),

według którego brakujący fragment zostanie odtworzony [47c, 58].

Ograniczona jest zatem do organizmów diploidalnych oraz haploidalnych

będących w fazie podziału [58]. Bliskość siostrzanej chromatydy

prawdopodobnie wpływa na dominację tego sposobu naprawy w późnej

fazie S i G2 cyklu komórkowego [59]. Ten sposób naprawy zdaje się też

być wiodącym w komórkach drożdży [60]. U kręgowców większe

znaczenie zdaje się mieć ewolucyjnie starsza droga niehomologicznego

łączenia końców (non – homologous end joining, NHEJ), mogąca mieć

miejsce w każdej fazie cyklu komórkowego i nie wymagająca diploidii [57,

58, 59]. To właśnie za jej pośrednictwem uzyskiwana jest wysoka

różnorodność klas przeciwciał [56]. Dochodzi tutaj do nieobecnej w HR

modyfikacji końców i enzymatycznego ich łączenia, co skutkuje

insercjami, delecjami i prowadzi do niestabilności genomu [47c, 51, 58].

Koncepcja wprowadzania zmian w genomach opiera się na

wykorzystaniu komórkowych mechanizmów naprawczych DSBs [61].

Proces HR mógłby na przykład prowadzić do poprawy genu lub też, jeśli

wprowadzony zostanie homologiczny DNA egzogenny, do włączenia

transgenu [62, rysunek 5]. Problem stanowiło wprowadzenie DSB

w pożądanym miejscu.



263

Rysunek 5. Możliwe wykorzystanie dróg naprawy dwuniciowych uszkodzeń DNA w komórce. NHEJ, poprzez insercje i delecje (ang. ‘indels’) może skutkować wyciszaniem genu. HDR,

będące pojęciem szerszym niż HR, może skutkować zamianą wadliwego genu lub dodaniem

transgenu. Źródło: wykonanie własne na podstawie Fig. 1 w [62]

Długość sekwencji rozpoznawanych przez restryktazy typu II

(przeciętnie 4 do 8 par zasad), zbyt krótka i przez to stosunkowo często

występująca w większości genomów, pozbawiała je wymaganej precyzji

[25, 62]. Próby uzyskania enzymów typu II rozpoznających dłuższe

sekwencje nie powiodły się, czego prawdopodobną jedną z przyczyn może

być fakt, że funkcje domen dla typu II nakładają się na siebie, a zatem

próby zmiany jednej mogą wpływać na aktywność drugiej [62]. Dopiero

odkrycie dwóch oddzielnych, funkcjonalnych domen w FokI pozwalało

przypuszczać, że zastępując domenę wiążącą DNA inną, rozpoznającą

odcinki dłuższe, zmienimy enzym w pożądany sposób [62].

Pomysł wcielono w życie na początku lat dziewięćdziesiątych, kiedy

połączono czynnik transkrypcyjny Ubx (Ultrabithorax) Drosophila

melanogaster z C- końcem domeny FN (odpowiedzialnej za cięcie) enzymu

FokI, doprowadzając tym samym do powstania pierwszego enzymu

restrykcyjnego o charakterze chimerycznym [63].

Iwona Kowalczyk

264

6. Białka chimeryczne wykorzystujące enzym FokI: ZFNs

Po raz pierwszy, cząsteczki znane dziś jako palce cynkowe (ZFP, zinc

finger proteins) zostały odkryte w czasie badań nad strukturą czynnika

transkrypcyjnego III oocytów żaby z rodzaju Xenopus [64].

6.1. Budowa

Budowa pojedynczego palca cynkowego przedstawia się następująco:

jest to około 30 reszt aminokwasowych, które zawierają po parze

niezmiennych reszt cysteinowych i histydnowych [65]. Struktura drugo-

rzędowa to dwie -harmonijki i jedna -helisa, a wspomniane reszty wiążą

jon Zn2+

, umożliwiając przyjęcie struktury trzeciorzędowej [65].Według

jednego ze źródeł, motyw palców cynkowych jest drugą co do częstości

domeną białka, jaka jest kodowana w ludzkim genomie [66]. Inne źródło

podaje, że w ludzkim genomie białka ZFP to najliczniejsza rodzina białek

o funkcji aktywatorów transkrypcji [67]. Po raz pierwszy, ich fuzji poprzez

peptyd łączący długości kilku aminokwasów z C-końcem domeny FN FokI

dokonano w 1996 roku i tę datę można uznać za początkową dla ZFNs

[68]. Każdy palec cynkowy wiąże 3 pary zasad obecnych w rowku

większym helisy DNA za pośrednictwem -helisy obecnej w swojej

strukturze [66]. W określonych stosunkach przestrzennych możliwe jest

jednak związanie 4 par zasad [62]. Odkrycie możliwości łączenia ze sobą

palców cynkowych (modular assembly – składanie modułowe), umożliwiło

tworzenie struktur rozpoznających sekwencje długości do 18 par zasad

[69]. Jednakże, jak zostało to wspomniane wcześniej, wiązanie się palców

cynkowych do określonych miejsc w genomie jest uwarunkowane

bliskością ZF sąsiednich, co stanowi ograniczenie w zastosowaniu [70].

Stało się to potrzebą opracowania dwóch metod: sequential selection, gdzie

kolejne palce cynkowe dobierane są stopniowo, z uwzględnieniem

stosunków przestrzennych [71], oraz pewną jej odmianę, bipartite

selection, gdzie zmianie ulegają reszty odpowiedzialne za wiązanie DNA

[62, 72]. Choć obie zwiększały powinowactwo nukleaz, okazały się

metodami zbyt pracochłonnymi i nieodpowiednimi do powszechnego

stosowania [62]. Wykazano też większą specyficzność w przypadku

łączenia palców w 3 podjednostki po 2 palce w każdej względem odwrotnej

konfiguracji (2x3 palce) [72].

6.2. Mechanizm działania

Jak zostało to zaznaczone wcześniej, enzym FokI wymaga dimeryzacji

do pełnej aktywności, dlatego nie jest zaskoczeniem, że w przypadku ZFNs

jest podobnie [23, 73]. Efektywne wprowadzanie cięć obydwu nici

uzyskano, gdy w obrębie cząsteczki DNA znajdowały się dwie odwrotne



265

sekwencje dla ZFPs (po jednej na każdej z nici), skierowane do siebie

końcami (tail-to-tail orientation) [73]. Nie bez znaczenia dla efektywności

pozostaje wzajemna odległość miejsc wiązania ZFN oraz sekwencja

i długość peptydu łączącego [73, 74]. Nukleaza pozostawia końce 5’

wzorem enzymu natywnego [73]. Graficznie, działanie nukleaz przedstawia

rysunek 6.

Pierwszymi sukcesami przy pracy z ZFN były modyfikacje genu yellow

na chromosomie X Drosophila melanogaster. W 2002 roku udało się

wprowadzić mutacje w jego obrębie, rok później udało się wprowadzić

donorowy fragment DNA [75, 76].

Rysunek 6. Graficzna ilustracja działania nukleaz palców cynkowych. Każdy palec wiąże trzy

kolejne zasady DNA za pośrednictwem struktury-helisy, a warunkiem do dimeryzacji domen restryktaz jest odpowiednia ich geometria i bliskość. Za optymalne warunki do indukowania

DSBs uważa się odwrócone położenie sekwencji, które mają być związane i 6 par zasad odległości między nimi. Źródło: [77], publikacja za pozwoleniem

6.3. Dostępne modyfikacje

Z uwagi na niewielką efektywność działania, zrozumiałym wydaje się

dążenie do jak najskuteczniejszej pracy nukleaz palców cynkowych [78].

Zdecydowanym przełomem okazało się wprowadzanie nukleaz do

komórek zarodków Drosophila za pomocą iniekcji mRNA, co względem

poprzednich metod było mniej czasochłonne [79]. Stworzono też dwie bazy

danych, służące za swego rodzaju biblioteki dostępnych ZFPs o wyjątkowo

wysokiej specyficzności i powinowactwie. Jedną z nich jest OPEN

(Oligomerized Pool ENgineering,), korzystająca z puli (ang. pool) palców

zaprojektowanych oddzielnie dla związania konkretnych 3 par zasad [80].

Iwona Kowalczyk

266

Z kolei CoDA (Context – Dependent Assembly) korzysta z zasobów OPEN,

by wybrać trzeci z trójki ZFPs dla nowego miejsca docelowego [81].

Nukleazami palców cynkowych posłużono się do stworzenia pewnej ich

odmiany: ZFNickases (ang. nick – nacinać). Wprowadzając mutację do

jednego z pary dimerów ZFN, uzyskano cząsteczkę, która tnie jedną tylko

nić DNA, a także stymuluje jej naprawę drogą HDR, zmniejszając tym

samym ryzyko niepożądanej mutagenezy drogą NHEJ [82, 83].

6.4. Problem cytotoksyczności i cięć poza miejscami docelowymi

Już pierwsze sukcesy z zastosowaniem nukleaz palców cynkowych

połączone były z obserwacją, że ekspresja jednej z nich, yA, przy

temperaturze 37 stopni Celsjusza, była dla muszek owocowych śmiertelna

[75]. Przypuszczano, że może to być związane z brakiem odpowiedniej

specyficzności białka i wiązaniem miejsc niepożądanych, o zbliżonym

stopniu homologii, co zostało potwierdzone wynikami późniejszych badań

[84]. Prawdopodobnie brak sztywnych reguł odnośnie dopasowania, który

dotyczy każdego z przedstawianych systemów, jest ważną cechą, która

zwłaszcza TALENs i CRISPR/Cas9 umożliwia adaptację do mutujących

genomów patogenów [62].

Brak wymaganej swoistości ma znaczenie w świetle zastosowań

klinicznych, czego przykładem może być wykorzystanie ZFNs do

wprowadzania mutacji w genie koreceptora chemokiny 5, CCR5, na

limfocytach Th jako metody terapii u osób zakażonych wirusem HIV [85].

Zaprojektowane do tego celu nukleazy wykazują też aktywność wobec

genu CCR2, o budowie zbliżonej do CCR5 i leżącego w jego bliskim

sąsiedztwie na trzecim chromosomie [86]. Nie można wykluczyć ryzyka

niepożądanych zmian w tym genie i tym samym implikacji klinicznych

u osób poddawanych wspomnianej terapii [87].

Komponowanie zestawów palców cynkowych powinno uwzględniać

odpowiednie ich powinowactwo i choć otrzymywano zestawy nawet

sześciopalcowe, najczęściej łączy się je w trójki rozpoznające 18 par zasad

i jest to minimalna liczba, aby zapewnić dostateczne powinowactwo

w kontekście genomu ssaków [87, 88].

Jeżeli chodzi o specyficzność, skuteczny okazał się sposób takiej

modyfikacji domeny FN FokI, by w pewien sposób „wymusić” na

cząsteczkach tworzenie heterodimerów i uniknąć wprowadzania cięć

niepożądanych przez homodimery, co ma miejsce zwłaszcza przy

nadekspresji ZFNs [89, 90]. Jeszcze lepsze efekty przyniosła modyfikacja

wspomnianej metody, w której oprócz heterodimeryzacji nie dochodzi do

„krzyżowania się” monomerów między sobą, co ściśle determinuje parę

tworzącą heterodimer [91].



267

Mniejsza cytotoksyczność była też pośrednim efektem próby

bezpośredniego dostarczenia nukleaz do komórek zamiast iniekcji mRNA

[92]. Białko było szybciej degradowane w porównaniu z poprzednią

metodą i skracało czas ekspozycji materiału genetycznego oraz ryzyko

szkodliwej nadekspresji [92].

6.5. Zastosowanie

6.5.1. Organizmy zwierzęce i roślinne

Chociaż grono organizmów, u których wykorzystano ZFNs stale się

zwiększa, sztandarowymi w literaturze pozostają organizmy modelowe

takie jak:

muszka owocówka (Drosophila melanogaster) [75, 76];

danio pręgowany (Danio reiro) [93];

szczur (rodzaj Rattus) [94];

żaba gatunku Xenopus tropicalis [95];

nicień Caenorhabditis elegans [96];

Inne gatunki to na przykład monarch (Danaus plexippus) czy świnia

domowa (Sus scrofa) [97, 98]. Wykorzystane organizmy roślinne to

rzodkiewnik (Arabidopsis thaliana), kukurydza zwyczajna (Zea mays),

tytoń (rodzaj Nicotiana) [99, 100, 101].

6.5.2. Zastosowanie terapeutyczne – człowiek

Pierwszym sukcesem w dziedzinie terapii chorób z wykorzystaniem

ZFNs w komórkach człowieka była ukierunkowana mutageneza

w komórkach pacjentów z mutacją receptora dla interleukiny 2 (IL2R) w ciężkim złożonym niedoborze odporności (SCID, Severe Combined

Immunodeficiency) [102]. Zastąpienie wadliwego locus prawidłowym

udało się uzyskać w około 18% komórek, przy czym około 7% było pod

tym względem homozygotami [102]. Kolejny przykład, choć na modelu

zwierzęcym, dotyczy genu F9, kodującego IX czynnik krzepnięcia

i nieprawidłowego w przypadku hemofilii typu B: w komórkach wątroby

myszy udało się dokonać naprawy zmutowanego locus, uzyskując wyższe

wartości aPTT oraz stężenia czynnika krążące we krwi [103]. Sukcesy

odnotowano przy próbie korekcji mutacji w genie HBB przy anemii

sierpowatej wykorzystując do tego ludzkie indukowane komórki

pluripotentne (hiPSCs) [104]. Takimi samymi komórkami posłużono się

przy próbach zakończonej sukcesem biallelicznej korekcji mutacji

punktowej u pacjentów z wrodzonym niedoborem 1-antytrpsyny

(A1ATD), gdzie oprócz ZFNs wykorzystano też transpozon piggyBac

Iwona Kowalczyk

268

[105], a także przy naprawie mutacji w genie-synukleiny (SNCA) [106].

Nie można zapomnieć o wspomnianych wcześniej w tym rozdziale

badaniach nad koreceptorem CCR5 na limfocytach T [107]. Udało się

również uzyskać limfocyty T odporne niemal całkowicie nie tylko na HIV-

1 wykorzystujący CCR5, ale również CXCR4 [108]. Wreszcie, palce cynkowe

okazały się skuteczne w immunoterapii, gdzie umożliwiły limfocytom T

ekspresję receptora o większym powinowactwie antyguzowym [109].

6.6. Sprzedaż

Komercyjnie dostępne palce cynkowe oraz ich nukleazy rozpow-

szechnia firma biofarmaceutyczna Sangamo BioSciences we współpracy

z Sigma-Aldrich, dla których konstruowanie ZFNs to własność

intelektualna [110, 111, 112]. Dawna cena 250 000 dolarów za pojedynczy

ZFN, dzięki coraz łatwiejszym sposobom pozyskiwania, dziś jest znacznie

zmniejszona [110]. ZFNs, projektowane na zamówienie, opatrzone

firmową nazwą CompoZr®, są wyceniane po wypełnieniu ankiety na

stronie producenta [111]. Z kolei gotowy, przykładowy zestaw

CompoZr® Targeted Integration Kit - AAVS1, kosztuje nieco ponad 11 220

złotych (dane z dnia 26.11.2015) [113].

Odkrycie nukleaz palców cynkowych było niewątpliwym przełomem.

W czasie, gdy sukcesywnie je udoskonalano, na horyzoncie pojawił się dla

nich swojego rodzaju „konkurent”, o czym w artykule podsumowującym

osiągnięcia związane z ZFNs wspomina sam Dana Carroll, pionier

w dziedzinie konstruowania chimerycznych endonukleaz [88].

7. Białka chimeryczne wykorzystujące enzym FokI: TALENs

Białka efektorowe TALEs (transcription activator – like effectors)

pierwotnie zostały opisane jako czynnik zjadliwości bakterii z rodzaju

Xanthomonas, patogennych wobec roślin [114].

7.1. Budowa

TALEs stanowią rodzinę białek o charakterze aktywatorów transkrypcji,

której cechy budowy są w znacznym stopniu między sobą zachowane [115].

Pojedyncza cząsteczka składa się z domeny centralnej odpowiedzialnej

za wiązanie DNA oraz odcinka C-końcowego, w obrębie którego wyróżnić

można region NLS (nuclear localisation signal) i domenę aktywującą

transkrypcję (AD) [116]. Centralna domena zwykle zawiera około 34

aminokwasy tworzące tandemowe powtórzenia [116]. Jednak z szeregu

aminokwasów głównie dwa, hiperzmienne, determinują specyficzność

cząsteczki: są nimi te umieszczone w pozycjach 12 i 13, które określamy

RVD (repeat variable diresidues) [117]. Każda z nich wiąże po jednej



269

zasadzie, co więcej w określony sposób (‘DNA recognition code’),

a pozostałe powtórzenia w tandemie wiążą kolejne zasady [115]. Okazuje

się też, że niemal wszystkie znane w genomach eukariontów miejsca

wiązania TAL poprzedza tymina [61, 115, 117]. Informacji o sposobie,

w jaki TAL wiąże się z DNA, dostarczyła analiza struktury krystalicznej

cząsteczki [118].

7.2. Mechanizm działania

Nukleazy TALEs (TALENs, TALNs) otrzymano w analogiczny do

ZFNs sposób, łącząc domenę FN enzymu FokI z białkami TALEs [119,

120]. Mechanizm cięcia zachodzi jak w przypadku ZFNs tyle, że zmienia

się domena wiążąca DNA.

Wzorem ZFPs, również i TALEs można łączyć ze sobą w długie

zespoły, lecz jest to łatwiej osiągalne [61, 66]. Świadczy to braku

niepożądanych oddziaływań między składowymi i tym samym większej

specyficzności modułów [62, 66]. Również opisany wcześniej dla TALENs

‘DNA recognition code’ w przypadku ZFNs nie istnieje [62, 66]. Wszystkie

te cechy sprawiają, że jesteśmy w stanie przewidzieć, jaka domena zostanie

związana oraz zaprojektować szereg TALEs tak, by wiązały pożądane

miejsce [62, 66, 67].

Opisywane białka nie są jednak pozbawione wad: jedną z nich jest

utrudniająca procesy klonowania znaczna ilość powtórzeń o wysokim

stopniu homologii [61, 66]. Stąd potrzeba rozwoju metod ułatwiających

otrzymywanie TALENs na wysoką skalę.


Szybkie i efektywne otrzymywanie TALENs umożliwiła metoda

Golden Gate cloning, wykorzystująca enzymy restrykcyjne typu IIS oraz

procesy cięcia restrykcyjnego i ligacji w jednej mieszaninie reakcyjnej

[121, 122, 123]. Sprawne otrzymywanie nukleaz w sposób zauto-

matyzowany umożliwia FLASH (Fast Ligation-based Automatable Solid-

phase High-throughoutput), metoda, w której do pierwotnego fragmentu

DNA kodującego powtórzenie TAL oznaczonego biotyną przyłączane są

sukcesywnie następne sekwencje [124]. Całość przyłączona jest do

namagnesowanej kropli opłaszczonej streptawidyną, która w końcowym

etapie jest odcinana [124]. Metoda jest niezwykle szybka i pozwala na

otrzymywanie nawet tysięcy nukleaz: DNA kodujące do 96 różnych

powtórzeń TAL to przedział czasowy jednego dnia [110]. Inne podejście

prezentuje ICA (iterative capped assembly), gdzie unieruchomione

monomery powtórzeń DNA są składane w łańcuchy, które, jeśli są

nieodpowiednio długie, na jednym z końców znakowane są

Iwona Kowalczyk

270

oligonukleotydami (‘capping oligonucleotides’), tym samym zwiększając

wydajność reakcji [125]. Technika LIC (ligation – independent cloning)

opiera się na łączeniu kodującego powtórzenia DNA w koliste plazmidy

i konstruowanie bibliotek dimerów, które później składane są w dłuższe

sekwencje [126]. Niezwykle wydajna, a przy tym stosunkowo tania jest

nowa metoda fairyTALE, który umożliwia konstruowanie plazmidu

kodującego TALEs o powinowactwie do danej sekwencji w przeciągu

jednego dnia [127].

7.4. Problem cytotoksyczności i cięć poza miejscami docelowymi

Niepożądana mutageneza jest także kwestią dotyczącą TALENs.

W porównaniu z nukleazami palców cynkowych, te drugie stawiane są

w niekorzystnym świetle.

Informacji o bezpośrednim porównaniu ZFNs i TALENs dostarcza

praca z 2011 roku, uwzględniająca ich aktywność wobec endogennych loci

w genomie człowieka, mianowicie wspomnianych już wcześniej w tym

rozdziale genów IL2R i CCR5 [128]. Oto niektóre z zawartych w niej

wniosków [128]:

ustalono optymalne długości linkera (peptydu łączącego FokN

z białkiem TALE) i spacera (liczby reszt oddzielających dwie

cząsteczki TALEs podczas dimeryzacji), zapewniające największą

aktywność;

dla pary swoistej wobec locus IL2Raktywność ZFNs ponad

dwukrotnie przewyższała TALENs, częstotliwość zmutowanych

alleli odpowiednio 37 i 14%);

dla pary swoistej wobec locus CCR5: aktywność obydwu białek

zbliżona, częstotliwość zmutowanych alleli 17% dla TALENs, 14%

ZFNs;

dla pary swoistej wobec locus CCR5: niepożądana mutageneza

w allelu CCR2 w przypadku ZFNs 11%, w przypadku TALENs 1%.

Powyższe dane świadczą o cytotoksyczności ZFNs przewyższającej

białka efektorowe TAL. Opublikowana dwa lata później praca dotycząca

mutacji genów muszek owocówek potwierdza te obserwacje i dostarcza

następujących dodatkowych danych [129]:

całkowita liczba mutacji wywołanych nukleazami palców

cynkowych ponad czterokrotnie przewyższała tę wywołaną TALENs

(odpowiednio 632:148);

dla ZFNs: około połowa z nich to delecje, pozostała część

w równych proporcjach insercje z delecjami oraz insercje;

dla TALENs: ponad 2/3 mutacji to delecje, 30% insercje z delecjami,

zaledwie 1% same insercje;



271

mediana dla rozmiaru delecji: ZFNs – 2 pary zasad, TALENs – 8 par

zasad;

różnice w cytotoksyczności mogą być podyktowane większą

specyficznością TALENs (1 zasada wiązana przez 1 moduł).

7.5. Zastosowanie

7.5.1. Organizmy zwierzęce i roślinne

Podobnie jak nukleazy palców cynkowych, również i TALENs

wykorzystano w badaniach nad zwierzętami, których przykłady są

następujące:

muszka owocówka [130];

danio pręgowany [131, 132];

żaba z rodzaju Xenopus [132];

bydło [133];

makak królewski (Macaca mulatta) i makak krabożerny (Macaca

fascicularis) [134].


Nadzieję na zastąpienie palców cynkowych przez nukleazy białek

TALE dały wyniki eksperymentu, w którym z sukcesem dokonano

wprowadzenia za pomocą TALENs transgenów do ludzkich zarodkowych

komórek macierzystych oraz indukowanych komórek pluripotentnych

[135]. Szybkie i wydajne, nukleazy pozwalały na indukowanie mutacji

w różnych loci w różnych typach komórek, co pozwalało śledzić związek

danej mutacji z ich metabolizmem i funkcjami [136]. Wprowadzenie

insercji i delecji (indels) w eksonie 51 genu dystrofiny w komórkach

pacjentów z dystrofią mięśniową Duchenna umożliwiło przesunięcie ramki

odczytu tak, że białku przywrócono jego prawidłową funkcję [137]. Za

pośrednictwem nukleaz możliwe jest indukowanie w jednokomórkowych

zarodkach mysich mutacji, co zwiększa dostępność modeli do badania

chorób człowieka: gen Rb38, którego mutacje są przyczyną rzadkiego

schorzenia genetycznego jakim jest zespół Hermanskiego –Pudlaka [138],

mutacje w genie Fus, leżące u podłoże stwardnienia zanikowego bocznego

[139] oraz geny zlokalizowane na chromosomie Y[140].

Iwona Kowalczyk

272

7.6. Sprzedaż

Komercyjnie dostępne nukleazy białek TALE zapewniają korporacje

takie jak Transposagen Biopharmaceuticals czy Thermo Fisher Scientific

[141, 142]. Cena przykładowej nukleazy TALE, ‘AAVS1 donor vector and

AAVS1-specific XTN™ TALEN nucleases’ to 999,0 $ [143].

8. CRISPR/Cas9

Locus CRISPR zostało po raz pierwszy opisane w 1987 roku przez

Yoshizumi Ishino, w czasie gdy wraz z zespołem badał budowę genu iap

u Escherichia coli [144]. Wówczas jednak system nie był znany pod

obecną nazwą [36]. Akronim dla nazwy locus został użyty po raz pierwszy

przez Ruuda Jansena w 2002 roku [41]. Potrzeba było kolejnej dekady, by

poznać znaczenie całego systemu [49]. Obecnie, CRISPR/Cas dołączył do

grona molekularnych, genetycznych „narzędzi” jako przedstawiciel trzeciej

już ich generacji [87].

Zarówno budowa, jak i działanie systemu CRISPR/Cas9 zostały

omówione w poprzednich podrozdziałach.


Przeciwdziałając niepożądanej mutagenezie, podjęto próby modyfikacji

systemu CRISPR. Jedną z nich jest skrócenie guide RNA do trugRNA

(truncated-guide RNA, ang. truncated – przycięty), co pozwoliło znacznie

zredukować niepożądaną mutagenezę, nie wpływając jednocześnie na

wydajność pracy w miejscu docelowym [145]. Innym sposobem jest

przekształcenie nukleaz w parę ‘Cas9 nickases’: każda z par takich nukleaz

wprowadzałaby SSB (single-stranded break = nick), czyli pojedyncze

nacięcie, które DSB pozwoliłoby uzyskać jedynie, gdy sekwencje wiążące

występują w odpowiedniej bliskości, co przekłada się na większą

specyficzność [146, 147]. Kolejny sposób to połączenie guide RNA

z domeną FN FokI w białko RFN (RNA-guided FokI Nuclease), po

uprzedniej inaktywacji obu centrów aktywnych Cas9 , otrzymując redukcję

niepożądanych cięć większą niż dla monomeru Cas9[148, 149].

8.2. Problem cytotoksyczności i niepożądanej mutagenezy

Za mutacje poza miejscami docelowymi w przypadku systemu CRISPR

odpowiada zarówno guideRNA, jak i nukleaza Cas9 [87].

Badając aktywność nukleazy wykazano, co następuje [150]:

zarówno odcinek dystalny, jak i proksymalny względem PAM mają

znaczenie w dopasowaniu, jednak dokładne dopasowanie wymagane

jest w obrębie 8-12 par zasad proksymalnie od PAM (tzw. seed



273

region); niedopasowanie w regionie dystalnym od PAM jest mniej

ściśle wymagane;

SpCas9 rozpoznaje też 5’-NAG-3’ i 5’-NGA-3’ ale z pięciokrotnie

mniejszą wydajnością niż 5’-NGG-3’;

ilość niepożądanych cięć zwiększy się przy nadmiernym stosunku

nukleazy do sgRNA, stąd pomysł miareczkowania ich wzajemnych

stężeń;

opracowano 4 reguły odnośnie stopnia homologii regionów

sąsiednich oraz stężeń reagentów, umożliwiające jak największą

efektywność.

W przypadku ZFNs i TALENs, ilość rozpoznawanych zasad, a co za

tym idzie – specyficzność, można było zwiększyć, łącząc palce cynkowe

i białka TALEs w długie szeregi [151]. W przypadku CRISPR/Cas

specyficzność jest ustalonana poziomie 22 par zasad, należy jednak

pamiętać, że nie są to, wzorem poprzednich nukleaz, oddziaływania DNA-

białko, lecz odpowiada za nie oddziaływanie między nukleotydami, co

czyni potencjalne miejsca niepożądanych uszkodzeń łatwiejszymi do

przewidzenia [151].

8.3. Zastosowanie

8.3.1. Organizmy roślinne i zwierzęce

Nie jest zaskoczeniem, że z chwilą odkrycia CRISPR/Cas9 zaczęto

wykorzystywać go na organizmach modelowych: danio pręgowanym

[152], makaku krabożernym [153], muszkach owocówkach [154], myszach

[155] i szczurach [156]. System CRISPR/Cas9 jest też wiodącą metodą

rozpatrywaną pod kątem przydatności w procesie edycji genomów

gatunków wymarłych zwierząt, nad którymi obecnie pracują naukowcy,

zajmujący się szeroko pojętą dziedziną de-ekstynkcji [48d].


System wykorzystano przy pracy nad ludzkimi genami EMX1

(kodującym czynnik transkrypcyjny biorący udział w rozwoju mózgowia)

oraz PVALB (gen kodujący parwalbuminę, białko wiążące wapń z dużym

powinowactwem) [38]. Innym przykładem są prace nad locus AAVS1

(adeno-associated virus integration site 1) [146]. O perspektywach

terapeutycznego zastosowania systemu mówi jego współodkrywczyni

w czasie konferencji TEDTalks, Jennifer Doudna, ostrzegając jednocześnie

przed nieoczekiwanymi konsekwencjami, jakie mogą wyniknąć ze zbyt

lekkomyślnego potraktowania tematu ingerencji w genom człowieka

w przyszłości [157].

Iwona Kowalczyk

274

8.4. Sprzedaż

Sprzedaż plazmidów z systemem CRISPR prowadzi organizacja

Addgene [158].

8.5. Zestawienie trzech generacji endonukleaz

Wydawać by się mogło, że na przestrzeni lat kolejne odkrywane

endonukleazy cechowała coraz większa doskonałość. Do pewnego stopnia

jest to zgodne z prawdą, należy jednak pamiętać, że każda metoda ma

swoje zalety i ograniczenia. Niektóre z głównych cech białek zebrano

w poniższej tabeli.

Tabela 4. Wybrane cechy trzech generacji chimerycznych endonukleaz.

CECHA

CZĄSTECZKI ZFNs TALENs CRISPR/Cas9

zdolność wiązania

DNA

palec cynkowy

(białko)

białko efektorowe

transkrypcji RNA

zdolność cięcia DNA domena FN FokI domena FN FokI nukleaza Cas9

długość sekwencji rozpoznawanej

9-18 par zasad (x2) 10-20 par zasad

(x2) 20 par zasad

rozmiar około 1 kz (x2) około 3 kz (x2) około 4,2 kz

(Cas9) i 0,1 kz

(gRNA)

zdolność do

multipleksowej

modyfikacji

(multiplet-targeting)

w znacznym

stopniu ograniczona ograniczona możliwa

zdolność do cięcia

DNA po metylacji

nie (wrażliwa na

metylację)

nie (wrażliwa na

metylację)

tak (niewrażliwa

na metylację)

koszt (względna

cena) bardzo wysoki wysoki niski

Źródło: opracowanie własne na podstawie tabeli zawartych w [61, 62]

Nukleazy palców cynkowych mogą być z łatwością dostarczane do

komórki drogą wektorów wirusowych (IDLVs, integrase-deficient

lentiviral vectors), zwłaszcza, jeśli nie jest możliwa droga transfekcji [61].

Zbyt duże rozmiary TALENs czynią dla nich ten sposób nieosiągalny [61].

ZFNs z kolei ma ograniczoną możliwość jeśli chodzi o konstruowanie

dłuższych „targetów”, z uwagi na interakcje między palcami. Ten problem

nie dotyczy TALENs, ale ich długie powtórzenia tandemowe utrudniają

wszelkie próby powielania cząsteczek. Zdecydowanie jednak przewagą

TALENs nad ZFNs jest większa specyficzność i mniejsza zdolność do

indukowania niepożądanej mutagenezy.

CRISPR umożliwił wyciszenie kilku genów jednocześnie, co

dotychczas osiągano w sposób mało wydajny i długotrwały, tym samym



275

ustawiając CRISPR w miejscu potencjalnych narzędzi do multipleksowych

zmian w genomie [155, 159]. Tę właśnie zaletę CRISPR wykorzystuje

profesor George Church, zastępując niektóre geny w komórkach słonia ich

mamucimi allelami, dążąc do częściowej rekonstrukcji genomu w procesie

de-ekstynkcji [47e]. Niemniej, tkwi w tej metodzie potencjał, który być

może zwiększą kolejne lata pracy nad ulepszającymi modyfikacjami.

Kolejna przewaga nad poprzednimi generacjami modyfikowanych

endonukleaz dotyczy sposobu dostarczania do komórki: CRISPR może

ulegać ekspresji in vitro w postaci dwuniciowych oligonukleotydów [147,

159]. Należy pamiętać, że CRISPR również nie jest pozbawiony wad:

dopuszczalne niedokładności w dopasowaniu były przyczyną jego

modyfikacji. Również konieczność wystąpienia sekwencji PAM jest swego

rodzaju ograniczeniem [159].

Kontrowersji wokół tematu modyfikowania komórek ludzkich

zarodków dostarcza niedawna publikacja [160], a do świadomego

korzystania ze zdobyczy technologii nawołuje wspomniana wcześniej

Jennifer Doudna [157].

9. Podsumowanie

Obecny rozwój technologii umożliwia korzystanie z różnorodnych

technik, za pośrednictwem których możliwe jest wprowadzenie zmian

w obrębie fragmentów genomów, a dokładniej – samych genów. Wiodące

trzy generacje zmodyfikowanych endonukleaz przywodzą na myśl

ustępowanie sukcesorów, jednak nie jest to do końca prawdą, bowiem

wszystkie nadal pozostają w użyciu. Faktem jest natomiast, że zwłaszcza

ostatnia z nich, system CRISPR/Cas, pozostaje dla nauki najbardziej

obiecująca.

Choć CRISPR/Cas nie przewyższa TALENs pod względem

specyficzności, posiada inne aspekty, dla których góruje zarówno nad

ZFNs jak i TALENs. Są to zdolność do zmiany kilku miejsc w genomie

jednocześnie oraz możliwość uzyskania wewnątrz komórki drogą

klonowania gRNA w wektorach służących do ekspresji pożądanych

oligonukleotydów. Jest to też metoda stosunkowo tania. Metody

udoskonalające jej specyficzność świadczą o tym, że jest powszechnie

wykorzystywana i spełnia swoją rolę jako narzędzie edytujące genomy.

Iwona Kowalczyk

276

Literatura

1. Heijne, von G., Liljas A., Molecular Mechanisms in Biological Processes:

Nobel Symposium 130, Federation Of European Biochemical Societies Letters,

579 (2005), s.851

2. http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2007/

3. Wilmut I., Schnieke A. E., McWhir J., Kind A.J., Campbell K. H. S., Viable

offspring derived from fetal and adult mammalian cells, Nature, 385 (1997),

s. 810-813

4. Gerstein M. B., Bruce C., Rozowsky J.S., Zheng D., Du J., Korbel J. O.,

Emanuelsson O., Zhang Z. D., Weissman S., Snyder M., What is a gene, post-

ENCODE? History and updated definition, Genome Research, 17 (2007),

s.669-681

5. Green E. D., Watson J. D., Collins F. S., Twenty-five years of big biology,

Nature, 526 (2015), s. 29-31

6. Collins F. S., Morgan M., Patrinos A., The Human Genome Project: Lessons

from Large-Scale Biology, Science, 300 (2003), s. 286-290

7. The ENCODE Project Consortium, A User’s Guide to the Encyclopedia

of DNA Elements (ENCODE), PLoS Biology, 9 (4) (2011), s. 1-21

8. The ENCODE Project Consortium, An integrated encyclopedia of DNA

elements in the human genome, Nature, 489 (2012), s.57-74

9. Luria S. E., Human M. L., A nonhereditary, host-induced variation

of bacterial viruses, Journal of Bacteriology, 64 (4) (1952), s. 557-569

10. Kühnlein U., Linn S., Arber W., Host specificity of DNA produced

by Escherichia coli. XI. In vitro modification of phage fd replicative form,


of America, 63 (2) (1969), s.556-562

11. Pray L., Restriction enzymes, Nature Education, 1(1) (2008), s.38.

12. Heinrichs A., Milestone 4: Making the cut, Nature Milestones, 8 (2007), s.7

13. Danna K., Nathans D., Specific Cleavage of Simian Virus 40 DNA by

Restriction Endonuclease of Hemophilus Influenzae, Proceedings of the

National Academy of Sciences of the United States of America, 68 (12)

(1971), s.2913-2917

14. http://www.nature.com/scitable/spotlight/restriction-enzymes-18458113

15. http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1978/

16. http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2015/

17. Weil P. A., Molecular Genetics, Recombinant DNA, & Genomic Technology,

Harper's Illustrated Biochemistry, 30e. Eds. Victor W. Rodwell, wersja online

z: http://accessmedicine.mhmedical.com/content.aspx?bookid=1366&Sectioni

d=73245504, Accessed November 07, 2015

18. Pingoud A., Fuxrelter M., Pingoud V., Wende W., Type II restriction

endonucleases: structure and mechanism, Cellular and Molecular Life

Sciences, 62 (2005), s.685-707

19. http://rebase.neb.com/rebase/rebase.enz.html

20. Kita K., Kotani H., Sugisaki H., Takanami M., The FokI Restriction-

Modification System. II. Presence of two domains in FokI methylase

http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2007/



277

responsible for modification of different DNA strands, The Journal

of Biological Chemistry, 264 (10) (1989), s. 5751-5756

21. Li L., Wu.L. P., Chandrasegaran S., Functional domains in Fok I restriction

endonuclease, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United

States of America, 89 (1992), s. 4275-4279

22. Wah D. A., Bittinaite J., Schildkraut I., Aggarwal A. K., Structure of Fok I has

implications for DNA cleavage, Proceedings of the National Academy

of Sciences of the United States of America, 95 (1998), s.10564-10569

23. Waugh D. S., Sauer R. T., Single amino acids substitutions uncouple the DNA

binding and strand scission activities of Fok I endonuclease, Proceedings

of the National Academy of Sciences of the United States of America,

90 (1993), s. 9596-9600

24. Bittinaite J., Wah D. A., Aggarwal A. K., Schildkraut I., FokI dimerization

is required for DANN cleavage, Proceedings of the National Academy

of Sciences of the United States of America, 95 (1998), s. 10570-10575

25. Halford S. E., Catto L. E., Pernstich C., Rusling D. A., Sanders K. L., The

reaction mechanism of FokI excludes the possibility of targeting zinc finger

nucleases to unique DNA sites, Biochemical Society Transactions, 39 (2011),

s.584-588

26. Pingoud A., Wilson G. G., Wende W., Type II restriction endonucleases

- a historical perspective and more, Nucleic Acids Research, 42 (12) (2014),

s. 7489-7527

27. Catto L. E., Ganguly S., Milsom S. E., Welsh J. A., Halford S. E., Protein

assembly and DNA looping by the FokI restriction endonuclease, Nucleic

Scids Research, 34 (6) (2006), s.1711-1720

28. Vanamee E. S., Santagata S., Aggarwal K. A., FokI Requires Two Specicific

DNA Sites for Cleavage, Journal of Molecular Biology, 309 (2001), s. 69-78

29. Gemmen G. J., Millin R., Smith D. E., DNA looping by two-site restriction

endonucleases: heterogeneous probability distributions for loop size and

unbinding force, Nucleic Acids Research, 34 (10) (2006), s.2864-2877

30. Catto L. E., Bellamy S. R. W., Retter S. E., Halford E. E., Dynamics and

consequences of DNA looping by the FokI restriction endonuclease, Nucleic

Acids Research, 36 (6) (2008), s. 2073-2081

31. Rusling D. A., Laurens N., Pernstich Ch., Wuite G. J. L., Halford S. E., DNA

looping by FokI: the impact of synapse geometry on loop topology at varied

site orientations, Nucleic Acids Research, 40 (11) (2012), s.4977-4987

32. Makarova K. S., Wolf Y. I., Snir S., Koonin E. V., Defense Islands in

Bacterial and Archaeal Genomes and Prediction of Novel Defense Systems,

Journal of Bacteriology, 193 (21) (2011), s.6039-6056

33. Makarova K. S., Haft D. H., Barrangou R., Brouns J. J. S., Charpentier E.,

Horvath P., Moineau S., Mojica F. J. M., Wolf Y. I., Yakunin A. F., van der

Oost J., Koonin E. V., Evolution and classification of the CRISPR-Cas

systems, Nature Reviews.Microbiology, 9 (6) (2011), s.467-477

34. Nishimasu H., Ran F. A., Hsu P. D., Konermann S., Shehata S. I., Dohmae N.,

Ishitani R., Zhang F., Nureki O., Crystal Structure of Cas9 in Complex with

Guide RNA and Target DNA, Cell, 156 (2014), s.935-949

Iwona Kowalczyk

278

35. Jinek M., Jiang F., Taylor D. W., Sternberg S. H., Kaya E., Ma E., Anders C.,

Hauer M., Zhou K., Lin S., Kaplan M., Iavarone A. T., Charpentier E., Nogales E.,

Doudna J. A., Structures of Cas9 Endonucleases Reveal RNA-Mediated

Conformational Activation, Science, 343 (6176) (2014), s.1247997-1247997

36. Deveau H., Garneau J. E., Moineau S., CRISPR/Cas System and Its Role

in Phage-Bacteria Interactions, The Annual Review of Microbiology, 64

(2010), s. 475-493

37. Mojica F. J. M., Diez-Villasenor C., Garcia-Martinez J., Almendros C., Short

motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence

system, Microbiology, 155 (2009), s.733-740

38. Cong L., Ran .A., Cox D., Lin S., Barretto R., Habib N., Hsu P. D., Wu X.,

Jiang W., Marraffini L. A., Zhang F., Multiplex Genome Engineering Using

CRISPR/Cas Systems, Science, 339 (6121) (2013), s.819-823

39. Hou Z., Zhang Y., Propson N. E., Howden S. E., Chu L., Sontheimer E. J.,

Thomson J. A., Efficient genome engineering un human pluripotent stem cells

using Cas9 from Neisseria meningitidis, Proceedings of the National Academy

of Sciences of the United States of America, 39 (110) (2013), s.15644-15649

40. Mojica F. J. M., Villasenor-Diez C., Martinez-Garcia J., Soria E., Intervening

Sequences of Regularly Spaced Prokaryotic Repeats Derive From Foreign

Genetic Elements, Journal of Molecular Evolution, 60 (2006), s.174-182

41. Jansen R., van Embden J. D. A., Gaastra W., Schouls L. M., Identification

of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes, Molecular

Microbiology, 43 (6) (2002), s.1565-175

42. Barrangou R., Fremaux Ch., Deveau H., Richards M., Boyaval P., Moineau S.,

Romero D. A., Horvath P., CRISPR Provides Acquired Resistance Against

Viruses in Prokaryotes, Science, 315 (2007), s.1709-1712

43. Bikard D., Marraffini L. A., Innate and adaptive immunity in bacteria:

mechanisms of programmed genetic variation to fight bacteriophages, Current

Opinion in Immunology, 24 (2012), s.15-20

44. Jiang F., Doudna J. A., The structural biology of CRISR-Cas systems, Current

Opinion in Structural Biology, 30 (2015), s.100-111

45. Terns M. P., Terns R. M., CRISPR-based Adaptive Immune Systems, Current

Opinion in Microbiology, 14 (3) (2011), s.321-327

46. Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C. M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z. A.,

Eckert M. R., Vogel J., Charpentier E., CRISPR RNA maturation by trans-encoded

small RNA and host factor RNAse III, Nature, 471 (7340) (2011), s.602-607

47. a. Shapiro, B., How to clone a mammoth? The science of de-extinction,

Oxford University Press, (2015), s.121-122

48. b. Shapiro, B., How to clone a mammoth? The science of de-extinction,

Oxford University Press, (2015), s.119

49. c. Shapiro, B., How to clone a mammoth? The science of de-extinction, Oxford

University Press, (2015), s.120

50. d. Shapiro, B., How to clone a mammoth? The science of de-extinction, Oxford

University Press, (2015), s.121-124

51. e. Shapiro, B., How to clone a mammoth? The science of de-extinction, Oxford

University Press, (2015), s.131-136



279

52. Sternberg H. S., Redding S., Jinek M., Greene C. E., Doudna J. A., DNA

interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9, Nature, 507

(2014), s.62-67

53. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E.,

A Programmable Dual RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacteria

Immunity, Science, 337 (2012), s. 816-821

54. http://2013.igem.org/Team:Paris_Bettencourt/Project/Detect; adres samego

obrazka: http://2013.igem.org/wiki/images/6/64/PB_gRNA_%281%29.png

55. Hefferin M. L., Tomkinson A. E., Mechanism of DNA double-break stand

reapair by non-homologous end joining, DNA Repair, 4 (2005), s.639-648

56. Pardo B., Gomez-Gonzalez B., Aguilera A., DNA double-strand break repair:

how to fix a broken relationship, Cellular and Molecular Life Sciences,

66 (2009), s.1039-1056

57. Jackson S. P., Bartek J., The DNA-damage response in human biology

and disease, Nature, 461 (7267) (2009), s.1071-1078

58. Keeney S., Neale M. J., Initiation of meiotic recombination by formation

of DNA double-strand breaks: mechanism and regulation, Biochemical

Society Transactions, 34 (2006), s.523-525

59. Sprauel-Soulas P., Rivera-Munoz P., Malivert L., Le Guyader G.,

Abramowski V., Revy P., de Villartay J. P., V(D)J and immunoglobulin class

switch recombination: a paradigm to study the regulation of DNA end-joining,

Oncogene, 26 (2007), s.7780-7791

60. Gołąb J., Jakóbisiak M., Lasek W., Stokłosa T., Immunologia, Wydawnictwo

Naukowe PWN, (2014), s.33-38 (rozdział 3.3: Powstawanie przeciwciał).

61. Lieber M. R., The Mechanism of Double-Strand DNA Break Repair by The

Nonhomologous DNA End Joining Pathway, Annual Review of Biochemistry,

79 (2010), s.181-211

62. Moynahan M. E., Jasin M., Mitotic homologous recombination maintains

genomic stability and suppresses tumorigenesis, Nature Reviews Molecular

Cell Biology, 11 (3) (2010), 196-207

63. Rothkamm K., Krüger I., Thompson L. H., Löbrich M., Pathways of DNA

Double Strand Break Repair during the mammalian Cell Cycle, Molecular and

Cellular Biology, 23 (16) 2003, s.5706-5715

64. Sonoda E., Hochegger H., Saberi A., Taniguchi Y., Takeda S., Differential

usage of non-homologous end joining, and homologous recombination in

double strand break repair, DNA Repair, 5 (2006), 1021-1029

65. Martins-Rocha M., Cavalheiro G. M., Matos-Rodrigues G. E., Martins A. P.

R., From Gene Targeting to Genome Editing: Transgenic animal applications

and beyond, Annals of the Brazilian Academy of Sciences, 87 (2suppl.)

(2015), s.1323-1348

66. Chandrasegaran S., Carroll D., Origins of Programmable Nucleases

for Genome Engineering, Journal of Molecular Biology, (2015),

doi:10.1016/j.jmb.2015.10.014

67. Kim Y. G., Chandrasegaran S., Chimeric restriction endonuclease,


of America, 91 (1994), s.883-887

http://2013.igem.org/Team:Paris_Bettencourt/Project/Detect

http://2013.igem.org/wiki/images/6/64/PB_gRNA_%281%29.png

http://dx.doi.org/10.1016/j.jmb.2015.10.014

Iwona Kowalczyk

280

68. Miller J., McLahlan A. D., Klug A., Repetitive zinc-binding domains

in the protein transcription factor IIIA from Xenopus oocytes, The European

Molecular Biology Organisation Journal, 4 (6) (1985), s.1609-1614

69. Jabalameli H. R., Zahednasab H., Moghaddam-Karimi A., Jabalameli M. R.,

Zinc finger nuclease technology: Advances and obstacles in modeling

and treating genetic disorders, Gene, 558 (2015), s.1-5

70. Gaj T., Gersbach Ch. A., Barbas C. F. III., ZFN, TALEN and CRISPR/Cas-

based methods for genome engineering, Trends in Biotechnology,

31 (7) (2013), s.397-405

71. Tupler R., Perini G., Green M. R., Expressing the human genome, Nature,

409 (2001), s.832-833

72. Kim Y. G., Cha J., Chandrasegaran S., Hybrid restriction enzymes: Zinc finger

fusions to Fok I cleavage domain, Proceedings of the National Academy

of Sciences of the United States of America, 93 (1996), s.1156-1160

73. Liu Q., Segal D. J., Ghiara J. B., Barbas C. F. III, Design of polydactyl zinc-

finger proteins for unique addressing within genome complex, Proceedings

of the National Academy of Sciences of the United States of America,

94 (1997), s.5525-5530

74. Isalan M., Choo Y., Klug A., Synergy between adjacent zinc fingers in

sequence-specific DNA recognition, 94 (1997), s.5617-5621

75. Greisman H. A., Pabo C. O., A General Strategy for Selecting High-Affinity

Zinc Finger Proteins for Diverse DNA Target Sites, Science, 275 (1997),

s.657-661

76. Moore M., Klug A., Choo Y., Improved DNA binding specificity from polyzinc

finger peptides by using strings of two-finger units, Proceedings of the

National Academy of Sciences of the United States of America, 98 (4) (2001),

s.1437-1441

77. Smith J., Bibikova M., Whitby F. G., Reddy A. R., Chandrasegaran S., Carroll

D., Requirements for double-strand cleavage by chimeric restriction enzymes

with zinc-finger DNA recognition domains, 28 (17) (2000), s.3361-3369

78. Händel E.-M., Alwin S., Cathomen T., Expanding or Restricting the Target

Site Repertoire of Zinc-finger Nucleases: The Inter-domain Linker as a Major

Determinant of Target Site Selectivity, Molecular Therapy, 17 (1) (2008),

s.104-111

79. Bibikova M., Golic M., Golic K. G., Carroll D., Targeted Chromosomal

Cleavage and Mutagenesis in Drosophila Using Zinc-Finger Nucleases,

Genetics, 161 (2002), s.1169-1175

80. Bibikova M., Beumer K., Trautman J. K., Carroll D., Enhancing Gene

Targeting with Designed Zinc Finger Nucleases, Science, 300 (2003), s.764

81. http://2011.igem.org/Team:Harvard/Project/Bioinformatics; adres obrazka:

http://2011.igem.org/wiki/images/7/7f/ZFN_diagram.jpeg

82. Joung J. K., Voytas D. F., Cathomen T., Reply to “Successgul genome editing

with modularly assembled zinc finger nucleases”, Nature Methods, 7 (1)

(2010), s.91-92

83. Beumer K. J., Trautman J. K., Bozas A., Liu J.-L., Rutter J., Gall J.G., Carroll

D., Efficient gene targeting in Drosophila by direct embryo injection with

http://2011.igem.org/Team:Harvard/Project/Bioinformatics

http://2011.igem.org/wiki/images/7/7f/ZFN_diagram.jpeg



281

zinc-finger nucleases, Proceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America, 105 (50) (2009), s.19821-19826

84. Maeder M. L et al., Rapid “ open-source“ engineering of customized zinc-

finger nucleases for highly-efficient gene modification, Journal of Molecular

Cell Biology, 31 (2) (2008), s.294-301

85. Sander J. D. et al.,Selection-Free Zinc-finger Engineering by Context-

Dependent Assembly (CoDA), Nature Methods, 8 (1) (2011), s.67-69

86. Kim E., Kim S., Kim D. H., Choi B. S., Choi I. Y., Kim J. S., Precision

genome engineering with programmable DNA-nicking enzymes, Genome

Research, 22 (2012), s.1327-1333

87. Ramirez C. L. et al., Engineered zinc ginger nickases induce homology-

directed repair with reduced mutagenic effects, Nucleic Acids Research,

40 (12) (2012), s.5560-5568

88. Beumer K., Bhattacharyya G., Bibikova M., Trautman J. K., Carroll D.,

Efficient Gene Targeting in Drosophila With Zinc-Finger Nucleases, Genetics,

172 (2006), s.2391-2403

89. www.clinicaltrials.gov, numer identyfikacyjny badania: NCT00842634

90. Lee H. J., Kweon J., Kim E., Kim S., Kim J. S., Targeted chromosomal

duplications and inversions in the human genome using zinc-finger nucleases,

Genome Research, 22 (2012), s.539-548

91. Koo T., Lee J., Kim J. S., Measuring and Reducing Off-Target Activities

of Programmable Nucleases Including CRISPR-Cas9, Molecules and Cells,

38 (6), (2015), s.475-481

92. Carroll D., Genome-Engineering With Zinc-Finger Nucleases, Genetics,

188 (2011), s.773-782

93. Szczepek M., Brondani V., Büchel J., Serrano L., Segal D. J., Cathomen T.,

Structure-based re design of the dimerization interface reduces the toxicity

of zinc-finger nucleases, Nature Biotechnology, 25 (7) (2007), s.786-793

94. Miller J. C. et al., An improved zinc-finger nuclease architecture for highly-

specific genome-editing, Nature Biotechnology, 25 (7) (2007), s.778-785

95. Sollu C. et al., Autonomous zinc-finger nuclease pairs for targeted

chromosomal deletion, Nucleic Acids Research, 38 (22) (2010), s.8269-8276

96. Gaj T., Guo J., Kato Y., Sirk S. J., Barbas C. F. III, Targeted gene knockout

by direct delivery of ZFN proteins, Nature Methods, 9 (8) (2012), s.805-807

97. Doyon Y. et al., Heritable Targeted Gene Disruption in Zebrafish Using Designed

Zinc Finger Nucleases, Nature Biotechnology, 26 (6) (2008), s.702-708

98. Geurts A. M. et al. Knockout Rats Produced Using Designed Zinc Finger

Nucleases, Science, 325 (5939) (2009), s.433

99. Young J. J. et al., Efficient targeted gene disruption in the soma and germ line

of the frog Xenopus tropicalis using engineered zinc-finger nucleases,

Proceedings of the national Academy of Sciences of the United States

of America, 108 (17) (2011), s.7052-7057

100. Morton J., Davis M. W., Jorgensen E. M., Carroll D., Induction and repair

of zinc-finger nuclease-targeted double-strand breaks in Caenorhabditis

elegans somatic cells, Proceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America, 103 (44) (2006),s.16370-16375

http://www.clinicaltrials.gov/

Iwona Kowalczyk

282

101. Hauschild J. et al., Efficient generation of biallelic knockout in pigs using zinc-

finger nucleases, Proceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America, 108 (29) (2011), s.12013-12017

102. Merlin Ch., Beaver L. E., Taylor O. R., Wolfe S. A., Reppert S. M., Efficient

targeted mutagenesis in the monarch butterfly using zinc-finger nucleases,

Genome Research, 23 (2013), s.159-168

103. Zhang F. et al., High frequency targeted mutagenesis in Arabidopsis thaliana

using zinc finger nucleases, Proceedings of the National Academy of Sciences

of the United States of America, 107 (26) (2010), s.12028-12033

104. Shukla K.V. et al., Precise genome modification in the crop species Zea mays

Rusing zinc-finger nucleases, Nature, 459 (2009),s.438-443

105. Townsend J. A., Wright D. A., Winfrey R. J., Fu F., Maeder M. L., Joung J.

K., Voytas D. F., High frequency modification of plant genes using engineered

zinc finger nucleases, Nature, 459 (7245) (2009), s.442-445

106. Urnov F. D. et al., Highly efficient endogenous human gene correction using

designed zinc-finger nucleases, Nature, 435 (2005), s.646-651

107. Li H. et al., In vivo genome editing restores hemostasis in mouse model

of hemophilia, Nature, 475 (2011), s.217-221

108. Zou J., Mall P., Huang X., Dowey S. N., Cheng L., Site-specific gene

correction in a point mutation in human iPS cells derived from an adult

patient with sickle cell disease, Bloog, 118 (17) (2011), s.4599-4608

109. Yusa K. et al., Tergeted gene correction of a1-antitripsin deficiency in induced

pluripotent stem cells, Nature, 478 (2011), s.391-394

110. Soldner F. et al., Generation of isogenic pluripotent stem cells differing

exclusively at two early onset Parkinson point mutation, Cell, 146 (2) (2011),

s.318-331

111. Perez E E. et al., Establishment of HIV-1 resistance in CD4+

T cells

by genome editing using zinc finger nucleases, Nature Biotechnology, 26 (7)

(2008), s.808-816

112. Voit R. A., Mcmahon M. A., Sawyer S. L., Porteus M. H., Generation

of an HIV-Resistant T-cell Line by Targeted “Stacking” of Restriction

Factors, Molecular Therapy, 21 (4) (2013), s.786-795

113. Torikai H. et al., A foundation for universal T-cell based immunotherapy:

T cells engineered to express a CD19-specific chimeric-antigen-receptor and

eliminate expression of endogenous TCR, Blood, 119 (24) (2012), s.5697-5705

114. Marx V., Genome-editing tools storm ahead, Nature Methods, 9(11) (2012),

s.1055-1059

115. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cstzfn?lang=pl&region=PL

116. http://www.sangamo.com/about/index.html

117. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cti1?lang=pl&region=PL

118. Van den Ackerwecken G., Marois E., Bonas U., Recognition of the Bacterial

Avirulence Protein AvrBs3 Occurs inside the Host Plant Cell, Cell, 87 (1996),

s.1307-1316

119. Boch J. et al., Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL Type-III

Effectors, Science, 326 (2009), s.1509-1512



283

120. Schornack S., Meyer A., Römer P., Jordan T., Lahaye T., Gene-for-gene-

mediated recognition of nuclear-targeted AvrBs3-like bacterial effector

proteins, Journal of Plant Physiology, 163 (2006), s.256-272

121. Moscou M. J., Bogdanove A. J., A Simple Cipher Governs DNA recognition

by TAL Effectors, Science, 326 (2009), s.1501

122. Mak A. N. S., Bradley P., Cernadas R. A., Bogdanove A. J., Stoddard B. L.,

The crystal structure of TAL effector PthXo1 bound to its DNA target,

Science., 335 (2012), s.716-719

123. Christian M. et al., Targeting DNA Double-Strand Breaks with TAL Effector

Nucleases, Genetics, 186 (2010), s.757-761

124. Li T. et al., TAL nucleases (TALNs): hybryd proteins composed of TAL

effectors and FokI DNA-cleavage domain, Nucleic Acids Research., 39 (1)

(2011), s.359-372

125. Engler C., Kandzia R., Marillonnet S., A One Pot, One Step Precision

Cloning method with High Throughoutput Capability, PLoS ONE, 3 (11)

(2008), e3647

126. Engler C., Greutzner R., Kandzia R., Marillonnet S., Golden Gate Shufling:

A One-Pot DNA Shuffling Method Based on Type IIs Restriction Enzymes,

PLoS ONE, 4 (5) (2009), e5553

127. Cermak T. et al., Efficient design and assembly of custom TALEN and other

TAL-effector based constructs for DNA-targeting, Nucleic Acids Research,

39 (12) (2011), e82

128. Reyon D. et al., FLASH Assembly of TALENs Enables High-Throughoutput

Genome Editing, Nature Biotechnology, 30 (5) (2012), s.460-465

129. Briggs A. W. et al., Iterative capped assembly: rapid and scalable synthesis

of repeat-module DNA such as TAL effectors from individual monomers,

Nucleic Acids Research, 40 (15) (2012), e117

130. Burgk-Schmid J. L., Schmidt T., Kaiser V., Höning K., Hornung V.,

A ligation-independent cloning technique for high-throughoutput assembly

on transcription activator-like effector genes, Nature Biotechnology, 31 (7)

(2013), s.76-81

131. Liang J., Chao R., Abil Z., Bao Z., Zhao H., FairyTALE: A High-

Throughooutput TAL Effector Synthesis Platform, American Chemical Society

Synthetic Biology, 3 (2014), s.67-73

132. Mussolino C. et al., A novel TALE nuclease scaffold enables high genome

editing activity in combination with low toxicity, Nucleic Acids Research,

39 (21) (2011), s.9283-9293

133. Beumer K. J. et al., Comparing Zinc Finger Nucleases and Transcription

Activator-Like Effector Nucleases for Gene Targeting in Drosophila, Genes,

Genomes, Genetics, 3 (2013), s. 1717-1725

134. Liu J. et al., Efficient and Specific Modifications of the Drosophila Genome,

by Means of an Easy TALEN Strategy, Journal of Genetics and Genomics,

39 (2012), s.209-215

135. Sander J. D. et al., Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using

engineered TALENs, Nature Biotechnology, 29 (8) (2011), s.697-698

Iwona Kowalczyk

284

136. Liu Y. et al., A highly effective TALEN-mediated approach for targeted gene

disruption in Xenopus tropicalis and zebrafish, Methoods 69 (2014), s.58-66

137. Carlson D. F. et al., Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock,


of America, 109 (43) (2012), s.17383-17387

138. Liu H. et al., TALEN-mediated Gene Mutagenesis in Rhesus and Cynomolgus

Monkeys, Cell Stem Cell, 14 (3) (2014), s.323-328

139. Hockemeyer D. et al., Genetic engineering of human ES and iPS cells using

TALE nucleases, Nature Biotechnology, 29 (8) (2011), s.731-734

140. Ding Q. et al., A TALEN genome editing system to generale human stem cell-

based disease models, Cell Stem Cell, 12 (2) (2013), s.238-251

141. Ousterout D. G. et al., Reading Frame Correction by Targeted Genome

Editing Restores Dystrophin Expression in Cells from Duchenne Muscular

Dystrophy Patients, Molecular Therapy, 21 (9) (2013), s.1718-1726

142. Wefers B. et al., Direct production of mouse disease models by embryo

microinjection of TALENs and oligodeoxynucleotides, Proceedings of National

Academy of Sciences of the United States of America, 110 (10) 2013,

s.3782-3787

143. Panda S. K. et al., Highly Efficient Targeted Mutagenesis in Mice Using

TALENs, Genetics, 195 (2013), s.703-713

144. Wang H. et al., TALEN-mediated editing of the Mouse Y Chromosome, Nature

Biotechnology, 31 (6) (2013), s.530-532

145. http://www.transposagenbio.com/xtn

146. http://corporate.thermofisher.com/en/home.html

147. http://www.transposagenbio.com/aavs-g-talen#

148. Ishino Y. et al., Nucleotide Sequence of the iap Gene, Responsible for

Alkaline Phosphatase Isozyme Conversion in Escherichia coli, and

Identification of the Gene Product, Journal of Bacteriology, 169 (12) (1987),

s.5429-5433

149. Fu Y. et al., Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide

RNA, Nature Biotechnology, 32 (3) (2013), 279-284

150. Ran F. A. et al., Double nicking by RNA-guided CRISPR-Cas9 for enhanced

genome editing specificity, Cell, 154 (6) (2013), s.1380-1389

151. Mali P. et al., RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9, Science.,

339 (2013), s.823-826

152. Tsai S. Q. et al., Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly

specific genome editing, Nature Biotechnology, 32 (6) (2014), s.569-576

153. Gullinger J. P., Thompson D. B., Liu D. R., Fusion of catalytically inactive

Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification, Nature

Biotechnology, 32 (6) (2014), s.577-582

154. Hsu P. D., et al., DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases,

Nature Biotechnology, 31 (9) (2013), s.827-832

155. Cho S. W., et al., Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-

guided endonucleases and nickases, Genome Research., 24 (2014), s.132-141

156. Hwang W. Y. et al., Efficient In Vivo Genome Editing Using RNA-guided

nucleases, Nature Biotechnology, 31 (3) (2013), s.227-229



285

157. Niu Y. et al., Generation of Gene-Modified Cynomolgus Monkey via

Cas9/RNA-mediated Gene-Targeting in One-Cell Embryos, Cell., 156 (2014),

s.836-843

158. Bassett A. R. et al., Highly Efficient Targeted Mutagenesis of Drosophila with

the CRISPR/Cas9 system, Cell Reports 4, (2013), 220-228

159. Wang H., et al., One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple

Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering, Cell, 153 (4) (2013),

s.910-918

160. Xinli Hu et al., Heritable gene targeting with gRNA/Cas9 in rats, Cell

Research, 23 (2013), s.1322-1325

161. http://www.ted.com/talks/jennifer_doudna_we_can_now_edit_our_dna_but_le

t_s_do_it_wisely

162. http://www.addgene.org/

163. Wijshake T., Baker D. J., van de Sluis B., Endonucleases: new tools to edit

the mouse genome, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Basis

of Disease, 1842 (10) (2014), s.1942-1950

164. Liang P. et al., CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human triponuclear

zygotes, Protein and Cell, 6(5) (2015), s.363-372

Molekularne narzędzia do edycji genomów wykorzystujące

endonukleazy: ZFNs, TALENs i CRISPR/Cas9 – porównanie

Streszczenie

Przedstawiona praca przeglądowa ma na celu zestawienie w analizie porównawczej

wykorzystywane obecnie molekularne ,,narzędzia”, za pomocą których wprowadzane są zmiany w genomach. Opatrzona została krótkim wstępem historycznym, który osadza ją

w tematyce odkryć biologii molekularnej. Pozostając w tym ujęciu, ukazano odkrycia, które

w perspektywie czasu doprowadziły do otrzymania omawianych chimerycznych nukleaz.

Na początku omówiono enzymy restrykcyjne oraz białko Cas9: kluczowe molekuły, dzięki którym przedstawiane molekuły chimeryczne są w stanie spełniać swoją funkcję.

Szczegółowo omówiona została ich budowa oraz funkcja. Z uwagi na fakt, że enzymy

stanowią temat przewodni niniejszej Konferencji, tym bardziej zasługiwały na wnikliwą

analizę. Nieodłącznym zagadnieniem jest sposób naprawy DNA w komórce, który odpowiada za to, że jesteśmy w stanie wykorzystać omawiane nukleazy dla własnych

potrzeb, i mechanizmy te również zostały opisane. W dalszej części zaprezentowano

pozostałe składowe, zgodnie z porządkiem chronologicznym, w jakim zostawały

odkrywane. Zestawione w porównawczej analizie, ukazują dominującą rolę CRISPR/Cas9 jako narzędzia do edycji genomów.

Molecular genome-editing tools which use endonucleases: ZFNs,

TALENs and CRISPR/Cas9 – comparison

Abstract The review paper presented aims to show in comparative analysis currently used molecular

„tools”, by which the possibility to edit genomes is mediated. A brief historical perspective

was presented at the beginning, therefore introducing it to the subject of molecular biology

discoveries. Remaining in that point of view, discoveries which led to launching mentioned chimeric nucleases were described. Firstly, restriction enzymes and Cas9 proteins were

presented: the key molecules, thank to which programmable nucleases are capable of having

Iwona Kowalczyk

286

their functions. Their overall structure and function was thoroughly characterized. Enzymes

are the main theme of this Conference, therefore it is even more justified to describe their

features in details. One cannot forget about the cellular ways of DNA-breaks repair , which

enable humans to use the nucleases for their own needs and these were also shown. Further on, the review presents the remaining elements which contribute to the tools, in accordance

with their chronological appearance. When shown in comparative analysis, it is the CRISPR

system which seems to be the foremost tool to be used.

287

Katarzyna Paradowska1, Grażyna Ginalska

2

Zastosowanie metody TLC bioautografii

do identyfikacji inhibitorów enzymatycznych

– praca przeglądowa

1. Wstęp

Metoda TLC bioautografii (Thin Layer Chromatography Bioauto-

graphy) jest często stosowana celem badań przesiewowych dotyczących

nowych bioaktywnych składników izolowanych z naturalnych źródeł,

najczęściej materiału roślinnego [13]. Wg Marstona termin „bioauto-

grafia” dotyczy eksperymentów wykonanych dla detekcji wzrostu mikro-

organizmu na płytce do chromatografii cienkowarstwowej, podczas gdy

pojęcie „autografia” dotyczy zastosowania chemicznych metod do

identyfikacji procesów lub efektów biologicznych, np. badania aktywności

antyoksydacyjnej [1]. Chociaż pojęcie bioautografia jest głównie związane

z określaniem właściwości przeciwbakteryjnych lub przeciwgrzybicznych

roślinnych ekstraktów, to jednakże może ono być używane do nazwania

testów związków o potencjalnym działaniu hamującym aktywność

enzymów [4].

Jedną z technik pozwalającą na wykrywanie związków o działaniu

hamującym aktywność enzymatyczną jest TLC bioautografia bezpośrednia

(TLC-DB) (Thin Layer Chromatography Direct Bioautography, TLC-DB)

[4]. W klasycznie prowadzonej technice TLC-DB płytka chromato-

graficzna jest spryskiwana lub zanurzana w inokulum bakteryjnym lub

grzybicznym o pożądanej gęstości [5, 6]. Bioautogramy są inkubowane

w temp. 25C przez 48 godzin w wilgotnej atmosferze [5, 6]. Wizualizację

przeprowadza się przez spryskiwanie płytek roztworami soli tetrazoliowych

(np. MTT, bromek błękitu tiazolilotetrazoliowego) [4]. Sole te są przek-

ształcane przez dehydrogenazy żyjących mikroorganizmów do intensywnie

zabarwionych formazanów nadających płytce kolory od purpurowego do

niebiesko-fioletowego [46]. Po zakończeniu etapu barwienia prowa-

dzonego w temp. 25C przez okres 24 godzin lub w temp. 37C przez czas

1 [email protected], Katedra i Zakład Biochemii i Biotechnologii, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Analityki Medycznej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 2 [email protected], Katedra i Zakład Biochemii i Biotechnologii, Wydział Farmaceutyczny

z Oddziałem Analityki Medycznej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie

Katarzyna Paradowska, Grażyna Ginalska

288

3-4 godzin, aktywność przeciwbakteryjna lub przeciw-grzybiczna jest

identyfikowana poprzez występowanie białych/kremowych plam na

purpurowym/niebiesko-fioletowym tle płytki chromatograficznej [46].

Przegląd dostępnego piśmiennictwa wskazuje na wykorzystanie techniki

TLC bioautografii w badaniach inhibicji następujących enzymów:

acetylocholinoesterazy [724], butyrylocholinoesterazy [11, 16, 20, 21, 25],

dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej [26], - i β-glukozydaz [2731],

lipazy [3234], monoaminooksydaz A i B [35, 36], fosfoglukoizomerazy [37,

38], peptydazy dipeptydylowej IV [39], oksydazy ksantynowej [4044],

topoizomerazy I [45] i tyrozynazy [3, 4648].

Należy wskazać, że głównymi ograniczeniami w stosowaniu techniki

TLC bioautografii w badaniach przesiewowych związków jako poten-

cjalnych inhibitorów enzymatycznych są dostępność i cena komercyjnych

preparatów enzymatycznych [1]. Wg naszej oceny klasycznym przykładem

tego rodzaju problemu jest badanie związków o potencjalnym działaniu

hamującym aktywność acetylocholinoesterazy, enzymu istotnego dla

człowieka z punktu strategii leczenia choroby Alzheimera, z wykorzys-

taniem preparatu handlowego enzymu izolowanego z Electrophorus

electricus [710, 12, 15, 1719, 2224].

Jednocześnie, biorąc pod uwagę opinię Marstona, należy zaznaczyć, że

użycie techniki TLC bioautografii, ściśle powiązanej z użyciem różnego

rodzaju rozpuszczalników organicznych, jest relatywnie wolne od ich

niekorzystnego (denaturującego) wpływu na testowane aktywności

enzymatyczne [1].

Warto pokreślić, że bezpośrednie spryskiwanie płytek do TLC roztworem

testowanego enzymu może być przyczyną często obserwowanych

problemów z powtarzalnością uzyskiwanych wyników. To niepożądane

zjawisko jest wynikiem:

• niestabilności enzymu (w głównej mierze);

• heterogenności substratu i biokatalizatora;

• obniżenia jakości rozdziału w miejscu lokalizacji plamki inhibitora,

spowodowanego spryskiwaniem wodnym roztworem buforowym

polarnej powierzchni;

• trudności technicznych wynikających ze spryskiwania reagentów

obecnych w roztworach o małej objętości z użyciem konwen-

cjonalnych spryskiwaczy [3].

Rozwiązaniem tych problemów jest zastosowanie techniki immobilizacji

biokatalizatora na powierzchni płytki do chromatografii cienkowarstwowej,

np. poprzez pułapkowanie w agarze. Wg Furlana i wsp. [24] zaletami

immobilizacji enzymów w trakcie TLC bioautografii są:

Zastosowanie metody TLC bioautografii do identyfikacji inhibitorów enzymatycznych


289

• dokładniejsza wiedza o wprowadzanej aktywności biokatalizatora

enzymatycznego na powierzchni płytki chromatograficznej;

• zapobieganie zjawisku dyfuzji plam (pasm) w szczególności

występującemu, gdy płytka chromatograficzna jest spryskiwana

wodnymi roztworami lub zawiesinami;

• opóźnienie wysuszenia płytki chromatograficznej mogące prowadzić

do inaktywacji badanych enzymów.

Celem prezentowanej pracy przeglądowej jest przedstawienie techniki

TLC bioautografii jako szybkiej i stosunkowo taniej techniki pozwalającej

na izolację aktywnych składników (inhibitorów) hamujących wybrane

aktywności enzymatyczne. Charakteryzowane bliżej biokatalizatory to

enzymy, których zmiany aktywności mają istotne znaczenie dla zdrowia

człowieka.

2. Metodologia TLC bioautografii w detekcji inhibitorów

wybranych biokatalizatorów enzymatycznych

2.1. Inhibicja acetylocholinoesterazy

Acetylocholinoesteraza (acylohydrolaza acetylocholiny, AChE, EC

3.1.1.7) katalizuje hydrolizę różnych estrów octanowych, odpowiada także

za reakcje transacetylacji [49]. Inhibitory AChE odgrywają kluczową rolę

w terapii choroby Alzheimera (AD) [7, 9, 10, 1214, 17, 18, 22, 23]. Mogą

one mieć także zastosowanie jako środki owadobójcze [19].

Dotychczas opisane są trzy metody oznaczania aktywności AChE

mające zastosowanie w trakcie procedury TLC bioautografii. Jedna z nich

oparta na metodzie Ellmana została wykorzystana w badaniach inhibicji

AChE w kilku pracach [12, 14, 17, 22] pomimo, że jej użycie wiąże się

z koniecznością każdorazowego wykluczania wyników fałszywie pozy-

tywnych, spowodowanych hamowaniem reakcji pomiędzy tiocholiną

i DTNB (kwasem 5,5’-ditiobis-(2-nitrobenzoesowym)) [12]. Uważa się

także, że po przeprowadzeniu tej metody powstająca żółta barwa,

spowodowana obecnością inhibitora daje niestabilne plamy (strefy) [8].

Alternatywna metoda o charakterze rutynowym polega na wykorzystaniu

octanu 1-naftolu jako substratu AChE [9, 17, 18, 23]. Powstający w reakcji

zależnej od testowanego enzymu -naftol reaguje z odczynnikiem Fast

Blue Salt B, dając purpurowy barwnik azowy. W tej metodzie obecność

inhibitorów AChE jest identyfikowana jako białe pasma. Jednakże

sugerowana jest konieczność poprawienia jej czułości [8]. Bardzo dobrym

rozwiązaniem tego problemu jest zaproponowane przez Mroczka użycie

jako substratu 2-naftolu, który w reakcji z odczynnikiem Fast Blue Salt B

daje głęboko fioletową barwę. Białe pasma (plamki) inhibitorów są


290

widoczne już po okresie 1 min i są stabilne przez okres co najmniej

24 godz. [8]. W Tabeli 1 przedstawiono inhibitory AChE odkryte za

pomocą metody TLC bioautografii

Tabela 1. Inhibitory acetylocholinoesterazy wykryte za pomocą techniki TLC bioautografii

Źródło inhibitorów (Ekstrakty) Inhibitory Literatura

Narcissus jonquilla ‘Pipit’ galantamina i powiązane

alkaloidy (Gtp) [7]

Narcissus jonquilla ‘Pipit’ 1,2-dihydrogalantamina [8]

Peganum nigellastrum (nasiona)

deoksywazycyna,

deoksywazycynon, wazycyna,

wazycynon, harmina, harmalina,

harmol, harman, nigellastryna I i II

[9]

Peganum harmala (nasiona) harmalina, harmina [12]

Conchocarpus fontanesianus (łodyga) diktamina, -fagaryna,

szikiminian, 2-fenylo-1-metylo-4-chinolon, marmezyna

[17]

Dorema ammoniacum D. Don (guma arabska)

analog doremonu A, doremon A, dshamiron, ammoresinol*

[18]

Stemona collinsiae (korzeń) dideohydrostemofolina

(asparagimina A), stemofolina [19]

Bacillus subtilis dwa związki o nieustalonej

strukturze [22]

Aniba canelilla 1-nitro-2-fenyloetan (główny składnik olejku eterycznego)

[23]

Ilex paraguanensis Saint-Hilaire kofeina [24]

* Struktury zidentyfikowano przy użyciu jedno- i dwuwymiarowej 1H i 13NMR spektroskopii

i spektrometrii mas [18]

2.2. Inhibicja butyrylocholinoesterazy

Butyrylocholinesteraza (acylohydrolaza acylocholiny, cholinoesteraza,

butyrycholinoesteraza, BChE, pseudocholinoesteraza, EC 3.1.1.8)

katalizuje hydrolizę różnych estrów choliny [50].

Aktywność BChE w mózgu zdrowej osoby jest niższa od 1,5 do 60 razy od

aktywności AChE, podczas gdy u chorych na chorobę Alzheimera stosunek

BChE/ AChE wzrasta z 0,6 do 11 [51]. Dla progresji AD charakterystyczny

jest w szczególności wzrost aktywności formy G1 BChE [20]. Dane

literaturowe wskazują, że kilka roślin może być źródłem związków nie tylko

hamujących aktywność AChE, ale także BChE. Przeprowadzone testy wśród

kilkunastu tradycyjnych europejskich roślin leczniczych dowiodły, że ekstrakty

heksanowe z Arnica chamissonis Less. subs. foliosa i Ruta graveolens L.

wykazują obecność związków hamujących obie aktywności enzymatyczne.

Jednakże metanolowe ekstrakty z Arnica chamissonis Less. subs. foliosa

i Hypericum perforatum (St. John’s Wort) wykazywały selektywną



291

inhibicję aktywności AChE [11]. Dobrym źródłem związków hamujących

aktywność BChE okazała się także roślina o łacińskiej nazwie Angelica

archangelica L. TLC bioautografia wykazała istotne działanie hamujące w

odniesieniu do charakteryzowanej aktywności enzymatycznej ze strony

imperatoryny obecnej w ekstrakcie heksanowym z owoców i 2’-O-

angelikanu heraklenolu obecnego w heksanowym ekstrakcie z korzeni. Na

podstawie głębszej analizy struktur związków badanych w tej pracy jej

Autorzy wskazali, że działanie hamujące aktywność BChE wykazywały

jedynie C8-podstawione i C5-niepodstawione furanokumaryny [25].

Z kolei w pracy Bhadra i wsp. [16] wykazano, że Marsilea quadrifolia L.

jest istotnym źródłem związków fitochemicznych hamujących aktywność

AChE i BChE. Ukazały się także publikacje, opisujące Cinnamomum

tamala [20] i Cinnamomum zeylanicum [21] jako bogate źródła związków

o działaniu antycholinoesterazowym. Pogłębione badania wskazują, że

odpo-wiedzialne za to działanie są terpenowe związki takie jak: linalol

i eugenol, przy czym linalol jest skuteczniejszym inhibitorem aktywności

AChE niż BChE [20], natomiast eugenol wykazuje działanie odwrotne [20].

2.3. Inhibicja dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej

Dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa (D-glukozo-6-fosforan:NADP+

1-oksydoreduktaza, enzym Entnera-Doudoroffa, G6PDH) katalizuje reakcję

rozpoczynającą szlak pentozowy, a precyzyjniej jego fazę oksydacyjną.

Badania dotyczące inhibicji dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej (EC

1.1.1.49) są ważne z punktu widzenia praktyki lekarskiej. Hamowanie

aktywności tego biokatalizatora odpowiada za zbyt małą syntezę NADPH,

co z kolei może prowadzić do wystąpienia anemii hemolitycznej.

Przykładem wykorzystania metody TLC bioautografii celem oznaczania

aktywności, mechanizmu inhibicji i wartości parametrów kinetycznych dla

opisywanego enzymu jest praca Camary i wsp. [26]. Należy jednak

podkreślić, że Autorzy wspomnianej publikacji podali nieprecyzyjną

informację dotyczącą źródła badanego preparatu G6PDH. Fakt ten utrudnia

interpretację uzyskanych wyników. Jeśli, źródłem badanej dehydrogenazy

glukozo-6-fosforanowej (EC 1.1.1.363) był mikroorganizm Leuconostoc

mesenteroides to zgodnie z dostępnymi danymi z enzymowej bazy danych

BRENDA należało przeprowadzić testy z NADP+ jako kosubstratem

reakcji [52]. Ponadto G6PDH jest określana mianem specyficznej

względem NADP+ [53], tymczasem w pracy Camary i wsp. eksperymenty

wykonywano jedynie w obecności NAD+

[26]. Pomimo tych zastrzeżeń

warto podkreślić, że TLC bioautografia wykonana na – żelu krzemion-

kowym 60 F254 zakończona pomiarem przy długości fali = 340 nm ilości

powstałego produktu reakcji (NADH) pozwoliła wykazać hamowanie


292

przebiegu reakcji przez mocznik (inhibicja kompetycyjna, Ki = 37,6 2,0

M) i KMnO4 (inhibicja niekompetycyjna, Ki = 0,75 0,05 M).

Testowana G6PDH ulegała immobilizacji (silnej adsorpcji) w miejscu

dozowania na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym 60 F254.

Zjawisko to prawdopodobnie odpowiada, za fakt uzyskania wyższej

wartości stałej Michaelisa względem glukozo-6-fosforanu w metodzie TLC

bioautografii, niż w teście, w którym po zakończeniu przebiegu reakcji,

nanoszono próbki na płytkę TLC celem określenia ilości powstałego

NADH (metoda „off-line”), odpowiednio: 1,15 0,04 mM i 0,40 0,03 mM.

2.4. Inhibicja - i β-glukozydaz

-glukozydazy (glukohydrolazy -D-glukozydu, -1,4-glukozydazy,

EC 3.2.1.20) są biokatalizatorami hydrolizującymi wiązania -1,4-gliko-

zydowe oligosacharydów. Enzymy te mogą także hydrolizować

polisacharydy, chociaż wolniej w porównaniu do oligosacharydów [54].

U człowieka enzymy te są zaangażowane w trawienie węglowodanów

spożytych z pokarmem, tzn. odpowiadają za ich hydrolizę do glukozy,

adsorbowanej następnie przez ścianę jelita, a następnie przenoszonej do

krwi [29].

β-glukozydazy (glukohydrolazy β-D-glukozydu, β-1,4-glukozydazy, EC

3.2.1.21) odpowiadają z kolei za hydrolizę β-glukozydów. Niektóre z nich

hydrolizują jeden lub więcej spośród wymienionych związków: β-D-

galaktozydy, -L-arabinozydy, β-D-ksylozydy i β-D-fukozydy [55].

Inhibitory glukozydaz są przedmiotem intensywnych badań w związku

z ich wykorzystaniem jako leków w leczeniu: cukrzycy typu 2 (poprzez

obniżanie hiperglikemii poposiłkowej) [2731], nowotworów [27, 30],

infekcji wirusowych (HIV-1, HBV, cytomegalowirus (CMV) i wirus

grypy) [29] i wrodzonych lizosomalnych chorób spichrzeniowych [27, 30].

Klasyczną pracą zawierającą opis TLC bioautografii do detekcji

inhibitorów β-glukozydazy jest publikacja Salazar i Furlana, która pojawiła

się na łamach czasopisma Phytochemical Analysis [27]. Zależna od

enzymu hydroliza eskuliny do eskuletyny, reagującej z kationami Fe3+

prowadzi do powstania kompleksu o barwie ciemnobrązowej. Obecność

znanego inhibitora – β-epoksydu konduritolu (Rys. 1) identyfikowano jako

jasno żółtą plamkę na ciemnobrązowym tle płytki. Wartość LOD (limit

detekcji) dla tego związku oznaczono na 0,1 g.



293

Rysunek 1. Struktura epoksydu konduritolu B [56]

Modyfikację metody opracowanej przez zespół Salazar i Furlana

zaproponowano w 2013 roku do wykrywania inhibitorów β-glukozydazy

obecnych w mikroorganizmach izolowanych z morskich gąbek [30].

W skrócie polegało to na zastąpieniu płytki chromatograficznej szklaną

płytką Petriego jako matrycą, na którą nanoszono immobilizowany

w agarze biokatalizator. W nowej metodzie, alternatywnej do klasycznej

TLC bioautografii, oznaczono wartość LOD dla β-epoksydu konduritolu na

0,05 g. Należy podkreślić, że istotną zaletą metody opracowanej przez

zespół Pandey i inni jest wyraźnie zauważalna przejrzystość stref

zawierających inhibitor/y testowanej aktywności enzymatycznej, znacznie

lepsza niż w metodzie opisanej przez Furlana [30].

Opisywana powyżej metoda z wykorzystaniem eskuliny, jako substratu

glukozydaz, może sprawiać jednakże trudności w detekcji inhibitorów

o budowie kumarynowej, charakterystycznej dla produktu reakcji

eskuletyny [28]. W związku z tym zaproponowano alternatywną metodę

oznaczania aktywności obu glukozydaz. Testowano takie parametry jak:

rodzaj i stężenie substratu, temperaturę i czas inkubacji, jak również

wartość pH roztworu buforowego. Jako substraty wybrano odpowiednio:

2-naftylo--D-glukopiranozyd i 2-naftylo-β-D-glukopiranozyd, które

w wyniku hydrolizy katalizowanej przez odpowiednie glukozydazy jako

produkty uwalniały: 2-naftol, odpowiedni anomer glukozy i wodę.

Powstający 2-naftol reagował z odczynnikiem Fast Blue B salt dając

purpurowy barwnik azowy. Ostatni etap TLC bioautografii był identyczny

z zaproponowanym wcześniej przez Marstona i innych w 2002 roku do

oznaczania aktywności AChE [1]. Limit detekcji dla β-epoksydu

konduritolu (Rys. 1), inhibitora - i β-glukozydaz wynosił 0,1 g. Miglitol

(Rys. 2) i kastanospermina (Rys. 7) hamowały aktywność -glukozydazy

do stężeń odpowiednio: 0,005 i 0,05 g. Eksperyment TLC bioautografii

wykonany z inhibicją drożdżowej β-glukozydazy przez metanolowy


294

ekstrakt z Urtica dioica L. wykazał obecność w materiale roślinnym

związku hamującego przebieg reakcji, o innej strukturze niż użyty

wzorcowy inhibitor kastanospermina.

Rysunek 2. Struktura miglitolu będącego inhibitorem -glukozydazy [56]

Połączenie chromatografii Sepbox (automatycznej HPLC/SPE/HPLC)

i TLC bioautografii jako szybkich metod rozdziału związków izolowanych

z naturalnych źródeł pozwoliło stwierdzić, że Phlomis tuberosa jest

bogatym źródłem związków hamujących aktywność -glukozydazy [31].

Warto równocześnie zaznaczyć, że aktywność charakteryzowanego bio-

katalizatora w trakcie TLC bioautografii oznaczano metodą opisaną przez

Simões-Pires i inni [28] z niewielkimi modyfikacjami.

Na podstawie rezultatów TLC bioautografii ekstraktów z trzech

gatunków porostów Ramalina: R. celastri, R. nervulosa i R. pacifica

(potwierdzonych przez metody HPLC i spektrofotometryczne) przyjmuje

się, że za aktywność anty-glukozydazową odpowiadają kwasy: usninowy,

salazynowy i sekikaic (Rys. 3). Dane badawcze wskazują, że wymienione

trzy związki są także efektywnymi zmiataczami wolnych rodników [29].

Rysunek 3. Struktury występujących w porostach Ramalina kwasów: usninowego [56],

salazynowego (opracowanie własne na podstawie [57]) i sekikaic (opracowanie własne na podstawie [58]) o właściwościach hamujących aktywności glukozydazowe



295

2.5. Inhibicja lipaz

Lipaza (triacyloglicerolowa acylohydrolaza, lipaza triacyloglicerolowa,

lipaza trzustkowa, LP, EC 3.1.1.3) odpowiada za hydrolizę 50-70%

wszystkich lipidów pokarmowych spożytych przez człowieka [34].

Hamowanie aktywności tego enzymu redukuje absorpcję trójglicerydów

w jelicie cienkim prowadząc do utraty masy ciała, co stanowi jedną ze

strategii leczenia otyłości [3234]. Obecnie trwają intensywne poszukiwania

nowych inhibitorów lipazy izolowanych z materiału roślinnego bądź

bakteryjnego. Orlistat (Rys. 4) – znany i wprowadzony do lecznictwa

związek hamujący aktywność LP odpowiada za występowanie takich

działań niepożądanych jak: uszkodzenie wątroby [34], ostre uszkodzenie

nerek (acute kidney injury, AKI) [33] i nefropatię szczawianową [33].

Rysunek 4. Struktura orlistatu będącego inhibitorem lipazy trzustkowej [56]

Dotychczas wykazano, że kilka roślin leczniczych: Camellia sinensis,

Dioscorea nipponica, Salacia reticulate i Nelumbo nucifera wykazuje

właściwości hamowania aktywności LP [32, 34]. Wpływ hamujący na

przebieg katalizy zależnej od lipazy wykazują także saponiny izolowane

z Panax ginseng i kwas oleanolowy, będący przedstawicielem trójterpe-

noidów [34].

Pomimo istotności, ze względów epidemiologicznych, prowadzenia

badań nad nowymi potencjalnymi inhibitorami lipazy trzustkowej

opublikowano dotychczas trzy prace wykorzystujące w tym celu technikę

TLC bioautografii [3234]. Hassan [32] wykazał, że metanolowe ekstrakty

z Camellia sinensis i Rosmarinus officinalis w odróżnieniu od metano-

lowego ekstraktu z Morus alba zawierają związki o działaniu hamującym

LP. Wykorzystywana w badaniach metoda wykrywania aktywności lipazy

na płytkach aluminiowych pokrytych warstwą żelu krzemionkowego 60 F254

polegała na rozpadzie -octanu naftylu do -naftolu i kwasu octowego.

Uwolniony -naftol reagował z odczynnikiem Fast Blue B salt. Obecność

orlistatu (kontrola pozytywna) i związków o działaniu hamującym

aktywność lipazy obecnych w wyciągach z Camellia sinensis i Rosmarinus

officinalis obserwowano jako białe plamki na purpurowym tle TLC płytek.


296

Warto podkreślić, że zaproponowana metoda TLC bioautografii nie

wymagała immobilizacji lipazy na nośniku. Stabilizację aktywności LP

osiągnięto poprzez dodanie do buforowanego roztworu enzymu albuminy

z surowicy wołowej w stężeniu (0,1% w/v) [32].

Odmienną metodę detekcji zahamowania aktywności lipazy powiązaną

z techniką TLC bioautografii zaproponował zespół pod kierunkiem

Kadeppagari’ego [33]. Tym razem jako substrat reakcji zaproponowano

maślan p-nitrofenylu. W wyniku działania lipazy produktami reakcji były

p-nitrofenol i kwas masłowy zakwaszający środowisko. Wykorzystanie

błękitu bromotymolowego – indykatora o barwie niebieskiej przy

wartościach pH 7,6 i barwie jasno-zielonej w zakresie wartości pH

6,0-7,6 skutkowało zieloną barwą tła płytki w sytuacji, gdy aktywność

enzymu nie była hamowana. Obecność inhibitorów, np. orlistatu (użytego

jako kontrola pozytywna, limit detekcji 1 ng) odpowiadała za wystąpienie

niebieskiej barwy plamki odpowiadającej lokalizacji związku o działaniu

hamującym katalizę zależną od lipazy trzustkowej. Wykazano hamowanie

przebiegu reakcji ze strony wybranych supernatantów z hodowli bakterii

rodzaju Streptomyces spp. – S. coelicolor, S. tendae i S. aurantiacus.

Działania o tym charakterze nie wykazano w odniesieniu do S. albaduncus.

W 2016 roku zespół pod kierunkiem Cheng’a na łamach czasopisma

Phytochemical Analysis zaproponował użycie mirystynianu β-naftylu jako

substratu lipazy [34]. Wybór tego rodzaju związku (kryterium długość

szkieletu węglowego) był w pełni uzasadniony. Lipaza wykazuje, bowiem

większą specyficzność w odniesieniu do długołańcuchowych kwasów

łańcuchowych. Autorzy prezentowanej pracy [34] jako zaletę opracowanej

metody podkreślają jej większą specyficzność w detekcji inhibitorów

lipazy. Należy bowiem przypomnieć, że zaproponowany wcześniej przez

Hassana protokół TLC bioautografii testowanego biokatalizatora był

obarczony możliwością interferencji ze strony inhibitorów acetylo-

cholinoesterazy.

Przeprowadzone eksperymenty dotyczące optymalizacji wyboru fazy

stacjonarnej do TLC bioautografii lipazy z mirystynianem β-naftylu jako

substratem i orlistatem jako inhibitorem, dowiodły, że najlepsze rezultaty

uzyskano w odniesieniu do płytek pokrytych żelem krzemionkowym.

Użycie płytek celulozowych i poliamidowych wiązało się z występo-

waniem niepożądanego efektu dyfuzji (mniej gęste i zwarte plamki

w miejscach dozowania inhibitora). Pogłębiona analiza dotycząca różnych

typów płytek pokrytych żelem krzemionkowym wykazała brak znaczących

różnic pomiędzy nośnikami z i bez wskaźnika fluorescencyjnego. Ponadto,

przeprowadzono optymalizację metody w odniesieniu do takich

parametrów jak: wybór producenta dostarczającego płytki do TLC

bioautografii, stężenie substratu, aktywność lipazy i stężenie Fast Blue B



297

salt. Ustalono także optymalne czasy dla poszczególnych etapów metody

– immersji, reakcji i derywatyzacji.

W odniesieniu do referencyjnych związków o charakterze inhibitorów

lipazy ustalono następujący szereg związków (od największej do najniższej

względnej zdolności hamowania, RLIC) luteolina nucyferyna kwer-

cetynaginsenozyd Rb1luteolozydkwas oleanolowy (struktury tych

związków przedstawiono na Rys. 5).

Rysunek 5. Struktury inhibitorów testowanych przez Cheng’a celem ustalenia od największej do najniższej względnej zdolności hamowania (RLIC) aktywności lipazy [34]. Wszystkie wzory

z wyjątkiem struktury nucyferyny opracowanej na podstawie [59] pochodziły ze źródła [56]

Analogiczny szereg RLIC, tym razem w odniesieniu do testowanych

ekstraktów był następujący: ekstrakt z Panax quinquefolius (American

ginseng) ekstrakt z Flammulina velutipes (enoki mushroom) ekstrakt

z Pleurotus eryngii (king trumpet mushroom) [34].

2.6. Inhibicja monoaminooksydaz A i B

Monoaminooksydazy (amina: tlen oksydoreduktaza (deaminująca),

MAO-A i MAO-B, EC 1.4.3.4) to flawoproteiny FAD-zależne katalizujące

oksydacyjną deaminację neurotransmiterów i amin biogennych [60]. Dwa

występujące izoenzymy MAO: MAO-A i MAO-B wykazują 70% zgodność

sekwencji [35]. Inhibitory MAO są stosowane w leczeniu depresji, chorób

Parkinsona i Alzheimera [36]. Należy wyraźnie zaznaczyć, że selektywne


298

nieodwracalne inhibitory MAO-A mają ograniczone zastosowanie w terapii

depresji, ponieważ ich interakcja z tyraminą, aminą biogenną występującą

w produktach spożywczych takich jak: sery, wina, ryby, przejrzałe banany,

czekolada, prowadzi do nadmiernej akumulacji spożytej tyraminy. Efektem

tego może być występowanie u pacjenta przełomu nadciśnieniowego,

syndromu serotoninowego i pobudzenia psychoruchowego [35]. Badania

prowadzone przez zespół Zarmouth i inni wykazały, że etanolowy ekstrakt

z nasion Psoralea coryfolia zawiera bawachininę (flawonon) (Rys. 6),

związek odpowiedzialny za inhibicję obu ludzkich izoenzymów MAO

(hMAO), przy czym jego skuteczność była większa w odniesieniu do

hMAO-B niż hMAO-A [35].

Szybką i skuteczną metodę TLC bioautografii do detekcji inhibitorów

MAO zaprezentowała Liang i inni [36]. Zastosowana przez ten zespół

metoda oznaczania aktywności MAO polegała na przekształcaniu

tryptaminy do aldehydu, reagującego z MTT z utworzeniem niebieskiego

formazanu. Obecność znanych inhibitorów MAO takich jak: iproniazyd,

klorgilina i pargilina (Rys. 6) była identyfikowana jako białe plamki na tle

niebieskiego tła płytki chromatograficznej. Limit detekcji w tej metodzie

dla trzech wymienionych powyżej inhibitorów ustalono na 10 ng.

Przeprowadzenie techniki TLC bioautografii pozwoliło zespołowi

chińskich badaczy wykazać obecność związku o potencjalnym działaniu

hamującym aktywność MAO w ekstrakcie z owoców Liquidambar

formosana.



299

Rysunek 6. Struktury inhibitorów MAO: bawachina [56], iproniazyd (opracowanie własne

na podstawie [61]), klorgiliny chlorowodorek i pargiliny chlorowodorek [56]

2.7. Inhibicja fosfoglukoizomerazy

Fosfoglukoizomeraza (D-glukozo-6-fosforanowa – aldozo-ketozowa

izomeraza, izomeraza aldozo-ketozowa, fosfoheksozowa izomeraza, PGI,

EC 5.3.1.9) jest biokatalizatorem odpowiedzialnym za odwracalną

izomeryzację glukozo-6-fosforanu do fruktozo-6-fosforanu [62, 63]. To

białko enzymatyczne bywa określane terminami „workhorse” lub

„housekeeping” z racji jego szerokiego zaangażowania w metabolizm

cukrów [64, 65]. PGI odgrywa kluczową rolę w takich szlakach

metabolicznych jak: glikoliza, szlak pentozofosforanowy, glukoneogeneza,

szlak Entnera-Doudoroffa [65]. Fosfoglukoizomeraza jest także zaanga-

żowane w syntezę egzopolisacharydu (EPS) bakteryjnego biofilmu [66].

Efektem badań prowadzonych w Katedrze i Zakładzie Biochemii

i Biotechnologii UM w Lublinie było zaproponowanie po raz pierwszy

w piśmiennictwie metody TLC-bioautografii do detekcji inhibitorów PGI.

Jako inhibitor tego białka wyizolowanego z referencyjnego szczepu

Escherichia coli ATCC 25922, wybrano kationy Hg2+

tworzące połączenia

merkaptydowe z grupą tiolową (sulfhydrylową) aminokwasu Cys,


300

zlokalizowanego w centrum aktywnym enzymu. Opracowana przez nas

metoda polegała na wykazaniu braku tworzenia na celulozowej płytce do

chromatografii cienkowarstwowej purpurowego formazanu, który powinien

powstawać z żółtego chlorku błękitu nitrotetrazoliowego (NBT), o ile

testowana aktywność PGI nie była hamowana [37]. Ważne, że opracowana

metoda nie wymagała immobilizacji PGI. W tym miejscu należy również

wspomnieć, że przeprowadzona przez nas TLC bioautografia

dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej z L. mesenteroides (enzym wskaź-

nikowy w metodach oznaczania aktywności PGI) wykazała brak

hamowania aktywności tego biokatalizatora przez kationy Hg2+

[37].

Uzyskany rezultat był zgodny z udokumentowaną wcześniej obserwacją

Ishaque i innych wskazującą, że dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa

z L. mesenteroides nie zawiera Cys w centrum aktywnym, tym samym jej

aktywność nie jest hamowana przez kationy Hg2+

[67].

Jak się wydaje szczególnie interesujące są dane dotyczące roli tego

biokatalizatora w metabolizmie mikroorganizmów jakimi są prątki

(Mycobacterium) [65, 6870]. Substrat PGI – glukozo-6-fosforan jest dla

tych bakterii prekursorem galaktanu, a następnie arabinogalaktanu,

będącego jednym z kluczowych składników mykobakteryjnej ściany

komórkowej [71]. Związek ten jest także aktywatorem allosterycznym

mykobakteryjnej pirofosforylazy ADP-glukozy (difosfoadenyloglukozy)

(adenylilotransferaza ATP:-D-glukozo-1-fosforan, adenylilotransferaza

glukozo-1-fosforanu, EC 2.7.7.27) [72]. Produkt reakcji ADP-glukoza jest

wykorzystywany do syntezy glikogenu (magazyn węgla) i trehalozo-6-

fosforanu [72]. Fruktozo-6-fosforan jest natomiast aktywatorem allo-

sterycznym prątkowego enzymu o nazwie syntaza trehalozo-6-fosforanu

(syntaza ,-trehalozo-fosforanu tworząca UDP, 1--glukozylotransferaza

UDP-glukoza:D-glukozo-6-fosforan, EC 2.4.1.15) [72]. Powstający

w wyniku reakcji trehalozo-6-foforan wraz z kwasami mikolowymi tworzy

trehalozowe mikolany. Klasycznym przedstawicielem tej grupy związków

jest 6,6’-dimikolan trehalozy, glikolipid, zwany czynnikiem wiązkowym

(cord factor), który odpowiada za wirulencję i przeżycie prątka

w komórkach organizmu gospodarza [72].

W ostatnich latach, w związku z rosnącą ilością lekoopornych

mykobakteryjnych szczepów, duże zainteresowanie badaczy budzą badania

nad testowaniem związków hamujących wybrane enzymy prątkowe.

Po przeanalizowaniu roli fosfoglukoizomerazy w metabolizmie prątków

wydaje się, że może być ona obiecującym celem (target, punktem

uchwytu) dla inhibitorów o potencjalnym działaniu jako leki.

Biorąc pod uwagę te istotne przesłanki, nasz zespół przy współpracy

badaczy z Zakładu Chemii Fizycznej UM w Lublinie przedstawił



301

propozycję użycia techniki TLC bioautografii do detekcji hamowania

aktywności PGI izolowanej z referencyjnego szczepu Mycobacterium

tuberculosis H37Ra. Jako wzorcowy inhibitor testowanego biokatalizatora

został użyty fosfoenolopirogronian (PEP), będący znanym inhibitorem

kompetycyjnym klasycznych fosfoglukoizomeraz. Efektem dotychczas

prowadzonych eksperymentów jest opracowanie manuskryptu

(zaakceptowanego do opublikowania) stanowiącego protokół badawczy

opisujący zastosowanie techniki TLC bioautografii do detekcji inhibitorów

mykobakteryjnej PGI [38]

2.8. Inhibicja peptydazy dipeptydylowej IV

Dipeptydylowa peptydaza IV (EC 3.4.14.5, DPP-IV) usuwa

preferencyjnie dipeptydy X-Pro lub X-Ala z N-końca polipeptydów i białek

[73]. Jej substratem o istotnym znaczeniu dla zdrowia człowieka jest

zawierający Ala, hormon inkretynowy – glukagonopodobny peptyd

(glucagon-like peptide, GLP-1) odpowiadający za 50-60% poposiłkowej

sekrecji insuliny [73, 74]. W stanach przedcukrzycowych oraz w cukrzycy

typu 2 sekrecja inkretyn jest zaburzona, co jest istotnym czynnikiem

w patogenezie niedoboru insuliny w cukrzycy typu 2 [74]. Jedną ze

strategii terapeutycznych w leczeniu wspomianego powyżej schorzenia jest

stosowanie inhibitorów DPP-IV, co pozwala wydłużyć okres półtrwania

i aktywność biologiczną GLP-1 [7375]. Związki te określane są terminem

„gliptyny”, a ich komercyjnie dostępne preparaty to: sitagliptyna,

widagliptyna, saksagliptyna, alogliptyna i linagliptyna [74].

Obecnie, trwają intensywne poszukiwania naturalnych związków

o działaniu hamującym aktywność dipeptydylowej peptydazy-IV,

wyodrębnionych z materiałów roślinnych. Dotychczas dostępne

piśmiennictwo wskazuje, że związkami tymi są alkaloidy: berberyna (Rys.

7) izolowana z roślin takich jak: Berberis aristata, Berberis aquifolium

i Hydrastis canadensis, 7-deoksy-6-epi-kastanospermina, australina (Rys.

7) i kastanospermina (Rys. 7) obecne w etanolowym ekstrakcie z nasion

Castanospermum australe [75].


302

Rys. 7 Struktury wybranych inhibitorów DPP IV: berberyny chlorek [56], australiny

(opracowanie własne na podstawie [76]) i kastanosperminy [56]

Interesujące są rezultaty zastosowania techniki TLC-bioautografii celem

skriningu związków potencjalnie hamujących aktywność DPP-IV

występujących w metanolowym ekstrakcie z Peganum nigellastrum Bunge

[39]. Zaproponowana przez Gu i wsp. nowa metoda oznaczania aktywności

charakteryzowanego biokatalizatora polegała na hydrolizie syntetycznego

substratu Gly-Pro-p-nitroaniliny. Powstała w wyniku reakcji p-nitroanilina

ulegała reakcji diazowania z azotynem sodowym, by następnie reagować

z N-(1-naftylo)etylenodiaminy dichlorowodorkiem dając finalnie barwnik

azowy. W zaproponowanej technice oznaczania aktywności DPP-IV

obecność inhibitorów (harmina) skutkowała występowaniem białych plam

na różowo-czerwonym tle płytki TLC [39]. W eksperymentach jako

pozytywną kontrolę wykorzystywano standardowy inhibitor dipepty-

dylowej dipeptydazy IV – diprotynę A, tripeptyd o strukturze Ile-Pro-Ile

[39, 73, 75, 77].

2.9. Inhibicja oksydazy ksantynowej

Oksydaza ksantynowa (oksydoreduktaza ksantyna:tlen, XO, EC

1.17.3.2, wcześniej EC 1.1.3.22) jest żelazo-molibdenową flawoproteiną



303

(FAD+) zawierającą centra żelazowo-siarkowe. Jej substratem może być

także hipoksantyna. Produktami reakcji są: kwas moczowy i reaktywne

formy tlenu (ROS) – anionorodnik ponadtlenkowy O2•- i H2O2 [78].

Nadmierne powstawanie produktów tej reakcji odpowiada za

występowanie: hiperurykemii, dny moczanowej, nadciśnienia, cukrzycy,

chorób zapalnych, starzenia i nowotworzenia [4044]

W 2006 roku zespół pod kierunkiem Furlana [40] przedstawił propozycję

metody dla szybkiej autograficznej techniki detekcji inhibitorów XO

i zmiataczy wolnych rodników. Konieczne było pułapkowanie enzymu

w żelu agarowym lub agarozowym. Produkty reakcji oksydazy ksanty-

nowej identyfikowano następującymi metodami: kwas moczowy z kwasem

fosfowolframowym, nadtlenek wodoru w reakcji Trindera i anionorodnik

ponadtlenkowy w reakcji z błękitem nitrotetrazoliowym (NBT). Najlepsze

rezultaty obserwowano po pokryciu płytek z żelem krzemionkowym 60

F254 roztworem agaru zawierającym XO i NBT, a następnie immersji płytek

w roztworze substratu – ksantyny. Utlenienie tego substratu zależne od

oksydazy ksantynowej skutkuje redukcją żółtego NBT do formy formazanu

o barwie purpurowej. Typowy inhibitor oksydazy ksantynowej – allo-

purynol (typ inhibicji nieodwracalny, samobójczy) enzymu był identyfiko-

wany jako biała plamka na purpurowym tle płytki. Limit detekcji dla tego

związku oznaczono na 5 ng. W związku z faktem, że w zaproponowanym

teście, zmiatacze wolnych rodników podobnie jak klasyczny inhibitor XO

dają pozytywne rezultaty, przetestowano dwa systemy do nieenzyma-

tycznej generacji nadtlenków. W pierwszym NADH i NBT były kompo-

nentami żelu agarowego, a barwienie przeprowadzano przez immersję

w roztworze PMS (metosiarczan fenazyny). W drugim przypadku wybar-

wianie wykonywano dla żelu zawierającego ryboflawinę i NBT, poddanego

ekspozycji na światło. Chociaż oba systemy okazały się skuteczne, to

jednak lepsze rezultaty obserwowano dla układu ryboflawina-światło-NBT.

W tej autografii w miejscu lokalizacji związku o właściwościach anty-

oksydacyjnych – taksyfoliny (flawonoid) obserwowano występowanie

białej plamki, w odróżnieniu od allopurinolu niedającego żadnej wyraźnej

strefy przejaśnienia tła płytki. Oznaczono limity detekcji dla taksyfoliny

i fizetyny, które były niższe niż 0,1 g.

Przyczyną konieczności intensyfikacji poszukiwań nowych inhibitorów

XO jest występowanie szeregu działań niepożądanych u pacjentów

przyjmujących ze wskazań lekarskich allopurynol takich jak: zapalenie

wątroby, nefropatia, reakcje alergiczne, toksyczność 6-merkaptopurynowa

i zespół nadwrażliwości na allopurynol [44].

Szczegóły stosunkowo udanej optymalizacji bioautograficznej techniki

detekcji XO przedstawionej pierwotnie przez zespół Furlana zapro-


304

ponowano w ramach doniesienia zjazdowego autorstwa Bräm i wsp. [42].

Walidacja obejmowała takie aspekty jak: aktywność enzymu, ilość

roztworu agaru z immobilizowanym biokatalizatorem, wybór składnika

buforowego – za najbardziej optymalny uznano bufor fosforanowy.

Wykazano znaczącą redukcję aktywności enzymu pod wpływem kationów

Ca2+

wchodzących w skład buforu Sörensena, a także fałszywie negatywne

rezultaty (brak hamowania reakcji ze strony allopurynolu), kiedy do

buforowania immobilizowanej XO użyto jako składnika TRIS/HCl

(Tris(hydroksymetyl) aminometan/HCl). Udowodniono, że metanolowe

ekstrakty z Camellia sinensis i Artemisia alba wykazywały działanie

inhibitorowe w odniesieniu do bakteryjnej XO do stężeń odpowiednio: 10

i 100 g w przeliczeniu na suchą masę [42, 43].

Najnowsza dostępna pozycja piśmiennicza dowodzi, że dobrym źródłem

składników wykazujących działanie inhibitorowe na aktywność XO jest

Pistacia lentiscus L. [44]. Wydaje się celowe przeprowadzenie TLC

bioautografii z użyciem preparatów: ekstraktu surowego i frakcji uzyskanej

z wykorzystaniem octanu etylowego będącego najlepszym solwentem do

ekstrakcji z liści wspomnianej rośliny składników o pożądanych

właściwościach [44].

2.10. Inhibicja topoizomerazy 1

DNA topoizomeraza (DNA topo I, Topo I, topo 1, EC 5.99.1.2) jest

enzymem, którego kluczową rolą jest relaksacja superskręconego DNA

[79, 80]. Kontrolowanie superskręcenia DNA przez ten biokatalizator

przebiega z nacięciem jednej nici DNA w odróżnieniu od topoizomeraz

typu II rozcinających obie nici DNA [81]. Optymalny przebieg katalizy

zachodzącej przy udziale topo I zależy od obecności kationów Mg2+

[81]

i nie wymaga obecności ATP jako kofaktora dostarczającego energii [80,

81]. Bakteryjne topoizomerazy I dzielimy na trzy podtypy: IA, IB i IC [81].

U wielu gatunków bakterii występują dwie topoizomerazy podtypu IA:

topo 1 (TopA) oraz topo III (TopB), przy czym TopA pełni kluczową rolę

dla ich przeżycia [81]. Ten fakt, a także duże różnice pomiędzy

eukariotycznymi, a prokariotycznymi topo I, czyni te ostatnie bardzo

dobrym punktem uchwytu dla leków przeciwbakteryjnych [81]. W tym

aspekcie ciekawą wydaje się praca Patil i innych [45], w której m.in. za

pomocą techniki TLC bioautografii wykazano działanie przeciwbakteryjne

metanolowego ekstraktu z kory Nothapodytes nimmoniana Graham

(wcześniejsza nazwa Mappia foetida Miers) w odniesieniu do

drobnoustrojów: S. aureus i E. coli. Precyzyjniej działanie to wywierała

kamptotecyna (Rys. 8), alkoloid izochinolinowy, związek o udowodnionym

działaniu przeciwnowotworowym, hamujący aktywność topo 1 [45, 80].



305

Rysunek 8. Struktura kamptotecyny będącej inhibitorem topoizomerazy 1 [56]

2.11. Inhibicja tyrozynazy

Oksydaza polifenolowa (L-tyrozyna, L-Dopa: tlen oksydoreduktaza,

tyrozynaza, EC 1.14.18.1) jest miedzioproteiną szeroko rozpowszechnioną

w przyrodzie. Biokatalizator ten odpowiada za koloryzację skóry i włosów

u ssaków [82]. Odpowiada za niepożądane zjawisko polegające na

brązowieniu owoców, warzyw i grzybów [3, 46]. W przypadku owadów

tyrozynaza pełni rolę obronną wpływając na proces gojenia ran,

enkapsulację parazytów i twardnienie oskórka (sklerotyzację) [3]. Testy

obejmujące badania związków o potencjalnym działaniu hamującym

aktywność tyrozynazy wydają się być atrakcyjne z powodu ich korzystnego

wpływu na przebieg schorzeń ściśle powiązanych z nadmierną produkcją

barwników melaninowych [3, 46, 47], poprawę jakości pożywienia [3, 46]

i kontrolę populacji owadów [3]. Jedna z pierwszych prac poświęconych

TLC bioautografii tyrozynazy wykazała hamowanie katalizy zależnej od

tego enzymu w obecności: kwasu kojowego (Rys. 9), glabrydyny (Rys. 9),

arbutyny (Rys. 9), dipalmitynianu kwasu kojowego i ekstraktu z Glycyrrhiza

glabra. Zaproponowana metodyka pozwoliła wykazać jednoznacznie

wyraźny efekt hamujący obserwowany jako biała plamka na tle brązowo-

purpurowej płytki już przy stężeniu 6 ng glabrydyny [46]. Istotną

wzmianką poczynioną przez Wangthong i innych współautorów cytowanej

pracy jest wskazanie faktu obniżenia aktywności enzymatycznej tyrozynazy,

powiązanego z wysychaniem fazy stacjonarnej po naniesieniu roztworu

enzymu, co skutkowało obserwacją jaśniejszego tła płytki chromato-

graficznej [46].

Zastosowanie przez García i Furlan strategii immobilizacji tyrozynazy

w agarze, a także implementacja metody powierzchni odpowiedzi

(response surface methodology, RSM), zgodnie z definicją stanowiącej

połączenie technik matematycznych i statystycznych, których przydatność

jest niezwykle istotna dla określenia optymalnych parametrów dla

przebiegu badanego procesu [83], w odniesieniu do takich czynników jak:


306

aktywność tyrozynazy, ilość tyrozyny, wartość temperatury i czas trwania

reakcji pozwoliło na optymalizację techniki TLC autografii (TLC

bioautografii) wykazującej inhibicję tyrozynazy przez kwas kojowy obecny

(0,1% w/w) w dichlorometanowym ekstrakcie z Calamagrostis

viridiflavescens (Poir.) Steud [3].

Rysunek 9. Struktury wybranych inhibitorów tyrozynazy [56]

3. Podsumowanie

Przegląd dostępnego piśmiennictwa dostarczający przykładów

protokołów TLC bioautografii skłania ku wnioskom, że metoda ta będąca

połączeniem chromatografii cienkowarstwowej z bioautografią jest efek-

tywna, niedroga i stosunkowo prosta w badaniach, głównie świata flory

jako źródła związków o potencjalnym działaniu biologicznym. Niemniej

jednak należy zauważyć, że w literaturze naukowej dominują opisy

dotyczące wykorzystania charakteryzowanej metody do identyfikacji

związków o działaniu przeciwbakteryjnym pochodzenia roślinnego.

Znacznie mniej wg naszej oceny są rozpowszechnione prace, w których

TLC bioautografia służy detekcji inhibitorów enzymatycznych mających

zastosowanie w praktyce lekarskiej.



307

Literatura

1. Marston A., Thin-layer chromatography with biological detection

in phytochemistry, Journal of Chromatography A, 1218 (2011), 2676-2683

2. Cheng Z., Wu T., TLC bioautography: high throughput technique for

screening bioactive natural products, Combinatorial Chemistry and High

Throughput Screening, 16 (2013), 531-539

3. García P., Furlan R. L. E., Multiresponse optimisation applied to the

development of a TLC autography for the detection of tyrosinase inhibitors,

Phytochemical Analysis, 26 (2015), 287-292

4. Choma I. M., Jesionek W., TLC-direct bioautography as a high throughput

method for detection of antimicrobials in Plants, Chromatography, 2 (2015),

225-238

5. Dewanjee S., Gangopadhyay M., Bhattabharya N., Khanra R., Dua T. K.

Bioautography and its scope in the field of natural product chemistry, Journal

of Pharmaceutical Analysis., 5(2) (2015), 75-84

6. Nasir B., Fatima H., Ahmad M., Ihsan-ul-Haq, Recent trends and methods

in antimicrobial drug discovery from plant sources, Austin Journal

of Microbiology, 1(1) (2015), 1002

7. Mroczek T., Mazurek T., Pressurized liquid extraction and anticholinesterase

activity-based thin layer chromatography with bioautography of

Amaryllidaceae alkaloids, Analytica Chimica Acta, 633 (2009), 188-196

8. Mroczek T., Highly efficient, selective and sensitive molecular screening

of acetylcholinoesterase inhibitors of natural origin by solid-phase extraction-

liquid chromatography/electrospray ionisation-octopol-orthogonal

acceleration time-of-flight-mass spectrometry and novel thin layer

chromatography-based bioautography, Journal of Chromatography A, 1216

(2009), 2519-2528

9. Zheng X. Y., Zhang Z. J., Chou G. X., Wu T., Cheng X. M., Wang Ch. H., Wang

Z. T., Acetylcholinoesterase inhibitive activity-guided isolation of two new

alkaloids from seeds of Peganum Nigellastrum bunge by an in vitro TLC-

bioautographic assay, Archives of Pharmacal Research, 32(9) (2009), 1245-1251

10. Benemar H., Rached W., Derdour A., Marouf A., Screening of Algerian

medicinal plants for acetylcholinoesterase inhibitory activity, Journal

of Biological Sciences, 10(1) (2010), 1-9

11. Wszelaki N., Kuciun A., Kiss A. K., Screening of traditional European

medicinal plants for acetylcholinoesterase and butyrylcholinoesterase

inhibitory activity, Acta Pharmaceutica, 60(10) (2010), 119-128

12. Adhami H. R., Farsam H., Krenn L., Screening of medicinal plants from

Iranian traditional Medicine for acetylcholinesterase inhibition, Phytotherapy

Research, 25 (2011), 1148-1152

13. Noridayu A. R., Hii Y. F., Faridah A., Khozirah S., Lajis N., Antioxidant

and antiacetylcholinesterase activities of Pluchea indica Less, International

Food Research Journal, 18(3) (2011), 925-929


308

14. Orhan I. E, Yilmaz B. S., Altun M. L, Saltan G., Şener B., Anti-

acetylcholinoesterase and antioxidant appraisal of the bulb extracts of five

Stenbergia species, Records of Natural Products, 5(3) (2011), 193-201

15. Zheng X. Y., Zhang L., Cheng X. M., Zhang Z. J., Wang Ch. H., Wang Z. T.,

Identification of acetylcholinesterase inhibitors from seeds of plants of genum

Peganum by Thin-layer Chromatography-Bioautography, Journal of Planar

Chromatography, 24(6) (2011), 470-474

16. Bhadra S., Mukherjee P. K., Bandyopadhya A., Cholinoesterase inhibition

activity of Marsilea quadrifolia Linn an edible leafy vegetable from West

Bengal, India, Natural Product Research, 26(16) (2012), 1519-1522

17. Cabral R. S., Sartori M. C., Cordeiro I., Queiroga C. L., Eberlin M. N., Lago J.

H. G., Moreno P. R. H., Young M. C. M., Anticholinesterase activity

evaluation of alkaloids and coumarin from stems of Conchocarpus

fontanesianus, Brazilian Journal of Pharmacognosy, 22(2) (2012), 374-380

18. Adhami H. R., Lutz J., Kählig H., Zehl M., Krenn L. Compounds from gum

ammoniacum with acetylcholinesterase inhibitory activity, Scientia

Pharmaceutica, 81 (2013), 793-805

19. Kongkiatpaiboon S., Rojsanga P., Pattarajinda V., Gritsanapan W.,

Acetylcholinesterase inhibitory activity of didehydrostemofoline, stemofoline

alkaloids and extracts from Stemona collinsiae Craib roots, Pharmacognosy

Journal, 5 (2013), 56-59

20. Dalai M. K., Bhadra S., Chaudhary S. K., Bandyopadhyay A., Mukherjee P.

K., Anti-cholinesterase potential of Cinnamomum tamala (Buch.-Ham.)

T.Ness & Eberm leaves, Indian Journal of Traditional Knowledge, 13(4)

(2014), 691-697

21. Dalai M. K., Bhadra S., Chaudhary S. K., Chanda J., Bandyopadhyay A.,

Mukherjee P. K., Anticholinesterase activity of Cinnamomum zeylanicum L.

leaf extract, TANG Humanitas Medicine, 4(2) (2014), e11; doi:

http://dx.org/10.5667/tang.2013.0034

22. Pandey S., Sree A., Sehti D. P., Kumar C. G., Kakollu S., Chowdhury L.,

Dash S. S., A marine sponge associated strain of Bacillus subtilis and other

marine bacteria can produce anticholinesterase compounds, Microbial Cell

Factories, (2014), 13:24

23. Silva N. N. S., Silva J. R. A., Alves C. N., Andrade E. H. A, da Silva J. K. R.,

Maia J. G. S., Acetylcholinesterase inhibitory activity and molecular docking

study of 1-nitro-2-phenylethane, the main constituent of Aniba canelilla

essential oil, Chemical Biology and Drug Design., 84 (2014), 192-198

24. Ramallo A., Salazar M. O., Furlan R. L. E., Thin layer chromatography-

autography-high resolution mass spectrometry analysis: accelerating the

identification of acetylcholinesterase inhibitors, Phytochemical Analysis,

26(6) (2015), 404-412

25. Wszelaki N., Paradowska K., Jamróz M. K., Granica S., Kiss A. K.,

Bioactivity-guided fractionation for the butyrylcholinoesterasase inhibitory

activity of furanocoumarins from Angelica archangelica L. roots and fruits,

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 59(17) (2011), 9186-9193



309

26. Camara M. A., Tian M., Yang L., Wang S., Application of Thin-layer-

chromatography in enzyme activity and inhibitors studies of glucose-6-

phosphate dehydrogenase, Journal of Planar Chromatography, 28(4) (2015),

333-336

27. Salazar M. O., Furlan R. L. E., A rapid TLC autographic method for the detection

of glucosidase inhibitors, Phytochemical Analysis, 18 (2007), 209-212

28. Simões-Pires C. A., Hmicha B., Marston A., Hostettmann K., A TLC

bioautographic method for the detection of α- and β-glucosidase inhibitors

in plant extracts, Phytochemical Analysis, 20 (2009), 511-515

29. Verma N., Behera B. C., Sharma B. O., Glucosidase inhibitory and radical

scavenging properties of Lichen metabolites salazinic acid, sekikkaic acid and

usnic acid, Hacettepe Journal of Biology and Chemistry, 40(1) (2012), 7-21

30. Pandey S., Sree A., Dash S. S., Sehti D. P., A novel method for screening beta-

glucosidase inhibitors, BMC Microbiology, 2013;13:55 doi:10.1186/1471-

2180-13-55

31. Yang Y., Gu L., Xiao Y., Liu Q., Hu H., Wang Z., Chen K. Rapid

identification of -glucosidase inhibitors from Phlomis tuberose by sepbox

chromatography and thin-layer chromatography bioautography, PLoS ONE,

2015;10:e0116922 doi:10.1371/journal.pone.0116922

32. Hassan A. M. S. TLC bioautographic method for detecting lipase inhibitors,


33. Bayineni V. K., Suresh S., Singh G., Kadeppagari R. K. Developments

of bioautographic method for the detection of lipase inhibitors, Biochemical

and Biophysical Research Communication, 453 (2014), 784-786

34. Tang J., Zhou J., Tang Q., Wu T., Cheng Z., A new TLC bioautographic assay

for qualitative and quantitative estimation of lipase inhibitors, Phytochemical

Analysis, 27(1) (2016), 5-12

35. Zarmouh N. O., Mazzio E. A., Elshami F. M., Messeha S. S., Eyunni V. K.,

Soliman K. F. A., Evaluation of the inhibitory effects of Bavachinin and

Bavachin on human monoamine oxidases A and B, Evidence-Based

Complementary and Alternative Medicine, 2015 (2015),

doi:10.1155/2015/852194

36. Liang J. B., Yang Z. D., Shu Z. M., Yu C. C., A rapid thin-layer

chromatography bioautographic method for the detecting the monoamine

oxidase in plants, Natural Product Research, 28(17) (2014), 1318-1321

37. Paradowska K., Lutek J., Ginalska G., A rapid detection for the inhibition

of phosphoglucose isomerase from Escherichia coli by mercury(II) chloride

based on TLC-autographic analysis – preliminary studies, Annales

Universitatis Mariae Curie Skłodowska, Sectio DDD, 27(2) (2014), 127-130

38. Paradowska K., Polak B., Chomicki A., Ginalska G. Establishment

of an effective TLC bioautographic method for the detection of Mycobacterium

tuberculosis H37Ra phosphoglucose isomerase inhibition by

phosphoenolpyruvate, Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry,

w druku, doi:10.3109/14756366.2016.1151012

39. Gu L. H., Liao L. P., Hu H. J, Annie Blich S. W., Wang C. H., Chou G. X.,

Wang Z. T., A thin-layer chromatography-bioautographic method for


310

detecting dipeptidyl peptidase IV inhibitors in plants, Journal of

Chromatography A, 1411 (2015), 116-122

40. Ramallo A., Zacchino S. A., Furlan R. L. E. A rapid TLC autographic method

for the detection of xanthine oxidase inhibitors and superoxide scavengers,


41. Azmi S. M. N., Jamal P., Amid A., Purification of xanthine oxidase inhibitor from

Carica papaya leaves using Reversed Phase Flash Column Chromatography

(RPFCC) – High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC), Australian

Journal of Basic and Applied Sciences, 6(1) (2012), 117-122

42. Bräm S., Meier B., Danova K., Wolfram E., Improved bioautographic

xanthine oxidase assay: combining HPTLC separation and activity assessment

for phytopharmaceutical research,

http://phytotherapie2014.smgp.ch/poster/QK12_small.pdf

43. Bräm S., Meier B., Danova K., Wolfram E., Bioautographic xanthine oxidase

assay: combining phytochemical separation and activity assessment as a tool

for medicinal plant research, Forsch Komplementmed, 21 (suppl. 1) (2014), 46

44. Haddi R., Marouf A., Xanthine oxidase inhibitory effects of Pistacia lentiscus

L. leaves extracts, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical

Sciences, 7(2) (2015), 34-39

45. Patil A., Patil S., Mahure S., Kale A., UV, FTIR, HPLC confirmation

of captothecin an anticancer metabolite from bark extract of Nothapodytes

nimmoniana (J. Graham), American Journal of Ethnomedicine, 1(3) (2014),

174-185

46. Wangthong S., Tonsiripakdee I., Monhaphol T., Nonthabenjawan R.,

Wanichwecharungruang S. P., Post TLC developing technique for tyrosinase

inhibitor detection, Biomedical Chromatography, 21 (2007), 94-100

47. Kamagaju L., Morandini R., Bizuru E., Nyetera P., Nduwayezu J. B., Stévigny

C., Ghanem G. Duez P., Tyrosinase modulation by five Rwandese herbal

medicines traditionally used for skin treatment, Journal

of Ethnopharmacology, 146(3) (2013), 824-834

48. Taibon J., Ankli A., Schwaiger S., Magnenat C., Boka V. I., Simões-Pires C.,

Aligiannis N., Skaltsounis A. L., Reich E. Stuppner H., Prevention of false-

positive results: development of an HPTLC autographic assay for the

detection of natural tyrosinase inhibitors, Planta Medica, 81(12-13) (2015),

1198-1204

49. http://www.brenda-enzymes.org/enzyme.php?ecno=3.1.1.7


51. Borowiec K., Rola cholinoesteraz i ich inhibitorów w chorobie Alzheimera,

[w] Młodzi naukowcy dla polskiej nauki, część 8 – Nauki przyrodnicze, praca

zbiorowa pod red. Kuczery M., Kraków 2013, 130-137.





56. http://www.sigmaaldrich.com.content/dam/sigma-aldrich/...

57. http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/image/imagefly.cgi?cid=5320418&width=400&



311

58. Majmudar C. Y., Højfeldt J. W., Arevang C. J., Pomerantz W. C., Gagnon J.

K., Pamela J. Schultz P. J., Cesa L. C., Doss C. H., Rowe S. P., Vásquez V.,

Tamayo-Castillo G., Cierpicki T., Brooks C. L. III, Sherman D. H., Mapp A.

K., Sekikaic acid and lobaric acid target a dynamic interface of the

coactivator CBP/p300, Angewandte Chemie International Edition in English,

51(45) 2012; 112511262

59. http://chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/structure/475-83-2


61. http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/image/imagefly.cgi?cid=3748&width=400&

height=400

62. Paradowska K., Ginalska G., Phosphoglucose isomerase – “portrait of the

protein with many faces”, Annales Universitatis Mariae Curie Skłodowska,

Sectio DDD, XXIII (3) (2010), 79-86


64. Davies C, Muirhead H, Chirgwin J., The structure of human phosphoglucose

isomerase complexed with a transition-state analoque, Acta Crystallographica

Section D Biological Crystallography, D59 (2003), 1111-1113

65. Mathur D., Garg L. C., Functional phosphoglucose isomerase from

Mycobacterium tuberculosis H37Rv: Rapid purification with high yield and

purity, Protein Expression and Purification., 52 (2007), 373-378

66. Paradowska K., Bednarz B., Ginalska G., Phosphoglucose isomerase from

Escherichia coli ATCC 25922 – pilot studies, Annales Universitatis Mariae

Curie Skłodowska, Sectio DDD, XXIII (3) (2010), 87-99

67. Ishaque A., Milhausen M., Levy R., On the absence of cysteine in glucose 6-

phosphate dehydrogenase from Leuconostoc mesenteroides, Biochemical and

Biophysical Research Communication, 59 (1974), 894-901

68. Tuckman D., Donnelly R. J., Zhao F. X., Jacobs W. R., Conell N. D.,

Interruption of the phosphoglucose isomerase gene results in glucose

auxotrophy in Mycobacterium smegmatis, Journal of Bacteriology, 179

(1997), 2724-2730

69. Mathur D., Ahsan Z., Tiwari M., Garg L. C., Biochemical characterization

of phosphoglucose isomerase of Mycobacterium tuberculosis, Biochemical

and Biophysical Research Communication, 337 (2005), 626-632

70. Anand K., Mathur D., Anant A., Garg L. C. Structural studies of

phosphoglucose isomerase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv, Acta

Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization

Communications, F66 (2010), 490-497

71. Hasan M. R., Rahman M., Jaques S., Purwantini E., Daniels L., Glucose 6-

phosphate accumulation in mycobacteria. Implication for a novel F420-

dependent anti-oxidant system, The Journal of Biological Chemistry, 285(25)

2010, 19135-19144

72. Diez M. D. A., Demonte A. M., Syson K., Arias D., Gorelik A., Guerrero S. A.,

Bornemann S., Iglesias A. A., Allosteric regulation of the partitioning of glucose-

1-phosphate between glycogen and trehalose biosynthesis in Mycobacterium

tuberculosis, Biochimica et Biophysica Acta, 1850(1) (2015), 13-21


312

73. Hsu K. C., Tung Y. S., Huang S. L., Jao C. L., Dipeptidyl peptidase-IV

inhibitory activity of peptides in porcine skin gelatin hydrolysates, chapter 8

[in] Bioactive Food Peptides in Health and Disease, INTECH, 2013, 205-218,

http://dx.doi.org/10.5772/51264

74. Jasik M., Inhibitory dipeptydylopeptydazy 4(DPP-4) ze szczególnym uwzględ-

nieniem sitagliptyny, Forum Zaburzeń Metabolicznych, 1(4) (2010), 220-229

75. Bharti S. K., Sharma N. K., Kumar A., Jaiswal S. K., Krishnan S., Gupta A.

K., Ghosh A. K., Prakash O., Dipeptidyl peptidase IV inhibitory activity

of seed extract of Castanospermum australe and molecular docking of their

alkaloids, Topclass Journal of Herbal Medicine, 1(1) (2012), 1-7

76. Kato A, Kano E., Adachi I., Molyneux R. J., Watson A. A., Nash R. J., Fleet

G. W. J., Wormald M. R., Kizu H., Ikeda K., Asano N., Australine and related

alkaloids: easy structural confirmation by 13

C NMR spectral data and

biological activities, Tedrahedron: Asymmetry, 14 (2003), 325-331

77. Umezawa H., Aoyagi T., Ogawa K., Naganawa H., Hamada M., Takeuchi T.,

Diprotins A and B, inhibitors of dipeptidyl aminopeptidase IV, Produced

by Bacteria, The Journal of Antibiotics, 37 (1984), 422-425



80. Pommier Y., Topoisomerase I inhibitors: camptothecins and beyond, Nature

Reviews Cancer, 6 (2006), 789-802

81. Szafran M., Zakrzewska-Czerwińska J., Jakimowicz B., Bakteryjne

topoizomerazy typu I – rola biologiczna i zastosowanie jako potencjalnych

celów dla antybiotyków, Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej

67 (2013), 130-142


83. Białas W., Wojciechowska D., Szymanowska D., Grajek W., Optymalizacja

procesu jednoczesnej hydrolizy i fermentacji natywnej skrobi metodą

powierzchni odpowiedzi, Biotechnologia, 4(87) (2009), 183-199

Implementacja metody TLC bioautografii do identyfikacji inhibitorów

enzymatycznych – praca przeglądowa

Streszczenie

Artykuł ten jest przeglądem aktualnego piśmiennictwa na temat zastosowania TLC

bioautografii jako metody do skriningu inhibitorów enzymatycznych. Rosnąca ilość informacji dotyczących tej techniki wskazuje na jej duży potencjał w odkrywaniu nowych

składników będących lekami

An implementation of TLC bioautography for the detection enzymes

inhibitors - review

Abstract

This review article focuses on current reports on application Thin Layer Cchromatography

bioautography (TLC bioautography) as a method for detection of enzymes inhibitors. The

rapid accumulation of information about this technique has revealed a great potential for the discovering of novel compounds with significant impact as drugs

313

Martyna Paździor1, Patrycja Horbowicz

2, Jakub Knurek

3

Proteaza wirusa HIV

– budowa, mechanizm działania, inhibitory

1. Wstęp

Wirus HIV (ang. human immunodeficiency virus) należy do rodziny

Retroviridae i atakuje głównie limfocyty T pomocnicze (Th). Materiałem

genetycznym wirusa jest dwuniciowy RNA ((+)dsRNA) o dodatniej

polarności. Genom wirusa jest otoczony podwójnym kapsydem i otoczką

lipidową inkrustowaną glikoproteinami. dsRNA HIV zawiera geny dla

białek strukturalnych (gag), odwrotnej transkryptazy (pol), proteazy,

glikoprotein osłonki lipidowej (env) i geny regulacyjne [17]. Dotychczas

odkryto dwa rodzaje wirusa HIV: HIV-1 i HIV-2. Skutkiem zakażenia się

wirusem HIV jest rozwój zespołu nabytego niedoboru odporności,

potocznie nazywanego AIDS. Udowodniono, że choroba ta rozwija się

dzięki aktywności proteazy wirusa HIV, która pełni ważną rolę w replikacji

wirusa. Hydrolizuje ona wiązania peptydowe w poliproteinach Pr55Gag

i Pr160Gag-Pol, w wyniku czego powstają pojedyncze białka. Poliproteiny

te znajdują się w uwolnionych z komórki, niedojrzałych wirionach.

2. Budowa proteazy wirusa HIV

Proteaza wirusa HIV (HIV-1 PR) jest enzymem, który należy do grupy

proteaz aspratylowych (EC 3.4.23.16). HIV-1 PR zbudowana jest z 99

aminokwasów i tworzy homodimer z pojedynczym centrum aktywnym

(Rys. 1). Pojedyncza podjednostka składa się z dziewięciu nici oraz

pojedynczej -helisy. Miejsce aktywne HIV-1 PR powstaje w szczelinie

pomiędzy obiema podjednostkami i charakteryzuje się typową dla proteaz

aspartylowych triadą katalityczną Asp-Thr-Gly.

1 Studenckie Koło Mikrobiologów „Bakcyl”, Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet

Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie 2 Studenckie Koło Mikrobiologów „Bakcyl”, Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie 3 [email protected], Studenckie Koło Mikrobiologów „Bakcyl”, Wydział Biologii

i Biotechnologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie

Martyna Paździor, Patrycja Horbowicz, Jakub Knurek

314

Rysunek 1. Budowa proteazy HIV-1 ze związanym inhibitorem kompetencyjnym – TL-3 [1]

Każdy monomer posiada powiększony region β-kartki antyrównoległej

(pętlę bogatą w glicynę), tzw. klapę, która odgrywa istotną rolę w wiązaniu

substratu, a także dwie reszty aspartylowe, Asp25 oraz Asp25’, kluczowe

dla aktywności proteolitycznej enzymu. Reszty alifatyczne umożliwiają

stabilizację hydrofobowego rdzenia HIV-1. Dodatkowo, dimer jest

stabilizowany przez niekowalencyjne oddziaływania hydrofobowe

łańcuchów bocznych oraz interakcje z udziałem reszt katalitycznych. Oba

monomery posiadają w swoim składzie dwie reszty cysteinowe, które

jednak nie tworzą wiązań dwusiarczkowych. W stanie wolnym klapy

przyjmują konformację półotwarte, zaś w momencie przyłączenia się

specyficznego ligandu do miejsca aktywnego, następuje przejście enzymu

do konformacji zamkniętej. Obecnie uznaje się, że dwa modele mogą być

używane do wytłumaczenia mechanizmu otwierania i zamykania klapy.

W pierwszym z nich po przyłączeniu się liganda powstaje kompleks

kolizyjny z HIV-1 i włączając się do centrum aktywnego wywołuje

zamknięcie klapy. Drugi z modeli zakłada powolną asocjację ligandu do

klapy, znajdującej się w półotwartej konformacji. Po przyłączeniu ulega

wejściu do miejsca aktywnego, czego konsekwencją jest zamknięcie

konformacyjne białka [1].

Aktywność proteazy jest niezbędna w procesie montowania

podzespołów wirusa HIV-1 w jedną, infekcyjną całość. Dokonuje ona

hydrolizy wiązań peptydowych w poliproteinach Pr55Gag

i Pr160Gag-Pol

.

Powstałe wolne białka formują dojrzały wirion. Ze względu na kluczową

rolę proteazy HIV-1 w cyklu infekcyjnym, jako strategię walki z HIV-1

przyjęto hamowanie aktywności enzymu przez specyficzne inhibitory [2].

Proteaza wirusa HIV – budowa, mechanizm działania, inhibitory

315

Aby jednak dokładnie zrozumieć znaczenie budowy HIV-1 PR, należy

dogłębnie poznać cykl życiowy wirusa HIV.

3. Cykl życiowy wirusa HIV

Wyróżniającą cechą wirusa HIV jest odwrotna transkrypcja

genomowego RNA na DNA przez enzym odwrotną transkryptazę. Reakcja

ta wymaga wcześniejszego związania białka gp120 do specyficznego

receptora wirusa – CD4 [3].

Rysunek 2. Cykl życiowy wirusa HIV [1].

Zanim jednak dojdzie do przepisania informacji genetycznej, dojrzały

wirion musi wniknąć do komórki. Dzieje się to na zasadzie adsorpcji i fuzji

cząstki wirusowej do błony zaatakowanej komórki. Po wejściu do komórki

HIV ulega odpłaszczeniu i wnika do jądra komórkowego, centralnego

organellum, którego zadaniem jest kierowanie pracą wszystkich

pozostałych kompartmetów komórkowych. Przepisanie wirusowego RNA

na ds-cDNA (ang. double stranded-complementary DNA) umożliwia jego

transport i integrację do genomu gospodarza, dzięki działaniu integrazy.

Preferencyjnymi miejscami integracji HIV w jądrowym DNA są regiony

hot spots oraz aktywne geny. Na tym stadium wirus może pozostać

w stanie uśpienia (latencji transkrypcyjnej) lub prezentować różny poziom


316

ekspresji białek, które następnie trzeba uaktywnić. Właśnie w tym procesie

główną rolę odgrywa proteaza HIV-1. Prekursor Gag zostaje rozcięty na

sześć podjednostek strukturalnych, zaś prekursorowa poliproteina Gag-Pol

na trzy białka, wykazujące aktywność katalityczną: odwrotną transkryptazę

(przepisującą wirusowe RNA na dsDNA), integrazę (włączającą przepisane

geny do genomu gospodarza) oraz proteazę (umożliwiającą wydajne

proteolityczne cięcie i dojrzewanie wirusa). Po złożeniu dojrzałego wirusa

HIV pączkuje on przez błonę komórki gospodarza. Istnieje wiele spekulacji

na temat tworzenia otoczek wirusowych przez HIV. Badania

fluorescencyjne pozwoliły potwierdzić występowanie otoczki na dojrzałych

wirionach, nie odnotowano zaś jej obecności na niedojrzałych cząstkach

wirusowych [5, 18].

Rysunek 3. Przekrój pokazujący asocjację przeciwciał do wirionu HIV. Wirus znajduje się w prawym dolnym rogu, a białka osocza krwi na górze i po lewej stronie. Możemy wyróżnić

przeciwciała bNAbs (ang. Broadly Neutralizing HIV-1 Antibodies) (A) związane z glikoproteinami

otoczki wirusa HIV (B), wirusowe białka matycy (C), kapsydu (D), odwrotnej transkryptazy (E),

integrafy (F), proteazy (G), Vif (H) [5].


317

Rysunek 4. Związanie wirusa HIV. Wirion znajduje się na górze zdjęcia, zaś jego dolną część

zajmuje atakowana komórka. Białko otoczki HIV łączy się poprzez glikoproteiny (A)

z receptorem CD4 (B), a następnie z koreceptorem CCR5 (C), co powoduje zmianę konformacji

peptydów fuzyjnych i umożliwia wniknięcie wirionu do wnętrza komórki [5].

Rysunek 5. Odwrotna transkrypcja wirusa HIV. Po wejściu kapsydu z wirusem do komórki

odwrotna transkryptaza (A) tworzy kopię cDNA (nić zielona) z RNA HIV (nić żółta),

wykorzystując primery RNA znajdujące się w cytozolu (B). Białko nukleokapsydu (C) działa jak białko opiekuńcze (chaperon), rozkładając drugorzędową strukturę RNA. Aktywność

rybonukleazowa odwrotnej transkryptazy pozwala na usunięcie wirusowego RNA po syntezie

DNA. Zobrazowana jest także interakcja między wirusowym białkiem Vif (D), a białkiem

gospodarza APOBEC (E) [5].


318

Rysunek 6. Integracja wirusa HIV do genomu gospodarza. Po odpłaszczeniu z kapsydu

(pokazanym na górze) i interakcji z białkami porów jądrowych (koloru fioletowego), jak

np. Nup358 (A), uwolniony wirusowy cDNA (B) wprowadzany jest przez rdzeń do nukleopazmy. Następnie zostaje on wstawiony do genomu przez enzym integrafy HIV (C).

Białko komórkowe LEDGF (D) jest ważnym czynnikiem decydującym o miejscu integracji

DNA w nukleosomach (E) [5].

Rysunek 7. Transkrypcja genów wirusa HIV. Wirusowe białko Tat (A), tworzące strukturę

łodyżka-pętla (ang. stem-loop) TAR RNA, wiąże się z kompleksem P-TEFb (B), aktywując

elongację przez polimerazę RNA (C). Zobrazowana jest także interakcja czynnika HIV Rev (D) z CRM1 (E), białko zaangażowane w transport przez pory [5]


319

Rysunek 8. Translacja wirusa HIV. Poliproteina Gag (A) ulega translacji z genomu HIV (koloru

żółtego) przez rybosomy komórkowe (B). Struktura pętli macierzystych w genomie (C) powoduje

przesunięcie ramki o ok. 5% czasu, dzięki czemu powstają dłuższe białka Gag-Pol (D) [5]

Rysunek 9. Pączkowanie wirusa HIV. Białka Gag (A) i Gag-Pol (B) tworzą błonę na powierzchni

komórki, a pochłaniając dwie kopie genomu wirusowego (koloru żółtego), które dimeryzują w określonej kolejności (C), wiążą się z trasferowym RNA gospodarza (D), który działa jako starter

do odwrotnej transkrypcji. Białka wirusowe Vpr (E) i Vif (F) są w nią również włączone. Kilka

typów białek systemu ESCRT (G) jest zaangażowane w proces pączkowania [5]


320

Rysunek 10. Dojrzewanie wirusa HIV. W prawym dolnym rogu znajduje się niedojrzały wirion,

który poddaje się działaniu proteazy (A), zaś w lewym górnym rogu możemy obserwować

dojrzałą formę wirionu po proteolitycznym rozkładzie białek Gag i Gag-Pol [5]

4. Mechanizm działania proteazy wirusa HIV

Mechanizm działania proteazy HIV (proteazy HIV-1), zwanej także

retropepsyną, przez lata pozostawał zagadką. Pojawiło się wiele teorii,

które różnią się między innymi ilością etapów, jak również rodzajem

cząstek pośrednich. Badanie homologii sekwencji HIV-1 PR pozwoliło

ustalić, że proteaza ta należy do klasy proteaz aspartylowych (MEROPS).

Wykorzystując między innymi metody kinetyczne czy krystalografię

rentgenowską opracowano kilka potencjalnych mechanizmów.


321

Rysunek 11. Mechanizm działania HIV-1 PR z uwzględnieniem pośrednika tetraedralnego

Najpowszechniejszy – kwasowy mechanizm został opisany przez

profesora biofizyki molekularnej K. Suguna. Zakładał on, że centrum

aktywne proteazy usytuowane jest pomiędzy dwiema identycznymi

podjednostkami. Znajduje się w nim charakterystyczny dla proteaz

aspartylowych układ aminokwasów Asp-Thr-Gly (Asp25, Thr26, Gly27)

[6]. Ważną rolę w reakcjach katalitycznych pełnią dwie reszty kwasu

asparaginowego: Asp25, znajdująca się na jednej podjednostce i Asp25’,

zlokalizowana na drugiej. Ujemnie naładowane Asp25 i Asp25’ znajdują

się najbliżej cząsteczki nukleofila, którym jest woda, i powodują jego

aktywację. Aktywowana cząsteczka wody atakuje grupę karbonylową

docelowego substratu i powoduje powstanie oksyanionowego pośrednika

tetraedralnego [7]. Uprotonowanie atomu azotu w grupie amidowej

polipeptydu prowadzi do przegrupowania pośrednika tetraedralnego do

produktu hydrolizy (rys.11).

W 1991 roku, polski naukowiec, Mariusz Jaskólski wraz z współ-

pracownikami zaproponował w oparciu o badania krystalograficzne

jednostopniowy mechanizm działania proteazy wirusa HIV. Mechanizm

ten opiera się na skoordynowanym ataku nukleofila (cząsteczki wody)

i elektrofila na docelowe wiązanie peptydowe w polipeptydzie [8].

Związkami docelowymi proteazy są prekursory białek wirusowych Gag

i GagPol (MEROPS). Na matrycy Gag kodowane są wszystkie białka

strukturalne, białka matriksowe (p17,MA), białka kapsydu (p24, CA),

nukleokapsydu (p7, NC), a także białka p6, p2 (SP1) i p1 (SP2).

Poliproteina GagPol koduje MA, CA, p2, NC, białka TFP, wirusowe

proteazy, odwrotną transkryptazę i integrazę. Dokładny mechanizm


322

aktywacji proteazy po przyłączeniu się do białek Gag i GagPol nie jest

dokładnie poznany. Uważa się jednak, że wymagana jest dimeryzacja

białek prekursorowych GagPol. Proteaza HIV-1 rozpoznaje asymetryczne

elementy w substracie peptydowym, dlatego też sekwencje aminokwasowe

w miejscach cięcia różnią się między sobą. Białka przeznaczone do

proteolitycznej obróbki składają się z nakładających się na siebie struktur

drugorzędowych i tworzą charakterystyczną „kopertę”, która wpasowuje

się do regionu odpowiedzialnego za wiązanie substratu. Istnieje jednak

kilka różnic w miejscach cięcia substratu, w których łańcuchy boczne

aminokwasów wystają poza granicę „koperty”. Różnice te są istotne

w procesie cięcia, dzięki nim wszystkie cięcia zachodzą z różną prędkością

i wykazują się większą specyficznością [6].

Rysunek 12. A) Organizacja genomu Proteazy HIV-1 i polipeptydów Gag i GagPol B) Cięcia

proteolityczne

Pierwsze rozszczepienie zachodzi na końcu C-terminalnym białka p2

(MA-CA-p2↓NC-p1-p6), następne oddzielają MA od CA-p2 (MA↓CA-p2)

oraz NC-p1 od p6 (NC-p1↓p6). Oddzielenie małego białka separującego p2

(CA↓p2) i p1 (NC↓p1) zachodzą jako ostatnie (rys.2). Rozszczepianie

wydaje się być regulowane przez sekwencję aminokwasowe, które znajdują

się w pobliżu proteazowego miejsca cięcia [18]. Udowodniono, że zarówno

sekwencja substratu w pozycji p4-p3’ znajdująca się w bezpośrednim

kontakcie z proteazą, jak i oddalona sekwencja w pozycji p4’ i p5’


323

wpływają na sposób jej działania. Proteaza wirusowa tnie dwa

prekursorowe białka i akumuluje je w cytoplazmie w pobliżu błony

komórkowej. Proces ten zachodzi w trakcie lub krótko po uwolnieniu

dojrzałych, potomnych cząstek wirusa z komórki gospodarza. Wynika

z tego, że proteaza wirusa HIV-1 nie jest wymagana w procesie replikacji

i uwalniania wirusa, lecz odgrywa istotną rolę w procesie dojrzewania

infekcyjnych cząstek wirusa [6].

5. Inhibitory proteazy wirusa HIV

Szczegółowa wiedza na temat struktury proteazy HIV oraz jej substratu

umożliwiła opracowanie specyficznych inhibitorów. Wiążą się one

do wirusowej proteazy z wysokim powinowactwem, ale zazwyczaj zajmują

większą część centrum aktywnego niż naturalne substraty [15]. Obecnie do

użycia klinicznego dopuszczone jest 9 inhibitorów HIV-1: saquinavir,

ritonavir, indinavir, nelfinavir, amprenavir, lopinavir, atazanavir, tipranavir

oraz darunavir [13,17]. Większość z nich jest przepisywana w połączeniu

z niską dawką ritonaviru, który ma wzmocnić skuteczność innych

inhibitorów w organizmie pacjenta. Ritonavir jest silnym inhibitorem

CYP3A4, dzięki czemu zwiększa cytoplazmatyczne stężenie innych

inhibitorów proteazy HIV, które są degradowane in vivo przez CYP3A4

[12,14]. Wszystkie wymienione inhibitory (z wyjątkiem tipranaviru) są

inhibitorami pierwszej generacji – kompetycyjnymi inhibitorami

peptydomimetycznymi, naśladującymi naturalny substrat wirusowej

proteazy. Rdzeń inhibitora stanowi związek izosteryczny wobec miejsca

cięcia proteolitycznego. W komercyjnie dostępnych lekach oraz w kilku

inhibitorach, które obecnie są poddawane testom klinicznym, głównym

składnikiem jest nieulegający hydrolizie hydroksyetylen lub cząsteczka

hydroksyetylaminy. W strukturze krystalicznej HIV-1 PR w kompleksie

z tymi inhibitorami centralna grupa hydroksylowa rdzenia lokalizuje się

pomiędzy Asp25 i Asp25’, co sprzyja interakcjom elektrostatycznym [6].

Wprowadzenie inhibitorów proteazy HIV-1 do tzw. terapii HAART

(highly active antiretroviral therapy) pod koniec 1995 roku stanowiło

kluczowy moment w walce z HIV/AIDS. Terapia ta, łącząca inhibitory

HIV PR z inhibitorami odwrotnej transkryptazy, powodowała znaczne

zmniejszenie miana wirusa oraz wzrost ilości limfocytów CD4+

u pacjentów zainfekowanych HIV-1, a także zahamowanie rozwoju AIDS

[15]. Pojawienie się terapii HAART spowodowało znaczący spadek

zachorowalności i śmiertelności w USA oraz innych krajach rozwiniętych.

Pomimo tak fenomenalnego progresu od momentu pierwszego pojawienia

się HIV/AIDS około 30 lat temu, efektywna terapia długoterminowa

pozostaje kwestią bardzo skomplikowaną. Kliniczne wykorzystanie


324

inhibitorów HIV PR jest ograniczone przez ich wysoką cenę oraz problemy

z tolerancją leczenia, toksycznością oraz adherencją. Przed

wprowadzeniem do użycia klinicznego pierwszego inhibitora panowały

optymistyczne przypuszczenia, że toksyczność tej klasy wirostatyków

będzie niższa ze względu na brak enzymów podobnych do HIV PR

w ludzkim organizmie. Niestety, bardzo szybko okazało się, że związki te

mogą wchodzić w interakcję z innymi cząsteczkami, zwłaszcza na szlaku

metabolizmu i dystrybucji lipidów. W konsekwencji efekty uboczne PI są

bardzo częste i bywają na tyle poważne, że toksyczność leczenia może

stanowić czasami większe ryzyko dla zdrowia pacjenta niż sama infekcja

wirusem HIV [11]. Patogeneza niektórych efektów ubocznych stosowania

inhibitorów HIV PR została szczegółowo wyjaśniona (np. kamica nerkowa

powodowana przez indinavir), jednak mechanizm patogenetyczny licznych

działań niepożądanych (np. lipodystrofia, insulinooporność, zahamowanie

pobierania glukozy czy zaburzenia metabolizmu kości) nie został

dotychczas dokładnie poznany [10].

Prawdopodobnie najpoważniejszym ograniczeniem inhibitorów proteazy

HIV pierwszej generacji jest szybkie rozwijanie się lekooporności. Wysoki

wskaźnik mutacji spowodowanych brakiem aktywności naprawczej

odwrotnej transkryptazy, dynamiczna replikacja wirusa u pacjentów HIV-

pozytywnych w połączeniu z niewystarczającym działaniem leków

prowadzi do szybkiej selekcji szczepów opornych na obecnie stosowane

inhibitory. Wirus HIV nabywa oporność przez nagromadzanie się mutacji

w genach kodujących proteazę, co prowadzi do zmniejszenia

powinowactwa do inhibitorów bez osłabiania interakcji z naturalnym

substratem. Mutacje mogą pojawiać się nie tylko w miejscu wiązania

substratu w bezpośrednim sąsiedztwie inhibitora, ale także poza centrum

aktywnym enzymu. Oprócz głównego mechanizmu substytucji

aminokwasowej obserwuje się również selekcję mutacji insercyjnych w PR

podczas terapii antyretrowirusowej. Co więcej, HIV pod naciskiem

selekcyjnym PI może zmienić substrat proteazy, np. zmieniając miejsce

cięcia w poliproteinie [10].

Inhibitory HIV PR drugiej generacji – darunavir i tipranavir – są

obecnie wykorzystywane u pacjentów, u których więcej niż jedna terapia

antyretrowirusowa przy udziale innych inhibitorów zakończyła się

niepowodzeniem (darunavir) lub u chorych, u których rozwinęła się

oporność na inhibitory pierwszorzędowe (tipranavir). Tipranavir został

dopuszczony do użycia klinicznego w 2005 r., natomiast darunavir w 2007

r. [9] Darunavir wykazuje podobieństwo strukturalne do amprenaviru,

podczas gdy tipranavir ma strukturę całkowicie odmienną od innych

inhibitorów - zamiast peptydomimetycznego rdzenia hydroksyetylenowego


325

zawiera pierścień dihydropironowy [8]. Większość izolatów klinicznych

jest wrażliwych zarówno na tipranavir, jak i na darunavir [9].

Pomimo niepodważalnego sukcesu HAART i korzyści dla pacjentów,

nowe podejście do leczenia przeciwwirusowego, włączając w to nowe

inhibitory HIV PR, są wysoce pożądane, aby osiągnąć lepszą kontrolę nad

infekcjami HIV z zachowaniem akceptowalnej jakości życia pacjenta.

Nowe PI powinny posiadać szeroką specyficzność przeciwko opornym

mutantom wirusa HIV, lepsze właściwości farmakokinetyczne, niższą

toksyczność i proste dawkowanie.

6. Podsumowanie

Przedstawiony przez nas artykuł przybliżył pokrótce budowę,

mechanizm działania oraz inhibitory proteazy HIV. Wirus atakuje przede

wszystkim komórki CD4 układu immunologicznego. Cykl życiowy, jaki

wirus przechodzi w komórkach gospodarza jest bardzo specyficzny. Jego

zrozumienie pozwala zagłębić się w badania, umożliwiające dokładniejsze

poznanie procesów, zachodzących w komórkach, które odpowiadają za

mechanizm choroby. Wprowadzenie do terapii inhibitorów proteazy HIV

spowodowało przełom w leczeniu osób zakażonych HIV. Równoczesne

stosowanie różnych leków antyretrowirusowych, najczęściej dwóch

nukleozydowych inhibitorów odwrotnej transkryptazy i jednego inhibitora

proteazy sprawiło, że osoby, u których rozpoznano już AIDS wracały do

zdrowia, a pacjenci, u których leczenie rozpoczęto w bezobjawowym

stadium znacznie rzadziej chorowały na schorzenia związane z zakażeniem

HIV. Prawdopodobnie najpoważniejszym ograniczeniem inhibitorów

proteazy HIV pierwszej generacji jest szybkie rozwijanie się lekooporności.

Literatura

1. Yang H., Nkeze J., Zhao R. Y., Effects of HIV-1 protease on cellular functions

and their potential applications in antiretroviral therapy, Cell & Bioscience,

2 (2012), 32, DOI: 10.1186/2045-3701-2-32

2. Keraman K., Mahmoud K. A., Kraatz H., An electrochemial approach for the

detection of HIV-1 protease, Chemical Communications, 37 (2007), s. 3829-

3831 DOI: 10.1039/B707140J

3. Hauser S. L., Josephson S. A., Harrison – Neurologia w medycynie klinicznej,

Wydawnictwo Czelej, Lublin, tom I, (2012), s. 558-560, ISBN: 978-83-7563-

189-0

4. Chojnacki J., Staudt T., Glass B., Bingen P., Engelhardt J., Anders M.,

Schneider J., Muller B., Hell S. W., Krausslich H. G., Maturation-dependent

HIV-1 surface protein redistribution revealed by fluorescence nanoscopy,

Science, 338 (2012), s. 524-528, DOI: 10.1126/science.1226359


326

5. Torbett B. E., Goodsell D. S., Richman D. D., Illustrations of the HIV Life

Cycle [w:] The Future of HIV-1 Therapeutics, Springer International

Publishing, (2015), s. 243-252, ISBN: 978-3-319-18517-0

6. Wensing A. M., Van Maarseveen N. M., Nijhuis M., Fifteen years of HIV

Protease Inhibitors: raising the barrier to resistance, Antiviral Research,

85 (2010), s. 59-74

7. Winters M. A., Merigan T. C., Insertions in the human immunodeficiency

virus type 1 protease and reverse transcriptase genes: clinical impact and

molecular mechanisms, Antimicrobial Agents Chemotheraphy, 49 (2005),

s. 2575-2582

8. Wlodawer A., Miller M., Jaskólski M., Sathyanarayana B. K., Baldwin E.,

Weber I. T., Selk L. M., Clawson J., Schneider J., Kent S. B., Conserved

folding in retroviral proteases: crystal structure of a synthetic HIV-1 protease,

Science, 245 (1989), s. 616-621

9. Hughes A., Barber T., Nelson M., New treatment options for HIV salvage

patients: An overview of second generation PIs, NNRTIs, integrase inhibitors

and CCR5 antagonists, Journal of Infection 57 (2008), 1-10

10. Pokorná J., Machala L., Řezáčová P., Konvalinka J., Current And Novel

Inhibitors of HIV Protease, Viruses 1 (2009), 1209-1239

11. Ghosh A. K., Aspartic Acid Proteases as Therapeutic Targets, Volume 45

(2011), ISBN: 978-3-527-64162-2

12. Ernest II Steven C., Hall Stephen D., Jones David R., Mechanism-Based

Inactivation of CYP3A by HIV Protease Inhibitor, Journal of Pharmacology

and Experimental Therapeutics, Volume 312 no.2 (2005), s. 583-591

13. Gills J. J., LoPiccola J., Tsurutani J., Shoemaker R.H., Best C. J.M., Abu-Asab

M. S., Borojerdi J., Warfel N. A., Gardner E. R., Danish M., Hollander M. C.,

Kawabata S., Tsokos M., Figg W. D., Steeg P. S., Dennis P. A., Nelfinavir,

A Lead HIV Protease Inhibitor, Is a Broad-Spectrum, Anticancer Agent that

Induces Endoplasmic Reticulum Stress, Autophagy, and Apoptosis In vitro

and In vivo, Clinical Cancer Research 13 (2007), 5183

14. Kirby Brian J., Collier Ann C., Kharasch Evan D., Whittington Dale,

Thummel Kenneth E., Unadkat Jashvant D., Complec Drug Interactions

of HIV Protease Inhibitors 1: Inactivation, Induction, and Inhibition

of Cytochrome P450 3A by Ritonavir or Nelfinavir, Drug Metabolism

& Disposition, Volume 39 no.6 (2011), s. 1070-1078

15. Mahungu T. W., Johnson M. A., Owen A., Back D. J., The impact

of pharmacogenetics on HIV therapy, International Journal of STD & AIDS,

Volume 20 no.3 (2009), s. 145-151

16. Cohen M.S., Chen Y., McCauley M., Gamble T., Hosseinipour M. C.,

Kumarasamy N., Hakim J. G., Kumwenda J., Grinsztejn B., Pilotto J. H.S.,

Godbole S.V., Mehendale S., Chariyalertsak S., Santos B. R., Mayer K. H.,

Hoffman I. F., Eshleman S. H., Piwowar-Manning E., Wang L., Makhema J.,

Mills L. A., de Bruyn G., Sanne I., Eron J., Gallant J., Havlir D., Swindells S.,

Ribaudo H., Elharrar V., Burns D., Taha T. E., Nielsen-Saines K., Celentano

D., Essex M., Fleming T. R., Prevention of HIV-1 Infection with Early


327

Antiretroviral Therapy, The New England Journal of Medicine ,Volume 365

(2011), s.493-505

17. Winek K., Sikora A., Mikuła T., Postępy w leczeniu zakażenia HIV, Postępy

Nauk Medycznych, Volume 10 (2010), s. 800-804

18. Watts J. M., Dang K. K., Gorelick R. J., Leonard C. W., Bess J. W. Jr., Swanstrom

R., Burch C. L., Weeks K. M., Architecture and secondary structure an entire

HIV-1 RNA genome, Nature, Volume 460 (2009), s. 711-716


Streszczenie

Omawiana w tej pracy proteaza wirusa HIV należy do rodziny proteaz aspartylowych. Jest

ona 99-aminokwasowym homodimerem z pojedynczym centrum aktywnym. Każdy

monomer posiada powiększony region β-kartki (pętlę bogatą w glicynę), tzw. klapę, która

odgrywa istotną rolę w wiązaniu substratu, a także dwie reszty aspartylowe, Asp25 Asp25’,

kluczowe dla aktywności proteolitycznej enzymu. Badanie homologii sekwencji HIV PR

z innymi komórkowymi proteazami aspartylowymi wykazało, że enzym ten posiada

sekwencję Asp-Thr-Gly , która jest sekwencją konserwatywną proteaz aspartylowych. Przynależność HIV PR do rodziny proteaz aspartylowych potwierdza także inhibicja tego

enzymu in vitro przez pepstatynę, naturalny produkt, który selektywnie hamuje aktywność

enzymów tej grupy. Struktura dimeryczna, w której każdy monomer zawiera jedną triadę

Asp-Thr-Gly w pseudo-symetrycznym centrum aktywnym wykazuje, że centrum aktywne HIV PR jest nie do odróżnienia z centrum aktywnym monomerycznych proteaz

aspartylowych. Mechanizm HIV PR jest bardzo podobny do mechanizmu działania innych

proteaz aspartylowych, jednak nie został on jak dotąd dokładnie zbadany. Mechanizm ten

zakłada, że reakcja hydrolizy jest jednoetapowym procesem, w którym nukleofilowa cząsteczka wody oraz kation wodorowy wspólnie atakują wiązanie peptydowe; jednoczesny

atak nukleofila i elektrofila jest główną różnicą pomiędzy tym podejściem a dotych-

czasowymi hipotezami.

HIV protease – its structure, mechanism, inhibitors

Abstract

HIV PR discussed in this work belongs to a group of aspartic proteases. It is a 99 amino acid homodimer with one active site. Each monomer has an extended β-sheet region (a glycine-

rich loop), the flap, which plays a meaningful role in binding of substrate. There are also

two aspartyl residues, Asp25 and Asp25’ in each monomer, which are essential for

proteolytic activity of PR. Examining a sequence homology of HIV protease and other cellular aspartic proteases demonstrates that this enzyme has the sequence Asp-Thr-Gly,

which is conserved among the aspartic protease enzymes. The proof that HIV PR belongs to

the aspartic proteases group is also in vitro inhibition of this enzyme by pepstatin, a natural

product selectively inhibiting members of this group. The dimeric structure in which each monomer contributes one Asp-Thr-Gly triad to the pseudo-symmetric active site that

is indistinguishable from those of the monomeric aspartic proteases. HIV PR mechanism

is very similar to other proteases’ mechanisms, however it is not fully examined. The

mechanism assumes that hydrolysis is a one-stage process, in which nucleophilic water molecule and hydrogen cation attack a peptide bond; simultaneous attack is the main

difference between this approach and other hypotheses so far.

328

Indeks autorów

Andrzejczak O. .................................................................................................. 59

Banyś A. ............................................................................................................ 83

Baran M. ............................................................................................................ 99

Białkowska A. ................................................................................................. 185

Bossowska M. ........................................................................................... 51, 242

Chibowski E. ................................................................................................... 169

Chojnacki M. ..................................................................................................... 20

Dudka K. ........................................................................................................... 99

Ginalska G. ...................................................................................................... 287

Horbowicz P. ................................................................................................... 313

Janocha A. ....................................................................................................... 136

Jurak M. ................................................................................................... 169, 205

Kalisio R. ......................................................................................................... 205

Karpik E............................................................................................................. 99

Karwowska Z. ..................................................................................................... 7

Knurek J........................................................................................................... 313

Kopik N. .......................................................................................................... 145

Kowalczyk I. ................................................................................................... 250

Krysiak J. ......................................................................................................... 185

Łopusiewicz Ł. ................................................................................................ 230

Łuczak D. ........................................................................................................ 136

Majchrzak K. ....................................................................................................... 7

Margas M. ....................................................................................................... 154

Mielcarska M. ............................................................................................ 51, 242

Misiorek M. ....................................................................................................... 37

Ostróżka-Cieślik A. ........................................................................................... 83

Owsiak A. .......................................................................................................... 37

Paradowska K. ................................................................................................. 287

Paździor M. ..................................................................................................... 313

Pięt M. ............................................................................................................... 20

Rydzyński D. ..................................................................................................... 73

Sarecka-Hujar B. ............................................................................................... 83

Szulczewska K. M. .......................................................................................... 185

Wiącek A. E. ........................................................................................... 169, 205

Zając A. ............................................................................................................. 20

Żelazowski P. .................................................................................................. 125

Żyracka E........................................................................................................... 37