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Volumen 5, Número 2. Abril-Junio 2014

Título del artículo.

Pseudomonas sp productoras de biosurfactantes

Título del artículo en idioma Inglés.

Pseudomonas sp producing biosurfactants

Autores.

Jeiry Toribio-Jiménez Juan Carlos Velázquez Aradillas Yanet Romero Ramírez Miguel Ángel Rodríguez Barrera José Daniel Chávez González Joseph Guevara Luna José Luis Aguirre Noyola Arely Fierro Torres

Referencia bibliográfica:

MLA

Toribio-Jiménez, Jeiry, Juan Carlos Velázquez Aradillas, Yanet Romero Ramírez, Miguel Ángel Rodríguez Barrera, José Daniel Chávez González, Joseph Guevara Luna, José Luis Aguirre Noyola y Arely Fierro Torres. " Pseudomonas sp productoras de biosurfactantes.” Tlamati. 5.2 (2014): 66-82. Print.

APA

Toribio-Jiménez, J., Velázquez-Aradillas, J. C., Romero-Ramírez, Y., Rodríguez-Barrera, M. A. Chávez-González, J. D., Guevara-Luna, J. , Aguirre-Noyola, J. L., Fierro-Torres, A. (2014). Pseudomonas sp

productoras de biosurfactantes. Tlamati, 5(2), 66-82.

ISSN: 2007-2066.

Publicado el 29 de Junio del 2014.

© 2014 Universidad Autónoma de Guerrero

Dirección General de Posgrado e Investigación

Dirección de Investigación

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TLAMATI, es una publicación trimestral de la Dirección de Investigación de la Universidad Autónoma de Guerrero. El contenido de los artículos es responsabilidad exclusiva de los autores y no refleja de manera alguna el punto de vista de la Dirección de Investigación de la UAG. Se autoriza la reproducción total o parcial de los artículos previa cita de nuestra publicación.

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Como citar el artículo: Toribio-Jiménez, J., Velázquez-Aradillas, J. C., Romero-Ramírez, Y., Rodríguez-Barrera, M. A. Chávez-González, J. D., Guevara-Luna, J. , Aguirre-Noyola, J. L., Fierro-Torres, A. (2014). Pseudomonas sp productoras de biosurfactantes. Tlamati, 5(2), 66-82

Pseudomonas sp productoras de biosurfactantes

Jeiry Toribio-Jiménez1* Juan Carlos Velázquez Aradillas2

Yanet Romero Ramírez1

Miguel Ángel Rodríguez Barrera1

José Daniel Chávez González1

Joseph Guevara Luna1

José Luis Aguirre Noyola1

1Unidad Académica de Ciencias Químico-Biológicas, Laboratorio de Investigación en Biotecnología y Genética

Microbiana, Universidad Autónoma de Guerrero. Av. Lázara Cárdenas s/n, Ciudad Universitaria Sur.

Chilpancingo, Gro. Teléfono: (+52) 747 4725503 Chilpancingo, Gro. México 2Posgrado en Diseño de Bioprocesos, Universidad Politecnica de Puebla., Puebla.

3Preparatoria No. 1., Universidad Autónoma de Guerrero., Chilpancingo, Gro.

*Autor de correspondencia

Resumen

Los biosurfactantes (BS) son moléculas anfifílicas de origen biológico con propiedades similares a los surfactantes sintéticos, es decir, con capacidad de reducir la tensión superficial del agua en la interface y llegan a formar estructu-ras agregadas denominadas micelas. Existe una gran diversidad de BS en la naturaleza, de los cuales se destacan los producidos por el género Pseudomonas sp. Este grupo de bacterias tienen la capacidad de sintetizar diferentes tipos de biosurfactantes. Se han aislado y reportado diversas especies de Pseudomonas sp en diversos nichos ecológicos con la capacidad de producir BS, los más producidos por este género son los glicolípidos y los lipopéptidos cíclicos (CLP´s), entre otros. Es por ello que en este trabajo se presenta una revisión actualizada sobre la producción, biosíntesis, méto-dos de obtención, purificación y usos potenciales de los biosurfactantes producidos por las diferentes especies del gé-nero Pseudomonas.

Palabras claves: biosurfactantes, Pseudomonas sp, producción y regulación

Abstract

Biosurfactants are amphiphilic molecules from biological origin with similar properties as the synthetic surfactants with the capacity of reducing surface tension from water at the interface and they are able to form structures of aggre-gation called micelles. A wide diversity of biosurfactants (BS) are found in nature. From this diversity, Pseudomonas

sp. genre are highlighted as a producer of BS. This group of bacteria has the capacity of synthesize different types of biosurfactants. Different Pseudomonas sp. species has been isolated from different ecological niches. Glicolypids and cyclic lipopeptides (CLP) among others, are produced by these genra. This is a review about production, biosynthesis, extraction and purification methods, and potential uses of produced biosurfactants from different species from Pseudo-

monas.

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Introducción

Los biosurfactantes son moléculas anfifílicas de origen biológico con propiedades similares a los surfactantes sin-téticos, es decir, con capacidad de reducir la tensión super-ficial del agua en la interface y a concentraciones mayores a la concentración micelar crítica producen agregados de-nominados micelas (Rosen, 2004). Debido a estas propie-dades, las moléculas de los biosurfactantes se ubican en la interface de fluidos como son los sistemas aceite-agua y aire-agua (Stoyanov, Rehage y Paunov, 2003). Además, la presencia de biosurfactantes en un medio acuoso favorece la solubilidad y la biodisponibilidad de compuestos orgáni-cos, siendo ésta una de sus principales propiedades para su aplicación en el área de la biotecnología ambiental en el campo de la biodegradación de contaminantes (Liu, Laha y Luthy, 1991). Además se ha reportado también que poseen actividad antibacterial, anti-fúngica, anti-tumoral, anti-micoplasmica y anti-������ ������ � ��� ������ ������

Singh y Cameotra, 2004). Son producidos extracelular-mente o forman parte de la membrana celular de una am-plia variedad de microorganismos (bacterias, hongos y levaduras) (Gautam y Tyagi, 2006, Rhaman et al., 2009) mostrando una amplia variedad en su estructura química, entre las cuales destacan los glicolípidos, lipopéptidos, lipoproteínas, ácidos grasos, fosfolípidos, lípidos particula-dos y poliméricos (Lang, 2002., Mulligan, 2009). Los bio-surfactantes difieren de los surfactantes químicos ( general-mente derivados del petróleo) por su baja toxicidad, pre-sentan mayor compatibilidad con el ambiente y son alta-mente específicos en su acción (Nitschke, Costa, Haddad, Gonçalves, Eberlin y Conteiro., 2005ab., Gautam y Tiagy, 2006, Mukherjee, Das y Sen, 2006). Varios de los biosur-factantes como los ramnolípidos presentan carga de tipo aniónica o neutra, y muy pocos presentan carga catiónica. Tal es el caso de los que poseen en su estructura química grupos amino (Mulligan, 2009). Los BS pueden ser produ-cidos usando una amplia variedad de materiales a bajo cos-to o materias primas de residuos agroindustriales, son esta-bles en condiciones extremas de temperatura, pH y salini-dad a diferencia de los sintetizados químicamente (Jiménez, 2010). El interés en los biosurfactantes se ha incrementado considerablemente en años recientes por sus potenciales aplicaciones en la industria y en la remediación de sitios contaminados. Por ello, el registro en el número de patentes internacionales para la aplicación de bio-tensoactivos en los sectores de alimentos, limpieza domés-tica, cosméticos, recuperación de crudo, remediación de suelos y aplicaciones en agricultura, crece de manera signi-ficativa año con año (Abdel-Mawgoud et al., 2010). No obstante, uno de los factores que limita la comercialización de biosurfactantes en algunos casos, son los costos eleva-dos de los sustratos, del proceso de producción y purifica-ción, y baja productividad de las especies microbianas uti-lizadas, lo que limita su producción en gran escala (Jiménez, 2010). Por esta razón, las investigaciones recien-tes se han enfocado tanto a la optimización de los procesos

de producción como a la búsqueda de sustratos económi-cos, con la finalidad de incrementar la rentabilidad de su producción a nivel comercial (Mukherjee et al., 2006).

Existe una amplia variedad de microorganismos que tienen la capacidad de producir biosurfactantes, entre éstos destaca el género Pseudomonas. Este es uno de los más grupos bacterianos más diversos, y su taxonomía ha sufri-do varios cambios desde su descripción temprana (Palleroni, 1984). Los miembros de este género son sensu

stricto al grupo I RNA, dentro del grupo de las Gamma

proteobacterias (Mulet, Lalucat y García-Valdés, 2010). Se han reportado diversas especies de este género con ca-pacidad de producir biosurfactantes y sus diversas aplica-ciones biotecnológicas. Es por ello que en este capítulo se plantea un panorama actual de las Pseudomonas sp como productoras de biosurfactantes, sus propiedades, condicio-nes de producción, biosíntesis, estructura química y sus aplicaciones biológicas, con la finalidad de ofrecer una revisión actualizada de los diferentes biosurfactantes pro-ducidos por este género.

Especies de pseudomonas productoras de biosurfactantes:

Las especies de Pseudomonas forman un gran grupo de bacterias productoras de BS. Muchos de los aislamientos de Pseudomonas han sido reportados por su capacidad de producir glicolípidos, especialmente ramnolípidos. Ade-más se han reportado cepas de Pseudomonas, como Pseu-

domonas sp (Lim et al., ���������������D'aes et al., 2011)con capacidad de producir artrofactina del grupo de los lipopéptidos (Lim et al., ������������� ����., 2010), biosur-PM, producido por P. maltophila (Phale et al., 1995), corrugatina producido por P. corrugate (Risse et al., 1998), lipopéptidos cíclicos (Janek et al., ����� Rokni-zadeh et al., 2012), lipodepsipéptidos (Laycock et al., 1999, Monti et al., 2001), biosurfactantes particulados pro-ducidos por Pseudomonas sp (Burd and Ward, 1997), pseudomicina A producida por P. syringae MSU 16H (Coiro et al., 1998). Otros de ellos incluyen a la viscosina y el depsipéptido viscosinamina producida por P. fluores-

cens DR54 (Rokni-zadeh et al., ������ Alsohim et al., 2014), putisolvina I y II producidos por P. putida

PCL1445 (Kruijit et al., ������Rokni-zadeh et al., 2013), polipeptina (Ui et al., 1997), siringomicina y siringopepti-na producidas por P. syringae pv. syringae B301D (Burch et al., 2014), amphisina producida por Pseudomonas spDSS73 (Sørensen et al., 2001, Koch et al., 2002), lokisina producida por P. koreensis 2.74 (Hultberg et al., 2010) y entolisina producida por P. entomophila (Vallet-Gely et al., 2010). La producción de surfactina, fenhicina y liche-nisnina se reportó en una cepa de Pseudomonas sp WJ6 (Xia et al., 2014). A continuación se describe una breve discusión de los tipos de biosurfactantes producidos por las diferentes especies de Pseudomonas.

Ramnolípidos producidos por Pseudomonas sp.

Diversas especies de Pseudomonas destacan por su capacidad para producir ramnolípidos (Maier y Soberón-

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���� ���������Abdel-��� �!�� ����"��������Muller et al.,2012). Los primeros en reportar la estructura de un glicolí-pido de tipo ramnolípido fueron Bergström et al. (1946), sintetizado por P. pyocyanea (ahora P. aeruginosa), con-formado por ramnosa y ácido #-hidroxidecanoico. Tres años después, Jarvis y Johnson (1949), empleando medios de cultivo con 3% de glicerol, también aislaron al biosur-factante ramnolípido producido por P. aeruginosa, y deter-minaron que estos compuestos estaban formados por un glucósido de #-hidroxidecanoil-#-hidroxidecanoato y dos moléculas de ramnosa. Cabe mencionar que antes de eluci-dar con certeza la estructura de los ramnolípidos, en la década de 1950 ya eran usados en procesos de biorreme-diación de suelos contaminados con aceites y metales pe-sados (Hemminger, 2005).

La primera estructura claramente elucidada de los ramnolípidos fue encontrada por Edwards y Hayashi (1965), quienes demostraron la unión glicosídica del disa-cárido de ramnosa al #-hidroxidecanoil-#-hidroxidecanoato y cuya estructura se ha denominado co-mo R2 (véase figura 1). Esta misma estructura también fue observada por Hisatsuka et al. (1971), utilizando P. aeru-

ginosa S7B1 cultivada en hexa n-decano y parafinas. Un año después, Itoh y Suzuki (1972) encontraron que P. ae-

ruginosa KY 4025 cultivada con 10% de n-alcanos produ-ce monoramnolípido correspondiente a L-$-ramnopiranosil-#-hidroxidecanoil-#-hidroxidecanoato, estructura a la cual se ha denominado R. Se han reportado otras variantes productoras de ramnolípidos, tal es el caso de P. aeruginosa 44T1 (Robert et al., 1989), P. aeruginosa

GS3 (Patel and Desai, 1997), P. aeruginosa EM1 (Chayabutra et al., 2001), P. aeruginosa BS2 (Dubey and Juwarkar, 2001), P. aeruginosa LBI (Benincasa et al., 2002, Nitschke et al., 2009). P. aeruginosa (Costa et al.,2006, Marsudi et al., 2008).

Por otro lado se han reportado otras especies de Pseu-

domonas sp con la capacidad de producir ramnolípido como se describe a continuación: P. putida 300-B mutante (obtenida de P. putida 33 silvestre), Pseudomonas sp 47T2

NCIB 400044 (Mercade et al., 1993), P. cepacea (Onbasli y Aslim 2009), P. chlororaphis NRRL B-30761 (Gunther et al., 2005, 2006), P. clemancea y P. collierea (Rahman et al., 2009), P. fluorescens 29L (Husain, 2008), P. fluores-

cens (Abouseoud et al., 2008a,b), P. fluorescens (Wilson and Bradley, 1996), P. fluorescens HW-6 (Vasileva-Tonkova et al., 2006), P. fluorescens, P. stutzeri, P. luteola

y P. putida (Onbaslis y Aslim 2009), P. putida (Martinez-Toledo et al., 2006), P. putida (Tuleva et al., 2002), P.

putida (Cuny et al., 2004), P. stutzeri G11 (Celik et al., 2008), P. stutzeri (Janiyani et al., 1992), P. teessidae

(Rahman et al., 2009). Pseudomonas sp (Singh et al.,2009), P. lurida NARs9 (Mishra, 2009) y P. aeruginosa

NY3 también con la capacidad de producir un nuevo ramnolípido (Maiqian Nie et al., 2010, P. desmolyticum

NCIM-2112 es capaz también de producir ramnolípidos (Jadhav et al., 2011).

Aplicación y biosintesis de ramnolipidos

En particular, los ramnolípidos producidos por P. aeru-

ginosa han sido estudiados para su aplicación en distintas áreas, que incluyen la descontaminación de suelos conta-minados con petróleo, la eliminación de elementos poten-cialmente tóxicos (EPT) de suelos, recuperación terciaria de petróleo, en la industria cosmética, en la protección contra plagas y en la industria farmacéutica. Son también son una fuente importante de L-ramnosa, que es usada en química fina y como materia prima para la síntesis de com-puestos orgánicos. Aunque la función fisiológica de los ramnolípidos en P. aeruginosa no ha sido completamente establecida, se les ha considerado como factores de viru-lencia y antimicrobianos, además, se les ha implicado en el establecimiento de la estructura y en la disgregación de las biopelículas, así como en la movilidad tipo “swarming” de esta bacteria (Caiazza et al., 2005).

En términos generales, los principales ramnolípidos producidos por P. aeruginosa son el ramnosil-#-hidroxidecanoil- # -hidrodecanoato (mono-ramnolípido) y

Figura 1. Estructura de los principales glicolípidos (mono y di-ramnolípidos)

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el ramnosil-ramnosil- # -hidroxidecanoil- # -hidrodecanoato (di-ramnolípido). La biosíntesis de estos biosurfactantes fueron descritos por Burger et al. (1963). La biosíntesis de los ramnolípidos en P. aeruginosa ocurre a través de tres etapas secuenciales (Soberón Chávez et al., 2005): (1) la enzima RhlA (codificada por el gen rhlA) es involucrada en la síntesis del dímero de ácido graso (HAAs) del ramnolípido (Lépine et al. ������Déziel et al., ������%�!��&�'����()�� ��)� ��� �������������* �����&��+�

se encuentra unida a la membrana (codificada por el gen rhlB) usa dTDP-L-ramnosa y la molécula de HAAs como precursores, el cual forman el monoramnolípido (Ochsner et al., 1994) y (3) estos monoramnolípidos a su vez son sustratos, junto con la dTDP-L- ramnosa, de la ramnosil-transferasa RhlC (codificada por el gen rhlC) para produ-cir diramnolípido (Rahim et al., 2001) (véase figura 2). En P. aeruginosa, un operón bicistrónico rhlAB, codifica para las primeras dos enzimas, mientras que rhlC se halla en otro operón en el genoma. La trascripción de las enzimas responsables de la biosíntesis de ramnolípidos es regulada por RhlR (codificado por el gen rhlR)�� ����,��� -����'�.��

cuando está unido a su autoinductor C4-HSL (sintetizado por el gen rhlI), activa la expresión y cuando no está unido al autoinductor la reprime. La trascripción de rhlR es acti-vada por el regulador transcripcional LasR (codificado por lasR), unido a su autoinductor 3O-C12-HSL (sintetizado por el gen lasI) (Williams y Cámara, 2009).

La producción de ramnolípidos por P. aeruginosa de-pende de factores nutricionales y ambientales, incluyendo limitaciones de nitrógeno, pH, y temperatura. La biosínte-

sis ocurre durante la fase exponencial tardía y la fase esta-cionaria de crecimiento, típicamente bajo las condiciones de limitación de nitrógeno y fosfatos. (Soberón – Chávez G et al., 2005).

Los ramnolípidos reducen la tensión superficial del agua de 72 mN/m a 30 mN/m y la tensión interfacial del agua/aceite de 43 mN/m a valores por abajo de 1 mN/m. Las propiedades de los ramnolípidos dependen de su com-posición, distribución y determinado a su vez por la cepa bacteriana, las condiciones de cultivo y la composición del medio, principalmente la fuente de carbono (Jiménez et al., 2010).

Los ramnolípidos muestran la capacidad de emulsificar hidrocarburos y estabilizar emulsiones. Haba et al., (2000) reportaron que sobrenadantes obtenidos en medios de cul-tivo provenientes de diferentes aislamientos de Pseudomo-

nas sp fueron capaces de emulsificar keroseno. Tales emulsiones permanecieron estables hasta por tres meses. Las emulsiones de n-alcanos, compuestos aromáticos, aceite crudo, keroseno, aceite de coco y de oliva fueron estabilizadas por los ramnolípidos, mostrando una estabili-dad de entre 5 a 25% de estabilidad después de 24 horas dependiendo de la fuente de carbono (Haba et al 2000, Mohamed Sifour et al., 2007).

Características, aplicaciones y biosintesis de lipopépti-dos ciclicos

Los lipopéptidos son compuestos por un péptido que puede ser ciclados (pudiendo formar estructuras cíclicas) para formar un anillo lactona entre dos aminoácidos en la

Figura 2. Biosíntesis de ramnolípidos (Soberón-Chávez, et al., 2005)

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cadena peptídica y una cadena de ácido graso unida por el N-terminal del aminoácido. Ambos varían en tamaño, esta característica le proporcionan diferentes propiedades bioló-gicas entre los diversos lipopéptidos estudiados, las cuales incluyen antifúngicos, fítotóxicos, antimicrobianos y regu-ladores de la formación de biopelículas, entre otras. �/!�'������� ����"�����0��1� �� �� ����"��������/!2 �� ����., 2002).

Los lipopéptidos son producidos por diversas especies de Pseudomonas, en la que se incluyen especies patogéni-cas y saprofitas. Estos compuestos juegan un papel impor-tante en la virulencia y la motilidad de las bacterias �12�� ��3�� �� ������4��&���5�� ��� ����"�����6)"�7���

ciclolipopéptidos o CLP´s producidos por Pseudomonas sp presentan actividad contra un amplio rango de microorga-nismos patógenos, entre los que se incluyen virus, mico-plasmas y bacterias grampositivas. Su amplio espectro antimicrobiano ha sido explotado en el control biológico de hongos patógenos de plantas (Nybroe y Sorensen, 2004).

Los CLP´s son producidos por un péptido sintetasa noribosomal (NRPS) los cuales poseen una estructura mo-dular. Cada módulo está construido por bloques, resultado de la incorporación paso a paso de aminoácidos a la cadena , ,�-��'�"� �8 ���2�� ������ 3� 2 �� � ������ ��� ���0)"� 9��

orden y número de módulos de un NRPS en muchos casos, son secuencias colineares de aminoácidos que correspon-den a una fracción del CLP. Los módulos pueden ser sub-divididos de iniciación y elongación. Un módulo típico de elongación de NRPS consiste en un dominio de adenila-ción (A), responsable de la selección y activación de ami-noácidos, un dominio de tiolación (T) responsable de la tioesterificación del aminoácido activado y por ultimo un dominio de condensación (C) el cual sirve para la forma-ción del enlace peptídico entre dos sustratos y así elongar la cadena peptídica. Los módulos de iniciación proveen el primer aminoácido para la síntesis del péptido y típicamen-te pierden un dominio C terminal (Finking y Marahiel, 2004). El dominio catalítico genra un péptido lineal el cual se fracciona y al final se ensambla por un dominio de tioesterasa (TE), la cual resulta en la liberación de un pro-ducto lineal o péptido cíclico vía reacción ciclización intra-��� '!���"� �:����� �� ��"�� ������ 3� 2 �� � ������ ��� ���0��

Bruijn et al., 2007). Basados en el tamaño y composición de la cadena de

ácido graso y el péptido, los CLP´s de las especies de Pseudomonas fueron clasificados en 4 grupos mayorita-rios: viscosina, amfisina, tolasina y siringomicina. Los del grupo de la viscosina incluyen CLP´s con nueve aminoáci-dos (viscosina, viscosinamida, masetolido A y D, pseu-��*������ ;� � +)�� ���� '��� � ���� ��� ������� � � ��� �����

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así como ambientes marinos (Raaijmakers et al., 2006). Los CLP´s del grupo de la amfisina, compuestos por tensi-na, amfisina, polipeptina A, lokisina y artrofactina �/ ���� �� �� ��"��������3<� �� �� �� ��"������)�� ��,=,�����

consta de once aminoácidos y se acopla con el ácido 3-hidroxidecanoico (3-HDA). El grupo de la tolasina que

incluyen tolasina, FP-B, corpeptina A, SP22 y SP25A, es un grupo muy diverso en cuanto a la composición y tama-ño del péptido el cual varia de 19 a 25 aminoácidos, y el lípido puede ser 3-HDA o 3-hidroxioctanoico (3-HOA). La parte del péptido en este grupo contiene aminoácidos inusuales, incluyen ácido 2,3-dihidro-2-aminobutirico (Dhb) y homoserina (Hse), pudiendo el primer aminoácido estar siempre por delante de los residuos allo-Thr. La parte cíclica del péptido contiene cinco a ocho aminoácidos y el anillo de lactona es formado entre el C-terminal del ami-noácido y el residuo de allo-Thr. Los lipopéptidos cíclicos del grupo de la tolasina son factores de virulencia produci-dos por Pseudomonas sp patógenas de plantas. Los CLP´s del grupo de la siringomicina (incluyen a la siringomicina, siringotastina, siringotóxina, pseudomonicina A y cormici-na A) estos muestran similaridad estructural con el grupo � � ��� ���'������� , ��� '���� � �� ������'����� ��!�!�� ���

Dhb, o 2,4-ácido diamino butírico (Dab) y el anillo de lactona es formado entre el N-terminal de la Ser y el C-terminal del 4-clorotreonina (Thr[4-Cl]), y el lípido puede estar compuesto por 3-hidroxi o 3,4-dihidroxi compuesto de 10 a 14 carbonos. Otro estudio reciente de estructuras de lipopéptidos cíclicos incluyen a la artrofactina produci-da por Pseudomonas sp MIS38, la cual contienen un pépti-do de once aminoácidos unido a una cadena de ácido graso #-hidroxidecanoil, y putisolvina I y II (Kuiper et al., 2004), el cual consiste en un péptido de 12 aminoácidos unido a una cadena lipídica de hexanóico. La ciclización de la putisolvina es diferente a otros péptidos, el anillo de lactona se forma entre el C-terminal y los residuos del noveno aminoácido en lugar del primer o tercer aminoáci-do (Raaijmakers et al., 2006). En otro estudio se demues-tra la producción de un nuevo CLP´s llamado entolisina, producido por P. entomophila, una bacteria entomapatogé-nica capaz de matar a Drosophila melanogaster después de su ingestión. Este nuevo CLP´s contiene catorce ami-noácidos unido a ácido 3-hidroxidecanoico (Vallet-Gely et al., 2010).

Características y biosíntesis de determinados lipopépti-dos ciclicos

1 Artrofactina: La artrofactina producida por Pseudo-

monas sp MIS38, es el lipopéptido cíclico más potente reportado. Este péptido contiene once aminoácidos unidos a un ácido graso #-hidroxidecanoil. Basado en su estructu-ra química, cae dentro del grupo de la amfisina y es muy similar a la lokisina (Raaijmakers, et al., 2006). Se han encontrado tres genes involucrados en la biosíntesis de la artrofactina sintetasa, arfA, arfB y arfC, en el cual forman el cluster y codifican para ArfA, ArfB y ArfC contiene dos, cuatro y cinco módulos funcionales respectivamente (un módulo es definido por una unidad que cataliza la in-corporación de un aminoácido específico dentro del pro-ducto peptídico). Cada módulo presenta un dominio C de condensación (responsable de la formación del enlace peptídico entre dos aminoácidos consecutivos), un domi-nio A de adenilación (responsable de formar un reconocer y adenilación a expensa de ATP) y un dominio T de tioa-

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Figura 3. Estructura de la viscosina (Braun et al., 2001)

denilación (es un sitio que sirve para unir el co-factor 4-fosfopanteteino y un acarreador de intermediarios de ami-nácidos tioesterificados). Sin embargo ninguno de los once módulos posee el dominio E de epimerización, responsa-ble de la conversión de residuos de aminoácidos de la for-ma L a la forma D. Por lo tanto dos dominios tioesterasas son localizadas en tandem en el C-terminal al final de ArfC. El gen arfB se expresa en la producción de artrofac-tina (Roongsawang et al., 2003).

2 Viscosina: La viscosina se compone de ácido hidro-xidecanóico y fue aislado por vez primera por P. viscosa

(Kochi et al., 1951). Tiene una concentración micelar criti-ca (CMC) de 4 >g/ml y reduce la tensión superficial del agua de 72 a 27 mN/m. Esta no afecta la membrana pero si lisa a los eritrocitos por su acción detergente a concentra-ciones por debajo de la CMC, y no es considerada por te-ner toxicidad membrana especifica. La viscosina es similar en tamaño, estructura y composición a otros lipopéptidos (Véase figura 3), como es el caso de la tolasina producida por P. tolaasii, surfactina producida por B. subtillus, sirin-gomicina y siringopéptina producida por P. syringae pv syringae (Rainey et al.�� ����"��/!�'������ � 8������ ������Bernheimer y Avigad, 1970).

El control genético de la producción de la viscosina fue examinada en P. fluorescens PfA7B. Ésta bacteria causa perforaciones en las cabezas del brócoli. Es un potente biosurfactante y hace capaz a la bacteria de entrar en con-tacto íntimo con las cabezas de cera que son difíciles de mojar en el brócoli (ya que actúa como un agente humec-tante). En mutantes deficientes de producción de viscosina obtenidas por mutagénesis con Tn5 y analizadas por HPLC se observó que las mutantes Vis- conservan su capacidad pectolítica, pero carecen de la capacidad de hacer perfora-ción en los brócolis sanos a diferencia de la cepa silvestre (Braun et al., 2001, Palashpriya, et al., 2008), En mutantes triparentales complementadas con sus clones silvestres correspondientes y transformadas en E. coli HB101 (plásmido pPK2013), en las tres transconjugantes obteni-das disminuye su capacidad estable de producción de vis-cosina y causan decaimiento típico en el tejido del brócoli. Los mapas de estos clones y perfil de proteínas muestran una región de DNA cromosomal de 25 kb de PfA7B afecta-da en la producción de tres proteínas de alto peso molecu-lar requeridas para su síntesis. Estas proteínas son de apro-ximadamente 218, 215 y 137 kDa respectivamente, y al parecer comprende un complejo sintetasa que se ensambla en un péptido de nueve aminoácidos de viscosina y subse-cuentemente se une a un componente hidrofóbico (ácido graso) (Braun et al., 2001).

3. Viscosinamida: La viscosamida es un nuevo anti-biótico y biosurfactante, pertenece a la familia de los dep-sipéptidos cíclicos aislados de Pseudomonas sp. La estruc-tura se asemeja a la viscosina (véase figura 4), aislada de P. viscosa y de P. fluorescens biovar II. La secuencia ami-noácidos en este péptido es D-glutamico y D-glutamina en la viscosina y viscosamida respectivamente. Su producción está relacionada con la fase inicial de crecimiento, según lo observado en P. fluorescens DR54, por lo que se le consi-dera un metabolito primario y no secundario. Esto ha sido observado en otros biosurfactantes, en donde la producción puede estar vinculada a la proliferación celular y al creci-miento en vez de condiciones de estrés (Nielsen et al.,

Figura 4. Estructura de la viscosinamida (Braun et al.,2001)

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1999). La viscosamida se ha identificado como un determi-

nante antagónico producido por P. fluorescens DR54 y ha demostrado que induce cambios fisiológicos en Pythium

ultimátum in vitro, la cual se ha detectado en muestras de la rizósfera. El impacto en el crecimiento y la actividad de P. ultimátum se estudió por microscopia directa después de la tinción fluorescente. P. fluorescens DR54 causa re-ducción en la densidad del micelio, la formación de oós-poras y actividad intracelular. Los estudios in vitro confir-man que la viscosinamida purificada induce el enquista-miento de las zoosporas de P. ultimátum (Thrane et al.,2000).

4. Amfisina: Es un nuevo miembro de un grupo dual de compuestos como es la tensina, viscosina y la viscosi-namida, las cuales despliegan propiedades de superficie activa propias de los biosurfactantes y antifúngicas. Pseu-

domonas sp. DSS73 fue aislada de la rizósfera de la caña de azúcar. Esta cepa presenta antagonismo contra hongos patógenos de plantas, Phytium ultimátum y Rhizoctonia

solani. La producción de la amfisina en combinación con la expresión de flagelos permite al cultivo bacteriano mo-verse fácilmente sobre la superficie en los medios de culti-vo (Andersen et al., 2003).

El sistema regulatorio de dos componentes GacA/GacS (GacA es el regulador responsable y GacS es el sensor cinasa) controlan el gen amfisina sintetasa (amsY). La mo-tilidad en superficie de esta bacteria requiere de la produc-ción de este biosurfactante. Su síntesis es regulada por el gen gacS, esto se ha observado en mutantes gacS que pier-den la motilidad en superficie y cuando se complementan con un plásmido que codifica el gen heterólogo gacS sil-vestre de P. syringae se recupera el fenotipo en la mutante (Andersen et al., 2003).

La estructura de cristal de la amfisina se presenta en tetrahidrato C66H114N12O20·4H2O, originado por la biosín-tesis no-ribosomal en Pseudomonas sp DSS73. La estruc-tura primaria de la amfisina es #-hidroxidecanoil-D-Leu-D-Asp-D-allo-Thr-D-Leu-D-Leu-D-Ser-L-Leu-D-Gln-L-Leu-L-Ile-L-Asp. El péptido es una lactona unida a Thr4 O? al C-terminal. La estereoquímica del ácido #-hidroxi es R. El péptido es un análogo del lipopéptido cíclico tensina y polipéptina producida por P. fluorescen (Sørensen et al.,

2001). 5. Lokisina: La lokisina fue aislada de Pseudomonas sp

DSS41 como un agente de biocontrol antifúngico. Basado en estudios de NMR (resonancia magnética nuclear) y MS (espectrometría de masas), la lokisina fue tentativamente identificada como polipeptina (véase figura 5). Sin embar-go, en análisis detallados de los constituyentes de aminoá-cidos determinado por cromatografía de gases reveló una diferencia de D-/L-leucina a una tasa de 3:2 y el allo-isomero de treonina. Este biosurfactante representa una nueva variación estructural de lipoundecapéptido (Sørensen et al., 2002).

Además se ha reportado a P. koreensis 2.74 con capaci-dad de producir lokisina. La eficacia de este biosurfactante fue determinado y el extracto crudo fue usado contra el oomyceto de P. ultimum, en cultivos hidropónicos de toma-te, observándose una reducción significativa de la enferme-dad. La adición del biosurfactante no afecta la microflora de la raíz de la planta, esto se observó cuando solo se eva-luó una fuente de carbono. Estos resultados confirman que los biosurfactantes son importantes en el desarrollo de es-trategias de control biológico contra oomicetos (Hultberg et al., 2010). En otro estudio se aisló y caracterizo un nuevo linaje de P. koreensis M9b, M9c y CCB10 con capacidad de producir biosurfactante (probablemente lokisina) el cual tiene la capacidad de desplazar (competir) a las bacterias Exiguobacterium aeriumticu M5G y B. subtillus ATCC 6633 en caldo PPGly y en condiciones de laboratorio (Toribio Jimenez et al., 2011).

6. Siringomicina: Muchos aislamientos fitopatógenos de P. syringae pv syringae secretan un lipodepsipéptido cíclico con propiedades de actividad de amplio espectro antimicrobiano y antifúngico. La siringomicina (syr) y si-ringopéptina (syp) son un determinante clave en la virulen-cia de P. syringae pv. syringae B301D y B728a (Sørensen et al., ������3<� �� �� ����"������) que contribuyen al desa-rrollo de la enfermedad. La siringomicina es un péptido compuesto con una cabeza polar, con una secuencia Ser-D-Ser1-D-Dab-Dab-Arg- Phe-Dhb-(3-OH) Asp-(4-Cl)Thr, unida a una cola de ácido 3-hidroxidecanoico y 3-hidroxitetradecanoico (Segre et al., 1989). Se han detectado y caracterizado cuatro genes involucrados en la biosíntesis de la siringomicina syrB, syrC, syrD, y syrP, que abarcan aproximadamente una región de 7 Kb. El gen syrB muestra alta similaridad con dominios de unión a la péptido sínteta-sa syrC, la cual codifica para una enzima parecida a la tioesterasa syrD y se transcribe en orientación opuesta con respecto a syrB y syrC, además codifica para una proteína similar a la súper familia de proteínas involucradas en la secreción específica y puede estar implicada en la secre-ción de la siringomicina a través de la membrana citoplas-mática. Finalmente, syrP, es localizada entre syrB y syrD, y exhibe similaridad con la región de fosfotransferasa de histidina cinasa y puede participar en un mecanismo de fosforilación de transducción de señales que controle la síntesis de siringomicina y promueve la virulencia de P.

syringae (Guenzi. et al., 1998, Wang et al., 2006). Los genes syr-syp son coordinados por SalA y SyrF en respues-Figura 5. Estructura de la lokisina (Sørensen et al., 2002)

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ta a las condiciones ambientales (Wang et al., 2006). 7. Tolasina: Es una toxina (péptido) formadora de

poro (Cho et al., 2010). Ésta consiste en 18 aminoácidos y su peso molecular es de 1,985 Da. Se han determinado dos ��@� ����� ��������������� ����������A���B��A���BB����2���

isómeros tienen un ácido #-hidroxioctánoico unido cova-lentemente al N-terminal. Diversos isómeros fueron iden-tificados en varios aislamientos de P. tolaasii y su estruc-�!����������� �'��� '�����3������� ����"�����0��+����� ���� ��

al., 2004). La tolasina tiene dos cargas positivas en el C-terminal, por lo cual es un péptido anfipático. Induce la disrupción de la membrana por la cual induce la formación de poros en la membrana y como surfactante (Hutchison y Johnstone, 1993). En la mutagénesis por Tn5 en P. tolaa-

sii NCPPB, solo 35 (0.7%) de 5,000 inserciones cromoso-males fueron tolasina negativo y 12 (0.25%) producen una reducida producción de tolasina. El análisis de extractos de proteínas SDS-PAGE de la cepa silvestre, demuestra la presencia de tres proteínas de alto peso molecular designa-das como TL1, TL2 y TL3. Alteraciones en estas proteínas aparentemente truncadas de 465 kDa (TL1), 440 kDa (TL2) y 435 kDa (TL3), fueron ausentes en algunas mu-tantes (Rainey et al., 1993). Además, se ha identificado el gen pheN y su producto en P. tolaasii NCPPB1116, se incluye dentro del grupo de proteínas reguladoras. Se ha especulado que su producción es regulada positivamente por el producto de pheN como consecuencia del reconoci-miento de las condiciones ambientales. (Murata et al.,1996).

8. Putisolvina: Es producida por P. putida PCL1445, crece en suelos contaminados con metales pesados y con hidrocarburos aromáticos (PAHs) (Kuiper et al., 2001). P.

putida PCL1445 es un colonizador eficiente de raíz y pue-de proliferar en productos de degradación del naftaleno y fenantreno. Es capaz de formar biopelículas en la superfi-cie de las raíces de plantas y en PVC (Kuiper et al., 2001).

Figura 6. 9���!'�!���� ����,!�����������;)�C!����������B��+)�C!����������BB"��:!�, �� ����., 2004)

Esta cepa produce dos lipodepsipéptidos cíclicos, llama-dos putisolvina I y II, cada uno contiene un lípido hexa-nóico unido al N-terminal del péptido de doce aminoáci-dos, en el cual el C-terminal del grupo carboxilo forma un enlace estér con el hidroxilo de la cadena de Ser-9 (Kuiper et al., 2004). La diferencia entre las dos estructuras es lo-calizada en el segundo aminoácido del C-terminal, el cual para la putisolvina I es Val y Leu/Ile para putisolvina II respectivamente (véase figura 6).

La producción del biosurfactante� es iniciada al final de la fase exponencial, sugiriendo que la producción es regu-lada por un sistema similar al Quorum Semsing. En mu-tantes Tn5 de la misma cepa, se aisló la cepa PCL1436, la cual no produce putisolvina I y II, se observó que es muta-da en un marco de lectura abierto (ORF), el cual presenta homología con diversos lipopéptidos sintetasa. El gen de la putisolvina sintetasa de PCL1445 fue llamado psoA

(Dubern et al., 2005).La putisolvina I y II representan un nuevo tipo de

CLP´s, la cual tienen la capacidad de reducir la tensión superficial, emulsionar el tolueno, e incrementar la disper-sión de naftaleno y fenantreno (Kuiper et al., 2004). Estas propiedades muestran un papel importante en el incremen-to de la disponibilidad de compuestos hidrofóbicos (Rosenberg et al., 1993). Además, se muestra que la secre-ción de putisolvina I y II estimulan la motilidad en swar-ming de células, presumiblemente por la alteración de la hidrofóbicidad de la superficie celular y juega un papel importante en la formación y degradación de biopelículas.

Con el fin de identificar los genes y características involucradas en la regulación de la producción de la puti-solvina por PCL1445, se genró una biblioteca de Tn5lu-

xAB y las mutantes fueron seleccionadas por la pérdida de la producción de biosurfactante usando el método de la gota colapsada (Bodour Maier, 1998). El análisis de se-cuencias de las regiones flanqueantes del Tn5luxAB de una

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mutante PCL1627, muestra que la inserción del Tn fue insertada en una región homologa al dnaK, la cual es loca-lizada río abajo de grpE y río arriba de dnaJ. El análisis de la producción de la putisolvina y de expresión indican que dnaK, junto con dnaJ y grpE son genes de choque térmi-co, que participan de manera positiva en la regulación (directa o indirectamente) de la biosíntesis de putisolvina a nivel transcripcional. El crecimiento de PCL1445 a bajas temperaturas resulta en un incremento en los niveles de producción de putisolvina. Además, la biosíntesis de PCL1445 es dependiente del sistema de señalización de dos componentes GacA/GacS, ya que en los análisis de expresión indican que dnaK es regulado positivamente por GacA/GacS (Dubern et al., 2005).

Las moléculas de putisolvina I y II son secretadas al medio de cultivo durante la fase exponencial tardía de crecimiento, indicando que su producción probablemente sea regulada por quorum sensing (percepción de quórum [PQ]). Para comprobar esto se identificaron los genes del sistema de quórum en P. putida PCL1445, los cuales in-cluye a ppuI, rsaL y ppuR mostrando alta similaridad con un clúster de genes en cepas de P. putida IsoF y WCS358, respectivamente (Steidle et al., ������ + ������and Venturi, 2004,). Las cepas con mutaciones en ppuI y ppuR muestran una reducción severa en la producción del biosurfactante. En el análisis de expresión de los genes biosintéticos, el gen ppuI muestra una expresión deficien-te, la cual se complementa con la adición sintética de 3-oxo-C10-N-acilhomoserina lactona (3-oxo-C10-AHL) o 3-oxo-C12-AHL al medio. En mutantes rsaL sobreproducto-ras de AHLs, la producción de putisolvina es inducida durante la fase de crecimiento temprano. El análisis de formación de biopelículas en PVC muestra que mutantes en ppuI y ppuR producen un biofilm denso a diferencia de la cepa silvestre, lo cual correlaciona con un decremento en la producción de putisolvina, y en mutantes rsaL existe un retraso en la formación del biofilms, lo cual correlacio-na con la producción temprana de putisolvina. Estos resul-tados demuestran que las señales de QS inducen la pro-ducción de putisolvina I y II, y controlan la formación debiofilms por P. putida (Dubern et al., 2006).

9. Entolisina: Es un nuevo CLP´s, producido por P.

entomophila, una bacteria entomapatogénica. Este nuevo CLP´s contiene catorce aminoácidos unido a ácido 3-hidroxidecanoico. Además se han identificado tres pépti-dos sintetasa no ribosomales (EtlA, EtlB y EtlC) involu-crados en su biosíntesis y dos componentes más (EtlR, MacAB), necesarios para su producción y secreción. El sistema de dos componentes GacS/GacA en P. entomophi-

la regula la producción de entolisina, esta es requerida para la motilidad en swarming, no participa en la virulen-cia de P. entomophila a Drosophila, pero si adquiere una ventaja de biocontrol (Vallet-Gely et al., 2010).

Condiciones de producción de lipopéptidos ciclicos

Existe un gran número de investigaciones que demues-tran que la sobreproducción de biosurfactantes por Pseu-

domona sp, se lleva a cabo una vez que los cultivos llegan

a fase estacionaria de crecimiento (Guerra-Santos et al., ��(6�� �!��� ��� � 8�22�"�� ��(��� D ����������� � :�E

ranth., 1989). En P. fluorescens, la producción de biosur-factante generalmente requiere una baja concentración de oxígeno y nitrógeno en cultivos líquidos (Persson et al., 1988). La limitación de cationes multivalentes también causa una sobreproducción de biosurfactantes. Las limita-ciones de hierro estimulan la producción de biosurfactante en P. fluorescens (Persson et al., 1990a, 1990b). Las fuen-tes de carbono juegan un importante papel en el peso y la estructura. La producción de viscosina es óptima in vitro

en un medio que contenga glicerol como fuente de carbono para su síntesis (Georgiou et al., 1992). Tipos diferentes de biosurfactante pueden ser producidos por especies bacte-rianas dependiendo de la fuente de carbono y otros nu-trientes disponibles (Desai et al., 1988).

Métodos usados para la detección de bacterias produc-toras de biosurfactantes:

Para estudiar la producción de biosurfactante, es nece-sario un método rápido, sensible y preciso para su detec-ción. Una variedad de diferentes métodos han sido descri-tos para la detección de microorganismos potencialmente productores, los que se enumeran a continuación:

(1). Van Der Vegt et al., (1991) desarrollaron un méto-do asimétrico para el análisis de la gota colapsada (ADSA) para la evaluación de microorganismos productores de biosurfactantes. En esta técnica, las gotas de medio de cul-tivo se colocan en una superficie de fluoroetileno-propileno. La tensión superficial es calculada a partir de los perfiles de las gotas colapsadas por ADSA. Solamente las bacterias productoras de biosurfactante en suspensión muestran reducción en la tensión superficial.

(2). Siegmund y Wagner (1991), describen una estima-ción colorimétrica de biosurfactantes bajo el principio de que los tensoactivos aniónicos reaccionan con el catión indicador formando un complejo de color característico. Ya que la cantidad de biosurfactante está en relación direc-ta con el diámetro del halo, este método puede ser tanto cuantitativo como cualitativo. Shulga et al., (1993) y Han-sen et al., (1993) desarrollaron este método para la detec-ción de bacterias productoras de ramnolípidos degradado-ras de hidrocarburos.

(3). Una prueba desarrollada por Hildebrand (1989), en el cual una gota de agua se colapsa cuando es adicionada a una suspensión bacteriana productora de biosurfactante. Jain et al. (1991) colocaron una gota de suspensión bacte-riana en una superficie cubierta de aceite. En este método, las gotas que contienen biosurfactante se colapsan y las que no contienen permanecen estables.

(4). Otra técnica utilizada es la cromatografía directa en capa fina (TLC) para la caracterización rápida de bacterias que producen biosurfactantes y descrito por Matsuyama et al., (1987). Con esta técnica, se identificaron los biosurfac-tante en Serratia marscescens mediante la aplicación de una sola colonia bacteriana directamente en placa de TLC sin ninguna preparación previa de la muestra.

(5). Por reducción de la tensión de la superficie de una

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solución, mediante la cuantificación exacta de la tensión superficial en presencia de biosurfactante. Las determina-ciones se basan evaluando los cambios en la tensión super-ficial e interfacial, por estabilización o desestabilización de emulsiones, y su balance hidrofílico-lipofílico (HLB). La tensión superficial en la interface del aire/agua y aceite/agua pueden ser fácilmente medible con un tensiómetro. La tensión superficial del agua destilada es de 72 mN/m. Cuando un agente tensoactivo se añade al aire/agua o acei-te/agua en concentraciones crecientes, se observa una re-ducción en la tensión superficial hasta un nivel crítico, por encima del cual las moléculas anfifílicas se asocian rápida-mente hasta formar estructuras moleculares parecida a micelas, bicapas y vesículas. Este valor se conoce como Concentración Micelar Critica (CMC) y se define como la concentración mínima de surfactante a partir del cual se forman micelas espontáneamente en una solución y es comúnmente usada para medir la eficiencia de un surfac-tante (Rosen, 2004).

(6). Bunster et al., (1989) estudiaron la actividad de superficie de las bacterias, mediante la medición de los ángulos de contacto obtenidos después de adición de las bacterias a una gota de agua. El ángulo de contacto es ubi-cado en la interface entre la gota y la superficie sólida. En ausencia de surfactante, las moléculas de agua se adhieren fuertemente entre sí, por lo que la gota conserva una apa-riencia redonda con un ángulo de contacto de más de 90°, mientras que en la presencia de biosurfactante, las fuerzas de adherencia se reducen causando un colapso de la gota creando un ángulo de contacto de menos de 90°.

(7). Detección de la actividad hemolítica, esta prueba de detección es cualitativa para la detección de microorga-nismos productores de biosurfactante, para esta se usa agar LB o nutritivo, suplementado con 5% de sangre de carnero *� �'������������ ����"�����6��+����������)"�7�����'���� �E

nismos son inoculados e incubados a temperatura óptima durante 48h. Una hemólisis se observa visualmente y pue-de ser indicativo de la lísis celular debido a la ruptura de la membrana, causada por la presencia de sustancias activa de superficie.

(8). Método de dispersión en aceite: en este método se adicionan 10 µl de caldo de cultivo sobre una capa de acei-te crudo (20 µl) en 50 ml de agua destilada. Posteriormente se agrega sobre la superficie cubierta de agua con aceite. La presencia de un halo emulsionado es indicador de pre-sencia de biosurfactantes. Este es un método sensible que permite detectar bacterias con esta capacidad (Morikawa et al., 2000).

(9). Ensayo de emulsificación (EA): En este método el medio de cultivo es centrifugado a 10,000 rpm por 15 min, posteriormente se mezclan 3 ml del sobrenadante con 0.5 ml de aceite/hidrocarburo y se mezcla vigorosamente du-rante 2 min. Se deja reposar por 1 h, con la finalidad de que se separen las fases acuosa/aceite, se usa como blanco medio de cultivo no inoculado (Jagtap et al., 2009). La absorbancia de la fase acuosa es obtenida de 0.1 unidades a 400 nm, y es multiplicada por el factor de dilución y se considera una unidad de actividad de emulsificación por

�����������9FG��)��C������������,�� ���������2������)"�

(10). Índice de emulsificación (IE): la actividad de emulsificación se mide mediante el cálculo del IE. En este método un sustrato hidrofóbico como keroseno o diésel es agregado al sobrenadante de un cultivo bacteriano (1:2 v/v), agitándose por 2 min, y se deja reposar durante 24 h. El IE se determina midiendo la altura total de la fase acuosa entre la altura de la emulsión del keroseno o diésel y multi-plicada por 100 (Ellaiah et al., ������/�2�� ����"������)"�7��estabilidad del IE designa la fuerza del biosurfactante.

(11). Ensayo de turbidez, este método fue desarrollado por Rosenberg et al. (1979) y posteriormente fue modifica-do por Neua and Porralla (1990). El caldo de cultivo filtra-do y secado se re suspende en una solución buffer. Se mide la DO a 446 nm. Para esto, se adiciona hidrocarburo y se agita vigorosamente por 2 min, se deja reposar por 10 min y se vuelve a medir la DO. La diferencia en turbidez se determina midiendo las diferencias entre a DO inicial y la final.

(12). Métodos moleculares para identificar los genes involucrados en la biosíntesis de biosurfactantes. La bús-queda directa de genes involucrados en la producción de biosurfactantes es rápida y menos laboriosa. Invenciones más recientes como las de Whiteley, Lee et al., (1999) pue-den ser usados para identificar moduladores y genes invo-lucrados en el sistema de PQ en bacterias productoras de biosurfactantes. Nuevas cepas y vectores han sido diseña-dos con éxito para evaluar la producción de biosurfactan-tes.

1 Métodos de recuperación y/o purificación de biosurfac-

tantes:

Una de las limitantes para la producción de biosurfac-tantes en escala piloto y semi-piloto se basa en el alto costo de la recuperación el cual llega a representar hasta el 60% del costo total de producción. Para reducir los costos se requiere la utilización de sustratos renovables y de bajo '������H �����+������������+������ ����., ������������

Cameotra, 1997). Durante todos estos procesos el riesgo de contaminación con compuestos no deseados del proceso de fermentación es latente. Una fuente potencial de contami-nación es la espuma producida durante la fermentación, por lo que se debe elegir con cuidado un anti espumeante que no afecte la estructura del biosurfactante y no sea toxi-co para la bacteria. La carga iónica (cromatografía), la so-lubilidad (agua/solvente orgánico) y localización (si es intracelular, extracelular o pegada a la célula) determinan el procedimiento de obtención del biosurfactante de inte-rés. En el caso de moléculas de alto peso molecular, la obtención y purificación se obtiene por precipitación usan-do sulfato de amonio, seguido por diálisis para remover pequeñas moléculas (Desai y Desai, 1993., Barck y Ste-nius, 1994). Otros métodos también involucran el uso de ácido tricloroacético (TCA), la precipitación con acetona, etanol y cloroformo/metanol. Diversos métodos conven-cionales conocidos para la recuperación de biosurfactantes son mencionados más adelante. (1) Precipitación con ace-tona en el que el sobrenadante libre de células es mezclado

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con acetona fría para precipitar emulsionantes, el cual des-pués es re-suspendido en un buffer de fosfatos. La mezcla es incubada a 4°C por 15 a 20 h para el precipitado del emulsificador. El biosurfactante es analizado por su capa-cidad emulsificante, fracción proteica y polisacárido. Este método ha sido usado en diversos trabajos, para purificar 2���!�*�'���� �� �&�� �2 � � �� ��"�� ������C����� � ���,�� ��

�������2������)"���)�C� '�,���'�@��'��� �����I� ������������

la acetona, el etanol es un solvente popular para obtener extracto crudo de bioemulsificadores del sobrenadante de Acinetobacter, Pseudomonas, Bacillus, Cyanobacterium y especies de levaduras. El medio de cultivo es centrifugado a 11,000g/20min/4°C y el biosurfactante es precipitado del sobrenadante usando etanol frio. Phetrong et al., (2008), hallaron una mayor eficiencia por precipitación del emulsi-ficador de A. calcoaceticus subsp anitrus SM7 con este método comparado con otros. (3) Precipitación con sulfato � ��������� �� ����� �,����,� '�,�����2���!�*�'���� �� ������

peso molecular como es el caso del emulsan. Este método fue introducido por Rosenberg et al., (1979) para precipita-ción de biosurfactantes de Arthrobacter RAG-1. Para este fin, se agrega 30% de (NH4)2SO4 directamente al medio de cultivo sin remover las células y se deja reposar toda la noche. Después el precipitado es suspendido en 3% de (NH4)2SO4 saturado y centrifugado hasta que el sobrena-dante sea clarificado. Posteriormente se agrega (NH4)2SO4

a una concentración final de 40%. El precipitado resultante es centrifugado y extraído con éter. Kaplan y Rosenberg (1982), obtuvieron biosurfactante de A. calcoaceticus

BD413 por incremento sucesivo de (NH4)2SO4 agregado a J���'������2� �� �'=�!���"��4)�C� '�,���'�@���'����� �� ��=E

todo es fácil, económico y rápidamente disponible para recuperar crudo como la surfactina, lipopéptidos, glicolípi-dos, etc. La hidrólisis ácida usa HCl concentrado para ba-jar el pH hasta 2.0 de insolubles a pH bajos (Mukherjee, Das, y Sen, 2006), precipita proteína y lípidos contenidos en los biosurfactantes a 4°C (Cooper et al., 1981). La muestra se centrifuga y el pellet obtenido es extraído usan-��� ������� ���� �� �� �1���'� � � C����� �� ���6�� A��E

niyavarn et al., 2003). El material extraído es filtrado para remover residuos y evaporado hasta secar completamente en un rotavapor. Los lipopéptidos de microorganismos que desarrollan en medios simples o complejos son purificados también por este método. En el caso de los ramnolípidos el sobrenadante es hidrolizado con HCl para precipitar glico-lípidos, lo cual son convertidos en insolubles en solución acuosa. Durante la acidificación, el biosurfactante presente es protonado, lo cual lo hace menos soluble en agua. Los métodos de acidificación, centrifugación y extracción son aplicables a otros glicolípidos. Sin embargo, diferente sol-ventes, cloroformo, metanol y acetato de etilo son usados generalmente para purificar ramnolípidos. La fase orgánica es removida y se mezcla con Na2SO4 para remover el agua y puede ser concentrado en un rotavapor a 40°C para obte-ner el extracto crudo. Los residuos son disueltos en NaHCO3 para purificar el biosurfactante. El número de publicaciones reportando la purificación de ramnolípidos por precipitación ácida ha ido en aumento (Haba et al.,

������3���� ����"�������)"�K��������='!����'����������*�E

rolípidos (Nunez et al., 2001), lípidos de trealosa, lípidos de mannosylerytritol (MELs) (Rapp et al., 1979), son ex-traídos de forma similar que los ramnolípidos.

2 Métodos de caracterización de biosurfactantes:

La caracterización preliminar del biosurfactante se rea-liza mediante una cromatografía en capa fina (TLC), esta es una de las técnicas más comunes para detectar biosur-factante, y se basa en el principio de competencia de solu-tos con el solvente en los sitios de superficie del adsorben-te. Los compuestos son distribuidos en la superficie del adsorbente. Cada muestra es separada en la placa para evi-tar contaminación cruzada con otra. Para detectar biosur-factante, se utiliza un sistema de solventes dependiendo el tipo de compuesto de interés. Los solventes orgánicos e inorgánicos en los que puede ser disuelto y no volátiles son los que se prefieren. Los solventes que no pueden ser usa-dos en HPLC, detección de UV por su interferencia pueden ser usados en el TLC. Algunos como el ácido acético, diétil éter, acetato de etilo, n-hexano y pirimidina son nece-sarios para mover los grupos funcionales del biosurfactan-te. La detección de los spot de las muestras en las placas de TLC, pueden ser determinadas por técnicas destructivas y no destructivas, las no destructivas tenemos la iodina, mé-todos con agua y radiación UV, las destructivas involucra el uso de H2SO4, orcinol, y ninhídrina para la detección de carbohidratos, lípidos y proteínas (Costa et al., 2006., Desai y Banat., 1997., Ellaiah et al., 2002., Gunther et al 2000, Arutchelvi y Doble, 2010).

Los biosurfactantes de alto peso molecular son analiza-dos por ensayos colorimétricos (Lowry’s, Bradford), es-pectrometría de masas (MS) y técnicas de secuenciación. El contenido de ácidos grasos y secuenciación del péptido es determinado con la ayuda de un equipo automatizado de degradación de EDMAN y espectrómetro de masas. La combinación de todas estas diferentes metodologías es importante para predecir la estructura completa del biosur-factante.

3 Determinación del contenido de proteína-lípidos

Los biosurfactante de alto peso molecular por lo gene-ral contienen lipoproteínas, proteínas, polisacáridos, lipo-polisacaridos o combinación de estas. Las proteínas son cuantificadas por el método de Lowry (Lowry et al., 1951) y Bradford (1976) y es usado por varios investigadores.

4 Uso de proteasas para la digestión de proteínas

La identificación de la secuencia de aminoácidos de la proteína, no siempre es posible debido a la incapacidad de obtener mediciones precisas de proteínas más grandes, por lo que la degradación de EDMAN y la MS son más facti-bles para el análisis de estructura de péptidos pequeños. Es necesaria la digestión de la proteína en pequeños péptidos de 6 a 20 aminoácidos para ser analizadas por EDMAN y MS/MS con la finalidad de proporcionar información nece-saria para identificar y reconstruir la estructura de la proteí-

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na completa. Las proteasas son usadas para la digestión, se usa tripsina por ejemplo que rompe las proteínas en los residuos de lisina y arginina en la dirección del C-terminal. Otras proteasas pueden ser usadas para ayudar a determi-nar el orden de secuencia de cada péptido (Strader et al., 2006 y Smyth et al., 2009b).

5 Electroforesis en geles de poliacrilamida-Dodecil sulfa-

to de sodio (SDS-PAGE)

Este método sirve para separar y determinar el peso molecular de la molécula del biosurfactante, involucra el uso de electroforesis, en el cual la muestra es aplicada en un buffer de carga que contiene un buffer y SDS. El papel del buffer de reducción es romper los enlaces de disúlfuro para facilitar la disposición linear de la proteína. Seguido por la unión del SDS a la proteína (dependiendo de la ma-sa molecular) para crear una proteína cargada negativa-mente. Bajo la influencia de la corriente eléctrica, las pro-teínas (dependiendo de la masa molecular) son separadas. Cada proteína puede ser eludida, removida y extraída de la banda (Toren et al., 2001).

6 Ensayos colorimétrico para detección y cuantificación

de glicolípidos

Los glicolípidos son cuantificados por el desarrollo de color usando la prueba de antrona u órcinol. Estos ensayos detectan y cuantifican los glicolípidos presentes después de la acidificación y calentamiento de la ramnosa, la cual forma un color con el reactivo, se usa una curva de calibra-ción de ramnosa o ramnolípidos de 0-50 mg/dl (Hodge y Hofreiter, 1962). Las moléculas de ramnosa de los ramno-lípidos reaccionan con el H2SO4 y órcinol (1,3-dihidroxi-5-metilbenceno) a altas temperaturas (30 min/80°C) y es cuantificado a 421 mn (Koch et al., 1991).

7 Caracterización química de los biosurfactante

Existen varios métodos llamados: TLC, HPLC (Cromatografía Líquida de Alta Afinidad), IR (Infrarrojo), GC-MS (Cromatografía de Gases-Espectrómetro de Ma-sas, NMR (Resonancia Magnética Nuclear) y FAB-MS (Bombardeo Atómico Rápido-Espectrómetro de Masas). El HPLC, consiste en una fase móvil, fase estacionaria y un detector. La fase móvil lleva la muestra en solución y es inyectada a través del inyector. La fase estacionaria es un sólido, sobre el cual la fase móvil fluye continuamente los componentes de la muestra. Los componentes migran acorde a las interacciones no covalentes de los compuestos de la columna. El detector emite respuesta a la elución de la muestra y subsecuentemente señales en picos en el cro-matograma. La cromatografía de gases GC-MS constituye un poderoso instrumento en la determinación de los com-ponentes de una muestra, al permitir tanto la separación de éstos como su detección individual. El espectro de masas (MS) de un compuesto puro ofrece valiosa información para fines de identificación cualitativa, siendo la determi-nación del peso molecular lo más importante, si bien la

fragmentación de la molécula puede ayudar en gran medi-da a la identificación del compuesto (Yakimov et al., 1995). El análisis de infrarrojo (IR): consiste en la aplica-ción de una fuente de radiación infrarroja, la cual cubre el rango del espectro entre 0.78 y 1000 mm. La absorción de IR es restringida a compuestos con pequeña energía en los estados vibracional y rotacional. Esta técnica determina los �!,���*!�'����� ��� ��! ������� �� ��� �-L!�������@�������

y apoya a la elucidación de la estructura del compuesto (Heyd et al., 2008). La surfactina, liquesina y ramnolípidos ���� ����� '���'� �������� ,��� ���� �='��'�� �H���� ���(��

�!� �5 �� ���(�� 3 ��� ���()"� 9�� ��������� ,��� 1�&�� � �

basa en la transición de átomos con un momento magnéti-co cuando un campo magnético externo se aplica. La NMR proporciona información sobre los grupos funciona-les, así como la posición de los vínculos dentro de las mo-léculas de carbohidratos y lípidos. Es posible obtener la ubicación exacta de cada grupo funcional así como la in-formación de los isómeros estructurales. El método de FAB-MS es un método de ionización suave que requiere una sonda de inserción directa para la introducción de la muestra. La muestra del biosurfactante se disuelve en me-tanol, se mezcla con la matriz y se utiliza para el análisis. El grupo de investigación de Manso Pajarron et al., (1993) han identificado mezclas de ramnolípidos utilizando este método. Es importante mencionar que los requisitos de tiempo para llevar a cabo algunas de la extracción, purifi-cación y análisis de algunos de los procedimientos descri-tos anteriormente pueden ser afectadas por varios factores tales como volumen de muestra, la presencia de carbono residual o la producción de otros sustratos como el petró-leo, mezclas o complejas composiciones medio (Satpute et al., 2010).

Conclusiones

Basados en esta revisión, los biosurfactantes produci-dos por especies del género Pseudomonas, principalmente las asociadas a plantas son ampliamente diversos, en es-tructura, y en actividad biológica. Aunque se han identifi-cado un gran número de genes involucrados en la biosín-tesis de biosurfactantes, aun en varios de ellos se descono-ce su regulación de producción en este género. Se conoce mucho en cuanto a la producción, biosíntesis, regulación y aplicaciones de los ramnolípidos, y se desconocen algunos de estos puntos en los lipopéptidos ciclicos. Se debe dar mayor énfasis en las bacterias que tienen la capacidad de producir biosurfactante, utilizar los métodos correctos para su identificación y elucidación de la estructura, así como las posibles aplicaciones ambientales (biocidas, biocontrol, biorremediación, etc) con la finalidad de usar estas tecno-logías compatibles con el medio ambiente. Se debe consi-derar el uso de fuentes de carbono de bajo costo y renova-bles, así como continuar la investigación dirigida hacia el análisis y explotación de la secuencia de los genomas de las bacterias productoras, lo cual permitirá la comprensión de la síntesis, regulación y actividad de los biosurfactante producidos por Pseudomonas sp.

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78

Referencias

Abdel-Mawgoud, A. M., Lepine, F., Deziel, E., (2010). Rhamnolipids: diversity of struc- tures, microbial origins and roles. Applied Microbiology and Biotechnology, 86, 1323–1336.

Abdel-Mawgoud, A. M., Hausmann, R., Lépine, F., Müller, M. M., y Déziel, E., (2011). Rhamnolipids: de-tection, analysis, biosynthesis, gentic regulation and bioengi- neering of production. En: Sobéron-Chavez, G. (Ed.), Biosurfactant, 1st edition, VII 216 pp. Springer, Berlin, pp. 13–55.

Abouseoud, M., Maachi, R., Amrane, A., Boudergua, S. y A. Nabi. (2008a). Evaluation of different carbon and nitrogen sources in production of biosurfactant by Pseu-

domonas fluorescens. Conference on Desalination and

the Environment. Sani Resort, Halkidiki, Greece, pp 143-151.

Abouseoud, M., Yataghene, A., Amran, A. y Maachi, R. (2008b). Biosurfactant production by free and alginate entrapped cells of Pseudomonas fluorescens. J Ind Mi-

crobiol Biotech, 35, 1303-1308. Alsohim, A. S., Taylor, T. B., Barrett, G. A., Gallie, J.,

Zhang, X. X., Altamirano-Junqueira, A. E., Johnson, L. J., Rainey, P. B. y Jackson, R. W. (2014). The biosurfac-tant viscosin produced by Pseudomonas fluorescens SBW25 aids spreading motility and plant growth promo-tion. Environ Microbiol, 6(7), 2267-81.

Banat, I. M., Makkar, R. S. y Cameotra, S. S. (2000). Po-tential commercial applications of microbial surfactants. Appl Microbiol Biotechnol, 53, 495-508.

Banat, I. M. (1993). The isolation of a thermophilic biosur-factant producing Bacillus sp. Biotechnol Lett, 15(6), 591-594.

Barck, M. y Stenius, P. (1994). Interactions between car-boxymethyl cellulose and cationic surfactants 1. Phase equilibria and surface tensions.� Colloids and Surfaces A:

Physicochemical and Engineering Aspects, 89(1), 59-69. Bassarello, C., Lazzaroni, S., Bifulco, G., Cantore, P. L.,

Iacobellis, N. S., Riccio, R., Gomez-Paloma L. y Eviden-te, A. (2004). Tolaasins A-E, five new lipodeppsipeptides produced by Pseudomonas tolaasii. J. Nat. Prod,. 67, 811-816.

Benincasa, M., Abalos, A., Oliveira, I. y Manresa, A. (2004). Chemical structure, surface properties and bio-logical activities of the biosurfactant produced by Pseu-

domonas aeruginosa LBI from soapstock. Antonie Van

Leeuwenhoek Int J Gen Mol Microbiol, 85, 1-8. Benincasa, M. y Accorsini, F. R. (2008). Pseudomonas

aeruginosa LBI production as an integrated process us-ing the wastes from sunflower-oil refining as a substrate. Bioresour Technol, 99(9), 3843-9.

Ben J. Duijff, W. Meijer, P. J., Bakker A. H. M. y Schip-pers, B. (1993). Siderophore-mediated competition for iron and induced resistance in the suppression of fusari-um wilt of carnation by fluorescent Pseudomonas spp. Neth. J. P1. Path, 99, 277-289.

Bergström S., Theorell, H. y Davide, H. (1946). On a met-

abolic product of Ps. pyocyanea, pyolipic acid, active against. Myobact. tuberculosis. Ark. Kem. Mineral Geol, 23A, 1-12.

Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for quantification of microorganism quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Ana Bio-

chem, 76: 248-254. Braun, V. (1997). Surface signaling: novel transcription

initiation mechanism starting from the cell surface. Arch.

Microbiol, 167, 325-331. Bruijn I., Maarten, J. D., de K Meng., Y., de Waard, P., van

Beek, T. A. y Raaijmakers, J. M. (2007). Genome-based discovery, structure prediction and functional analysis of cyclic lipopeptide antibiotics in Pseudomonas species. Molecular Microbiology, 63(2), 417-428.

Bunster L, Fokkema, N. J. y Schippers, B. (1989). Effect of surface-active Pseudomonas spp. on leaf produced by Pseudomonas marginalis. Canadian Journal of Microbi-

ology, 42 (3), 243-251. Burch, A. Y., Zeisler, V., Yokota, K., Schreiber, L. y Lin-

dow, S. E. (2014). The hygroscopic biosurfactant syrin-gafactin produced by Pseudomonas syringae enhances fitness on leaf surfaces during fluctuating humidity. En-

viron Microbiol. 16(7), 2086-98. Burd, G., y Ward, O. P. (1997). Energy-dependent accumu-

lation of particulate biosurfactant by Pseudomonas mar-

ginalis. Can J Microbiol, 43, 391-94. Cameotra, S. S. y Bollag, J. M. (2003). Biosurfactant-

enhanced bioremediation of polycyclic aromatic hydro-carbons. Crit. Rev. Env. Sci. Tec, 33, 111-126.

Carrillo, P. G., Mardaraz, C., Pitta-Alvarez, S. I. y Giuliett, A. M. (1996). Isolation and selection of biosurfactant producing bacteria. World J Microbiol Biotechnol, 12, 82-84.

Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., y O’Toole, G. A. (2005). Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol, 187, 7351–7361.

Celik, G. Y., Aslim, B. y Beyatli, Y. (2008). Enhanced crude oil biodegradation and rhamnolipid production by Pseudomonas stutzeri strain G11 in the presence of Tween-80 and Triton X-100. J Environ Biol, 29, 867-870.

Chayabutra, C., Wu, J. y Lu-Kwang, J. (2001). Rhamno-lipid production by Pseudomonas aeruginosa under de-nitrification: effects of limiting nutrients and carbon sub-strates. Biotechnol. Bioeng, 72, 25-33.

Cho, K. H., Wang, H. S. y Kim, Y. K. (2010). Temperature-dependent hemolytic activity of membrane pore-forming peptide toxin, tolaasin. J Pept Sci, 16(2), 85-90.

Coiro, V. M., Segre, A. L., Di Nola, A., Paci, M., Grottesi, A., Veglia, G. y Ballio, A. (1998). Solution conformation of the Pseudomonas syringae MSU 16H phytotoxic lipodepsipeptide Pseudomicina A determined for com-puter simulations using distance geometry and molecular dynamics from NMR data. Eur J. Biochem, 257, 449-56.

Cooper, D. G., Macdonald, C. R., Duff, S.J. y Kosaric, N. (1981). Enhanced Production of Surfactin from Bacillus

subtilis by Continuous Product Removal and Metal Cati-

Tlamati (2014) 5(2), 66-82

79

on Additions. Appl Environ Microbiol, 42, 408-412. Costa S.G., Nitschke, M., Haddad, R., Eberlin, M. N. y

Contiero, J. (2006). Production of Pseudomonas aeru-

ginosa LBI rhamnolipids following growth on Brazilian native oils. Process Biochem, 41, 483-488.

Costa S.G, Lépine, F., Milot, S., Déziel, E., Nitschke M. y Contiero J. (2009). Cassava wastewater as a substrate for the simultaneous production of rhamnolipids and polyhy-droxyalkanoates by Pseudomonas aeruginosa. J Ind Mi-

crobiol Biotechnol, 36(8), 1063-72. Cuny, P., Acquaviva, M. y Gilewicz, M. (2004). Phenan-

threne degradation, emulsification and surface tension activities of a Pseudomonas putida strain isolated from a coastal oil contaminated microbial mat. Ophelia, 58, 283-287.

D'aes, J., Hua, G. K., De Maeyer, K., Pannecoucque, J., Forrez, I., Ongena, M., Dietrich, L. E., Thomashow, L. S., Mavrodi, D. V. y Hofte, M. (2011). Biological control of Rhizoctonia root rot on bean by phenazine and cyclic lipopeptide-producing Pseudomonas CMR12a. Phyto-

pathology, 101, 996-1004. Das, P., Mukherjee, S. y Sen, R. (2008). Antimicrobial po-

tential of a lipopeptide biosurfactante derived from a ma-rine Bacillus circulans. J Appl Microbiol, 104, 1675-1684.

Desai, A. J., Patel, K. M., y Desai, J. D. (1988). Emulsifier production by Pseudomonas fluorescens during the growth on hydrocarbons. Current Science, 57(9), 500-501.

Desai, J. D. y Banat, I. M. (1997). Microbial production of surfactants and their commercial potential. Microbiol Mol

Biol Rev, 61, 47-64. Desai, J. D. y Desai, J. A. (1993). Production of biosurfac-

tants. En N. Kosaric (ed.), Biosurfactants. Marcel Dek-ker, New York, pp. 65–97.

Déziel, E., Lépine, F., Milot, S. y Villemur, R. (2003). rhlA

is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aerugino-

sa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy) alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids. Microbiol Sgm, 149, 2005-2013.

Dubern, J. F., Lagenrijk, E. L., Lugtenberg, B. J. J. y Bloemberg, G. V. (2005). The heat shock genes dnaK, dnaJ, and grpE are involved in regulation of putisolvin biosynthesis in Pseudomonas putida PCL1445. Journal

of Bacteriology, 187(17), 5967-76. Dubern, J. F., Lagendijk, E. L., Lugtenberg, B. J. J. y

Bloemberg, G. V. (2005). The heat shock genes dnaK, dnaJ, and grpE are involved in regulation of putisolvin biosynthesis in Pseudomonas putida PCL1445. J Bacteri-

ol, 187, 5967-5976. Dubern, J. F., Lugtenberg, B. J. J. y Bloemberg, G. V.

(2006). The ppuI-rsaL-ppuR quorum sensing system reg-ulates biofilm formation of Pseudomonas putida

PCL1445 by controlling biosynthesis of the cyclic lipopeptides putisolvin I and II. J.Bacteriol, 188, 2898-2906.

Dubey, K. y Juwarkar, A. (2001). Distillery and curd whey

wastes as viable alternative sources for biosurfactant pro-duction. World Journal of Microbiology and Biotechnolo-

gy, 17, 61-69. Dubern, J.F. y Guido, B. V. (2006). Infuence of environ-

mental conditions on putisolvins I and II production in Pseudomonas putida strain PCL1445. FEMS Microbiol

Lett, 263, 169-175. Edwards, J. R. y Hayashi, J. A. (1965). Structure of a rham-

nolipid from Pseudomonas aeruginosa. Arch. Biochem.

Biophys, 111, 415-421. Ellaiah, P., Prabhakar, T., Sreekanth, M., Taleb, A. T., Raju,

P. B. y Saisha, V. (2002). Production of glycolipids con-taining biosurfactant by Pseudomonas species. Indian J

Exp Biol, 40, 1083-1086. Finking, R. and M.A. Marahiel. (2004). Biosynthesis of

nonribosomal peptides. Annu. Rev. Microbiol. 58:453-88 Gautam K.K. y Tyagi V.K. (2006). Microbial surfactants: a

review. J. Oleo Sci, 55, 155-166. Georgiou, G., Lin, S. C. Sharma, M. M. (1992). Surface-

active compounds from microorganisms. Biotechnology, 10, 60-65.

Gewolb, J. (2002). Bioengineering. Working outside the protein-synthesis rules. Science, 295, 2205-2207.

Guenzi, E., Galli, G., Grgurina, I., Dennis, C. G., y Grandi, G. (1998). Characterization of the Syringomycin Synthe-tase gen Cluster. A link between prokaryotic and eukary-otic peptide synthetases. Journal of Biological Chemistry, 273(49), 32857-32863.

Gunther, N. W., Nunez, A., Fett, W. y Solaiman, D. K. Y. (2005). Production of rhamnolipids by Pseudomonas

chlororaphis, a nonpathogenic bacterium. Appl Environ

Microbiol, 71, 2288-2293. Gunther, N. W., Nunez, A., Fortis, L., Solaiman, D. K. Y.

(2006). Proteomic based investigation of rhamnolipid production by Pseudomonas chlororaphis strain NRRL B-30761. J Ind Microbiol Biotech, 33, 914-920.

Haba E., Espuny, M. J., Busquets, M. y Manresa, A. (2000). Screening and production of rhamnolipids by Pseudomo-

nas aeruginosa 47T2 NCIB40044 from waste frying oils. J. Appl. Microbiol, 88, 379-387.

Hansen, K.G., Desai, J. D. y Desai, A. J. (1993). A rapid and simple screening technique for potential crude oil degrading microorganisms. Biotechnology. Technology, 7, 745-748.

Heid, M., Kohnert, A. Tan, T. H., Nusser, M., Kirschhöfer, F., Brenner-Weiss, G., Franzreb, M. y Berensmeier S. (2009). Development and trends of biosurfactant analysis and purification using rhamnolipids as an example. Anal

Bioanal Chem, 391, 1579–1590Hemminger, P. (2005). Bioremediation of contaminated

soils. Biocycle, 46, 35-38. Henriksen, A., Anthoni, U., Nielsen, T.H., Sørensen, J.,

Christophersen, C. y Gajhede, M. (2000). Cyclic lipoundecapeptide tensin from Pseudomonas fluorescens

strain 96.578. Acta Crystal, 56, 113-115. Hildebrand, P. D. (1989). Surfactant-like characteristics and

identity of bacteria associated with broccoli head rot in Atlantic Canada. Canadian Journal of Plant Pathology,

Tlamati (2014) 5(2), 66-82

80

11(3), 205-224. Hisatsuka K., Nakahara, T., Sano, N. y Yamada, K. (1971).

Formation of rhamnolipid by Pseudomonas aeruginosa

and its function in hydrocarbon fermentation. Agr. Biol.

Chem. Tokyo, 35, 686-692. Hodge, J.D. y Hofreiter, B. T. (1962). Determination of

reducing sugars and carbohydrates. Methods in Carbohy-

drate Chemistry, 1: 380-394. Huber. B., Riedel, K., Kothe, M., Givskov, M., Molin, S. y

Eberl, L. (2002). gentic analysis of function involved in the late stages of biofilm development in Burkolderia

cepacia HIII. Mol Microbiol, 46, 411-426. Hultberg M, Alsberg, T., Khalil, S. y Alsanius, B. (2010).

Suppression of disease in tomato infected by Pythium

ultimum with a biosurfactant produced by Pseudomonas

koreensis. BioControl, 55(3), 435-444. Husain, S. (2008). Effect of surfactants on pyrene degrada-

tion by Pseudomonas fluorescens 29L. World J Microbiol

Biotechnol, 24, 2411-2419. Hutchinson, M. L., Tester, M. A. y Gross, D. C. (1995).

Role of biosurfactants and ion-channelforming activities of syringomycin in transmembrane ion flux - a model for the 150 mechanism of action in the plant-pathogen inter-action. Mol Plant Microbe Interact, 8, 610-620.

Hutchison, M. I. y Johnstone, K. (1993). Evidence for the involvement of the surface-active properties of the extra-cellular toxin tolaasin in the manifestation of brown blotch disease symptoms by Pseudomonas tolaasii on Agaricus bisporus. Physiol. Mol. Plant Pathol, 42, 373-384.

Itoh, S. y Suzuki, T. (1972). Effect of rhamnolipids on growth of Pseudomonas aeruginosa mutant deficient in n-paraffin-utilizing ability. Agric. Biol. Chem. Tokyo, 36, 2233-2235.

Jadhav, M., Kalme, S., Tamboli, D. y Govindwar, S. (2011). Rhamnolipid from Pseudomonas desmolyticum

NCIM-2112 and its role in the degradation of Brown 3REL. Journal of Basic Microbiology, 51(4), 385–396.

Jagtap, S., Yavankar, S., Pardesi, K. y Chopade, B. (2009). Production of bioemulsifier by Acinetobacter sp. from healthy human skin of tribal population. Ind J Expt Biol

(in press). Jain, D. K., Thompson, D. L. C, Lee, H. y Trevors, J. T.

(1991). A drop-collapsing test for screening surfactant producing microorganisms. J. Microbiol. Methods, 13, 271-279.

Janek, T., Lukaszewicz, M., Rezanka, T. y Krasowska, A. (2010). Isolation and characterization of two new lipopeptide biosurfactants produced by Pseudomonas

fluorescens BD5 isolated from water from the Arctic Ar-chipelago of Svalbard. Bioresour Technol, 101(15), 6118-23.

Janiyani, K.L., Wate, S.R. y Joshi, S. R. 1992. Surfactant production by Pseudomonas stutzeri. J Microb Biotech-

nol, 7, 18-21. Jarvis, F.G. y Johnson, M. J. (1949). A Glyco-lipide pro-

duced by Pseudomonas aeruginosa. J Am Chem Soc, 71, 4124-4126.

Jiménez, D. I., Medina, S. A. M. y Gracida, J. N. (2010). Propiedades, Aplicaciones y Producción de Biotensoac-tivos. Rev. Int. Contam. Ambient, 26(1) 65-84.

Kaplan N. y Rosenberg, E. (1982). Exopolysaccharide distribution of and bioemulsifier production by Acineto-

bacter calcoaceticus BD4 and BD413. Appl Environ

Microbiol, 44, 1335-1341. Kruijt, M., Tran, H. & Raaijmakers, J. M. (2009). Func-

tional, gentic and chemical characterization of biosur-factants produced by plant growth-promoting Pseudo-

monas putida 267. J Appl Microbiol, 107, 546-56. Koch, B., Nielsen, T.H., Sørensen, D., Andersen, J. B.

Christophersen, C., Molin, S., Givskov, M., Sørensen, J., y Nybroe, O. (2002). Lipopeptide Production in Pseudo-

monas sp. Strain DSS73 Is Regulated by Components of Sugar Beet Seed Exudate via the Gac Two-Component Regulatory System. Applied and Environmental Micro-

biology, 68(9), 4509-4516. Koch, A. K., Käppeli, O., Fiechter, A. Reiser, J. (1991).

Hydrocarbon assimilation and biosurfactant production in Pseudomonas aeruginosa mutants. J Bacteriol, 173, 4212-4219.

Kochi, M., Weiss, D. W., Pugh, L. H. y Groupé, V. (1951). Viscosin, a new antibiotic. Bacteriol Proc, 1, 29-30.

Kohli, R.M., Trauger, J.W., Schwarzer, D., Marahiel, M.A. y Walsh, C. T. (2001). generality of peptide cyclization catalyzed by isolated thioesterase domains of nonriboso-mal peptide synthetases. Biochemistry. 40, 7099-108

Kuiper I., Bloemberg, G.V. y Lugtenberg, B.J.J. (2001). Selection of a plant-bacterium pair as a novel tool for rhizostimulation of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria. Mol Plant-Microbe Interact, 14 1197-1205.

Kuiper I., Lagendijk, E.L., Pickford, R., Derrick, J.P., Lamers, G.E.M., Thomas-Oates, J.E., Lugtenberg, B.J. y Bloemberg, G.V. (2004). Characterization of two Pseu-

domonas putida lipopeptide biosurfactants, putisolvin II and I, which inhibit biofilms formation and break down existing biofilms. Mol Microbiol 51, 97-113.

Kwang-Hyun, C., Sung-Tae, K. y Young-Kee, K. (2007). Purification of a Pore-forming Peptide Toxin, Tolaasin, Produced by Pseudomonas tolaasii 6264. Journal of

Biochemistry and Molecular Biology, 40 (1), 113-118. Laycock, M.V., Hildebrand, P.D., Thibault, P., Walter, J.A.

y Wright, J.L.C. (1991). Viscosin, a potent peptidolipid biosurfactant and phytopathogenic mediator produced by a pectolytic strain of Psedomonas fluorescens. Journal

of Agricultural and Food Chemistre, 39, 483-489. Lépine, F., Déziel, E., Milot, S. y Villemur, R. (2002).

Liquid chromatographic/mass spectrometric detection of the 3-(3-hydroxyalkanoyloxy) alkanoic acid precursors of rhamnolipids in Pseudomonas aeruginosa cultures. J

Mass Spectrom 37, 41-46. Lim, S.P., Roongsawang, N., Washio, K. y Morikawa, M.

(2007). Functional analysis of a pyoverdine synthetase from Pseudomonas sp. MIS38. Biosci Biotechnol Bio-

chem, 71(8), 2002-9. Lim, S.P., Roongsawang, N., Washio, K. y Morikawa, M.

Tlamati (2014) 5(2), 66-82

81

(2009). Flexible exportation mechanisms of arthrofactin in Pseudomonas sp. MIS38. J Appl Microbiol, 107(1), 157-66.

Liu Z., Laha S. y Luthy, R.G.. (1991). Surfactant solubili-zation of polycyclic aromatic hydrocarbon compounds in soil-water suspensions. Water Sci. Technol. 23, 475-485.

Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L. y Randall, R. J. (1951). Protein measurement with the Folin phenol rea-gent. J Biol Chem, 193, 265-275.

Maier, R.M. y Soberón-Chávez, G.. (2000). Pseudomonas

aeruginosa rhamnolipids: biosynthesis and potential applications. Appl. Microbiol. Biot, 54, 625-633.

Maiqian, N., Xihou, Y., Chunyan, R., Yang, W., Feng, X. y Qirong S. (2010). Novel rhamnolipid biosurfactants pro-duced by a polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacterium Pseudomonas aeruginosa strain NY3. Bio-

technology Advances, 28(5), 635-643. Makkar, R.M. Cameotra, S. S. (1997). Biosurfactant pro-

duction by a thermophilic Bacillus subtilis strain. J Ind

Microbiol Bioeng, 18, 37-42. Makkar, R.S. y Cameotra, S. S. (2002). An update on the

use of unconventional substrates for biosurfactant pro-duction and their new applications. Appl Microbiol Bio-

technol, 58, 428-434. Manso-Pajarron, A., De Koster, C.G., Heerma, W., Sch-

midt, M. y Haverkamp, J. (1993). Structure identifica-tion of natural rhamnolipid mixtures by fast atom bom-bardment tandem mass spectrometry. Glycoconjugate J,

10, 219-226. Marsudi, S., Unno, H. y Hori, K. (2008). Palm oil utiliza-

tion for the simultaneous production of polyhydroxyal-kanoates and rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa. Appl Microbiol Biotechnol, 78(6), 955-61.

Martinez-Toledo A., Rios-Leal, E., Vazquez-Duhalt, R., Gonzalez-Chavez, M. C., Esparza-Garcia, F.J. y Rodri-guez-Vazquez, R. (2006). Role of phenanthrene in rham-nolipid production by P. putida in different media. Envi-

ron Technol, 27, 137-142. Matsuyama T., Sogawa, M. y Yano, I. (1987). Direct colo-

ny thin-layer chromatography and rapid characterization of Serratia marcescens mutants defective in production of wetting agents. Appl. Environ. Microbiol, 57, 1186-1188.

Mercade, M. E., Manresa, M. A., Robert, M., Espuny, M. J., de Andres. C. y Guinea, J. (1993). Olive oil mill ef-fluent (OOME). New substrate for biosurfactant produc-tion. Bioresource Technology, 43, 1-6.

Mishra P. K., Mishra, S., Bisht, S. C., Selvakumar, G., Kundu, S., Bisht J.K. y Gupta, H. S. (2009). Isolation, molecular characterization and growth-promotion activi-ties of a cold tolerant bacterium Pseudomonas sp.

NARs9 (MTCC9002) from the Indian Himalayas. Biol

Res, 42(3), 305-13. Mohamed, S., Al-Jilawi, H. M., y Ghazi, M. A. (2007).

Emulsification Properties of Biosurfactant Produced from Pseudomonas aeruginosa RB 28. Pakistan Journal

of Biological Sciences, 10, 1331-1335.

Monti, S.M., Gallo, M., Ferracane, R., Borrelli, R.C., Ri-tieni, A., Greco, M. L., Graniti, A. y Flogiano, V. (2001). Analysis of bacterial lipodepsipeptides by matrix assisted laser desorption/ionisation time-of-flight and high per-formance liquid chromatography with electrospray mass spectrometry. Rap Commun Mass Spectometry, 15, 623-8.

Morikawa, M., Hirata, Y. y Imanaka, T. (2000). A study on the structure-function relationship of lipopeptide biosur-factants. Biochim Biophys Acta, 1488, 211-218.

Mukherjee, S., Das, P. y Sen, R. (2006). Towards commer-cial production of microbial surfactants. Trends Biotech-

nol, 24, 509-515. Mulet, M., Lalucat, J. y Garcia-Valdés, F. (2010). DNA

sequence-based analysis of the Pseudomonas species. Enviromental Microbiology. 12(6), 1513-30.

Muller, M. M., Kugler, J. H., Henkel, M., Gerlitzki, M., Hormann, B., Pohnlein, M., Syldatk, C. y Hausmann, R. (2012). Rhamnolipids--next genration surfactants? J

Biotechnol, 162, 366-80. Mulligan, C.N. y Gibbs, B.F. (1989). Correlation of nitro-

gen metabolism with biosurfactant production by Pseu-

domonas aeruginosa. Applied Environment Microbiolo-

gy, 55, 3016-3019. Mulligan, C. (2009). Recent advances in the environmental

applications of biosurfactants. Current opinion of col-

loids and interface science, 14, 372-378. Murata, H. y Magae, Y. (1996). Toxin production in a

mushroom pathogenic bacterium, Pseudomonas tolaasii

strain PT814 is activated by signals present in a host, Pleurotus ostreatus, and those accumulating in the medi-um in the course of bacterial growth. En D. J. Royse (ed). Mushroom biology and mushroom products, 483-494.

Neu, T.R., Hartner, T. y Poralla, K. (1990). Surface active properties of Viscosin a peptidolipid antibiotic. Appl Mi-

crobiol Biotechnol, 32, 518-520. Nielsen T. H., D. Sørensen, C. Tobiasen, J. B. Andersen, C.

Christophersen, M. Givskov y J. Sørensen. (2002). Anti-biotic and Biosurfactant Properties of Cyclic Lipopep-tides Produced by Fluorescent Pseudomonas sp. From the Sugar Beet Rhizosphere. Applied and Environmental

Microbiology, 68(7), 3416–3423. Nitschke, M., Costa, S. y Contiero, J. (2009). Structure and

applications of a rhamnolipid surfactant produced in soy-bean oil waste. Appl Biochem Biotechnol. 160(7), 2066-74.

Nitschke, M. y Pastore, G.M. (2006). Production and prop-erties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis

grown on cassava wastewater. Bioresour Technol, 97, 336-341.

Nitschke, M., Costa, S.G.V., y Conteiro, J. (2005a). Rham-nolipid surfactants: an update on the general aspects of these remarkable biomolecules. Biotechnol Prog, 21, 1593-1600.

Nitschke M., Costa, S.G.V., Haddad, R., Gonçalves, L.A.G., Eberlin, M.N., y Conteiro, J. (2005b). Oil wastes as unconventional substrates for rhamnolipid biosurfac-

Tlamati (2014) 5(2), 66-82

82

tant production by Pseudomonas aeruginosa LBI. Bio-

technol Prog. 21, 1562-1566. Nunez, A., Ashby, R., Foglia T.A., y Solaiman, D. K. Y.

(2001). Analysis and characterization of sophorolipids by liquid chromatography with atmospheric pressure chemical ionization. Chromatographia, 53, 673-677.

Onbasli, D. y Aslim, B. (2009). Biosurfactant production in sugar beet molasses by some Pseudomonas spp. J

Environ Biol, 30, 161-163. Onbasli, D. y Aslim, B. (2009). Effects of some organic

pollutants on the exopolysaccharides (EPSs) produced by some Pseudomonas spp. strains. J Hazard Mater, 168(1), 64-7.

Palleroni, N.J. (1984). Genus I Pseudomonas Migula 1894. En N.R Kreig y J. G. Holt (Eds), Bergey´s Manual of

Systematic Bacteriology, Vol. 2. Baltimore, MD. USA: The Williams’s vs Wilkins Co., 323-379.

Patel, R.M. y Desai, A. J. (1997). Biosurfactant production by Pseudomonas aeruginosa GS3 from molasses. Letters

in Applied Microbiology, 25, 91-94. Patil, J.R. y Chopade, B. A. (2001a). Distribution and in

vitro antimicrobial susceptibility of Acinetobacter spe-cies on the skin of healthy humans. Natl Med J India, 14, 204-208.

Patil, J.R. y Chopade, B. A. (2001b). Studies on bioemulsi-fier production by Acinetobacter strains isolated from healthy human skin. J Appl Microbiol, 91, 290-298.

Persson, A., Molin, G. y Weibull, C. (1990a). Physiologi-cal and morphological changes induced by nutrient limi-tation of Pseudomonas fluorescens 378 in continuous culture. Applied Environment and Microbiology, 56, 686-692.

Persson, A., Molin, G. y Weibull, C. (1990b). Biosurfac-tant yields and nutrient consumption of Pseudomonas

fluorescens 378 studied in a microcomputer controlled multifermentation system. Biotechnology Bioengineer,

36, 252-255. Persson, A., Osterberg E. y Dostalek, M. (1988). Biosur-

factant production by Pseudomonas fluorescens 378: growth and product characteristics. Applied Microbiolo-

gy Biotechnology, 29, 1-4. Phale, P.S., Savithri, H.S., Rao, N. y Vaidyanathan, C. S.

(1995). Production of biosurfactan Biosur-pm by Pseu-

domona maltophila Csv89. Characteriation and role in hydrocarbon Uptake. Arch Microbiol, 163, 424-31.

Phetrong, K., H-Kittikun, A. y Maneerat, S. (2008). Pro-duction and characterization of bioemulsifier from a ma-rine bacterium, Acinetobacter calcoaceticus subsp. ani-

tratus SM7. Songklanakarin J Sci Technol, 30(3), 297-305.

Raaijmakers, J.M., de Bruijn I. y de Kock Maarten, J. D. (2006). Cyclic Lipopeptide Production by Plant-Associated Pseudomonas spp. Diversity, Activity, Bio-synthesis, and Regulation. MPMI, 19(7), 699-710.

Rahim, R., Ochsner, U. A., Olvera, C., Graninger, M., Messner, P., Lam, J. S. y Soberón-Chávez, G. (2001). Cloning and functional characterization of the Pseudo-

monas aeruginosa rhlC gen that encodes rhamnosyl-

transferase 2, an enzyme responsible for di-rhamnolipid biosynthesis. Mol Microbiol, 40, 708-718.

Rahman, P., Lungut, A., Idowu, J. Olea, M. (2009). Bio-surfactant production using novel bacteria from North-east England. Building business on bioscience sustaina-

ble innovation conference. Heriot-Watt University, Edin-burgh.

Rainey, P.B., Brodey, C.L. y Johnstone, K. (1993). Identi-fication of a gen cluster encoding three high-molecular-weight proteins, which is required for synthesis of tolaasin by the mushroom pathogen Pseudomonas

tolaasii. Mol Microbiol, 8(4), 643-52. Rapp, P., Bock, H., Wray, V. Wagner, F. (1979). For-

mation, isolation and characterization of trehalose dimy-colates from Rhodococcus erythropolis grown on n-alkanes. J Gen Microbiol, 115, 491-503.

Risse, D., Beiderbeck, H., Taraz, K., Budzikiewicz H. y Gustine, D. (1998). Bacterial constituents part LXXVII. Corrugatina, a lipopeptide siderophore from Pseudomonas corrugate. J. Biosci, 10, 869-80.

Robert, M., Mercade, M. E., Bosch, M. P., Parra, J. L., Espuny, M. J., Manresa M.A. y Guinea, J. (1989). Effect of the carbon source on biosurfactant production by Pseudomonas aeruginosa 44Ti. Biotechnology Letters,

11, 871-874. Rokni-Zadeh, H., LI, W., Sanchez-Rodriguez, A., Sinnae-

ve, D., Rozenski, J., Martins, J. C. y De Mot, R. (2012). gentic and functional characterization of cyclic lipopep-tide white-line-inducing principle (WLIP) production by rice rhizosphere isolate Pseudomonas putida RW10S2. Appl Environ Microbiol, 78, 4826-34.

Rokni-zadeh, H., Li, W., Yilma, E., Sanchez-Rodriguez, A. y De Mot, R. (2013). Distinct lipopeptide production systems for WLIP (white line-inducing principle) in Pseudomonas fluorescens and Pseudomonas putida. Environ Microbiol Rep, 5, 160-9.

Rosen, M. (2004). Surfactants and interfacial phenomena. John Wiley and Sons, Inc. USA.

Rosenberg, E., Zuckerberg, A., Rubinovitz, C. y Gutnick, D. L. (1979). Emulsifier of Arthrobacter RAG-1: isola-tion and emulsifying properties. Appl Environ Microbiol,

37, 402-408. Rosenberg, E. (1993). Exploiting microbial growth on

hydrocarbons- new markets. Tibtech, 11, 419-424. Segre, A., Bachmann, R.C., Ballio, A., Bossa, F.,

Grgurina, I., Iacobellis, N.S., Marino, G., Pucci, P., Sim-maco, M. y Takemoto, J. Y. (1989).The structure of sy-ringomycins A1, E and G. FEBS Lett, 255(1), 27-31.

Shirata, A., Sugaya, K., Takasugi M., y Monde, K. (1995). Isolation and biological activity of toxins produced by a Japanese strain of Pseudomonas tolaasii, the pathogen of bacterial rot of cultivated oyster mushroom. Ann.

Phytopathol.Soc. Jpn, 61, 493-502. Shulga, A. N., Karpenko, E.V., Eliseev, S.A. y Turovsky,

A. A. (1993).The method for determination of aniono-genic bacterial surface-active peptidolipids. Microbiol. J.

55, 85-88. Sieber, S.A. y Marahiel, M. A. (2005). Molecular mecha-

nisms underlying nonribosomal peptide synthesis: ap-proaches to new antibiotics. Chem Rev, 105, 715-738.