pyrrolizidin-alkaloide (pa) in honig und pollen
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Lehrstuhl für Lebensmittelchemie, Universität WürzburgMichael Kempf, Peter Schreier
Institut für Pharmazeutische Biologie, TU BraunschweigAnnika Reinhard, Till Beuerle
Pyrrolizidin-Alkaloide (PA) in Honig und Pollen
Senecionin
Senecionin-N-Oxid
N
HO
O
O
OH
HO
N
HO
O
O
OH
HO
O
Motivation� Datenlage zu Gehalten von PA in Honigen
(einschließlich Imkereierzeugnissen und Pollenprodukten) lückenhaft (SKLM 2002)
� Ziel des Projekts:
Entwicklung einer Methode zur selektiven und sensitiven Analytik (0.1ppm) von PA in Honig und Pollen
Erarbeitung einer verlässlichen Datengrundlage über das Vorkommen von PA in diesen Produkten
GC oven
backflushvent
GC ov en
backflushvent
600°Creduction reac tor
GC oven
backflushvent
He
water separator
pyrolysis reacto r, 1250 °C p yrolysis reactor, 1 440 °C
CO
magic mix
pyrolys is mode for the
determ ination of O/O1816
H2
pyrolysis mode for the
determination ofH/H21
oxidat ion reactor, 960 °C
o xidation mode for t he
d etermination of C /C, N/N13 1215 14
Grenzwerte für Phytopharmaka1:� innere Anwendung: 1µg/Tag (<6Wochen/Jahr); 0.1µg/Tag (>6Wochen/Jahr)� äußere Anwendung: 100µg/Tag (<6Wochen/Jahr); 10µg/Tag (>6Wochen/Jahr)� Schwangere und Stillende:
� innere Anwendung: keine Benutzung� externe Anwendung: nach Rücksprache mit dem Arzt
1) für PA mit 1,2-ungesättigtem Necingerüst sowie deren N-Oxide
Pyrrolizidin-Alkaloide – Struktur I
Senecionin
Necin-Base
Necin-Säure
7(R)
N
HHO OH
9
Heliotrin
7(S)
� typische sekundäre (toxische) Pflanzeninhaltsstoffe� ca. 380+ Strukturen aus 600 Pflanzen bekannt
Retronecin
Akute Toxizität / GenotoxizitätAkute 1,2-Doppelbindung + Makrocyclische Ester > Diester >Toxizität: Heliotridin-Monoester > Retronecin-Monoester
Nektarpflanzen / Verbreitung / Strukturen
Senecio spp.
Eupatorium spp.
Echium spp.
Borago off.
Symphytum off.
Heliotropium spp.
[Crotalaria spp.]
Asteraceae
Boraginaceae
Fabaceae
N
HO
O
O
OH
HO
N
HO
OHO
OH
HO
Nektarpflanzen / Verbreitung / Strukturen
Analytische Methode I
N
HO
O
O
OH
HO
N
HO
O
O
OH
HO
O
N
HO
O
O
O
N
OO
O
O
OH
HO
FestphasenextraktionKonzentrierung an SCX
LiAlH4-Reduktion� PA-Ester in Retronecin/Heliotridin
Derivatisierung mit MSTFA� GC-MS Analytik
Di-TMS-
Heliotridin
Di-TMS-
Retronecin
Zink-Reduktion� N-Oxide in tertiäre PA
Zugabe des internen StandardsHeliotrin (2µg/20g)
Analytische Methode II
17,0 17,5 18,0 18,5 19,0 19,5 20,0 20,5Time (min)
40
50
60
70
80
90
100
30
40
50
60
70
80
90
10018,42
20,55
17,61
18,43
19,22
20,55
17,61
di-TMS-heliotridineRI= 1632
di-TMS-retronecineRI= 1600
A
B
di-TMS-retronecineRI= 1600
di-TMS-heliotridineRI= 1632
di-TMS-retronecineRI= 1600
A
B
di-TMS-retronecineRI= 1600
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
Honig-Probe # 21A
Honig-Probe # 21B
+ interner Standard(Heliotrin ���� di-TMS-Heliotridin)
LOQ: 10ng/g (0.01ppm)
N
HOSi O
Si
� bei allen untersuchten Honig- und Pollenproben (n=216/n=55) wurden nie natürlich vorkommende Heliotridin-PA gefunden
� alle Proben waren mit dieser Methode quantifizierbar
PA in Honig: Wissensstand
� Deinzer et al., 1977, Science: GC-MS,
Senecio jacobaea (n=4) 0.3-3.9 µg/g
� Culvenor et al., 1981, J.Agric.Food.Chem.: GC-MS Echium plantagineum (n=5) 0.27-0.95 µg/g
� Crews et al., 1997, Food Add. Cont.: LC-MS, Senecio jacobaea (n=23) 0.002-1.48 µg/g
� Beales et al., 2004, J.Agric.Food.Chem.: LC-MS, Echium plantagineum, H. europaeum, H. amplexicaule
(n=68, LOD:1ng/g) 0.03-2.2 µg/g
� Betteridge et al., 2005, J.Agric.Food.Chem.: LC-MS,
Echium vulgare (n=9, LOD: 1ng/g) 0.017-2.85 µg/g
� NL, Nahrungsmittel- und Warenamt: 2007, LC-MS,
Senecio jacobaea (n=171, 28%, ∅: 0.007 µg/g, LOD: 1 ng/g) 0.001-0.365 µg/g
PA in Honig: Ergebnisse I
PA Gehalte Honig (n=3) *
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
21 32 34 35 36 39 41 43 50 93 119 145 153 155 161 176 179 188 212
Honigprobe
PA
Geh
alt
[µg
/g]
*) PA-Gehalt berechnet als Heliotridin/Retronecin-Äquivalente
� non-target Analyse von 216 Honigen (19 PA-positiv; 9%)� Bereich*: 0.02µg/g – 0.12µg/g, ∅ 0.06µg/g
PA in Honig: Ergebnisse IIRegionale Verteilung der untersuchten Proben
Regionale Verteilung der PA-positiven Proben
94
60
34
22 6
Europa nicht zugeordnet Zentral-/Südamerika Australien/Neuseeland USA/Canada
123
31
nicht zugeordnet Zentral-/Südamerika Australien/Neuseeland USA/Canada
2005
Boppré et al., J.Agric.Food.Chem.:
• Echium vulgare (Boraginaceae)
• nativer Pollen
• LC-MS, 8-14mg/g
2008
Boppré et al., J.Agric.Food.Chem.:
• Pollenhöschen, LC-MS, u.a.:• Echium vulgare (Boraginaceae): 350µg/g
• Echium plantagineum (Boraginaceae): 6-28µg/g
• Eupatorium cannabinum (Asteraceae): 120µg/g
• Senecio jacobaea (Asteraceae): 100µg/g
• Senecio ovatus (Asteraceae): 70µg/g
PA in Pollen: Wissensstand
PA in Pollenprodukten: Ergebnisse I
PA Gehalte Pollenprodukte (n=4) *
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
18,00
20,00
2 3 8 9 12 13 19 24 28 33 34 37 38 40 45 50 52
Pollenprobe
PA
Geh
alt
[µg
/g]
*) PA-Gehalt berechnet als Heliotridin/Retronecin-Äquivalente
� non-target Analyse von 55 Pollenprodukten (17 PA-positiv; 31%)� Bereich*: 1.08µg/g – 16.35µg/g, ∅ 5.17µg/g
PA in Pollenprodukten: Ergebnisse II
3316
4 1 1
Europa nicht zugeordnet USA/Mexiko Neuseeland Asien
9
8
Europa (Spanien/5, Rumänien/2, Italien/1, Frankreich/1) nicht zugeordnet
Regionale Verteilung der untersuchten Proben
Regionale Verteilung der PA-positiven Proben
PA in Honig / Pollen: Diskussion I
• Bundesanzeiger, 1992, June 17, 4805
Phytopharmaka: 1,2 ungesättigte PA max. 1µg/Tag bzw. 0.1µg/Tag und Nulltoleranz für Schwangere und Stillende
• Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR), Positionspapier des BfR vom 12. März 2007
Bei der Bewertung der Verunreinigungen von Lebensmitteln durch Pflanzenteile oder Pflanzenbestandteile die toxikologisch relevante Stoffe enthalten …wird unterschieden, ob einerseits akut-toxische oder andere nicht-genotoxischeEffekte (z.B. THC, Morphin) oder andererseits genotoxische
Effekte (z.B. Pyrrolizidinalkaloide) des pflanzlichen Wirkprinzips im Vordergrund der Risikobewertung stehen.Im ersten Fall wird das Konzept des „margin of safety“angewandt, im zweiten das der „Nulltoleranz“.
Deutschland
Australien /
Neuseeland
Niederlande
USA
Europa
PA in Honig / Pollen: Diskussion I
Deutschland
Australien /
Neuseeland
Niederlande
USA
Europa
• Lebenslange tägliche Einnahme
Virtually Safe Dose von 0.43 ng/kg/ Körpergewicht pro Tag (Riddellin)
• Maximal Tolerable Risk
3µg/Person/Tag
• TDI (nicht-karzinogene Effekte)
6.5µg/Tag
• Kräuterbeschluss
die Menge toxischer PA in Kräuterpräparaten< 1 µg/kg oder Liter.
PA in Honig / Pollen: Diskussion I
Deutschland
Australien /
Neuseeland
Niederlande
USA
Europa
• Amtsblatt der Europ. Union 27.06.2008
Genehmigung für raffiniertes Echium Öl
PA nicht nachweisbar (Nachweisgrenze 4µg/kg)
Berechnet auf eine Tagesdosis für dieses Lebensmittel ���� ca. 0.05 µg PA/Tag
PA in Honig / Pollen: Diskussion I
Deutschland
Australien /
Neuseeland
Niederlande
USA
Europa
• FDA Empfehlung von 2001
…the clear evidence of an association between oral exposure to pyrrolizidine alkaloids and serious adverse health effects and the lack of any valid scientific data that would enable the agency to determine whether there is an exposure, if any, that would present no harm to consumers, indicates that this substance should not be used as an ingredient in dietary supplements…
…the manufacturer bears the primary responsibility for ensuring that its dietary supplement products are safe…
PA in Honig / Pollen: Diskussion I
Deutschland
Australien /
Neuseeland
Niederlande
USA
Europa
• Food Standards Australia New Zealand
provisorischer “safe level of intake” (tolerable daily intake): 1µg/kg Körpergewicht/Tag
20
Zusammenfassung / Fazit
� 19 von 216 (9%) Honigen, sowie 17 von 55 (31%) Pollen-produkten erwiesen sich als PA-positiv
� Honig: ∅∅∅∅ 0.06µg/g
� Pollen: ∅∅∅∅ 5.17µg/g
� Berechnete Tagesdosis mit einer Verzehrmenge von 20g (Honig) bzw. 10g (Pollen):
Alle Proben (Ausnahme ein Honig) liegen über dem Grenzwert für Phytopharmaka von 1µg/Tag.
� alle PA-positiven Proben enthielten z. T. erhebliche Anteile von Pollen PA-produzierender Pflanzen (meist Echium spp.).
� bei hoch belasteten Honigen besteht die Gefahr der down-stream Kontamination in der Nahrungsmittelindustrie
Vielen Dank für’sZuhören
Bieneninstitut CelleDr. Werner von der Ohe