PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF CYSTEINE PROTEINASE FROM SOME VEGETABLES AND FRUITS

MRS. RATCHANEE SAIPRAJONG ASSISTANT PROFESSOR DR.SURAPONG PINITGLANG

ASSOCIATE PROFESSOR DR.KHANOK RATANAKHANOKCHAI

THE RESEARCH WAS FINANCIALLY SUPPORTED BY UNIVERSITY OF THE THAI CHAMBER OF COMMERCE

2009

การท าใหบรสทธและลกษณะจ าเพาะของเอนไซมซสเตอน โปรตเนส จากผกและผลไมบางชนด

Purification and characterization of cysteine proteinase from some vegetables and fruits

โดย

รชน ไสยประจง สรพงษ พนจกลาง กนก รตนะกนกชย

รายงานการวจยนไดรบทนสงเสรมงานวจยจากมหาวทยาลยหอการคาไทย พ.ศ. 2552

ชอเรอง : การท าใหบรสทธและลกษณะจ าเพาะของเอนไซมซสเตอน โปรตเนส จากผก และผลไมบางชนด

ผวจย : รชน ไสยประจง สาขาวชาวทยาศาสตรและเทคโนโลยการอาหาร คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยหอการคาไทย

ผวจยรวม : ผศ.ดร.สรพงษ พนจกลาง และ รศ.ดร.กนก รตนะกนกชย ปทแลวเสรจ : 2552 จ านวน 62 หนา ค าส าคญ : ซสเตอน โปรตเนส, Ficus hispida, ficain

บทคดยอ*

งานวจยมวตถประสงคเพอศกษาแหลงของเอนไซมซสเตอน โปรตเนส ในผกและ

ผลไมบางชนด ท าการศกษาในผลไมจ านวน 42 ตวอยาง และผกจ านวน 73 ตวอยาง พบวาผลไมใหผลบวก จ านวน 17 ตวอยาง และผกใหผลบวก จ านวน 39 ตวอยาง เมอท าการตรวจสอบชนดของเอนไซมโปรตเนสดวยสารยบยง พบวาเอนไซมโปรตเนสทพบในตวอยางสามารถแบงไดเปน 2 ชนด คอ เซรน โปรตเนส และซสเตอน โปรตเนส ในงานวจยนไดสนใจทจะน าเอนไซมไฟเซนจากมะเดอปลอง (Ficus hispida L.) มาศกษาแยกใหบรสทธ และลกษณะจ าเพาะบางสวนเนองจากมรายงานการศกษาทยงไมแพรหลายมาก โดยน าไฟเซนจาก Ficus hispida มาแยกใหบรสทธโดยตกตะกอนดวยแอมโมเนยมซลเฟตรอยละ 80 และแยกใหบรสทธในขนตอนเดยวดวยเทคนค covalent chromatography ผานคอลมน Thiopropyl Sepharose 6B เอนไซมทแยกไดจาก

มะเดอปลองถกยบยงดวย 2,2 dipyridyl disulphide (2PDS) และ iodoacetamide แสดงวาอยในกลมซสเตอน โปรตเนส เมอน ามาหาน าหนกโมเลกลโดยวธ sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) พบวาซสเตอน โปรตเนส จากมะเดอปลองใหแถบโปรตน 4 แถบทมน าหนกโมเลกลอยในชวง 23,000 ถง 45,000 ดาลตน เอนไซมทแยกไดเปนไกลโคโปรตนเนองจากใหผลบวกกบชดทดสอบ GelCode® glycoprotein staining ทง 4 แถบ แสดงวาเอนไซมจากมะเดอปลองเปนไกลโคโปรตนและอยในรป multiple form เมอน าโปรตนขนาด 23,000 ดาลตน ไปวเคราะหกรดอะมโนโดย Liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS/MS) พบกรดอะมโน จ านวน 55 ตว ทมความคลายคลงกบ Chain A จาก Carica papaya chymopapain และไดท านายโครงสรางสามมตของเอนไซม chymopapain โดยใชโปรแกรม Discovery Studio® Visualizer Version 2.01, Accelrys Software และน ากรดอะมโนทง 55 ตวมาเปรยบเทยบพบวาบรเวณ catalytic sites มความ

ก

เหมอนกบ chymopapain แสดงวามความใกลเคยงกนอยางยง เมอท าการศกษาการยอย ซบสเตรตสงเคราะหของเอนไซมไฟเซนจาก Ficus hispida พบวาเอนไซมไฟเซนสามารถยอย ซบสเตรตสงเคราะหคอ Gyl-Arg-p-nitroanilide dihydroxychloride, N-Benzoyl-L-Arginine-p-nitroanilide hydrochloride, Ala-Ala-Phe-p-nitroanilide, N-succinyl-Gly-Gly-Phe-p-nitroanilide และ N-succinyl-L-Phenylalanine-p-nitroanilide ไดดตามล าดบ แสดงใหเหนวาต าแหนง subsite P1 เอนไซมไฟเซนจากมะเดอปลองมความจ าเพาะส าหรบกรดอะมโน arginine

* ผลงานวจยเรองนไดรบทนสงเสรมการวจย ส าหรบพนกงานประจ ามหาวทยาลยหอการคาไทย

ข

Title : Purification and characterization of cysteine proteinase from some vegetables and fruits Researcher : Ratchanee Saiprajong Department of Food Science and Technology School of Science

University of the Thai Chamber of Commerce Co-researcher : Assit.Prof.Dr.Surapong Pinitglang and Assoc.Prof.Dr.Khanok RatanaKhanokchai Year of Accomplishment : 2009 No. of Pages : 62 Pages Key words : cysteine proteinase, Ficus hispida, ficain

Abstract*

The aim of this study is to screen source of cysteine proteinase from some

vegetables and fruits. The fruit sample showed positive result on AZCL-casein plate 17 from 42 samples and vegetable showed 39 from 73 samples. The enzyme from fruit and vegetable can be classified into two types proteinase; serine and cysteine proteinases by using specific inhibitors. In this study we focus in ficain from Ficus hispida L. because it has been a very few studies. Ficain (EC3.4.22.3), cysteine proteinase from latex of Ficus hispida was purified by 80% saturated ammonium sulphate precipitation

and single-step Thiopropyl Sepharose 6B covalent chromatography. The enzyme

activity was completely inhibited by 2,2 dipyridyl disulphide (2PDS) and iodoacetamide, indicating that the purified enzyme is a member of cysteine proteinase. The molecular weight of purified enzyme was determined by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The cysteine proteinase from Ficus hispida had four major bands with molecular weight range of 23,000 to 45,000 dalton. The purified multiple form enzymes were glycoprotein because each band showed positive with GelCode® glycoprotein staining kit. Major band from SDS-PAGE at 23,000 dalton was determined for amino acid residue by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS/MS). The major band of purified enzyme had 55 amino acids matched to Chain A from Carica papaya chymopapain . The three-dimensional structure of chymopapain was generated by Discovery Studio® Visualizer Version 2.01, Accelrys

ค

Software. A comparison of the short amino acid sequences around the catalytic sites of the chymopapain indicates a high degree of similarity. In investigating the ficain from Ficus hispida L. can rapidly catalyze the hydrolysis of Gyl-Arg-p-nitroanilide dihydroxychloride, N-Benzoyl-L-Arginine-p-nitroanilide hydrochloride, Ala-Ala-Phe-p-nitroanilide, N-succinyl-Gly-Gly-Phe-p-nitroanilide, and N-succinyl-L-Phenylalanine-p-nitroanilide. This result indicated that P1 subsite of ficain specifics for amino acid arginine.

* The research was financially supported by University of the Thai Chamber of Commerce

ง

กตตกรรมประกาศ

คณะผวจยขอขอบคณ มหาวทยาลยหอการคาไทย ทใหทนอดหนนและสนบสนนการท าวจยในครงน ขอขอบคณคณะวทยาศาสตร ทใหการสงเสรมในการท าวจยโดยใหความสะดวกในการใชอาคารสถานท วสดอปกรณและเครองมอตางๆ และขอขอบคณอาจารย ครปฏบตการ และเจาหนาท สาขาวชาวทยาศาสตรและเทคโนโลยการอาหารทอ านวยความสะดวกในการท าวจยในครงนใหส าเรจลลวงไปดวยด ทายสด ขอขอบพระคณ ทกก าลงใจทใหการสนบสนนการท างานในครงนส าเรจลลวงเปนอยางด คณะผท าวจย มกราคม 2553

จ

สารบญ

หนา บทคดยอภาษาไทย ก บทคดยอภาษาองกฤษ ค กตตกรรมประกาศ จ สารบญ ฉ สารบญตาราง ช สารบญรป ซ บทท

1. บทน า 1 2. เอกสารและงานวจยทเกยวของ 3 3. ระเบยบวธวจย 11 4. ผลการทดลอง 24 5. สรปการวจยและขอเสนอแนะ 40

เอกสารอางอง 42 ภาคผนวก 45

ฉ

สารบญตาราง

ตารางท หนา

ตารางท 2.1 ชนดและแฟมลของซสเตอน โปรตเนส และแหลงทมา 5 ตารางท 3.1 ตวอยางผลไมชนดตางๆ และสวนทใชในการทดลอง 12 ตารางท 3.2 ตวอยางผกชนดตางๆ และสวนทใชในการทดลอง 14 ตารางท 4.1 ผลการคดเลอกแหลงของเอนไซมซสเตอน โปรตเนสจาก 25

ตวอยางผลไมชนดตางๆ บน AZCL-casein plate ตารางท 4.2 ผลการคดเลอกแหลงของเอนไซมซสเตอน โปรตเนสจาก 27

ตวอยางผลไมชนดตางๆ บน AZCL-casein plate ตารางท 4.3 ผลการท าปฏกรยากบตวยบยงชนดตาง ๆ บน AZCL-casein plate 30 ตารางท 4.4 ผลของสารยบยงทมตอเอนไซมซสเตอน โปรตเนส จากมะเดอปลอง 38

ช

สารบญรป

รปท หนา รปท 3.1 AZCL-casein agar plate 17 รปท 3.2 การหยดสารสกดเอนไซมจากตวอยางชนดตางๆ บน AZCL-casein plate 18 รปท 3.3 ขนตอน covalent chromatography by thiol-disulphide interchange 20 รปท 4.1 blue zone ทเกดจากการยอยโปรตนของเอนไซมบน AZCL-casein plate 24 รปท 4.2 ลกษณะของมะเดออทมพร (Ficus racemosa) ผลสก 31 รปท 4.3 รปแบบของโปรตนทไดจากมะเดออทมพร แยกโดยใชวธ SDS-PAGE 33 รปท 4.4 ลกษณะของมะเดอปลอง (Ficus hispida L.) ผลมขนาดเลก 34 และล าตนเปนปลองๆ รปท 4.5 รปแบบของโปรตนทไดจากมะเดอ แยกโดยใชวธ SDS-PAGE 35 รปท 4.6 SDS-PAGE ของเอนไซมซสเตอนโปรตเนสทผานการท าใหบรสทธ 36 จาก Thiopropyl Sepharose 6B covalent column

รปท 4.7 ล าดบของกรดอะมโนจากไฟซนจากมะเดอปลองท Matched 37 กบ Chain A จาก Carica papaya Chymopapain (ตวอกษรสแดง) รปท 4.8 โครงสรางสามมตของเอนไซม Chymopapain 37

ซ

1

บทท 1

บทน ำ

ปจจบนไดมการน าเอาเอนไซมมาประยกตใชในอตสาหกรรมอาหารมากขน เพอพฒนาผลตภณฑอาหาร เชน กลน รส เนอสมผส เปนตน ใหไดตรงตามความตองการของผบรโภคมากยงขน เอนไซมทน ามาใชในอตสาหกรรมอาหารไดแก เอนไซมโปรตเนส (Proteinase) อะไมเลส(Amylase) อนเวอรเทส (Invertase) เปนตน ซงเอนไซมทมความส าคญทสดส าหรบการน ามาประยกตใชในอตสาหกรรมอาหารคอ เอนไซมโปรตเนส ซงไดแกเอนไซมในกลม เปปซน ทรปซน ไคโมทรปซน คารบอกซเปปตเดส และอะมโนเปปตเดส โดยจะไดมาจากแหลงตาง ๆ กน เชน สตว พชผกผลไม และจลนทรย เปนตน โดยน ามาใชในอตสาหกรรมอาหารหลายประเภทไดแก อตสาหกรรมเนยแขง อตสาหกรรมเบยร และไวน อตสาหกรรมการแปรรปเนอสตว อตสาหกรรมธญพช อตสาหกรรมสารปรงรส และอตสาหกรรมการผลตโปรตนไฮโดรไลเซท โดยประโยชนส าคญของเอนไซมโปรตเนสนน จะเปนตวเรงปฏกรยาทเกดในสงมชวต (Biocatalyst) ท าใหอตราเรวของปฏกรยาเพมสงขนได 108-1014 เทาของปฏกรยาเดมทไมมเอนไซมเปนตวเรง ดงนนในอตสาหกรรมอาหารจงนยมใชเอนไซมโปรตเนสเปนอยางมาก แตจากผลการศกษาขอมลพบวาในประเทศไทยมการผลตหรอสกดเอนไซมโปรตเนสในปรมาณทนอยมาก สวนใหญทางโรงงานอตสาหกรรมจะสงซอจากตางประเทศเปนสวนใหญ

ประเทศไทยเปนภมประเทศทเหมาะแกการท าเกษตรกรรม จงท าใหประเทศไทยมอาชพเกษตรกรรมเปนสวนใหญ ซงสงผลใหผกและผลไมในบางฤดกาลมปรมาณและการผลตสงจงท าใหผกและผลไมนนเกดผลผลตลนตลาดซงสงผลท าใหผกและผลไมมมลคาทางการคาต า ท าใหเกษตรกรเกดภาวะขาดทน ดงทไดกลาวขางตนแลววาแหลงทใชในการผลตเอนไซมนนจะไดมาจากแหลงตางๆ กน เชน สตว พช ผก ผลไมและจลนทรย ดงนนจงไดมความสนใจทจะศกษาแหลงของเอนไซมโปรตเนสแหลงใหมๆ จากผกและผลไม เพอใชเปนแหลงในการผลตเอนไซม โปรตเนสในระดบอตสาหกรรม เพอเปนการเพมมลคาทางการคาของผกและผลไมใหเพมสงขนและท าใหผกและผลไมนนไมเกดสภาวะลนตลาด และท าใหเกษตรกรมรายไดเพมมากขนกวาเดมและเพอเปนการเพมองคความรทางดานเอนไซม ซสเตอน โปรตเนสชนดใหมทแยกไดจากพช

2

ในงานวจยนจงไดท าการคดเลอกแหลงในการผลตเอนไซมโปรตเนสจากผกและผลไม ท าการแยกเอนไซมโปรตเนสใหบรสทธดวยวธการ covalent chromatography ศกษาสมบตทางเคมและทางกายภาพบางสวนของเอนไซม และรวมทงวเคราะหโปรตนทไดดวยเครอง MALDI-TOF Mass Spectrometry และ Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LC/MS-MS) เพอน า ผลการทดลองทไดมาศกษากรดอะมโนและเปปไทดของเอนไซมซสเตอน โปรตเนสทแยกไดและพฒนาน าเอนไซมโปรตเนสนไปใชในอตสาหกรรมตอไป นอกจากนยงเปนการสรางองคความรใหมเกยวกบเอนไซมโปรตเนสชนดใหมจากผกและผลไม วตถประสงคของโครงการวจย 1) เพอคดเลอกแหลงของเอนไซมซสเตอน โปรตเนสในผกและผลไม 2) เพอท าการแยกเอนไซม ซสเตอน โปรตเนสชนดใหมใหบรสทธโดยวธ covalent chromatography 3) เพอศกษาสมบตทางเคมของเอนไซมซสเตอน โปรตเนส

3

บทท 2

เอกสารและผลงานวจยทเกยวของ ชนดและสมบตของเอนไซมโปรตเอส

โปรตเอสเปนเอนไซมทยอยสลายพนธะเปปไทดของโปรตนใหเปนกรดอะมโนและ โอลโกเปปไทดตางๆ โปรตเอสชนด endopeptidase สามารถเรยกไดอกชอหนงวาโปรตเนส ซง โปรตเนสผลตไดจากพช สตว และจลนทรย โดยในระยะแรกๆ นนศกษาการผลตโปรตเนสในพชและสตวเปนสวนใหญ โปรตเนสทผลตจากพช เชน โบรมเลนจากสบปะรด ปาเปนจากยางมะละกอ โปรตเนสทผลตจากสตว เชน เรนนน จากกระเพาะลกวว อยางไรกตามโปรตเนสทมบทบาทส าคญทสดคอ โปรตเนสทผลตจากจลนทรย ซงจลนทรยทสามารถผลตโปรตเนสไดมทงเชอแบคทเรยและรา โปรตเนสเปนเอนไซมทมบทบาทมากในอตสาหกรรมหลายประเภท เชน อตสาหกรรมอาหาร อตสาหกรรมทอผา อตสาหกรรมฟอกหนง อตสาหกรรมเยอกระดาษ อตสาหกรรมเคม อตสาหกรรมยา อตสาหกรรมถายรป การบ าบดของเสย และโดยเฉพาะอตสาหกรรมสารซกลาง มปรมาณการใชและคดเปนมลคามากทสดเมอเปรยบเทยบกบอตสาหกรรมอนๆ (Helle และ Boyce, 1990; Kumar และ Takagi, 1999) ไดมการจดแบงชนดของโปรตเนสไวหลายวธ เชน แบงตามจดก าเนดไดเปนสามชนดคอ จากพช สตว และจลนทรย หรอแบงตามลกษณะการตดบนสายโพลเปปไทดไดเปนสองชนดคอ exopeptidase ซงท าหนาทตดทปลายสายโพลเปปไทด และ endopeptidase ซงท าหนาทตดภายในระหวางสายโพลเปปไทด หรอถาแบงตามลกษณะบรเวณเรงของเอนไซมสามารถแบงไดเปนสชนด และทกชนดเปน endopeptidase ดงนนอกชอหนงทใชเรยกเอนไซมทเปน endopeptidase นวา proteinase ไดแก metalloproteinase, acid proteinase, cystein proteinase และ serine proteinase

สามารถแบงโปรตเนสออกเปน 4 กลม โดยอาศยความแตกตางของสภาวะในการท างานของเอนไซม ไดแก 1. Metalloproteinase (EC 3.4.24) เปนโปรตเนสทอออนของโลหะกระตนการท างานของเอนไซม และพบอออนของโลหะทบรเวณเรง แบงออกเปน 2 กลม คอ 1.1 Neutral proteinase เปนเอนไซมทมอะตอมของสงกะส (Zn) อย ทบรเวณเรง ท างานไดดท pH เปนกลางเมอใชซบสเตรตสงเคราะห FAGLA (furylacrolylglycylleucinamide) และถกยบยงการท างานไดดวยสารพวก chelating agent เชน ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) และ 1,10-phenantroline โมเลกลของเอนไซมจะม เสถยรภาพเพมขน เมอม

4

แคลเซยม ตวอยางของนวทรลโปรตเนสทส าคญ ไดแก thermolysin ทผลตจาก Bacillus นวทรลโปรตเนสนยมน าไปใชในอตสาหกรรมอาหาร อตสาหกรรมฟอกหนง และอตสาหกรรมยา 1.2 Alkaline-metalloproteinase เปนเอนไซมทมโลหะเปนสวนประกอบทบรเวณเรง ท างานไดดในชวง pH 7.0 ถง 9.0 ในการยบยงแอคตวตของเอนไซมดวย EDTA นน ตองใช EDTA ทมความเขมขนมากกวา 10-2 โมลาร จงสามารถยบยงการท างานของเอนไซมได เหมาะทจะน าไปใชในอตสาหกรรมสารซกฟอก 2. Acid proteinase (EC 3.4.23) หรอเรยกอกชอหนงวา aspartic proteinase เนองจากมหมคารบอกซลของกรดอะมโนแอสปารตกอยทบรเวณเรงของเอนไซม จลนทรยทผลตเอนไซมน สวนใหญเปนพวกราและยสต แตมแบคทเรยบางชนดผลตไดดวย เอนไซมม pH ทเหมาะสมในการท างานอยในชวง 2.0 ถง 4.0 เอนไซมในกลมน ไดแก เรนนน และเปปซน ซงถกยบยงการท างานดวยสาร diazoketone แตไมถกยบยงดวยสาร EDTA และ diisopropyl fluorophosphate (DFP) น าหนกโมเลกลอยในชวง 30 ถง 40 kDa สามารถเกดปฏกรยาจ าเพาะไดดกบกรดอะมโนทมโครงสรางแบบ aromatics การใชประโยชนของเอนไซมสวนใหญใชในอตสาหกรรมการผลตผลตภณฑโปรตนจากถวเหลอง เชน ซอว และเตาเจยว เปนตน นอกจากนยงใชในอตสาหกรรมขนมอบและเนยแขงดวย 3. Cysteine proteinase (EC 3.4.22) หรอเรยกอกชอหนงวา sulphydryl proteinase เปนเอนไซมทท างานไดดในชวง pH คอนขางเปนกลาง ถกเรงปฏกรยาไดดเมอมสารรดวซ ไดแก HCN หรอ กรดอะมโน ซสเตอน และถกยบยงปฏกรยาโดยสารจ าพวก sulphydryl reagent ไดแก p-chloromercury benzoate (PCMB) สวนสาร DFP มผลยบยงปฏกรยาเพยงเลกนอยเทานน มน าหนกโมเลกลอยในชวง 30 ถง 50 kDa ซสเตอน โปรตเนส สามารถแบงออกเปน 6 แฟมล ไ ด แ ก clostripain, calpain, papain, interleukin-1--converting, piconavirus cysteine proteinase และ streptococcal proteinase แหลงของซสเตอน โปรตเนส มหลายชนด เชน พบใน พช สตว และจลนทรย (ดงแสดงในตารางท 2.1) (Surapong, 1996) เอนไซมทจดอยในกลมน สวนใหญไดจากพชชนสง เชน ปาเปน และโบรมเลน และผลตไดจากจลนทรยบางชนด เชน Clostridium spp. และ Streptococcus spp. 4. Serine proteinase (EC 3.4.21) เอนไซมกลมนมกรดอะมโนเซรน และฮสทดนอย ทบ รเวณ เรง ถกยบย งป ฏ ก รยาดวยสาร DFP และ phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) โดยทวไปเอนไซมมชวง pH ทเหมาะสมในการท างานคอนขางกวางระหวาง 4.0 ถง 11.0 อะตอมของโลหะแคลเซยมอออนอาจชวยท าใหเอนไซมมเสถยรภาพมากขน มน าหนกโมเลกลอยใน ช วง 15 ถ ง 30 kDa อลคาไล น โป รต เนสส วน ใหญ ผล ตจาก Bacillus sp. ได แก B. licheniformis, B. subtilis และ alkaliphilic Bacillus sp. โดยเอนไซมจะถกสรางและปลอย

5

ออกอยางอสระในน าเลยงเชอ และอาจรวมกบโปรตเนสชนดอนดวย เชน นวทรลโปรตเนส โดยอาจมการสรางอลคาไลนโปรตเนสไปพรอมๆ กบนวทรลโปรตเนส หรออาจสรางนวทรลโปรตเนสกอนอลคาไลนโปรตเนสกได ตารางท 2.1 ชนดและแฟมลของซสเตอน โปรตเนส และแหลงทมา

Family Enzyme (EC number) Source

Papain Papain Papain Papain Papain Papain Papain Papain Papain Papain Papain

Papain (3.4.22.2)

Caricain (3.4.22.30) Chymopapain A (3.4.22.6)

Chymopapain M (3.4.22.25) Actinidin (3.4.22.14) Asclepain (3.4.22.7)

Ficin (3.4.22.3) Ananain (3.4.22.31)

Stem bromelain (3.4.22.32) Fruit bromelain (3.4.22.33)

Legumain (3.4.22.34)

Plants Carica papaya Carica papaya Carica papaya Carica papaya

Actinidin chinensis Asclepias syriaca

Ficus glabata Ananas comosus Ananas comosus Ananas comosus

Vigna nadiata

Streptococcal proteinase

Clostripain Clostripain Clostripain

piconavirus cysteine proteinase

piconavirus cysteine proteinase

papain

Stretopain (3.4.22.10) Clostripain (3.4.22.10) Gingipain R (3.4.22.37)

Der pl (NA) Picornain 3C (3.4.22.28) Picornain 2A (3.4.22.29) Histolysain (3.4.22.35)

Microbial Haemolytic streptococci Clostridium histolyticum Porphyrmonas gingivalis

Dermatophagoides pteronyssinus Picornavirus Picornavirus

Entamaeba histolytica

6

ตารางท 2.1 (ตอ) Family Enzyme(EC number) Source

papain papain papain papain papain Calpain

interleukin-1--converting enzyme

Cathepsin B (3.4.22.1)

Cathepsin H (3.4.22.16) Cathepsin L (3.4.22.15) Cathepsin S (3.4.22.27) Cathepsin T (3.4.22.24)

Calpain (3.4.22.17) interleukin-1--converting

enzyme

Animal Rat liver, Human Liver Rat liver, Human Liver

Bovine spleen Chicken skeletal muscle

Bovine spleen Pig kidney

Human blood monocytes

ทมา : Surapong, 1996 ยงมรายงานการศกษาเอนไซมซสเตอน โปรตเนส จากแหลงตางๆ รวมถงเทคนคในการ

แยกใหบรสทธ ดงน - Williams และ Whitaker 1969 ไดศกษาเอนไซมไฟซน (ficin) จาก Ficus glabrata โดยใช CM-cellulose chromatography พบวาเอนไซมจาก Ficus glabrata เปน multiple molecular form ประกอบไปดวย 6 component ทม peptide map เหมอนกน

- Brocklehurst และคณะ 1973 ไดรายงานเกยวกบการใชเทคนค covalent chromatography ในการแยกใหบรสทธเอนไซมในกลมซสเตอน โปรตเนส โดยอาศยหลกการทเอนไซมในกลมนบรเวณเรงจะมหม thiol อย เมอน ามาแยกใหบรสทธดวยเทคนค covalent chromatography เอนไซมจะเขาไปจบกบเจลดวยพนธะโควาเลนท หลงจากนนท าการชะออกมาดวยบฟเฟอร โดยในรายงานนไดท าการแยกเอนไซมปาเปนจากยางมะละกอโดยใช Sepharose –glutathione-2-pyridyl disulphide gel พบวาเมอท าการยอย -N-benzoyl-L-arginine ethyl

ester ท pH 6.0 พบวาใหคา Km = 18.2<0.1 มลลโมลาร และ kcat=16.40.5s-1 - Lowe 1976 ไดรายงานวาเอนไซมซสเตอน โปรตเนส เปนเอนไซมทมหม thiol ของ

เอนไซมซสเตอน โปรตเนส อยบนบรเวณเรง พบในสตวเลยงลกดวยน านม พช และแบคทเรย รายงานนไดมองไปทโปรตเนสจากพช เชน ปาเปน ไฟซน และstem bromelain และ streptococcal proteinase haemolytic streptococci โดยรายงานวาเอนไซมปาเปนเปนเอนไซมทมการศกษาอยางกวางขวาง

7

- Paul และคณะ 1976 ไดศกษาเอนไซมไฟซน (ficin) จาก Ficus glabrata โดยใชเทคนค

covalent chromatography และศกษาลกษณะของ active centre โดยใช 2,2-Dipyridyl Disulphide โดยน ายางของ Ficus glabrata มาแยกใหบรสทธโยใชเทคนค covalent chromatography ในคอลมน Sepharose –glutathione-2-pyridyl disulphide gel - Abe และคณะ 1987 ไดศกษาการแยกใหบรสทธและสมบตของเอนไซมซสเตอน โปรตเนส จากเมลดขาวทก าลงงอกไดโดยแยกใหบรสทธ ตามขนตอนดงน (NH4)2SO4 CM-Sephadex Chromatography, Sephadex G-100 gel filtration, Phenyl-Sepharose CL-4B Chromatography และ Chromatofocusing พบวาซสเตอน โปรตเนส มน าหนกโมเลกล 23 kDa มคา isoelectric point ท pH 5.15 และมคา pH ทเหมาะสมเทากบ 5.5 และ 5.75 เมอใช

-N-benzoyl-DL-arginine-2-naphthylamide และ casein ตามล าดบ นอกจากนพบวาเอนไซมนถกยบยงการท างานโดย leupeptin antipain และE-64 ดงนนจงจดเอนไซมนอยในกลม ซสเตอน โปรตเนส (cysteine proteinase (EC3.4.22))

- Buttle และคณะ 1989 ไดท าการศกษาเอนไซมซสเตอน โปรตเนสจากยางมะละกอ (Carica papaya) โดยน ายางมะละกอมาท าใหแหงโดยวธ spray-dried จากนนน ามาท าใหบรสทธโดยเทคนค affinity chromatography บน Gly-Phe-aminoacetonitrile เชอมตอกบ CH-Sepharose 4B และท าการชะดวย 2-hydroxyethyl disulphide pH 4.5 ได papain และ papaya cysteine IV น ามาแยกโดยเทคนค cation-exchange chromatography และจากการศกษาลกษณะจ าเพาะเบองตนพบวามความใกลเคยงกบ chymopapain ทงขนาดโมเลกลและประจ

- Rowan และคณะ 1990 ไดท าการศกษาแยกเอนไซมซสเตอน โปรตเนส จากสบประรด (Ananas comosus) โดยใชวธทเกยวของกบ active-site directed affinity chromatography พบวาซสเตอน โปรตเนสในสวน crude pineapple stem extract ม 4 ชนด ไดแก stem bromelain (major component) ananain comosain และ fruit bromelain

- Jiang และคณะ 1994 ไดแยกใหบรสทธและศกษาลกษณะเฉพาะของ cysteine proteinase จากปลา Mackerel (Scomber australasicus) เมอน าเอนไซมมาแยกใหบรสทธโดย HiLoad DEAE-Sepharose, HiLoad S Sepharose และ FPLC Superdex 75 chromatography พบวา มน าหนกโมเลกลประมาณ 99 kDa เมอใช Superose 12 Gel filtration เมอน ามาตรวจสอบความบรสทธโดยวธ SDS-PAGE พบ แถบโปรตน 2 แถบ มน าหนกโมเลกลเทากบ 35 และ 23 kDa ตามล าดบ สามารถไฮโดรไลซ Z-Phe-Arg-MCA และ Z-Arg-Arg-MCA ไดแตไมสามารถไฮโดรไลซ Z-Arg-MCA และ L-Arg-MCA ได pH และอณหภมทเหมาะสมเมอไฮโดรไลซ Z-Arg-Arg-MCA เทากบ 6.0 และ 35 องศาเซลเซยส ตามล าดบ

8

- Walker และคณะ 1998 ไดศกษาความสามารถในการไฮโดรไลซ โปรตนใน crop, digestive gland และ salivary gland extract จาก Field Slug (Deroceras reticulatum) พบวาม proteolytic เอนไซมอยหลายชนด ทง aspartic acid proteinase, metalloproteinases หรอ serine proteinase พบวาเอนไซมทเปนชนดหลกทพบคอ เอนไซมซสเตอน โปรตเนส มน าหนกโมเลกลประมาณ 40 kDa โดยวธ SDS-PAGE

- Kundu และคณะ 2000 ไดศกษาเอนไซมซสเตอน โปรตเนส จากพชสมนไพร Ervatamia coronaria พบวาประกอบดวยเอนไซมซสเตอน โปรตเนส 3 ชนด เรยกวา Ervatamin เมอน า Ervatamin B มาแยกใหบรสทธโดยใช ion-exchange chromatography และ crystallization พบวามน าหนกโมเลกล 26 kDa โดยวธ SDS-PAGE และ Gel filtration และเมอไฮโดรไลซ ซบสเตรตสงเคราะห N-succinyl-alanine-alanine-alanine-p-nitroanilide พบวามคา Km และ

Kcat เทากบ 6.6 0.5 มลลโมลาร และ1.87 x 102 s-1 ตามล าดบ มคา pH ทเหมาะสมเทากบ 6.0-6.5 เมอใช azocasine เปนซบสเตรต และมคาเทากบ 7.0-7.5 เมอใช azoalbumin เปนซบสเตรต มอณหภมทเหมาะสมเทา 50-55 องศาเซลเซยส

- Freitas และคณะ 2007 ไดศกษาแอคตวตของเอนไซมและรปแบบโปรตนของน ายางจาก Calotropis procera โดยวธ 1D และ 2D electrophoresis Mass Spectrometry(MALDI-TOF) และศกษาถงความสามารถในการไฮโดรไลซโปรตน จากการศกษาพบวาในน ายางของ มเอนไซมซสเตอน โปรตเนส อยางนอย 4 ชนด

- Vallés และคณะ 2007 ไดศกษาลกษณะเฉพาะของเอนไซมยอยโปรตนชนดใหมจาก ripe fruits ของ Bromelia antiacantha โดยน า crude extract มาแยกใหบรสทธบางสวนโดยใช อะซโตน พบวาสารสกดดงกลาวใหกจกรรมของเอนไซม >80% ท pH 5.0-9.0 และถกยบยงอยางสมบรณ ดวย E-64 trans-epoxysuccinyl-leucyl-amido (4-guaidino)-butane และ iodoacetic acid เมอท าการศกษา IEF-zymogram พบวามแถบโปรตน 5 แถบ

- Kyndt และคณะ 2007 ไดศกษาการแยกใหบรสทธและลกษณะจ าเพาะของเอนไซมซสเตอน โปรตเนส จากยาง Vasconcellea spp. 3 สายพนธเทยบกบ Carica papaya จากการทดลองพบวาเอนไซมซสเตอน โปรตเนส จากยาง Vasconcellea spp. มความใกลเคยงกบเอนไซมซสเตอน โปรตเนสจาก Carica papaya การวเคราะหโปรตนดวยเครอง MALDI-TOF Mass Spectrometry การวเคราะหโปรตนเพอจ าแนกวาเปนโปรตนชนดใดบางนน ตองใชวธการหาน าหนกโมเลกล (molecular weight) เพอน าไปเปรยบเทยบกบฐานขอมลของโปรตนมาตรฐาน ซงการหาน าหนกโมเลกลของโปรตนสามารถท าไดหลายวธเชน SDS-PAGE เปรยบเทยบกบโปรตน

9

มาตรฐาน ปจจบนเครองมอทนยมมาใชคอ Mass Spectrometer โดยใชหลกการยงแสงเลเซอรลงไปบนตวอยางโปรตนใหเกดการแตกตวของอออน (ion) แลวเคลอนทไปตามทอสญญากาศทมสนามไฟฟา ภายใตภาวะดงกลาวสารทมวลโมเลกลนอยจะเคลอนทไปไดเรวกวาสารทมมวลโมเลกลมาก และตกกระทบกบตวตรวจจบ (detector) สงเปนสญญาณไปยงระบบคอมพวเตอรเพอวเคราะหผลตอไป สามารถวเคราะหโปรตนทมปรมาณนอยมาก และใหผลทถกตองแมนย า นอกจากนยงสามารถเชอมโยงกบระบบฐานขอมลในอนเตอรเนตไดอกดวย การท านายโครงสราง 3 มต

ความส าคญของโครงสราง 3 มต การศกษาโครงสราง 3 มตของเอนไซม จะท าใหเขาใจถงการมวนตวของสายโพลเปปไทด

ทจะน าเอา side chain ของกรดอะมโนตางๆ ทท าหนาทส าคญในการเรงปฏกรยาใหมาอยใกลชดกนเกดเปนบรเวณเรงปฏกรยา (active site) ของเอนไซมซงเปนบรเวณทซบสเตรต โคเอนไซม โคแฟกเตอร หรอ สารทมโครงสรางคลายซบสเตรต (substrate analogue) เขาจบกบเอนไซม โครงสราง 3 มตของเอนไซมชวยในการศกษาโครงสรางของบรเวณเรงปฏกรยา และการท าปฏกรยาของซบสเตรตกบบรเวณเรงปฏกรยา ซงเมอน าผลนมาประกอบกบการศกษาจากการใชเทคนคอนๆ จะชวยใหเขาใจถงวธการท างานของเอนไซมไดดขน การศกษาโครงสราง 3 มตของเอนไซมนนจะใชวธ X-ray diffraction เพอดการหกเหและการกระจายของแสงรงส X-ray ทเกดตอผลกของเอนไซม ซงสามารถบอกถงต าแหนงของอะตอมตางๆ ของเอนไซม จากขอมลเหลานเมอน ามาประกอบกบขอมลการเรยงล าดบกรดอะมโน (amino acid sequence) จะท าใหสรางภาพ 3 มตของเอนไซมได (Drenth และคณะ, 1970) ปจจบนการหาล าดบกรดอะมโนหรอล าดบเบส เปนงานทท ากนเปนประจ าในหองปฏบตการ Molecular Biology จงท าใหมขอมลเกยวกบล าดบกรดอะมโนลงตพมพจ านวนมากและเพมขนเรอย ๆ ในแตละป ในขณะทการหาโครงสราง 3 มตของเอนไซมยงมจ านวนนอย จงไดมการพฒนาเทคนค X-ray crystallography และ multidimensional nuclear magnetic resonance (NMR) เพอศกษาโครงสราง 3 มตของโปรตนโดยเฉพาะ แตทง 2 วธยงมขดจ ากดทงความยงยากซบซอนของเทคนคและความยงยากในการเตรยมโปรตนเพอน ามาวเคราะห

นอกจากนแลวเทคนคนยงตองการผ เชยวชาญในการแปลผลของขอมลทไดจากการวเคราะห และยงตองใชระยะเวลานานเปนป จงท าใหขอมลโครงสราง 3 มตตางๆ ยงมจ านวนไมมากนก ดงนนจงมผคดคนวธการใหมในการท านายโครงสราง 3 มตของโปรตน โดยใชโปรแกรมคอมพวเตอร ซงเปนการท านายโครงสรางของโปรตนทใชระยะเวลานอย จงชวยประหยดเวลาในการหาโครงสรางของโปรตน การท านายโครงสราง 3 มตของโปรตนม 3 วธ คอ Comparative

10

(homology) modeling, Fold recognition (threading) และ Abinitio method ซงวธทเปนทนยมและมความถกตองแมนย าสง คอ Comparative (Homology) modeling โดยอาศยหลกการของความคลายคลงกนของล าดบของโปรตนทไมทราบโครงสราง (Unknown Protein หรอ Model Protein) กบโปรตนททราบล าดบกรดอะมโน (Reference Protein หรอ Templated) ซงสมมตใหลกษณะโครงสรางของ โปรตนทง 2 เหมอนกน เมอมเปอรเซนตความคลายคลงกนอยในระดบทยอมรบได (>25%) ดงนนสามารถท านายโครงสราง 3 มตของ Unknown Protein จาก Reference Protein ได สงทส าคญทสดในการท านายโครงสราง 3 มตของโปรตนดวยวธ Comparative (homology) modeling คอการเลอก Reference Protein ทจะน ามาเปนตนแบบ ซงถาเลอกไดถกตองจะท าใหการท านายโครงสรางเกดความแมนย าและถกตอง

11

บทท 3

อปกรณและวธการทดลอง 3.1 อปกรณ เครองมอ และสารเคมทใช 3.1.1 อปกรณและเครองมอหลกทใชในงานวจย

3.1.1.1 คอลมน Thiopropyl Sepharose 6B (GE HealthCare, USA)

3.1.1.2 ชดทดสอบ Glycoprotein GelCode Glycoprotein Staining Kit (ThermoScientific, USA)

3.1.1.3 ชดสกดโปรตน Ezway PAG Protein Elution Kit (Komabiotech, Korea) 3.1.1.4 เครอง MALDI-TOF MS (Reflex IV, BRUKER) 3.1.1.5 เครอง Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC/MS-MS) รน

Finnigan LTQ Linear Ion Trap Mass Spectrometer 3.1.1.6 ชดเครองมอ Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel

Electrophoresis (SDS-PAGE Mighty Small II SE 250/SE 260, Hofer Scientific Instruments Ltd., USA) และเครอง power supply ส ำหรบใหกระแสไฟฟำ (Bucher Instruments) 3.1.1.7 อปกรณและเครองมอพนฐำนทใชในหองปฏบตกำร (ภำคผนวก ก)

3.1.2 สารเคมทจ าเปนในการทดลอง 3.1.2.1 Acrylamide (Phamacia Biotechnology) 3.1.2.2 AZCL-casine (Megazyme, Ireland) 3.1.2.3 Molecular weight standard marker (GE HealthCare, USA) 3.1.2.4 L-Tyrosine (Sigma -Aldrich, USA) 3.1.2.5 Thiopropyl Sepharose 6B (GE HealthCare, USA) 3.1.2.6 ซบสเตรตสงเครำะห (Sigma-Aldrich, USA)

3.1.2.6.1 Gyl-Arg p-nitroanilide dihydroxy chloride 3.1.2.6.2 Ala-Ala-Phe p-nitroanilide 3.1.2.6.3 N-succinyl-Gly-Gly-Phe- p-nitroanilide 3.1.2.6.4 N-succinyl-L-Phenylalanine- p-nitroanilide 3.1.2.6.5 N-Benzoyl-L-Arginine 4-p-nitroanilide hydrochloride

12

3.1.2.7. สำรยบยง

3.1.2.7.1 2, 2 Dipyridyl disulphide (2PDS) 3.1.2.7.2 Iodoacetamide 3.1.2.7.3 phenylmethyl sulfonylfluoride (PMSF) 3.1.2.7.4 -Mercaptoethanol (ME)

3.1.2.8 สำรเคมพนฐำนในหองปฏบตกำร (ภำคผนวก ก) 3.2 การคดเลอกแหลงของเอนไซมซสเตอน โปรตเนส (Cysteine Proteinase)

3.2.1 วตถดบทใชในการทดลอง แหลงของวตถดบทน ำมำใชในกำรคดเลอกเอนไซม ตวอยำงผลไม จ ำนวน 42 ชนด ดงแสดงในตำรำงท 3.1 และตวอยำงผกจ ำนวน 73 ตวอยำง ดงแสดงในตำรำงท 3.2 โดยสวนทน ำมำใชในกำรทดสอบจะใชทงสวนทกนไดและกนไมได ตวอยำงทใชในกำรทดลองจะซอจำกตลำดสด หรอ ซปเปอรมำเกต และแหลงอนๆ ตารางท 3.1 ตวอยำงผลไมชนดตำงๆ และสวนทใชในกำรทดลอง

ล าดบ ตวอยาง สวนทใช

1 ขนน เนอ

2 ซงขนน ซง

3 เมลดขนน เมลด

4 พทรำ เนอ

5 แกวมงกรพนธสขำว เนอ

6 มะมวงเขยวเสวย เนอ

7 เสำวรส เนอ

8 กลวยน ำวำ เนอ

9 กลวยน ำวำดบ เนอ

10 ฝรงแปนสทอง เนอ

11 มะเฟอง ทงผล

12 ละมดไทย เนอ

13 ละมดมำเลย เนอ

14 สำเก เนอ

13

15 ชมพมะเหมยว เนอ

16 ชมพแกมแหมม เนอ

17 ชมพทบทมจนทร เนอ

18 มนแกว เนอ

19 มะดน เนอ

20 มะกอกน ำ เนอ

21 มะขำม ทงผล

22 สมอเทศ เนอ

23 แคนตำลป (ซนเลด) เนอ

24 แคนตำลป (ซนเลด) เปลอก

25 แคนตำลป (Japanese Melon) เนอ

26 แคนตำลป (เขยวมรกต) เนอ

27 แคนตำลป (เมลอนสทอง) เนอ

28 แคนตำลป (นออน) เนอ

29 สำล ทงผล

30 สมโอ เนอ

31 องน ทงผล

32 มะขำมปอม เนอ

33 ลกพลบ ทงผล

34 แตงไทยออน เนอ

35 แตงไทยออน เปลอก

36 เงำะโรงเรยน เนอ

37 เงำะโรงเรยน เปลอก

38 ลำงสำด เนอ

40 ลำงสำด เปลอก

41 มะเดอปลอง ทงผล

42 มะเดออทมพร ทงผล

43 สบปะรด เนอ (positive control)

44 กว เนอ (positive control)

14

ตารางท 3.2 ตวอยำงผกชนดตำงๆ และสวนทใชในกำรทดลอง ล าดบ ตวอยาง สวนทใช

1 มะเขอเทศ ทงผล

2 ฟกทอง เนอ

3 ฟกแมว ทงผล

4 ฟกเขยว เนอ

5 ฟกเขยว เปลอก

6 น ำเตำ เนอ

7 น ำเตำ เปลอก

8 น ำเตำ ทงผล

9 มะระจน ทงผล

10 ใบบวบก ใบ

11 มะเขอสมวงใหญ ทงผล

12 มะระขนก ทงผล

13 บวบเหลยม เปลอก

14 บวบเหลยม เนอ

15 ผกปรง เนอ

16 พรกชฟำ ทงผล

17 กระเจยบเขยว ทงผล

18 มะเขอเหลอง ทงผล

19 มะกรด เนอ

20 มะกรด เปลอก

21 สะระแหน ใบ

22 แตงลำน ทงผล

23 แตงกวำ เนอ

24 แตงกวำ เปลอก

25 แครอท ทงหว

15

26 มะนำว เนอ

27 บวบง ทงผล

28 มะเขอมวงเลก ทงผล

29 มะเขอมวงใหญผลร ทงผล

30 ขำวโพดออน ทงฝก

31 ถวแขก ทงฝก

32 เปลอกมะละกอ เปลอก

33 ถวงอก ทงตน

34 ใบชะพล ใบ

35 ใบยหรำ ใบ

36 ใบกระเจยบ ใบ

37 ใบแขยง ใบ

38 ใบแมงลก ใบ

39 ผกบงไทย ใบและกำน

40 ผกปวยเลง ใบและกำน

41 ผกแผว ใบ

42 ผกชไทย ใบและกำน

43 ผกโขมเลก ใบและกำน

44 ผกสลด (ผกกำดหอม) ใบ

45 มะกอกปำ เนอ

46 หอมหวใหญ เนอ

47 มนฝรง เนอ

48 หวไชเทำ เนอ

49 หวไชเทำ เปลอก

50 ผกบงไทย ใบและกำน

51 ใบโหระพำ ใบ

52 ใบผกกำดกวำงตง ใบ

53 บวบหอม ทงผล

54 บวบหอม เนอ

16

55 บวบหอม เปลอก

56 มะแวง ทงผล

57 ถวฝกยำว ทงฝก

58 กะหล ำปล ใบ

59 ดอกแค ทงดอก

60 ดอกหอม ทงตน

61 บลอกโคล ดอก

62 ขนฉำย ใบและกำน

63 ต ำลง ใบและกำน

64 บอกไซ ใบและกำน

65 ฮองเต ใบและกำน

66 คะนำฮองกง ใบ

67 คะนำฮองกง ล ำตน

68 มะเขอเปรำะ (สเขยว) ทงผล

69 ถวลนเตำหวำน ทงผล

70 กรนโอค (green oak) ใบ

71 สลดคอส (salad cos) ใบ

72 เรดคลอเรล (red coral) ใบ

73 กรน คอส (green cos) ใบ

74 สบปะรด เนอ (positive control)

75 Phosphate buffer (negative control)

3.2.2 การคดเลอกแหลงของเอนไซมซสเตอน โปรตเนส (Cysteine Proteinase) ท ำกำรคดเลอกแหลงของเอนไซมซสเตอน โปรตเนสจำกผกหรอผลไมตำงๆ โดยน ำ

ตวอยำงผกและผลไมชนดตำงๆ มำสกดเอนไซมดวย ฟอสเฟตบฟเฟอร pH 6.0 ในอตรำสวน 1:1 น ำตวอยำงบดใหละเอยดดวยเครองปนน ำผลไม กรองเอำกำกทง จะไดสวนใส หรอ crude enzyme จำกนนน ำ crude enzyme ทไดมำทดสอบประสทธภำพกำรยอยโปรตน บน AZCL-casein plate ดวยเทคนค agar plate diffusion สงเกต blue zone ทเกดขน (รปท 3.1) กำรเกด blue zone สำมำรถสงเกตไดอยำงชดเจนเนองจำกใชซบสเตรตจ ำเพำะคอ AZCL-casein (Azurine-

17

Crosslinked-Casein), (Megazyme, Ireland) โดยเตรยมจำกส azurine จบกบโปรตนคอ เคซน หรออำจจะใหจบกบโพลแซคคำไรคชนดอนๆ เชน AZCL-xylan แลวแตจดประสงคของงำนวจย AZCL-casein เปน insoluble substrate และเปนซบสเตรตทมควำมจ ำเพำะตอเอนไซมโปรตเนส เมอท ำกำรทดสอบควำมสำมำรถในกำรไฮโดรไลซโปรตน พบวำถำในตวอยำงทน ำมำศกษำมเอนไซมโปรตเนสจะไฮโดรไลซโปรตนท ำใหปลดปลอยสน ำเงนออกมำ เปน blue zone ดงแสดงในรปท 1 ซงมควำมกวำง ควำมเรวในกำรเกดปฏกรยำตำงกนแปรตำมปรมำณของเอนไซมทมอยในในผกและผลไม ท ำกำรทดลองดงน

A B

รปท 3.1 AZCL-casein agar plate : A คอ AZCL-casein plate กอนท ำกำรทดสอบควำมสำมำรถ ในกำรยอยโปรตน, B คอ AZCL-casein plate หลงท ำกำรทดสอบ จะเกด blue zone ขนรอบๆ หลม

3.2.2.1 กำรทดสอบบน AZCL-casein plate เตรยมสำรละลำยวนใหมควำมเขมขนรอยละ 1.5 (w/v) ในฟอสเฟตบฟเฟอร pH 6.0 จำกนนน ำไปตมจนเดอดน ำมำเตมซบสเตรต AZCL – casein ควำมเขมขนรอยละ 0.1 คนให AZCL – casein กระจำยทวสำรละลำย เทใสจำนเลยงเชอ ปรมำตร 25 มลลลตร เพอใหมควำมหนำของวนเทำกนทกจำนทงใหวนแขงตว จำกนนเจำะวนใหเปนหลมเสนผำนศนยกลำง 6 มลลเมตร น ำ crude enzyme ทสกดไดมำหยดในหลมๆ ละ 100 ไมโครลตร (รปท 3.2) น ำไปบมทอณหภม 35 องศำเซลเซยส ตรวจผลกำรทดลองโดยดกำรเกด blue zone ทก 30 นำท

ในกำรทดลองจะใช crude enzyme จำกสบประรด และกว เปน positive control และใชสำรละลำยฟอสเฟตบฟเฟอร pH 6.0 เปน negative control

18

รปท 3.2 กำรหยดสำรสกดเอนไซมจำกตวอยำงชนดตำงๆ บน AZCL-casein plate

3.3 การตรวจสอบชนดของเอนไซมโปรตเนส จำกผลกำรคดเลอกแหลงของเอนไซมซสเตอน โปรตเนส พบวำมตวอยำงทนำสนใจทจะน ำมำศกษำตอหลำยตวอยำง เชน แคนตำลป มะเดออทมพร มะเดอปลอง และบวบง เปนตน เนองจำกให blue zone กวำง ดงนนจงท ำกำรตรวจสอบวำเปนเอนไซมในกลมใด โดยน ำมำท ำ

ปฏกรยำกบตวยบยง ชนดตำงๆ ไดแก 2,2 Dipyridyl disulphide (2PDS), phenylmethyl sulfonylfluoride (PMSF), Iodoacetamide และ -Mercaptoethanol (-ME) ทดสอบควำมสำมำรถในกำรยอยโปรตนบน AZCL-casein plate เพอจะไดคดเลอกแหลงของเอนไซมจำกผกและผลไมมำศกษำตอเพยง 1 ชนด 3.4 แยกเอนไซมซสเตอน โปรตเนสใหบรสทธโดยเทคนค Covalent Chromatography

คดเลอกแหลงของเอนไซมจำกผกและผลไมทมแอคตวตสงทสดมำ 1 ชนด ในทน คณะผวจยมควำมสนใจ มะเดออทมพร และมะเดอปลอง เนองจำกกำรศกษำซสเตอน โปรตเนส ในผลไมชนดนมำบำงในตำงประเทศ แตในเมองไทยยงไมมรำยงำนกำรศกษำ รวมทงผลไมทงสองชนดนมปลกทวไปทงภำคกลำง ภำคอสำน ภำคใตและภำคเหนอ ออกผลทงป ดงนนในกำรทดลองครงแรกไดคดเลอกมะเดออทมพรมำท ำกำรศกษำ ดงน

3.4.1 การเตรยมเอนไซมซสเตอน โปรตเนส น ำผลมะเดออทมพรมำแชในน ำกลนทม 1 มลลโมลำร EDTA เปนเวลำ 1 ชวโมง

จำกนนน ำมำปนรวมกบ 0.1 โมลำร ฟอสเฟตบฟเฟอร pH 6.0 ทม 20 มลลโมลำร ซสเตอน ใน

19

ปรมำตรทนอยทสด ในเครองปนน ำผลไม แยกกำกออกดวยกำรกรองดวยผำขำวบำง ทงกำกและน ำน ำปนจำกมะเดออทมพรทกรองไดไปปนเหวยง ทควำมเรว 8000 รอบตอนำท เปนเวลำ 30 นำท ทอณหภม 4 องศำเซลเซยส น ำสวนใสทไดมำตกตะกอนดวยแอมโมเนยมซลเฟตอมตว ควำมเขมขนรอยละ 80 น ำไปปนเหวยงแยกตะกอนทควำมเรว 10000 รอบตอนำท เปนเวลำ 15 นำท ทอณหภม 4 องศำเซลเซยส น ำตะกอนโปรตนทได มำท ำ dialysis เปนเวลำ 24 ชวโมง ดวย 0.1 โมลำร ฟอสเฟตบฟเฟอร pH 6.0 จำกนนละลำยใน 0.1 โมลำร โซเดยม อะซเตทบฟเฟอร pH 4.4 และน ำไปแยกใหบรสทธดวยเทคนค covalent chromatography ตอไป

3.4.2 การแยกใหบรสทธดวยเทคนค Covalent Chromatography หลกกำรกำรแยกใหบรสทธโดยเทคนค covalent chromatography โดยใชเจล

Thiopropyl Sepharose 6B ดงแสดงในรปท 3.3 3.4.2.1 น ำตะกอนทละลำยใน 0.1 โมลำร โซเดยม อะซเตทบฟเฟอร pH 4.4ปรมำตร 100 มลลลตร ท ำกำรแยกใหบรสทธ โดยน ำสำรละลำยเอนไซมใสใน Thiopropyl Sepharose 6B ปรมำตร 50 มลลลตร ซงไดผำนกำร equilibrated ดวย อะซเตทบฟเฟอร pH 4.4 ทงไวคำงคนทอณหภม 4 องศำเซลเซยส 3.4.2.2 ท ำกำรลำงโปรตนทไมจบกบ Thiopropyl Sepharose 6B ดวยน ำกลนจนกระทงไดคำกำรดดกลนแสงทควำมยำวคลน 280 นำโนเมตร เทำกบ 0.012 และลำงดวย 0.1 โมลำร ทรส ไฮโดรคลอไรด บฟเฟอร pH 8.0 ปรมำตร 2 คอลมน 3.4.2.3 น ำเจลมำแพคใสในคอลมน และ equilibrated ดวย 0.1 โมลำร ทรส ไฮโดรคลอไรด บฟเฟอร pH 8.0 3.4.2.4 ชะเอนไซมซสเตอน โปรตเนส ดวย 0.1 โมลำร ทรส ไฮโดรคลอไรด บฟเฟอร pH 8.0 ทม 20 มลลโมลำร ซสเตอน และ 1 มลลโมลำร DTT 3.4.2.5 ท ำกำรเกบสำรละลำยทผำนคอลมนออกมำ fraction ละ 10 มลลลตร และน ำมำวดแอคตวตโดยใช L-BAPNA เปนซบสเตรตและวดปรมำณโปรตนทควำมยำวคลน 280 นำโนเมตร 3.4.2.6 น ำ fraction ทใหแอคตวตมำรวมกนและน ำมำเตม 2PDS ทอมตวเพอยบยงปฏกรยำของเอนไซมใน 0.1 โมลำร ฟอสเฟตบฟเฟอร pH 6.0 และท ำใหเขมขน เกบทอณหภม 4 องศำเซลเซยส และน ำไปศกษำตอไป

20

รปท 3.3 ขนตอน Covalent chromatography by thiol-disulphide interchange

3.5 การตรวจวดกจกรรมเอนไซมซสเตอน โปรตเนส (ดดแปลงจากวธของ Anson, 1938) 3.5.1 กำรเตรยมกรำฟมำตรฐำนของ L-Tyrosine เตรยมสำรละลำย L-Tyrosine ทมควำมเขมขน 0, 10, 20, 30, 40, 50, และ 60 ไมโครกรมตอมลลลตร บรรจในหลอดทดลองหลอดละ 0.25 มลลลตร เตม 0.4 โมลำร โซเดยมคำรบอเนต หลอดละ 1.25 มลลลตร ผสมใหเขำกน หลงจำกนนเตมสำรฟอลนรเอเจนต (Folin-ciocalteu reagent) ลงไปหลอดละ 0.25 มลลลตร ผสมใหเขำกน ทงไวนำน 10 นำท หลงจำกนนน ำไปวดคำกำรดดกลนแสงทควำมยำวคลน 660 นำโนเมตร ดวยเครองวดกำรดดกลนคลนแสง สรำงกรำฟมำตรฐำนระหวำงคำกำรดดกลนแสงกบควำมเขมขนของสำรละลำย L-Tyrosine ทควำมเขมขนตำงๆ (ภำคผนวก ข) 3.5.2 กำรวเครำะหกจกรรมของเอนไซมซสเตอน โปรตเนสจำกสำรละลำยตวอยำง เตมเอนไซม 0.25 มลลลตร ลงในเคซนรอยละ 0.5 ใน 50 มลลโมลำร คำรบอเนต-ไบคำรบอเนตบฟเฟอร pH 10.0 จ ำนวน 1.25 มลลลตร บมทอณหภม 50 องศำเซลเซยส นำน 10 นำท จำกนนหยดปฏกรยำดวย 0.4 โมลำร กรดไทรคลอโรอะซตก จ ำนวน 1.25 มลลลตร ผสมใหเขำกน น ำไปปนดวยควำมเรว 12,000 รอบตอนำท นำน 10 นำท แลวน ำสำรละลำยสวนใสบรรจในหลอดทดลอง หลอดละ 0.25 มลลลตร หลงจำกนนท ำกำรทดลองเชนเดยวกบขอ 3.5.1 เมอวดคำกำรดดกลนแสงแลวน ำไปเปรยบเทยบกบกรำฟมำตรฐำนเพอหำกจกรรมของเอนไซมโปรตเนส ก ำหนดให 1 หนวยของเอนไซม หมำยถงปรมำณเอนไซมซสเตอน โปรตเนสทยอยสลำยเคซนรอยละ 0.5 ใหผลตภณฑไทโรซน 1 ไมโครโมล ท pH 10.0 อณหภม 50 องศำเซลเซยส ภำยในเวลำ 1 นำท

21

3.5.3 การวเคราะหปรมาณโปรตน (Lowry และคณะ 1951) 3.5.3.1 กำรเตรยมกรำฟมำตรฐำนของโปรตน เตรยมสำรละลำย bovine serum albumin (BSA) ทควำมเขมขน 0, 50, 100, 150, 200 และ 250 ไมโครกรมตอมลลลตร บรรจในหลอดทดลองหลอดละ 1 มลลลตร เตม reagent C หลอดละ 5 มลลลตร ผสมใหเขำกนทงไวเปนเวลำ 10 นำท หลงจำกนนเตมสำรฟอลนรเอเจนต (Folin-ciocalteu reagent) ลงไปหลอดละ 0.5 มลลลตร ผสมใหเขำกน ทงไว 30 นำท จำกนนน ำไปวดคำกำรดดกลนแสงทควำมยำวคลน 660 นำโนเมตร ดวยเครองวดกำรดดกลนคลนแสง สรำงกรำฟมำตรฐำนระหวำงคำกำรดดกลนแสงกบควำมเขมขนของสำรละลำย BSA ทควำมเขมขนตำงๆ (ภำคผนวก ข) 3.5.3.2 กำรวเครำะหปรมำณโปรตนจำกสำรละลำยตวอยำง น ำตวอยำงของสำรละลำยทตองกำรทดสอบมำบรรจในหลอดทดลองหลอดละ 1 มลลลตร หลงจำกนนท ำกำรทดลองเชนเดยวกบขอ 3.5.3.1 เมอวดคำกำรดดกลนแสงแลวน ำไปเปรยบเทยบกบกรำฟมำตรฐำนเพอหำปรมำณโปรตน 3.6 การตรวจสอบความบรสทธของเอนไซมซสเตอน โปรตเนส โดยวธ Sodium Dodecyl Sulfate –Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) 3.6.1 การเตรยมและเทคนคการทดสอบ SDS-PAGE 3.6.1.1 ยดแมแบบทประกอบดวยแผนกระจกและแผนเซรำมกกบแทนทใชส ำหรบเตรยมเจลใหแนน โดยมแผนพลำสตกบำงขนำดเลกสอดทขำงๆ ระหวำงกระจกและแผนเซรำมกเพอใหเกดชองวำงส ำหรบเทเจล 3.6.1.2 ผสม separating gel (รอยละ 12 (w/v)) เทลงในแมแบบใหมพนทสวนบนเหลออยประมำณ 1 นว ปลอยทงไวใหเจลแขงทอณหภมหอง 3.6.1.3 ผสม stacking gel (รอยละ 5 (w/v)) เททบลงบน separating gel ในแบบจนสดขอบดำนบนของแมแบบ จำกนนสอดพลำสตกบำงทมลกษณะเปนซฟนลงใน stacking gel ทยงไมแขงตว เพอใหเกดชองวำงส ำหรบใสตวอยำงทตองกำรทดสอบ ปลอยทงไวใหเจลแขงตวทอณหภมหอง 3.6.1.4 ถอดแผนพลำสตกบำงทมลกษณะเปนซฟนออกจำกเจล จำกนนน ำเจลทแขงตวในแมแบบออกจำกแทนยดและตดตงเขำกบชด electrophoresis โดยใหดำนลำงของ เจลจมอยใน electrode buffer และเตม electrode buffer จนทวมผวดำนบนของเจล

22

3.6.1.5 เตมตวอยำงโปรตนทตองกำรทดสอบหำขนำด จ ำนวน 20 ไมโครกรม ซงตมรวมกบสำรละลำย SDS (sample buffer) ลงในชองวำงส ำหรบใสตวอยำงสวนบนของ stacking gel โดยท ำพรอมกบโปรตนมำตรฐำนททรำบขนำดโมเลกล

3.6.1.6 ตอขวไฟฟำของชดทดสอบเขำกบหมอแปลงไฟฟำกระแสตรงปรบใหมกระแสไฟฟำประมำณ 10 มลลแอมแปรตอเจล

3.6.1.7 ปลอยใหตวอยำงโปรตนเคลอนทภำยในเนอเจลจนสน ำเงนของ bromphenol blue ทเตมใน sample buffer เคลอนทลงไปจนสดขอบลำงของเจล

3.6.1.8 ปดกระแสไฟฟำ น ำเจลออกจำกชดทดสอบคอยๆ ลอกเนอเจลออกจำกแมแบบ น ำเจลทไดไปยอมดวยชดสยอม silver stain หรอ Coomassie Brilliant Blue G-250

3.6.1.9 น ำเจลทผำนกำรยอมแลวมำลำงดวย destain 1 และ 2 3.6.1.10 ตรวจสอบควำมบรสทธและขนำดของโปรตนโดยเปรยบเทยบกบโปรตน

มำตรฐำน 3.7 การวเคราะหไกลโคโปรตน (glycoprotein) น ำเอนไซมทผำนคอลมน Thiopropyl Sepharose 6B มำตรวจสอบชนดของโปรตน โดยใชชดทดสอบ GelCode® Glycoprotein Staining ท ำกำรทดลองโดยน ำตวอยำงเอนไซมทตองกำรตรวจสอบไปตรวจสอบบน SDS-polyacrylamide gels จำกนนเตมรเอเจนทตำมขนตอนทก ำหนด จะพบวำ glycols ทพบในกลมไกลโคโปรตน จะถกออกซไดสเปน aldehydes และเมอน ำมำยอมสจะไดสชมพ 3.8 การตรวจวเคราะหโปรตนโดย เครอง MALDI-TOF Mass Spectrometry น ำเอนไซมทมน ำหนกโมเลกล 23,000 ดำลตน จำก SDS-PAGE ไปวเครำะหโปรตนโดยใชเครอง MALDI-TOF mass spectrometry ท ศนยพนธวศวกรรมและเทคโนโลยชวภำพแหงชำต ส ำนกงำนพฒนำวทยำศำสตรและเทคโนโลยแหงชำต (สวทช.) โดยใชเครอง MALDI-TOF MS (Reflex IV, BRUKER) ในกำรตรวจวเครำะห 3.9 การตรวจวเคราะหโปรตนโดย เครอง Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LC/MS-MS) น ำเอนไซมทมน ำหนกโมเลกล 23,000 ดำลตน จำก SDS-PAGE ไปวเครำะหโปรตนโดยใช Liquid chromatography-mass spectrometry (LC/MS-MS) รน Finnigan LTQ Linear Ion

23

Trap Mass Spectrometer ทศนยพนธวศวกรรมและเทคโนโลยชวภำพแหงชำต ส ำนกงำนพฒนำวทยำศำสตรและเทคโนโลยแหงชำต (สวทช.) 3.10 การวเคราะหโครงสรางสามมตของเอนไซมซสเตอน โปรตเนส

ท ำกำรวเครำะหกรดอะมโนจำกเอนไซมไซมซสเตอน โปรตเนส จำกมะเดอปลอง โดยน ำ chymopapain มำท ำกำรสรำงโครงสรำงสำมมตโดยใชโปรแกรม Discovery Studio Visualizer 2.01 จำก Accelrys® จำกนนน ำล ำดบกรดอะมโนทวเครำะหไดจำกมะเดอปลองมำเทยบเคยงกบโครงสรำงสำมมตของเอนไซม chymopapain ทได

3.11 ผลของสารยบยงการท างานของเอนไซมไฟเซนจากมะเดอปลอง

น ำสำรละลำยเอนไซมมำท ำปฏกรยำกบตวยบยง ชนดตำงๆ ไดแก 2,2 dipyridyl disulphide (2PDS), phenylmethyl sulfonylfluoride (PMSF), iodoacetamide และ -mercaptoethanol (-ME) จำกนนทดสอบควำมสำมำรถในกำรยอยโปรตนบน AZCL-casein plate 3.12 การศกษาการยอยซบสเตรตสงเคราะหของเอนไซมไฟเซนจากมะเดอปลอง

น ำเอนไซมไปตรวจวดกจกรรมของเอนไซมซสเตอนโปรตเนส โดยใชซบสเตรตสงเครำะหคอ Gyl-Arg-p-Nitroanilide dihydroxychloride, Ala-Ala-Phe-p-Nitroanilide, N-succinyl-Gly-Gly-Phe-p-Nitroanilide, N-succinyl-L-Phenylalanine-p-Nitroanilide และ N-Benzoyl-L-Arginine-p- Nitroanilide (Sigma-Aldrich, USA) ทควำมเขมขนตำงๆ กน เปนซบสเตรต วดกำรท ำงำนของเอนไซมโดยกำรวดคำดดกลนคลนแสงทควำมยำวคลน 410 นำโนเมตร

24

บทท 4

ผลการทดลอง 4.1 ผลการคดเลอกแหลงของเอนไซมซสเตอน โปรตเนส (Cysteine Proteinase)

จากการน าตวอยางผลไม จ านวน 42 ตวอยาง และตวอยางผกจ านวน 73 ตวอยาง มาตรวจสอบประสทธภาพการยอยโปรตนบน AZCL-casein plate พบวาตวอยางจากผลไมทงสวนทกนได และกนไมได ทใหผลบวกเกด blue zone ขนบรเวณรอบๆ หลมทหยดตวอยาง (รปท 4.1) จ านวน 17 ตวอยาง ไดแก ขนน ซงขนน เมลดขนน ละมดไทย ละมดมาเลย สาเก แคนตาลปซนเลด (เนอ) แคนตาลปซนเลด (เปลอก) แคนตาลป (เขยวมรกต) แคนตาลป (Japanese melon) แคนตาลป (เมลอนสทอง) แคนตาลป (นออน) แตงไทยออนทงเนอและเปลอก เงาะโรงเรยน(เนอ) มะเดอปลอง และมะเดออทมพร ดงแสดงในตารางท 4.1 ตวอยางผกทใหผลบวก จ านวน 39 ตวอยางจากทงหมด 73 ตวอยาง ตวอยางผกทให blue zone กวาง ไดแก บวบง ผกสลด ผกกาดกวางตง บวบหอม มะเขอเหลอง มะเขอมวง และมะแวง เปนตน

รปท 4.1 blue zone ทเกดจากการยอยโปรตนของเอนไซมบน AZCL-casein plate

25

ตารางท 4.1 ผลการคดเลอกแหลงของเอนไซมซสเตอน โปรตเนสจากตวอยางผลไมชนดตางๆ บน AZCL-casein plate

ล าดบ ตวอยาง สวนทใช ผลการทดสอบ

1 ขนน เนอ +

2 ซงขนน ซง +

3 เมลดขนน เมลด +

4 พทรา เนอ -

5 แกวมงกรพนธสขาว เนอ -

6 มะมวงเขยวเสวย เนอ -

7 เสาวรส เนอ -

8 กลวยน าวา เนอ -

9 กลวยน าวาดบ เนอ -

10 ฝรงแปนสทอง เนอ -

11 มะเฟอง ทงผล -

12 ละมดไทย เนอ +

13 ละมดมาเลย เนอ +

14 สาเก เนอ +

15 ชมพมะเหมยว เนอ -

16 ชมพแกมแหมม เนอ -

17 ชมพทบทมจนทร เนอ -

18 มนแกว เนอ -

19 มะดน เนอ -

20 มะกอกน า เนอ -

21 มะขาม ทงผล -

22 สมอเทศ เนอ -

23 แคนตาลป (ซนเลด) เนอ ++

24 แคนตาลป (ซนเลด) เปลอก ++

25 แคนตาลป (Japanese Melon) เนอ ++

26

26 แคนตาลป (เขยวมรกต) เนอ ++

27 แคนตาลป (เมลอนสทอง) เนอ ++

28 แคนตาลป (นออน) เนอ ++

29 สาล ทงผล -

30 สมโอ เนอ -

31 องน ทงผล -

32 มะขามปอม เนอ -

33 ลกพลบ ทงผล -

34 แตงไทยออน เนอ +

35 แตงไทยออน เปลอก +

36 เงาะโรงเรยน เนอ +

37 เงาะโรงเรยน เปลอก -

38 ลางสาด เนอ -

40 ลางสาด เปลอก -

41 มะเดอปลอง ทงผล ++

42 มะเดออทมพร ทงผล ++

43 สบปะรด เนอ (positive control)

++

44 กว เนอ (positive control)

++

45 Phosphate buffer (negative control) -

หมายเหต + หมายถง blue zone ทมความกวางเทากบ 6-10 มลลเมตร ++ หมายถง blue zone ทมความกวางเทากบ 10-20 มลลเมตร _ หมายถง ไมเกด blue zone

สวนตวอยางผกทน ามาทดสอบทงหมด 73 ตวอยาง มจ านวน 39 ตวอยาง ทให blue

zone บน AZCL-casein ไดแก ฟกเขยว น าเตา ใบบวบก มะเขอมวงผลร มะเขอมวงผลใหญและเลก มะกรด สาระแหน เปลอกมะละกอ มะนาว บวบเหลยม ใบยหรา ผกปวยเลง ผกฮองเต หอมหวใหญ และ มนฝรง เปนตน ทนาสนใจไดแก บวบง ผกสลด ผกกาดกวางตง บวบหอม มะเขอเหลอง และมะแวง เนองจากให blue zone กวาง ผลการทดลองแสดงในตารางท 4.2

27

ตารางท 4.2 ผลการคดเลอกแหลงของเอนไซมซสเตอน โปรตเนสจากตวอยางผลไมชนดตางๆ บน AZCL-casein plate

ล าดบ ตวอยาง สวนทใช ผลการทดสอบ

1 มะเขอเทศ ทงผล -

2 ฟกทอง เนอ -

3 ฟกแมว ทงผล -

4 ฟกเขยว เนอ +

5 ฟกเขยว เปลอก +

6 น าเตา เนอ +

7 น าเตา เปลอก -

8 น าเตา ทงผล +

9 มะระจน ทงผล -

10 ใบบวบก ใบ +

11 มะเขอสมวงใหญ ทงผล ++

12 มะระขนก ทงผล -

13 บวบเหลยม เปลอก +/-

14 บวบเหลยม เนอ +/-

15 ผกปรง เนอ -

16 พรกชฟา ทงผล +

17 กระเจยบเขยว ทงผล +

18 มะเขอเหลอง ทงผล ++

19 มะกรด เนอ +

20 มะกรด เปลอก +

21 สะระแหน ใบ +

22 แตงลาน ทงผล -

23 แตงกวา เนอ -

24 แตงกวา เปลอก -

25 แครอท ทงหว -

28

26 มะนาว เนอ +

27 บวบง ทงผล ++

28 มะเขอมวงเลก ทงผล +

29 มะเขอมวงใหญผลร ทงผล +

30 ขาวโพดออน ทงฝก -

31 ถวแขก ทงฝก -

32 เปลอกมะละกอ เปลอก ++

33 ถวงอก ทงตน -

34 ใบชะพล ใบ -

35 ใบยหรา ใบ +

36 ใบกระเจยบ ใบ -

37 ใบแขยง ใบ -

38 ใบแมงลก ใบ -

39 ผกบงไทย ใบและกาน -

40 ผกปวยเลง ใบและกาน +

41 ผกแผว ใบ -

42 ผกชไทย ใบและกาน -

43 ผกโขมเลก ใบและกาน -

44 ผกสลด (ผกกาดหอม) ใบ ++

45 มะกอกปา เนอ -

46 หอมหวใหญ เนอ +

47 มนฝรง เนอ +

48 หวไชเทา เนอ +

49 หวไชเทา เปลอก +

50 ผกบงไทย ใบและกาน -

51 ใบโหระพา ใบ -

52 ใบผกกาดกวางตง ใบ ++

53 บวบหอม ทงผล ++

54 บวบหอม เนอ ++

29

55 บวบหอม เปลอก -

56 มะแวง ทงผล ++

57 ถวฝกยาว ทงฝก -

58 กะหล าปล ใบ -

59 ดอกแค ทงดอก -

60 ดอกหอม ทงตน +

61 บลอกโคล ดอก -

62 ขนฉาย ใบและกาน +

63 ต าลง ใบและกาน +

64 บอกไซ ใบและกาน +

65 ฮองเต ใบและกาน +

66 คะนาฮองกง ใบ +

67 คะนาฮองกง ล าตน +

68 มะเขอเปราะ (สเขยว) ทงผล +

69 ถวลนเตาหวาน ทงผล -

70 กรนโอค (green oak) ใบ -

71 สลดคอส (salad cos) ใบ +

72 เรดคลอเรล (red coral) ใบ -

73 กรน คอส (green cos) ใบ -

74 สบปะรด เนอ (positive control) ++

75 Phosphate buffer (negative control) -

หมายเหต + หมายถง blue zone ทมความกวางเทากบ 6-10 มลลเมตร ++ หมายถง blue zone ทมความกวางเทากบ 10-20 มลลเมตร _ หมายถง ไมเกด blue zone 4.2 ผลการตรวจสอบชนดของเอนไซมโปรตเนส

จากผลการคดเลอกแหลงของเอนไซมซสเตอน โปรตเนส จากตวอยางผลไมและผกชนดตางๆ พบวามตวอยางทใหผลบวกโดยสามารถยอยเคซนบน AZCL-casein plate ไดหลายตวอยาง ซงคณะผวจยไดมความสนใจตวอยางทจะน ามาศกษาตอหลายตวอยางจากผลไม ไดแก

30

ขนน แคนตาลปสายพนธตางๆ มะเดอสายพนธตางๆ ส าหรบตวอยางจากผก ไดแก บวบง ผกสลด มะแวง เปนตน โดยพจารณาจากเสนผานศนยกลางของ blue zone รวมถงอตราเรวในการเกดปฏกรยาซงในผกหรอหรอผลไมทเกดปฏกรยาเรว แสดงวามปรมาณเอนไซมในปรมาณทสงกวาผกหรอผลไมทเกดปฏกรยาชา กอนทจะน าไปศกษาไดท าการตรวจสอบยนยนเอนไซมโปรตเนสในตวอยางเหลานจดเปนเอนไซมโปรตเนสในกลมซสเตอน โปรตเนสหรอไม เนองจากการตรวจสอบโดยใช AZCL-casein plate เปนการตรวจสอบเบองตนวาเปนเอนไซมในกลมโปรตเนสหรอไมเทานน จงตองท าการตรวจสอบโดยท าปฏกรยากบสารยบยงชนดตางๆ เพอดวาเปนเอนไซมโปรตเนสในกลมใด ผลการทดลองแสดงในตารางท 4.3

ตารางท 4.3 ผลการท าปฏกรยากบตวยบยงชนดตาง ๆ บน AZCL-casein plate

ตวอยาง สารยบยง ผลการทดสอบ 1. phosphate buffer pH 6.0 2. บวบง 3. บวบง 4. บวบง 5. บวบง 6. แคนตาลป 7. แคนตาลป 8. แคนตาลป 9. มะเดออทมพร 10. มะเดออทมพร 11. มะเดออทมพร 12. มะเดอปลอง 13. มะเดอปลอง 14. มะเดอปลอง 15. โบรมเลน 16. โบรมเลน

- - 2PDS 2PDS + PMSF 2PDS + PMSF + ME 2PDS 2PDS + PMSF 2PDS + PMSF+ME 2PDS PMSF Iodoacetamide 2PDS PMSF Iodoacetamide - 2PDS

- + + - -

+++ ++ ++ - + - - + - + -

หมายเหต + หมายถงใหผลบวกบน AZCL-casein plate เกด blue zone - หมายถงใหผลลบบน AZCL-casein plate ไมเกด blue zone

31

จากผลการทดสอบกบสารยงยงทง 3 ชนด ไดแก 2,2 Dipyridyl disulphide (2PDS) และ Iodoacetamide ซงเปนสารยบยงเอนไซมในกลมซสเตอน โปรตเนส สวน phenylmethyl sulfonylfluoride (PMSF) เปนสารยบยงเอนไซมในกลมเซรน โปรตเนส พบวา เมอน า crude เอนไซมจากตวอยางชนดตางๆ มาท าปฏกรยากบสารยบยง crude เอนไซมจากบวบงและแคนตาลปไมถกยบยงดวย 2PDS และ iodoacetamide แตจะถกยบยงดวยสาร PMSF แสดงวา เอนไซมโปรตเนสทพบในบวบงและแคนตาลปจดอยในกลมเซรน โปรตเนส ซงสอดคลองกบรายงานวจยของ Noda และคณะ ในป 1994 ไดรายงานวาเอนไซมโปรตเนสทแยกไดจาก melon fruit (Cucumis melo L.) อยในกลมเซรน โปรตเนส เนองจากถกยบยงดวย diisopropyl phosphofluoridate (DFP) ซงเปนสารยบยงเอนไซมเซรน โปรตเนสชนดหนง และ Yamagata และคณะ ในป 1994 ไดรายงานวาใน Cucumis melo L. จะพบเอนไซม thermostable alkaline เซรน โปรตเนส ในขณะท crude เอนไซมจากมะเดออทมพรและมะเดอปลอง จะถกยบยงดวย 2PDS และ iodoacetamide และไมถกยบยงดวย PMSF จงจดอยในกลมเอนไซมซสเตอน โปรตเนส ดงนนคณะผวจยจงไดเลอกมะเดอทงสองสายพนธมาศกษาโดยในระยะแรกไดท าการศกษาในมะเดออทมพร เนองจากหาไดงายพบไดทวไปและมผลขนาดใหญ และเปนชวงทออกผลพอด ลกษณะของมะเดออทมพรดงแสดงในรปท 4.2 โดยการศกษาในครงแรกไดน ามะเดออทมพรผลสกซงอยในฤดกาลนนมาท าการแยกเอนไซมซสเตอน โปรตเนส

รปท 4.2 ลกษณะของมะเดออทมพร (Ficus racemosa) ผลสก

32

4.4 การแยกเอนไซมซสเตอน โปรตเนสใหบรสทธโดยเทคนค Covalent Chromatography ในมะเดออทมพรผลสก

4.4.1 การตกตะกอนโปรตนดวยแอมโมเนยมซลเฟต เมอน าผลมะเดออทมพรสกมาสกดเอนไซมโดยใช ฟอสเฟต บฟเฟอร pH 6.0 จากนน

น า crude เอนไซมซสเตอน โปรตเนส มาตกตะกอนดวยแอมโมเนยมซลเฟตอมตวรอยละ 80 พบวามสารชนดอนมลกษณะเหมอนวนเจอปนเปนจ านวนมาก และมผลรบกวนตอการตกตะกอนเอนไซมซสเตอน โปรตเนส แตอยางไรกตามสามารถแยกตะกอนโปรตนออกมาไดในปรมาณหนง 4.4.2 การท าใหเอนไซมซสเตอน โปรตเนสบรสทธโดย Covalent Chromatography เมอน าตะกอนของเอนไซมมาละลายดวย ฟอสเฟต บฟเฟอร pH 6.0 และน าเอนไซมมาท าใหบรสทธในขนตอนเดยวในคอลมน Thiopropyl Sepharose 6B ชะดวย 0.1 โมลาร ทรส ไฮโดรคลอไรด บฟเฟอร pH 8.0 ทม 20 มลลโมลาร ซสเตอน และ 1 มลลโมลาร DTT น า fraction ทใหแอคตวตมารวมกนและน ามาเตม 2PDS ทอมตวใน 0.1 โมลาร ฟอสเฟต บฟเฟอร pH 6.0 และน าไปวเคราะหกจกรรมของเอนไซมซสเตอน โปรตเนส และปรมาณโปรตน รวมถง SDS-PAGE พบวากจกรรมของเอนไซมและปรมาณโปรตนทไดต ามาก ซงไมสอดคลองกบตะกอนทไดในขนตอนการตกตะกอนดวยแอมโมเนยมซลเฟตอมตวรอยละ 80 ทมปรมาณมาก และเมอน าไปตรวจสอบความบรสทธดวย SDS-PAGE พบวาไมพบแถบโปรตน (รปท 4.3) แสดงใหเหนวาปรมาณโปรตนมนอยมาก ตะกอนทไดเปนสารชนดอนทปนเปอนมา เนองจากเปนผลสกจงอาจท าใหมคารโบไฮเดรตในปรมาณสงโปรตนมปรมาณนอยมาก และเนองจากในฤดกาลนนมะเดออทมพรอยในชวงผลสกไมมผลดบ จงไมไดท าการศกษาในผลดบซงในผลดบจะมน ายางมากกวาคาดวานาจะมปรมาณเอนไซมสงกวาในผลสก ซงเสนอแนะวาควรท าการศกษาเอนไซมซสเตอน โปรตเนสในมะเดออทมพรผลดบตอไป เนองจากในระยะนนมมะเดอปลองผลดบเปนจ านวนมาก ดงนนคณะผวจยจงไดน ามะเดอปลองผลดบมาท าการศกษาในระยะทสอง

33

รปท 4.3 รปแบบของโปรตนทไดจากมะเดออทมพร แยกโดยใชวธ SDS-PAGE 1 หมายถง โปรตนมาตรฐาน bovine serum albumin 2 หมายถง โปรตนมาตรฐาน ท molecular weight ตางๆ 3 หมายถง crude เอนไซมจากมะเดออทมพร 4 หมายถง เอนไซมทผาน covalent chromatography 4.5 การแยกเอนไซมซสเตอน โปรตเนสใหบรสทธโดยเทคนค Covalent Chromatography ใน

มะเดอปลองผลดบ มะเดอ (fig) เปนพชทอยในแฟมล Moraceae มสมาชกประมาณ 850 สปชส พบไดทวไป

มะเดอมความส าคญทางยาและอาหาร พบวามองคประกอบอยหลายชนด เชน ยาง น าตาล ฟลาโวนอยด วตามนเอ วตามนซ กรดและเอนไซม โดยเฉพาะเอนไซมไฟเซน (fician หรอ ficin) ในประเทศไทยพบมะเดอหลายสายพนธทงทเปนพนธพนเมองดงเดมไดแก มะเดออทมพร (Ficus racemosa) และมะเดอปลอง (Ficus hispida) และสายพนธทน าเขามาปลกทเรยกวามะเดอฝรง ไดแกสายพนธ Ficus grabrata และ Ficus carica ในปจจบนงานวจยเกยวกบเอนไซมไฟเซนในมะเดอจะเปนงานวจยในกลมของมะเดอ Ficus grabrata และ Ficus carica ในขณะทในมะเดอปลองมรายงานคอนขางนอย ดงนนคณะผวจยจงมความสนใจทจะท าท าการศกษาเอนไซมไฟเซน ซงเปนเอนไซมในกลมซสเตอน โปรตเนสในมะเดอปลองโดยท าการแยกใหบรสทธโดยใชเทคนค covalent chromatography และท าการศกษาลกษณะเฉพาะบางสวนของเอนไซมไฟเซน

34

มะเดอปลอง มชอวทยาศาสตรคอ Ficus hispida L. เปนสายพนธทพบในประเทศไทยโดยพบไดทวไปทกภาค ลกษณะของผลจะมขนาดเลกกวามะเดออทมพร (รปท 4.4 ก) ผลและใบจะมขนเลกๆ เมอจบจะรสกสาก ล าตนมลกษณะเปนปลองๆ ดงแสดงในรปท 4.4 ข เอนไซมทพบในมะเดอคอเอนไซมซสเตอน โปรตเนส ทเรยกวา ไฟเซน (fician หรอ ficin)

ก ข

รปท 4.4 ลกษณะของมะเดอปลอง (Ficus hispida L.) ผลมขนาดเลกและล าตนเปนปลองๆ

เมอน ามะเดอปลองผลดบทงผลมาแยกเอนไซม พบวาปรมาณของ crude เอนไซมและ

โปรตนทแยกไดมปรมาณนอยมาก ประกอบกบมรายงานวจยหลายฉบบไดรายงานวาเอนไซมไฟเซนในมะเดอจะพบในสวนของน ายาง ดงเชนในรายงานวจยของ Devaraj และคณะ, 2008 ไดท าการศกษา thermostable aspartic protease จากยางของ Ficus racemosa L.; Chetia และ คณะ ในป 1998 ไดท าการศกษาเอนไซมโปรตเนสจากยางของ Ficus hispida L. ดงนนคณะผวจยจงไดท าการทดลองสกดยางจากผลมะเดอปลองหลายวธ ดงน กรดยางจากผลบบเอายางออกมา กรดยางแลวแชในฟอสเฟต บฟเฟอร pH 6.0 และเปรยบเทยบกบน าทงผลมาสกดเอนไซม พบวาในยางของมะเดอปลองจะมเอนไซมโปรตเนสในปรมาณสงกวาในผลมะเดอปลอง เมอน ามาตรวจวเคราะหบน SDS-PAGE (รปท 4.5) พบวาใน crude เอนไซมจากมะเดอปลองจะใหแถบโปรตนมากกวา 1 แถบมน าหนกโมเลกลอยในชวง 23,000 ถง 45,000 ดาลตน จงไดน ายางจากมะเดอปลองมาท าการศกษาท าใหบรสทธตอไป

35

รปท 4.5 รปแบบของโปรตนทไดจากยางมะเดอและผลมะเดอ แยกโดยใชวธ SDS-PAGE

1 โปรตนมาตรฐาน 2 crude enzyme จากผลมะเดอตกตะกอนดวยแอมโมเนยมซลเฟต 3 crude enzyme จากผลมะเดอตกตะกอน ดวย acetone 4 crude enzyme จากยางมะเดอ 5 crude enzyme จากยางมะเดอ ตกตะกอนดวย acetone 6 โปรตนมาตรฐาน

4.5 การตรวจสอบความบรสทธของเอนไซมซสเตอน โปรตเนส โดยวธ Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) เมอน าเอนไซมไฟเซนจากยางของมะเดอปลองมาท าใหบรสทธโดยใชเทคนค covalent chromatography ผานคอลมน Thiopropyl Sepharose 6B และน าไปตรวจสอบความบรสทธดวยวธ SDS-PAGE (รปท 4.6) พบวาเอนไซมไฟเซนจากมะเดอปลองใหโปรตน 4 แถบน าหนกโมเลกลอยในชวง 23,000 ถง 45,000 ดาลตน ซงสอดคลองกบรายงานวจยทรายงานวาองคประกอบเอนไซมไฟเซนจากมะเดอจะอยในรปของ multiple forms (Chetia และคณะ 1998; Devaraj และคณะ 2008; Williams และคณะ 1968; Williams และ Whitaker 1969) และมรายงานวาเอนไซมไฟเซนเปนโปรตนในกลมไกลโคโปรตน (Friedenson และ Liener, 1974; Misenheimer และคณะ, 2001) จงน าเอนไซมจากมะเดอปลองไปตรวจสอบไกลโคโปรตนตอไป

36

4.6 การต 4.6 ผลการวเคราะหไกลโคโปรตน (glycoprotein) เมอน าเอนไซมทผานคอลมน Thiopropyl Sepharose 6B มาตรวจสอบไกลโคโปรตน โดยใชชดทดสอบ GelCode® Glycoprotein Staining พบวาโปรตนทง 4 แถบ มน าหนกโมเลกลอยในชวง 23,000 ถง 45,000 ดาลตน และเมอน ามายอมสจะไดสชมพแสดงวาโปรตนทง 4 แถบเปนไกลโคโปรตน แสดงวาเอนไซมซสเตอนโปรตเนสทอยในมะเดอปลองอยในรป multiple forms จากนนไดคดเลอกโปรตนทมน าหนกโมเลกล 23,000 ดาลตน ไปวเคราะหโปรตนโดยเครอง MALDI-TOF MS และ LC/MS-MS ตอไป เนองจากมรายงานวจยหลายฉบบทรายงานวาเอนไซมไฟเซนในมะเดอจะมน าหนกโมเลกลอยในชวงน (Devaraj และคณะ 2008) 4.7 ผลการตรวจวเคราะหโปรตนโดยเครอง MALDI-TOF MS และ LC/MS-MS เมอน าโปรตนทมน าหนกโมเลกลเทากบ 23,000 ดาลตน ไปวเคราะหโปรตนดวยเครอง MALDI-TOF MS และ LC/MS-MS พบวาเมอท าการวเคราะห MALDI-TOF MS เอนไซมไฟเซนจากมะเดอปลอง ไมสามารถเทยบเคยงกบขอมลในฐานขอมลได จงท าการวเคราะหโปรตนโดยเครอง LC/MS-MS พบวาเอนไซมไฟเซนจากมะเดอปลองมล าดบของกรดอะมโน จ านวน 55 ตว ทความคลายคลงกบ Chain A จาก Carica papaya chymopapain (รปท 4.7)

รปท 4.6 SDS-PAGE ของเอนไซมซสเตอนโปรตเนสทผานการท าใหบรสทธจาก Thiopropyl Sepharose 6B covalent column

1 โปรตนมาตรฐาน 2 purified fraction from Thiopropyl Sepharose 6B column 3 glycoprotein staining

37

YPQSIDWRAKGAVTPVKNQGACGSXWAFSTIATVEGINKIVTG

NLLELSEQELVDCDKHSYGCKGGYQTTSLQYVANNGVHTSKVY

PYQAKQYKCRATDKPGPKVKITGYKRVPSNXETSFLGALANQP

LSVLVEAGGKPFQLYKSGVFDGPCGTKLDHAVTAVGYGTSDGK

NYIIIKNSWGPNWGEKGYMRLKRQSGNSQGTCGVYKSSYYPFK

GFA รปท 4.7 ล าดบของกรดอะมโนจากไฟเซนจากมะเดอปลองท Matched กบ Chain A จาก Carica papaya chymopapain (ตวอกษรสแดง)

จงไดน าล าดบกรดอะมโนของ chymopapain มาท านายโครงสรางสามมตของเอนไซม chymopapain โดยใชโปรแกรม Discovery Studio Visualizer 2.01, Accelrys® ไดโครงสรางสามมตดงแสดงในรปท 4.8 ข เพอทจะไดเปนแมแบบในการน ากรดอะมโนจ านวน 55 ตวทไดจากเอนไซมไฟเซนจากมะเดอปลองมาเทยบเคยง ผลจากการเทยบเคยงพบวา กรดอะมโนจากมะเดอปลอง(รปท 4.8 ก) มความใกลเคยงในบรเวณ A B และ C จากขอมลดงกลาวแสดงวาเอนไซมไฟเซนมบรเวณทมโครงสรางสามมตทคลายคลงกบ chymopapain เนองจากวา catalytic site ของเอนไซมไฟเซน มโครงสรางเหมอนกบโครงสรางของ chymopapain

ก ข

รปท 4.8 การเปรยบเทยบการเรยงล าดบกรดอะมโนของเอนไซมไฟเซน (A, B และ C) ทมชนดของกรดอะมโนทเหมอนกบเอนไซม chymopapain ซงแสดงดวยบรเวณสเขยว น าเงนและเหลองตามล าดบ ก; คอ กรดอะมโนจากไฟเซนจากมะเดอปลอง บรเวณส เขยว น าเงนและเหลอง ข; โครงสรางสามมตของเอนไซม chymopapain;α-helices และ β-strands แสดงดวย สน าเงน

38

4.8 ผลของสารยบยงการท างานของเซรนโปรตเนสบรสทธ จากการศกษาเบองตนผลของสารยบยงตอการท างานของเอนไซมซสเตอน โปรตเนส จาก

มะเดอปลอง พบวาสาร 2PDS และ iodoacetamide ทความเขมขน 1 และ 10 มลลโมลาร สามารถยบยงการท างานของเอนไซมไดโดยไมเกด blue zone ในขณะทสาร PMSF ทความเขมขน 1 และ 10 มลลโมลาร ไมสามารถยบยงการท างานของเอนไซมไดโดยสงเกตจาก blue zone ทเกดขน (ตารางท 4.4) แสดงใหเหนวาเอนไซมไฟเซนจากมะเดอปลองเปนเอนไซมในกลมซสเตอน โปรตเนส เนองจาก 2PDS และ iodoacetamide เปนสารยบยงทยบยงเฉพาะเอนไซมในกลมซสเตอน โปรตเนส ในขณะท PMSF เปนสารยบยงเอนไซมเซรน โปรตเนส

ตารางท 4.4 ผลของสารยบยงทมตอเอนไซมซสเตอน โปรตเนส จากมะเดอปลอง

Inhibitor Concentration (mM)

proteinase activity on* AZCL-Casein plate

None - + PMSF 1 + 10 + 2PDS

1 10

- -

Iodoacetamide

1 10

- -

หมายเหต +, positive with AZCL-casein plate -, negative with AZCL-casein plate

4.9 การศกษาการยอยซบสเตรตสงเคราะหของเอนไซมซสเตอน โปรตเนส

เมอตรวจวดแอคตวตของเอนไซมไฟเซนจากมะเดอปลอง ดวยซบสเตรตสงเคราะห 5 ชนด คอ Gyl-Arg-p-nitroanilide dihydroxychloride, Ala-Ala-Phe-p-nitroanilide, N-succinyl-Gly-Gly-Phe-p-nitroanilide, N-succinyl-L-Phenylalanine-p-nitroanilide และ N-Benzoyl-L-Arginine-p-nitroanilide hydrochloride (LBAPNA) พบวาเอนไซมไฟเซนจากมะเดอปลองสามารถยอย ซบสเตรตสงเคราะห ทง 5 ชนดไดแตกตางกน โดยสามารถยอย Gyl-Arg-p-nitroanilide dihydroxychloride และ LBAPNA ไดดทสด รองลงมาซบสเตรต Ala-Ala-Phe- p-nitroanilide, N-succinyl-Gly-Gly-Phe-p-nitroanilide, และ N-succinyl-L-Phenylalanine-p-nitroanilide สามารถยอยไดดตามล าดบ จากผลการยอยซบสเตรตสงเคราะหแสดงใหเหนวา

39

ต าแหนง subsite P1 ของเอนไซมไฟเซนจากมะเดอปลองมความจ าเพาะส าหรบกรดอะมโน arginine มากกวา phenylalanine เนองจากสามารถยอยไดดกวา แสดงถงเอนไซมมความจ าเพาะกบซบสเตรตมากกวา สามารถเขาจบไดดกวาจงมการยอยซบสเตรตในปรมาณสง

40

บทท 5

สรปการวจยและขอเสนอแนะ

จากทดลองสามารถสรปผลการทดลองไดดงน 1. จากการน าตวอยางผลไม จ านวน 42 ตวอยาง และตวอยางผกจ านวน 73

ตวอยาง มาตรวจสอบประสทธภาพการยอยโปรตนบน AZCL-casein plate เพอคดเลอกแหลงของเอนไซมซสเตอน โปรตเนส พบวาตวอยางจากผลไมใหผลบวก จ านวน 17 ตวอยาง ไดแก ขนน ซงขนน เมลดขนน ละมดไทย ละมดมาเลย สาเก แคนตาลปซนเลด (เนอ) แคนตาลปซนเลด (เปลอก) แคนตาลป (เขยวมรกต) แคนตาลป (Japanese melon) แคนตาลป (เมลอน สทอง) แคนตาลป (นออน) แตงไทยออนทงเนอและเปลอก เงาะโรงเรยน (เนอ) มะเดอปลอง และมะเดออทมพร

2. ตวอยางผกใหผลบวก จ านวน 39 ตวอยางจากทงหมด 73 ตวอยาง ตวอยางผกทให blue zone กวาง ไดแก บวบง ผกสลด ผกกาดกวางตง บวบหอม มะเขอเหลอง มะเขอมวง และมะแวง

3. ตวอยางทใหความสนใจน ามาศกษาตอ เชน ตวอยางจากผลไมไดแก ขนน แคนตาลปสายพนธตางๆ มะเดอสายพนธตางๆ ส าหรบตวอยางจากผก เชน บวบง ผกสลด มะแวง เปนตน

4. การตรวจสอบชนดของเอนไซมโปรตเนส โดยใชสารยบยงชนดตางๆ ผลการทดลอง พบวาเอนไซมจากมะเดออทมพรและมะเดอปลองอยในกลมซสเตอน โปรตเนส เนองจากถกยบยง

ดวย 2,2 Dipyridyl disulphide (2PDS) และ iodoacetamide จงเลอกมะเดอมาท าการศกษา เนองจากโปรตนจากตวอยางอนจะเปนเอนไซมในกลมเซรน โปรตเนส

5. จากการศกษาเอนไซมจากผลมะเดอไดท าการทดลองเปน 2 ระยะ ดงน ระยะท 1 ท าการศกษาเอนไซมในผลมะเดออทมพรผลสก พบวามปรมาณ

เอนไซมนอยมาก มสารจ าพวกคารโบไฮเดรตจ านวนมาก ระยะท 2 ศกษาเอนไซมในผลและยางของมะเดอปลองผลดบ พบวาในยางของ

มะเดอปลองผลดบมปรมาณเอนไซมมากกวาในมะเดอปลองทงผล จงไดศกษาเอนไซมซสเตอน โปรตเนสจากยางมะเดอปลอง

41

6.เมอน ายางจากมะเดอปลอง มาแยกใหบรสทธโดยตกตะกอนดวยเกลอแอมโมเนยมซลเฟตอมตวรอยละ 80 และน ามาแยกใหบรสทธดวยเทคนค covalent chromatography ผานคอลมน Thiopropyl Sepharose 6B เมอน าไปตรวจสอบความบรสทธดวย SDS-PAGE พบโปรตน 4 แถบ น าหนกโมเลกลอยในชวง 23,000 ถง 45,000 ดาลตน

6. เมอวเคราะห glycoprotein พบวาโปรตนทง 4 แถบ ใหแถบสชมพแสดงวาเปนไกลโคโปรตน แสดงวาเอนไซมทแยกไดจากมะเดอปลองนาจะเปนเอนไซมในกลมไฟเซน เนองจากมรายงานวาเอนไซมไฟเซนมสมบตเปนไกลโคโปรตน และอยในรปของ multiple forms

7. เมอตดเอนไซมจากแถบโปรตนทประมาณ 23000 ดาลตน จาก SDS-PAGE สงไปวเคราะหโปรตนดวยเครอง MADTI- TOF MS และ LC/MS-MS พบวา เอนไซมไฟเซน จากมะเดอปลองม ล าดบของกรดอะมโน 55 ตว ทความคลายคลงกบ Chain A จาก Carica papaya chymopapain

8. เมอน าล าดบของกรดอะมโน 55 ตว ทไดจากโปรตน 23}000 ดาลตน ไปเทยบเคยงกบโครงสรางสามมตของเอนไซม Chymopapain เพอท านายการขดตวมวนตวของไฟเซน ผลทไดจากการเทยบเคยง พบวากรดอะมโนจากเอนไซมไฟเซนมบรเวณทมโครงสรางสามมตทคลายคลงกบเอนไซม Chymopapain

9. เอนไซมไฟเซนจากมะเดอปลองสามารถยอยซบสเตรตสงเคราะหคอ Gyl-Arg-p-nitroanilide dihydroxychloride และ N-Benzoyl-L-Arginine-p-nitroanilide hydrochloride ไดดทสด แสดงใหเหนวาต าแหนง subsite P1 เซรน โปรตเนสมความจ าเพาะส าหรบกรดอะมโน arginine ในขณะทพบวาสามารถยอย Ala-Ala-Phe-p-nitroanilide, N-succinyl-Gly-Gly-Phe-p-nitroanilide และ N-succinyl-L-Phenylalanine-p-nitroanilide ไดดตามล าดบ

42

เอกสารอางอง

Abe, K., Kondo, H. and Arai, S. 1987. Purification and proteinase of a cysteine proteinase from germinating rice seeds. Agric.Biol.Chem. 51(6) : 1509-1514.

Aehle, W., Sobek, H. and Schomburg, D. 1995. Evaluation of protein 3-D structure prediction: comparison of modelled and X-ray structure of an alkaline serine protease. J. Biotechnol. 41 : 211-219.

Anson, M.L. 1938. Estimation of pepsin, papain and cathepsin with hemoglobin. Journal of General Physic. 22 : 79- 89.

Brocklehurst, K., Carlsson, J., Kierstan, M.P.J. and Crook, E.M. 1973. Preparation of fully active

papain from dried papaya latex. Biochem.J. 133 : 573-584.

Buttle, D.J., Kembhavi, A.A., Sharp, S.L., Shute, R.E., Rich, D.H. and Barrett, A.J. 1989. Affinity purification of the novel cysteine proteinase papaya proteinase IV, and papain from papaya latex. Biochem J. 261(2):469-476.

Chetia, D., Nath, L.K. and Dutta, S.K. 1999. Extraction, purification and physic-chemical

properties of proteolytic enzyme from the latex of Ficus hispida Linn. Indain Journal of

Phamaceutical Sciences. 61 : 29-33.

Cormier, F., Charest, C. and Dufresne, C. 1989. Partial purification and properties of proteases

from fig Ficus carica callus cultures. Biotechnology Letters. 11 : 797-802.

Devaraj, K.B., Kumar, P.R. and Prakash, V. 2008. Purification, characterization, and solvent-

induced thermal stabilization of ficin from Ficus carica. Journal of Agricultural and

Food Chemistry. 56 : 11417-11423.

Drenth, J., Jansonius, J.N., Koekoek, K., Sluyterman, L.A.A., Wolthers, B.G. 1970. The structure of the papain molecule. Philos.Trans.R.Soc.London,Ser.B. 257:231.

Freitas, C.D.T., Oliveira, J.S., Miranda, M.R.A., Macedo, N.M.R., Sales, M.P., Villas-Boas, L.A., and Ramos, M.V. 2007. Enzymatic activities and protein profile of latex from Calotropis procera. Plant Physiology and Biochemistry. 45: 781-789.

43

Friedenson, B. and Liener, I.E. 1974. Evidence that ficin is a glycoproteine. Biochim Biophys Acta. 342(1) : 209-212.

Grudkowska, M. and Zagdanska. 2004. Multifunctional role of plant cysyeine proteinases. Acta Biochimica Polonica. 51(3): 609-624.

Helle, O. and Boyce, C.O., 1990, “Microbial proteinase and biotechnology”. Microbial Enzyme and Biotechnology, 2nd ed., New York, USA : Elsevier Applied Science, pp. 240- 241

Jiang, S-T., Lee, J-J. and Chen, H-C. 1994. Purification and characterization of a novel cysteine proteinase from Mackerel (Scomber australasicus). J. Agric. Food Chem. 42:1639-1646.

Kramer, D.E. and Whitaker J.R. 1969. Ficin-catalyzed reactions. hydrolysis of α-N-benzoyl-L-

arginine-ethyl ester and -N-benzoyl-L-argininamide. Plant Physiol. 43 : 609-614.

Kumar, C.G. and Takagi, H. 1999. Microbial alkaline proteases: from a bioindustrial viewpoint. Biotechnology Advances. 17:561-594.

Kundu, S., Sundd, M. and Jagannadham, M.V. 2000. Purification and characterization of a stable cysteine protease Ervatamin B with two disulfide bridges, from the latex of Ervatamia coronaria. J. Agric. Food Chem. 48(2):171-179.

Kyndt, T., Van Damme, E.J.M., Beeumen, J.V. and Gheysen. 2007. Purification and characterization of the cysteine proteinases in the latex of Vasconcellea spp. FEBS Journal. 274:451-462.

Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227:680-685.

Maes, D., Bouckaert, J., Poortmans, F., Wynns, L. and Looze, Y. 1996. Structure of chymopapain at 1.7 Å resolution. Biochemistry. 35(50) : 16292-16298.

Misenheimer, T.M., Hahr, A.J., Harms, A.C., Annis, D.S. and Mosher, D.F. 2001. Disulfide connectivity of recombinant c-terminal region of human thrombospondin. J. Biol. Chem. 276: 45882 – 45887.

Noda, K., Koyanagi, M. and Kamiya, C. 1994. Purification and characterization of an

endoprotease from melon fruit. J. of Food Science. 59(3):585-587.

44

Paul, J., Malthouse, G. and Brocklehurst, K. 1976. Preparation of fully from Ficus glabrata by

covalent chromatography and characterization of its active centre by using 2,2-

dipyridyl disulphide as a reactivity probe. Biochem. J. 159 : 221-234.

Person, M.D., Chaimbault, P. and Elfakir C. 2007. Analysis of native amino acids by liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry: comparative study between two sources and interfaces. Journal of Mass Spectrometry. 43(2) : 204-215.

Rowan, A.D., Buttle, D.J. and Barrett, A.J. 1990. The cysteine proteinase of the pineapple plant. Biochem J. 266:869-875.

Surapong, P. 1996. Gradation in active centre characteristics of four cysteine proteinase variants of the papain family. Thesis for the degree of Doctor of Philosophy of the University of London.

Vallés, D., Furtado, S. and Cantera, A.M.B. 2007. Characterization of news proteilytic enzymes from ripe fruits of Bromelia antiacantha Bertol.(Bromeliaceae). Enzyme and Microbial Technology. 40:409-413.

Walker, A.J., Glen, D.M., and Shewry, P.R. 1998. Purification and characterization of a digestive cysteine proteinase from the field slug(Deroceras reticulatum): A potential target for slug control. J. Agric. Food Chem. 46(7):2873-2881.

Williams, D.C., Sgarbieri, V.C., and Whitaker J.R. 1968. Proteolytic activity in the genus

ficus. Plant Physiol. 43 :1083-1088.

Williams, D.C. and Whitaker J.R. 1969. Mutiple molecular forms of Ficus glabrata ficin. Their

separation and relative physical, chemical, and enzymatic properties. Plant Physiol.

44:1574-1583.

Yamagata, H., Masuzawa, T., Nagaoka, Y., Ohnishi, T. and Iwassaki, T. 1994. Cucumsin, a

serine protease from melon fruits, shares structural homology with subtilisin and is

generated from a large precursor. Journal of Biological Chemistry. 269 : 32725-32731.

45

ภาคผนวก ก

1. สารเคมทใชในการทดลอง 1. Acetic acid(Carlo Erba) 2. Acrylamide(Phamacia Biotechnology) 3. Agar (Difco Laboratories) 4. Ammonium persulfate (Carlo Erba) 5. Ammonium sulfate (Carlo Erba) 6. Bovine serum albumin (Sigma Chemical Co.,) 7. Bromphenol Blue(Sigma Chemical Co.,) 8. Casein (Sigma Chemical Co.,) 9. Coomassie Brilliant Blue G-250(GE HealthCare, USA) 10. Dialysis bag (Spectrum Laboratories) 11. Dimethylsulfoxide(Merck KGaA) 12. Ethylenediaminetetraacetic acid (Fluka Chemical) 13. Ethanol (Merck KGaA) 14. Folin-Ciocalteu’s reagent (Sigma Chemical Co.,) 15. Glycine (Sigma Chemical Co.,) 16. Hydrochloric acid (Merck KGaA) 17. Hydrogen peroxide (Merck KGaA) 18. Iodoacetamide (Fluka Chemical) 19. 2-Mercaptoethanol (Sigma Chemical Co.,) 20. Methanol (Merck KGaA) 21. N, N'-Methylene-bis acrylamide (Phamacia Biotechnology) 22. Molecular weight standard marker (Pierce, USA) 23. Phenylmethylsulfonyl fluoride (Fluka Chemical) 24. Potassium sodium tartrate(Carlo Erba) 25. Silver stain kits(Phamacia Biotechnology)

46

26. Sodium carbonate (Merck KGaA) 27. Sodium chloride (Merck KGaA) 28. Sodium dodecyl sulfate (Sigma Chemical Co.,) 29. Sodium hydrogen carbonate (Merck KGaA) 30. Sodium hydrogen phosphate (Merck KgaA) 31. Sodium hydroxide (Carlo Erba) 32. Sodium phosphate (Carlo Erba) 33. N,N,N',N'-tetramethyethylenediamine (TEMED)(Phamacia Biotechnology) 34. Trichloroacetic acid (Carlo Erba) 35. Tris (hydroxymethyl)-aminomethane (Merck KGaA)

47

ภาคผนวก ข

การเตรยมสารเคม และวธการทดสอบ 1. การวเคราะหปรมาณโปรตน ตามวธของ Lowry (1951)

สารเคม 1. รเอเจนท (Reagent)

รเอเจนท A โซเดยมคารบอนเนต 10 กรมในสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด ความเขมขน 0.1 นอรมอล ปรมาตร 500 มลลลตร รเอเจนท B คอปเปอรซลเฟต 0.5 กรม ในสารละลายโพแทสเซยมโซเดยมตราเตรท (รอยละ 1) ปรมาตร 100 มลลลตร

รเอเจนท C ผสม reagent A กบ reagent B ในอตราสวน 50:1 (เมอตองการใชภายใน 1 วน) 2. Folin-ciocalteu reagent น ามาเจอจางดวยน ากลนอตราสวน 1:1 3. bovine serum albumin (BSA)

วธทดลอง 1.1 การเตรยมกราฟมาตรฐานของโปรตน เตรยมสารละลาย bovine serum albumin (BSA) ทความเขมขน 0, 50, 100, 150, 200 และ 250 ไมโครกรมตอมลลลตร บรรจในหลอดทดลองหลอดละ 1.0 มลลลตร เตมสารรเอเจนท C หลอดละ 5.0 มลลลตร ผสมใหเขากนทงไวเปนเวลา 10 นาท หลงจากนนเตมสารโฟลนรเอเจนตลงไปหลอดละ 0.5 มลลลตร ผสมใหเขากนทงไว นาน 30 นาท จากนนน าไป วดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 660 นาโนเมตร ดวยเครองสเปคโตรโฟโตมเตอร (Spectrophotometer) สรางกราฟมาตรฐานระหวางคาการดดกลนแสงกบความเขมขนของสารละลาย BSA ทความเขมขนตางๆ ดงกลาวขางตน

1.2 การวเคราะหปรมาณโปรตนของสารละลายตวอยาง 1. น าสารตวอยางปรมาตร 1.0 มลลลตรในหลอดทดลอง 2. เตม รเอเจนท C ปรมาตร 5.0 มลลลตร ผสมใหเขากนตงทงไว 10 นาท 3. เตม Folin-ciocalteu reagent ปรมาตร 0.5 มลลลตร ผสมใหเขากนตงทงไว 30 นาท

48

4. น าไปวดคาการดดกลนคลนแสงทความยาวคลน 660 นาโนเมตร โดยวดเปรยบเทยบกบ blank ทใชน ากลนแทนสารตวอยาง อานคาความเขมขนของโปรตนจากกราฟมาตรฐาน

2. การวเคราะหกจกรรมของเอนไซมโปรตเนสดดแปลงจากวธของ Anson (1938)

สารเคม 1. 0.4 M Trichloroacetic acid (TCA) : กรดไตรคลอโรอะซตก 16.35 กรม ละลายในน ากลน ปรบปรมาตรเปน 250 มลลลตร 2. 0.4 M Na2CO3 : โซเดยมคารบอเนต 10.60 กรม ละลายในน ากลน ปรบปรมาตรเปน 250 มลลลตร 3. 50 มลลโมลาร คารบอเนต-ไบคารบอเนตบฟเฟอร pH 10.0 : A : 50 mM solution of anhydrous sodium carbonate : แอนไฮดรสโซเดยมคารบอเนต 1.32 กรม ละลายในน ากลน ปรบปรมาตรเปน 250 มลลลตร B : 50 mM solution of sodium bicarbonate :โซเดยมไบคารบอเนต 1.05 กรม ละลายในน ากลน ปรบปรมาตรเปน 250 มลลลตร ดดสารละลาย A มา 27.5 มลลลตร และสารละลาย B มา 22.5 มลลลตร ผสมใหเขากน 4. Casein รอยละ 0.5 : เคซน 0.5 กรม ละลายใน 50 มลลโมลาร คารบอเนต-ไบคารบอเนตบฟเฟอร pH 10.0 แลวอนดวยความรอน พรอมทงคนเบาๆ เพอใหเคซนละลาย แลวปรบปรมาตรเปน 100 มลลลตร 5. Folin-ciocalteu reagent น ามาเจอจางดวยน ากลน ในอตราสวน 1:1

6. L-Tyrosine ความเขมขน 100 g/ml : ไทโรซน 0.01 กรม ละลายในน ากลน 7-8 มลลลตร คอยๆ เตม 0.1 N NaOH กวนจนไทโรซนละลายหมด ปรบปรมาตรเปน 10 มลลลตร แลวเจอจางความเขมขนลง 10 เทา

วธการทดลอง 1.1. การเตรยมกราฟมาตรฐานของ L-Tyrosine

เตรยมสารละลาย L-Tyrosine ทมความเขมขน 0, 10, 20, 30, 40, 50, และ 60 ไมโครกรมตอมลลลตร บรรจในหลอดทดลองหลอดละ 0.25 มลลลตร เตม 0.4 โมลาร โซเดยมคารบอเนต หลอดละ 1.25 มลลลตร ผสมใหเขากน หลงจากนนเตมสารฟอลนรเอเจนต (Folin-ciocalteu

49

reagent) ลงไปหลอดละ 0.25 มลลลตร ผสมใหเขากน ทงไวนาน 10 นาท หลงจากนนน าไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 660 นาโนเมตร ดวยเครองวดการดดกลนคลนแสง สรางกราฟมาตรฐานระหวางคาการดดกลนแสงกบความเขมขนของสารละลาย L-Tyrosine ทความเขมขนตางๆ

1.2. การวเคราะหกจกรรมของเอนไซมโปรตเนสจากสารละลายตวอยาง

1. บรรจสารละลายเคซนในหลอดทดลองหลอดละ 1.25 มลลลตร ตงแชไวในอางน ารอน อณหภม 50 องศาเซลเซยส แลวเตมเอนไซมลงในหลอดทดลองหลอดละ 0.25 มลลลตร ใชน า กลนเปน blank แทนสารละลายเอนไซม 2. บมเอนไซมไวในอางน ารอนอณหภม 50 องศาเซลเซยส นาน 10 นาท 3. หยดปฏกรยาดวยกรดไทรคลอโรอะซตก (0.4 M TCA) 1.25 มลลลตร ผสมใหเขากน วางทงไวนาน 5 นาท 4. น าไปปนทความเรว 12,000 รอบตอนาท อณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 10 นาท 5. น าสารละลายสวนใสบรรจในหลอดทดลองหลอดละ 0.25 มลลลตร 6. เตมสารละลายโซเดยมคารบอเนต (0.4 M) ปรมาตร 1.25 มลลลตร ผสมใหเขากน 7. เตม Folin reagent (1:1) ปรมาตร 0.25 มลลลตร ผสมใหเขากนตงทงไว 10 นาท

8. น าไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 660 นาโนเมตร โดยวดเปรยบเทยบกบ blank ทใชน ากลนแทนสารละลายเอนไซม อานคาความเขมขนของ L-Tyrosine จากกราฟมาตรฐาน 3. การเตรยมสารทใชส าหรบทดสอบดวยเทคนค electrophoresis 3.1 SDS-PAGE ชด Electrophoresis ของบรษท Hoefer scientific instruments ประเทศสหรฐอเมรกา สารเคม 1. Seperating gel (รอยละ 12) Acrylamide (รอยละ 30) 5.0 มลลลตร Tris-HCl (1.5 โมลาร pH 8.8) 3.8 มลลลตร SDS (รอยละ 10) 160.0 ไมโครลตร น ากลน 6.0 มลลลตร ไลอากาศ 10 นาท

50

แอมโมเนยมเปอรซลเฟต(รอยละ30) 20.0 ไมโครลตร N,N,N’,N’ -tetramethylenediamine (TEMED) 20.0 ไมโครลตร 2. Stacking gel (รอยละ 5)

Acrylamide (รอยละ 30) 0.825 มลลลตร Tris-HCl (0.5 โมลาร pH 6.8) 0.625 มลลลตร SDS (รอยละ 10) 50.0 ไมโครลตร น ากลน 3.45 มลลลตร แอมโมเนยมเปอรซลเฟต (รอยละ 30) 10.0 ไมโครลตร TEMED 10.0 ไมโครลตร

3. Sample buffer น ากลน 3.8 มลลลตร Tris-HCl (0.5 โมลาร pH 6.8) 1.0 มลลลตร กลเซอรอล 0.8 มลลลตร SDS (รอยละ 10) 1.6 มลลลตร

-mercaptoethanol 0.4 มลลลตร Bromophenol blue 0.4 มลลลตร 4. Electrode buffer เขมขน 5 เทา Tris 45.0 กรม ไกลซน 216.0 กรม SDS 15.0 กรม น ากลน 3.0 ลตร เกบไวทอณหภม 4 องศาเซลเซยส กอนน าไปใชเจอจาง electrode buffer (5X) ปรมาตร 70 มลลลตร ดวยน ากลนใหมปรมาตรเปน 350 มลลลตร 5 . ช ด ส ย อ ม Silver stain kits protein (Amersham Bioscience, Sweden) ประกอบดวย - EDTA-Na2 - Glutadialdehyde 25% - Sodium carbonate - Silver nitrate 2.5%

51

- Sodium acetate - Sodium Thiosulphate 5% วธทดลอง 1. ยดแมพมพทประกอบดวยแผนกระจกและแผนเซรามคกบแทนเตรยมเจลใหแนน โดยมแผนพลาสตกบางขนาดเลกสอดดานขางระหวางแผนกระจกและแผนเซรามค เพอใหเกดชองวางส าหรบเทเจล 2. ผสม seperating gel (รอยละ 12) เทลงในแมพมพ ใหมพนทสวนบนเหลออยประมาณ 1 นว ปลอยทงไวใหเจลแขงตวทอณหภมหอง 3. ผสม stacking gel (รอยละ 5) เททบลงบน seperating gel ในแมพมพจนสดขอบดานบนของกระจก สอดแผนพลาสตกบางทมลกษณะเปนซฟนลงใน stacking gel ทยงไมแขงตว เพอใหเกดชองวางส าหรบใสตวอยางโปรตนทตองการทดสอบ ปลอยทงไวใหเจลแขงตวทอณหภมหอง 4. ถอดแผนพลาสตกบางทมลกษณะเปนซฟนออกจากเจล น าเจลรวมทงแมพมพออกจากแทนยด ตดตงเขากบชดทดสอบโดยใหดานลางของเจลจมอยใน electrode buffer เตม electrode buffer ลงในชองวางระหวางเจลสองแผนจนทวมผวดานบนของเจล 5. เตมตวอยางโปรตนทตองการทดสอบความบรสทธและหาขนาดโมเลกลทตมดวยสารละลาย sample buffer ทอณหภม 100 องศาเซลเซยส นาน 3 นาท ทงใหเยนแลวเตมลงในชองวางส าหรบใสตวอยางโปรตนบรเวณสวนบนของ stacking gel โดยท าพรอมกบโปรตนมาตรฐานททราบขนาดโมเลกล 6. ตอขวไฟฟาของชดทดสอบเขากบหมอแปลงไฟฟากระแสตรง ปรบใหมความตางศกย 100 โวลท และกระแสไฟประมาณ 10-15 มลลแอมแปร 7. ปลอยใหตวอยางโปรตนเคลอนทไปภายในเจล จนสของ bromophenol blue ทเตมใน sample buffer เคลอนทลงไปจนสดขอบลางของเจล 8. ปดกระแสไฟฟา น าเจลและแมพมพออกจากชดทดสอบ 9. ลอกเนอเจลออกจากแมพมพ 10. น าเจลทไดไปยอมดวยสยอม silver stain 11. ลางสสวนเกนออกโดยใช destain I นานประมาณ 1 ชวโมง 12. แชเจลตอใน destain II จนกระทงสวนทเปน background ใส

52

5. กราฟมาตรฐานโปรตนขนาดตางๆ ส าหรบ SDS-PAGE การตรวจสอบขนาดโมเลกลของโปรตนโดยเทคนค SDS-PAGE สามารถค านวณไดจากคา Rf ซงค านวณจากการวดระยะทางจากแถบโปรตนทเคลอนทจากหลมดานบนลงสเจลดานลางตอระยะทางท marker dye เคลอนท (แสดงดงสตรขางลาง) จากนนจงเขยนกราฟระหวางคา Rf กบคา Log Molecular weight เพอค านวณหาขนาดโมเลกลของแถบโปรตนทปรากฏขน

รปท ข.2 คา Rf ของโปรตนมาตรฐาน

53

ภาคผนวก ค ตารางท ค.1 การเตรยมแอมโมเนยมซลเฟตทมความเขมขนอมตวรอยละตางกน ณ อณหภม 0 องศาเซลเซยส

54

ภาคผนวก ง งานวจยทน าเสนอผลงานวจยในงานประชมสมมนาวชาการระดบนานาชาต The 21st Annual

Meeting and International Conference of Thai Society for Biotechnology (TSB) ในหวขอ”Biotechnology: A Solution to the Global Economic Crisis?” ในระหวางวนท 24-25 กนยายน 2552 ณ ศนยการประชมแหงชาตสรกต

55

56