qui346 cromatografia (2ª parte) cromatografia a...
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28/07/2016
Prof. Mauricio X. Coutrim –
DEQUI - UFOP
CROMATOGRAFIA
(2ª Parte)
Cromatografia a
Líquido
QUI346
01
MECANISMOS
CROMATOGRÁFICOS
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• Classificação dos tipos de cromatografia conforme os
mecanismos de separação.
• Cromatografia de:
Adsorção
Partição
Troca-iônica
Exclusão molecular
Bio-afinidade
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É o mais antigo tipo de
cromatografia.
Utiliza uma FM líquida ou
gasosa. Essa adsorvida na
superfície da FE sólida.
O equilíbrio entre as FM e FE
proporciona a separação dos
solutos eluidos.
CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO
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A FE líquida forma
um filme fino sobre
um sólido (suporte)
Os diferentes
equilíbrios
alcançados pelos
solutos entre a FM e
FE são os
responsáveis pela
separação destes.
CROMATOGRAFIA DE PARTIÇÃO
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CROMATOGRAFIA IÔNICA
Cromatografia
por Par Iônico
Utiliza FE reversa.
Um reagente par
iônico (um tensoativo
com grupo alifático e
com carga oposta à
dos solutos) é
adicionado antes da
amostra. Na FM é
adicionado um
tampão (solvente
orgânico + água +
ácido ou base) que
deixará os solutos
ionizados.
CROMATOGRAFIA IÔNICA
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Cromatografia de Troca
Iônica
Cátions e ânions orgânicos
são ligados covalentemente a
diversos tipos de resinas (FE).
Solutos iônicos de cargas
opostas presentes na FM são
atraídos para a resina através
de forças eletrostáticas.
CROMATOGRAFIA IÔNICA
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AS PRINCIPAIS RESINAS
UTILIZADAS COMO
SUPORTE EM
CROMATOGRAFIA DE
TROCA-IÔNICA SÃO
AQUELAS BASEADAS NO
POLÍMERO ESTIRENO -
DIVINILBENZENO
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Ou Cromatografia por Permeação em Gel (GPC).
A FM passa através dos poros de um gel (FE) e os solutos presentes são separados por diferença de tamanho.
Os poros são geralmente pequenos e excluem os solutos de maior tamanho.
Moléculas maiores atravessam a coluna em menos tempo do que as menores.
CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO MOLECULAR
CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO MOLECULAR
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Aplicações de GPC
a) Separação preliminar de uma amostra complexa (p. ex.
proteínas a serem analisadas por HPLC);
b) Análises de amostras de proteínas purificadas para
verificação da presença de dímeros, trímeros e outras
espécies agregadas;
c) Estimação da massa molar a partir da curva de
calibração;
d) Análise e controle de qualidade de polímeros orgânicos.
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Altamente seletiva! Baseia-se nas interações específicas entre
um tipo de molécula de soluto da FM e uma determinada
molécula imobilizada na FE.
CROMATOGRAFIA DE BIO-AFINIDADE
Exemplo: Um anticorpo
imobilizado na FE reage
com uma proteína
específica dentre os
diversos tipos de proteínas
presentes na FM. A
proteína é extraída da FE
alterando-se o pH ou a
força iônica da FM.
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA EM COLUNA
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SEM PRESSÃO (Clássica)
Características: tubo de vidro com extremidade superior aberta e
inferior com torneira; de 10 cm a alguns metros;
diâmetro variando de alguns centímetros a um metro;
FE geralmente é um sólido; FM flui pela gravidade
COM PRESSÃO (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - HPLC)
Características: tubo de aço de 5 a 50 cm, com pequeno diâmetro
(mm); FE geralmente é um líquido; FM flui pela
pressão de uma bomba peristáltica
A fase estacionária (sólido ou líquido) fica dentro de um cilindro (coluna)
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA CLÁSSICA
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A COLUNA CROMATOGRÁFICA
Características: tubo de vidro cilíndrico + torneira
Posição: vertical (gravidade)
Enchimento: lã de vidro na saída da tubo + fase estacionária
(adsorvente) misturada com o solvente
Eluição: amostra na parte superior + suporte + solvente (FM)
Coleta: frasco(s) coletor(es)
CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO
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INTERAÇÕES ↔ POLARIDADE
Ordem decrescente de retenção por FE sólida (polar)
de substâncias por função química:
-COOH > -OH > -NH2 > -SH > -CHO > -C=O >
-CO2R > -OCH3 > -CH=CH-
Algumas fases estacionárias para CL:
-Óxido de alumínio básico, neutro e ácido (63mm < dp < 200mm)
-Celulose microcristalina (63mm < dp < 200mm)
-Silicato de magnésio (75mm < dp < 150mm)
-Sílica gel (63mm < dp < 200mm)
CARACTERÍSTICAS DAS FE e FM EM CL CLÁSSICA
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•O adsorvente deve ser ativado (D (200 oC a 200 oC / ± 4 horas)
•A atividade varia de lote para lote (não é reprodutível)
•Os adsorventes provocam alguns tipos de reações indesejáveis
(alumina condensa aldeídos e cetonas, carvão ativo provoca algumas
decomposições químicas e sílica isomeriza terpenos)
O eluente deve:
- Ser um bom solvente para a amostra e fracamente adsorvido pela FE
- Não interagir quimicamente com a FE nem com a amostra
- Ter baixo ponto de ebulição (35 – 85 oC)
- Ter polaridade adequada para o desenvolvimento cromatográfico
Eluentes em ordem crescente de polaridade:
Hexano, éter de petróleo, ciclohexano, tetracloreto de carbono,
benzeno, tolueno, diclorometano, clorofórmio, éter etílico, acetato
de etila, piridina, acetona, etanol, metanol e ácido acético
O ENCHIMENTO DA COLUNA E A ELUIÇÃO
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- A eficiência da coluna será melhor quanto mais uniforme
for o enchimento
- Deve-se fazer uma pasta com o adsorvente e a FM
- A adição dessa pasta na coluna deve ser feita com essa já
contendo 1/3 de FM
- As bolhas de ar devem ser eliminadas com a vibração da
coluna (essa ação também homogeneíza o enchimento)
- A FM deve sempre estar cerca de 2 cm acima da FE
(sólido)
- A adição da FM não deve perturbar a FE
- A vazão da FM deve ser constante e adequada
UTILIZAÇÃO DE CL CLÁSSICA
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- Separação e purificação de intermediários
de síntese orgânica
- Purificação de solventes (escala
preparativa)
- Separação de esteróides da urina e do
sangue
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICÊNCIA (HPLC)
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Diferentemente da CLC utiliza pressão na eluição da FM
Início nos anos 70 com a disponibilidade de colunas recheadas com partículas de pequenos diâmetros (3 a 10 mm).
Nos anos 70 e 80 vários detectores foram desenvolvidos (>10) A partir dos anos 80 já é comumente utilizada
Dimensões típicas de colunas:
1. Comprimento: de alguns mm a vários cm (m)
2. Diâmetro: 2 a 5 mm e 3 a 200 mm (micro coluna)
3. Fast HPLC (comp ~ 3mm e dp menores)
Utilização: 50% (biotecnologia, biomedicina, bioquímica e farmácia) Analytical Chem. vol 62, no. 19, oct 1 1990
TEORIA BÁSICA A Banda Cromatográfica
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Após a injeção, as moléculas do analito começam a ser arrastadas, mas elas se dispersam, distribuindo-se pela coluna segundo o perfil de uma distribuição gaussiana:
A largura da banda (pico cromatográfico) é função do parâmetro s da distribuição
gaussiana associada à eluição (wb » 4 s).
O tempo médio que as moléculas de um analito demoram para atravessar a coluna é o tempo de retenção tR.
TEORIA BÁSICA O Tempo de Retenção
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tR
tM
tR’ = tR - tM
TEMPO
SIN
AL
tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico
cromatográfico)
tM = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um
composto que não interaja com a FE atravessar a coluna)
tR’ = Tempo de Retenção Ajustado (tempo médio que as moléculas do analito
passam sorvidas na FE)
CROMATOGRAMA
EFICIÊNCIA CROMATOGRÁFICA
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A migração de um analito pela
coluna provoca inevitavelmente
o alargamento da sua banda:
Efeitos do
alargamento
excessivo de picos:
Picos mais largos e menos intensos =
menor detectabilidade.
Separação deficiente de analitos com
retenções próximas.
EFICIÊNCIA: Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito.
EFICIÊNCIA CROMATOGRÁFICA
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Supondo a coluna cromatográfica
como uma série de estágios
hipotéticos e separados onde
ocorre o equilíbrio entre o analito,
a FE e a FM:
O número de pratos teóricos (N) de
uma coluna pode ser calculado por:
ASSIMETRIA
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O fator de assimetria (As),
medido a 10% da altura,
também fornece
informações sobre a
eficiência cromatográfica.
Picos cromatográficos de
Compostos eluídos
eficientemente apresentam:
0,8 < A10 < 1,2 As = B / A
RESOLUÇÃO
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RESOLUÇÃO (Rs) expressa
a separação efetiva entre
dois picos adjacentes
FATORES QUE AFETAM A RESOLUÇÃO
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EFEITO DA EFICIÊNCIA, DA RETENÇÃO E DA SELETIVIDADE NA
RESOLUÇÃO CROMATOGRÁFICA
Resolução = x x
N e k se referem ao composto
mais retido
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Critérios de Escolha
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Seleção da Modalidade e
Mecanismo de
Separação
ESQUEMA DO APARELHO DE HPLC
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Reservatório FM
/ Degaseificador Recuperação
/ Descarte
HPLC - INSTRUMENTAÇÃO
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Cromatógrafo Líquido de Alta
Eficiência (HPLC) com Detetores
UV-Vis, Indíce de Refração e
Espectrofluorimétrico.
Marca/Modelo: Shimadzu
HPLC-IT-TOF Shimadzu
HPLC - INSTRUMENTAÇÃO
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Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (HPLC) da Agilent (HP)
HPLC vs UHPLC (UPLC)
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1. DIÂMETRO DE PARTÍCULA DA FE
i. Clássica (63mm < dp < 200mm)
ii. HPLC (2mm < dp < 10mm)
iii. UHPLC (2mm < dp < ? (1,2)mm)
2. PRESSÃO MÁXIMA
i. Clássica (atmosférica)
ii. HPLC (100 a 300 atm; 500 a 4000 psi)
iii. UHPLC (UPLC) (acima de 1000 atm; 15000 psi)
Menor diâmetro de partícula (FE) maior área
superficial maior EFICIÊNCIA maior pressão (FM)
Artigo referência para uma abordagem atual sobre UHPLC:
L Maldaner e ICSF Jardim. Scientia Chromatographica v4, n3, p197-207, 2012.
Disponível em http://www.scientiachromatographica.com/files/v4n3/v4n3a14.pdf
PRINCIPAIS PARTES DO SISTEMA HPLC
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1. SISTEMA DE INJEÇÃO DA AMOSTRA
2. FASE MÓVEL (FM)
3. FASE ESTACIONÁRIA (FE) = COLUNA
4. SISTEMA DE DETEÇÃO
INJEÇÃO DA AMOSTRA NO HPLC
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Injeção Manual
Injeção automática
• Injetor com pistão automático
• Injetor pneumático por sucção
INJETOR PARA HPLC
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Esquema de Injetor de seis vias para HPLC
INJETOR PARA HPLC
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Esquema de Injetor tipo Rheodyne de seis vias
INJETOR PARA HPLC
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Tipo mais comum
é um com uma
válvula de 6 vias (3
entradas e 3
saídas) (Rodyne®)
FASE MÓVEL: ISOCRÁTICA x GRADIENTE
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A separação de um soluto em uma coluna se dá devido às diferenças nas
afinidades entre esse e a FM e a FE: maior afinidade pela FM mais rápida a
eluição (menor tR) e maior afinidade pela FE maior o tR.
Tipos de FM: Isocrática e Gradiente
(com força linear de solvente-LSS)
PRINCIPAIS PARTES DO SISTEMA HPLC
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1. SISTEMA DE INJEÇÃO DA AMOSTRA
2. FASE MÓVEL (FM)
3. FASE ESTACIONÁRIA (FE) = COLUNA
4. SISTEMA DE DETEÇÃO
FASE MÓVEL: ISOCRÁTICA x GRADIENTE
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A eluição por gradiente melhora a resolução e a separação dos picos, além
da largura na base ficar mais fina e mais semelhantes ( ↑ N)
Em LSS (força linear
de solvente), K’ (fator
de retenção ou
capacidade) médio é
praticamente o
mesmo para todos os
solutos que eluem
em diferentes
tempos.
CARACTERÍSITICAS DA FM
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Possuir alto grau de pureza
Solubilizar a amostra
Ser inerte à FE (não decompô-la)
Ser inerte aos componentes da amostra (não reagir)
Ter baixa viscosidade
Ser compatível com o detector
Ter polaridade adequada à separação
POLARIDADE DA FM
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SÉRIE
ELUOTRÓPICA
(ordem dos
solventes utilizados
como FM em ordem
crescente de
polaridade).
COMPOSIÇÃO DA FM
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EM HPLC O
DESENVOLVIMENTO
CROMATOGRÁFICO É
MUITO DEPENDENTE
DA COMPOSIÇÃO DA
FASE MÓVEL
COLUNA DE FASE REVERSA (C18)
(DMF, acetona, benzonitrila,
benzeno, tolueno e naftaleno)
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The chromatograms right show the
results of separations of protein
mixtures by ion exchange
chromatography. The lettered
peaks correspond to different
proteins (A = ovalbumin, B =
conalbumin, C = cytochrome c, D
= lysozyme). The separation
corresponding to the
chromatogram on the left was
performed at pH 5.85, while the
one on the right was performed at
pH 6.5. It is evident that operation
conditions such as pH and
temperature have a significant
effect on the output.
INFLUÊNCIA DO pH CROMATOGRAFIA DE ÍONS
COMPOSIÇÃO DA FM
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INFLUÊNCIA DO pH CROMATOGRAFIA DE ÍONS
INFORMAÇÕES
DA COLUNA
COMPOSIÇÃO DA FM
PRINCIPAIS PARTES DO SISTEMA HPLC
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1. SISTEMA DE INJEÇÃO DA AMOSTRA
2. FASE MÓVEL (FM)
3. FASE ESTACIONÁRIA (FE) = COLUNA
4. SISTEMA DE DETEÇÃO
FASE ESTACIONÁRIA IDEAL
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Consiga executar a análise no menor tempo possível
Com máxima capacidade de amostra
Com a melhor resolução na separação
Com fácil introdução da amostra
Produzindo menor queda de pressão possível
Com o custo mais baixo possível
FASE ESTACIONÁRIA PARA HPLC
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5 TIPOS DIFERENTES:
1. CLS (adsorção) p.ex. sílica e alumina (FN)
2. CLL (partição) suporte sólido recoberto por líquido (FR)
3. CLFL (partição) p.ex.HC ligado a um suporte sólido (FR)
ou –NH2 ligado ao suporte (FN)
4. CET (exclusão de tamanho) p. ex. sílica ou resina cruzada
5. CTI (interação iônica) p.ex. Est-DVB + –SO3¯ ou –NR3+
TIPOS DE FE QUANTO AO
MECANISMO DE SEPARAÇÃO
SÍLICA PARA FE EM HPLC
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A SÍLICA É O PRINCIPAL COMPOSTO
UTILIZADO COMO PARTÍCULA EM FASE
ESTACIONÁRIA PARA HPLC
FE QUIMICAMENTE LIGADA
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1. Si-OH (silanol) + ROH Si-O-R (éster silicato) + H2O
2. Si-OH + R3SiCl (organoclorosilano) Si-O-SiR3 (siloxano) + HCl
3. Si-OH — Si-Cl + RLi Si-R (silício-carbono) + LiCl
SOCl
OBS: O método 1 produz fase menos estável enquanto os métodos 2
e 3 produzem fases estáveis a pH <8
CLASSIFICAÇÃO DA FE (TIPO DE PARTÍCULA)
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Sólidos rígidos, semi-rígidos ou não rígidos
Partículas porosas ou peliculares
Partículas esféricas ou irregulares
Partículas com diferentes diâmetros
PARTÍCULAS PARA FE EM HPLC
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UFOP 51
AS PARTÍCULAS QUE
COMPÕEM A FASE
ESTACIONÁRIA EM HPLC
TÊM IMPORTÂNCIA
FUNDAMENTAL, POIS
DELAS DEPENDEM A
EFICÊNCIA DA SEPARAÇÃO.
O LIMITE DE PRESSÃO A
SER UTILIZADO TAMBÉM
DEPENDE DELAS!
PARTÍCULAS PARA FE EM HPLC
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UFOP 52
QUANTO MENOR O
TAMANHO DA PARTICULA
MAIOR A ÁREA
SUPERFICIAL E MAIOR A
RESISTÊNCIA PARA A
PASSAGEM DA FM
Fonte:
http://www.phenomenex.com/Kinetex/Selectivities/Biphenyl?returnURL=/Produc
ts/Search/HPLC (consultado em 13/nov/14)
HPLC
UHPLC
ou
UHPLC
PARTÍCULAS PARA FE EM HPLC
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UFOP 53
EFEITO NA SEPARAÇÃO PELO TAMANHO DA PARTÍCULA
Fonte: http://www.allcrom.com.br/kinetex.html (consultado em 13/nov/14)
1 2
3
1 – coluna comum (dp = 5 mm)
2 – coluna (dp = 2,6 mm) com pressão
comum
1 – coluna (dp = 2,6 mm) com alta
pressão (UPLC)
ENCONTRE AS FÓRMULAS DE PELO MENOS SETE DESSES FÁRMACOS E
COLOQUE-OS NUMA ORDEM CRESCENTE DE POLARIDADE.
PARTÍCULAS PARA FE EM HPLC
28/07/2016 Prof. Mauricio X. Coutrim – DEQUI -
UFOP
ESTRUTURAS MOLECULARES DOS FÁRMACOS
OBS: Estruturas retiradas de páginas da wikipédia
1) procainamida
2) Acetaminofen / Paracetamol
3) Ácido fólico
4) sulfatiazol
5) acetobutol
6) dextrometorfano
7) difenidramina
8) Propafenona
9) Amitriptilina
10) Fluoxetina (R,S)
11) naproxeno
12) Difunisal
13) Indometacina
3) Ácido fólico
H2N
1) p
H3C
6) d
11)
H3C
PARTÍCULAS PARA FE EM HPLC
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UFOP 55
CADA FAIXA DE
TAMANHO DE
PARTÍCULA
APLICA-SE A
UM TIPO DE
SEPARAÇÃO.
PARTÍCULAS PARA FE EM HPLC
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UFOP 56
EXEMPLO DE PARTÍCULAS PELICULARES (NÚCLEO
SÓLIDO COM CAMADA POROSA).
PARTÍCULAS PARA FE EM HPLC
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É o nome que se dá
ao processo de se
ligar grupos
trimetilsilil aos
grupos silanóis
resultantes em fase
estacionária
quimicamente ligada
para evitar que
grupos mais polares
apresentem picos
com caldas.
Esse processo dá
mais durabilidade à
fase estacionária.
ENDCAPPING
PARTÍCULAS PARA FE EM HPLC
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UFOP 58
TIPOS DE FASE
ESTACIONÁRIAS
PARA HPLC
(hidrofóbicas)
Fonte: http://www.phenomenex.com/Kinetex/Selectivities/Biphenyl?returnURL=/Products/Search/HPLC (consultado em 13/nov/14)
PARTÍCULAS PARA FE EM HPLC
28/07/2016 Prof. Mauricio X. Coutrim – DEQUI -
UFOP 59
TIPOS DE FASE ESTACIONÁRIAS PARA
HPLC (hidrofílicas e aromáticas)
Fonte: http://www.phenomenex.com/Kinetex/Selectivities/Biphenyl?returnURL=/Products/Search/HPLC (consultado em 13/nov/14)
PARTÍCULAS PARA FE EM HPLC
28/07/2016 Prof. Mauricio X. Coutrim – DEQUI -
UFOP 60
FASE ESTACIONÁRIA QUIRAL (ciclodextrinas - CD)
Fonte: Shodex, colunas para HPLC. http://www.shodex.net/index.php?seitenid=19 (consultado em 15/nov/14)
Para separação de
isômeros óticos a fase
estacionária também deve
apresentar isomeria ótica
PARTÍCULAS PARA FE EM HPLC
28/07/2016 Prof. Mauricio X. Coutrim – DEQUI -
UFOP 61
APLICAÇÃO:
WARFARINA
(anticoagulante)
Fonte: Shodex, colunas para HPLC. http://www.shodex.net/index.php?seitenid=19 (consultado em 15/nov/14)
FE QUIRAL com
ciclodextrina
PARTÍCULAS PARA FE EM HPLC
28/07/2016 Prof. Mauricio X. Coutrim – DEQUI -
UFOP 62
Fonte: http://az621941.vo.msecnd.net/documents/e1e6bbfa-
9759-4293-bcea-c72db79131da.pdf (consultado em 13/nov/14)
celulose
FASE ESTACIONÁRIA QUIRAL
(celulose e amilose)
fenilcarbamato
-CH3
-CH3
3,5 dimetil
PARTÍCULAS PARA FE EM HPLC
28/07/2016 Prof. Mauricio X. Coutrim – DEQUI -
UFOP 63
APLICAÇÃO:
DISOPIRAMIDA
(antiarrítmico p/
tratamento da
taquicardia
ventrícular) Fonte: https://phenomenex.blob.core.windows.net/documents/fac273de-826b-4502-
b5ac-eb748b3130f3.pdf (consultado em 15/nov/14)
FE QUIRAL com celulose
PRINCIPAIS PARTES DO SISTEMA HPLC
28/07/2016 Prof. Mauricio X. Coutrim – DEQUI - UFOP 64
1. SISTEMA DE INJEÇÃO DA AMOSTRA
2. FASE MÓVEL (FM)
3. FASE ESTACIONÁRIA (FE) = COLUNA
4. SISTEMA DE DETEÇÃO
DETECTOR IDEAL PARA HPLC
28/07/2016 Prof. Mauricio X. Coutrim – DEQUI - UFOP 65
Alta sensibilidade e baixo limite de detecção
Resposta rápida a todos os solutos
Insensível a mudanças de temperatura, composição e vazão da FM
Pequeno volume extra (alargamento do pico)
Resposta linear com a massa de soluto
Não destrutivo
Seguro e conveniente para a utilização
Fornecer resposta qualitativa sobre o composto detectado
DETECTORES EM HPLC
28/07/2016 Prof. Mauricio X. Coutrim – DEQUI - UFOP 66
OS MAIS COMUNS:
Refractive Index (RI),
Ultra-Violet (UV) (l fixo e varável),
Fluorescent,
Radiochemical,
Electrochemical,
Near-Infra Red (Near-IR),
Mass Spectroscopy (MS),
Nuclear Magnetic Resonance (NMR),
Light Scattering (LS).
Sensibilidade (g.mL-1)
(10-8 a 10-9)
(10-9 a 10-11)
(10-9 a 10-10)
(10-12 a 10-15)
(10-8 a 10-10)
LINEARIDADE DE DETECÇÃO
28/07/2016 Prof. Mauricio X. Coutrim – DEQUI - UFOP 67
Limite de detecção (LD) = 3 x ruído
Limite superior LS) = maior valor da curva
Faixa dinâmica = LS / LD
DETECTOR IR (ÍNDICE DE REFRAÇÃO)
28/07/2016 Prof. Mauricio X. Coutrim – DEQUI - UFOP 68
Fonte: http://www.shodex.net/index.php?seitenid=1&applic=1485, consultado em 15/nov/14
Detector por Índice de Refração
VANTAGENS
1) Detector universal
2) Adequado para substâncias que não
absorvam energia UV-Vis
3) Útil nos casos de solventes que
absorvam fortemente na região UV
(P. ex., solventes para GPC)
4) A relação do sinal (IR) é diretamente
correlacionada com a concentração
do analito
DETECTOR UV (Diode Array)
28/07/2016 Prof. Mauricio X. Coutrim – DEQUI - UFOP 69
Fonte: Jones, Analytical Chemistry,1985, Vol. 57, pp. 1057-1073
Detector de UV-Vis com arranjo de diodos
DETECTOR DE FLUORESCÊNCIA
28/07/2016 Prof. Mauricio X. Coutrim – DEQUI -
UFOP 70
EXEMPLOS DE UTILIZAÇÃO:
1. Determinação de DNA/RNA,
Enzima, funcionalidade e
bioquímica de proteína;
2. Determinação de PAH
Diagrama do detector de fluorescência em um
único comprimento de onda de excitação (Scott, Raymond P. W. Chromatographic detectors: design, function, and operation,
Series: Chromatographic Science, Marcel Dekker, Inc. v.70, p.202, 1996)
DETECÇÃO POR FLUORESCÊNCIA
28/07/2016 Prof. Mauricio X. Coutrim – DEQUI -
UFOP 71
Naftaleno Acenafteno
Acenaftileno
Fuoreno
Fenantreno An traceno
Fluoranteno Pireno
Benzo[a]Antraceno * Criseno *
Benzo[g,h,i]Perileno Dibenzo[a,h]Antraceno * Indeno[1,2,3 - cd]Pireno *
Benzo[b]Fluoranteno * Benzo[k]Fluoranteno *
Benzo[a]Pireno *
Figura 1 - Estrutura dos 16 HPAs incluídos na lista de poluentes prioritários da
EPA. As estruturas assinaladas com (*) referem-se aos HPAs carcinogênicos.
Determinação de Hidrocarbonetos
Policíclicos Aromáticos (HPA´s)
A
P
L
I
C
A
Ç
Ã
O
DETERMINAÇÃO DE HPA´s
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UFOP 74
C
R
O
M
A
T
O
G
R
A
M
A
DETERMINAÇÃO DE HPA´s
28/07/2016 Prof. Mauricio X. Coutrim – DEQUI -
UFOP 75
C
O
N
C
E
N
T
R
A
Ç
Õ
E
S
L
I
M
I
T
E
S
DETECTOR DE ESPECTROMETRIA DE MASSAS
28/07/2016 Prof. Mauricio X. Coutrim – DEQUI -
UFOP 76
INSTRUMENTAÇÃO
Fonte: Seminário de Bruna Pegorelli Gomes e
Vanessa Aparecida dos Santos, apresentado na aula
de QUI346 em 27/07/16
QUADRUPOLO OU TOF
DETECTOR DE ESPECTROMETRIA DE MASSAS
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INSTRUMENTAÇÃO
Fonte: Seminário Rafael Vieira Thais Ostolin , apresentado na aula de QUI346 em 27/07/16
DETECTOR DE ESPECTROMETRIA DE MASSAS
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UFOP 78
INSTRUMENTAÇÃO
Fonte: Seminário de Vanessa A. B. Serra,
apresentado na aula de QUI346 em 27/07/16.
DETECTOR DE ESPECTROMETRIA DE MASSAS
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UFOP 79
EXEMPLOS DE UTILIZAÇÃO:
Determinação de substâncias
presentes nas folhas de chá verde
por UPLC/LCMS-IT-TOF
Fonte: http://www.shimadzu.com/an/lcms/lcmsittof/ittof.html, consultado em 16/nov/14
Fonte: http://www.shimadzu.com/an/lcms/lcmsittof/metabo-
example.html, consultado em 16/nov/14
ANALISADOR
PRINCÍPIO A amostra é fragmentada e ionizada em um padrão
característico da espécie química (analito).
1 Moléculas da amostra são bombardeadas por elétrons (electron impact =
EI) ou íons (chemical ionization = CI):
ABCDE + e- ABCDE.+ + 2 e-
2 O íon formado se fragmenta: ABCDE.+ AB
. + CDE+
ABCDE.+ AB+ + CDE
.
ABCDE.+ A+ + BCDE
.
3 Os íons formados são separados de acordo com suas massas e cargas
Ab
un
dân
cia
Massa / Carga
O gráfico do número de íons
formados em função da razão
Massa / Carga dos íons é o
ESPECTRO DE MASSAS do analito
DETECTOR DE ESPECTROMETRIA DE MASSAS
MONITORAMENTO DO ÍON SELECIONADO (SIM = Single Ion Monitoring)
Seleciona-se um fragmento resultante da fragmentação da espécie de
interesse. Gera-se o cromatograma plotando-se o número de íons
detectados com a massa desse fragmento em função do tempo.
Espectros de massas completos coletados e arquivados em
intervalos regulares de tempo
Geração do cromatograma a partir dos espectros:
CROMATOGRAMA DE ÍONS TOTAIS (TIC = Total Ion Chromatogram)
Para cada espectro o número total de íons detectados na faixa de massas
varrida é somado e plotado em função do tempo, gerando o cromatograma.
TIC
Universal
Similar a DIC
SIM
Seletivo
Maior Sensibilidade
DETECTOR DE EM: GERAÇÃO DO CROMATOGRAMA
TIC = Total Ion
Chromatogram Aparecem os picos
correspondentes a todas
substâncias eluídas
SIM = Single Ion
Monitoring (m/z = 149) Cromatograma construído a
partir dos mesmos dados
acima, mas apenas usando
fragmentos com massa = 149
(ftalatos: plastificante)
DETECTOR DE EM: (LC-MS/MS): TIC x SIM X SRM
DETECTOR DE EM: (LC-MS/MS): TIC x SIM X SRM
APLICAÇÃO Determination of Phthalate Ester
Congeners and Mixtures by LC/ESI-MS
in Sediments and Biota of an Urbanized
Marine Inlet
Zhong-Ping Lin et al.
Environ. Sci. Technol. 2003, 37, 2100-2108
28/07/2016 Prof. Mauricio X. Coutrim – DEQUI - UFOP 84
Idealmente os analitos devem estar presente na amostra em
condições de análise (injeção direta da amostra no sistema
cromatográfico)
Na realidade, as amostras precisam ser preparadas para o
sistema cromatográfico
Extração:
Limpeza da amostra (clean up)
Concentração dos analitos da amostra
Derivatização:
Muitos analitos não são adequados para a separação e/ou
detecção
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA (analitos)
DIVERSAS TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO
28/07/2016 Prof. Mauricio X. Coutrim – DEQUI - UFOP 85
1) Extração líquido-líquido (LLE),
2) Extração por Soxhlet (p.ex., p/ extração de lipídeos),
3) Extração por arraste de vapor (p.ex., p/ óleos essenciais),
4) Extração líquido-líquido a baixa temperatura (LLE-PLT,
liquid-liquid extraction with partition at low temperature),
5) Extração sólido-líquido a baixa temperatura (SLE-LTP,
solid-liquid extraction with low temperature partitioning),
DIVERSAS TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO
28/07/2016 Prof. Mauricio X. Coutrim – DEQUI - UFOP 86
6) Extração em fase sólida (solid phase extraction, SPE),
7) Extração por headspace (HS),
8) Microextração em fase sólida (SPME),
9) Microextração em gota única ( SDME, single drop micro
extraction).
10)Headspace e microextração em fase sólida (HS-SPME),
DIVERSAS TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO
28/07/2016 Prof. Mauricio X. Coutrim – DEQUI - UFOP 87
11) Extração assistida por micro-ondas (microwave-assisted
extraction, MAE),
12) Extração assistida por ultrassom (ultrassonic-assisted
extraction, UAE),
13) Extração em fluído supercrítico (supercritical fluid
extraction, SFE),
14) Extração subcrítica com água (líquida a altas temperaturas
e pressão) (Subcritical water extraction, SWE), etc.
EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (EFS)
28/07/2016 Prof. Mauricio X. Coutrim – DEQUI - UFOP 88
Etapas do processo de EFS:
1) condicionamento do cartucho (uso de solvente adequado
para disponibilizar os sítios ativos e para ajustar as forças
dos solventes de eluição com o solvente da amostra);
2) extração dos analitos da amostra pela passagem desta no
cartucho;
3) lavagem do cartucho para eliminar possíveis interferentes;
4) eluição dos analitos de interesse para posterior análise.
EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA
28/07/2016 Prof. Mauricio X. Coutrim – DEQUI - UFOP 89
Sistema de vácuo Manifold para a
extração das amostras
Cartuchos com fase sólida (FS) C18
para extração de compostos
orgânicos de amostras complexas
EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA
28/07/2016 Prof. Mauricio X. Coutrim – DEQUI - UFOP 90
Vantagens da EFS:
1) diminuição do tempo de extração das amostras,
2) automação do sistema de extração permitindo que várias
amostras sejam extraídas simultaneamente,
3) utilização de pequenos volumes de solvente para eluição
e condicionamento,
4) eliminação de outras etapa de clean-up das amostras (a
fase estacionária retem apenas os analitos de interesse).
7/28/2016 QUI 149 / Mauricio - DEQUI - UFOP 91
DERIVATIZAÇÃO
Tipos: 1) pré-coluna 2) pós-coluna
Técnica utilizada com diversas finalidades em cromatografia. Nela o analito é reagido, antes ou depois da separação, com a finalidade de melhorar a análise, qualitativa ou quantitativamente. Essa reação deve ser rápida, quantitativa e com poucos subprodutos. Em CG, muitas vezes, a polaridade do analito é diminuída.
Aspectos: Qualitativo: o derivado apresenta sinal numa região específica
de detecção (eliminação de interferentes). Quantitativo: o sinal do derivado é muito maior do que o
respectivo analito (aumento do limite de detecção).
7/28/2016 QUI 149 / Mauricio - DEQUI - UFOP 92
DETERMINAÇÃO DE ALDEÍDOS E CETONAS
Reagente derivatizante:
a) dimedona (5,5-dimetil-1,3-ciclohexanodiona (dimedona)
b) 1,3-ciclohexanodiona
c) acetilacetona
d) 3-aminofluoranteno
e) cloridrato de o-benzilhidroxilamina
f) cloridrato de metoxilamina
g) 2,4 dinitrofenilhidrazina (2,4-DNFHi)
h) bissulfito de sódio (NaHSO3)
7/28/2016 QUI 149 / Mauricio - DEQUI - UFOP 93
DETERMINAÇÃO DE ÁCIDOS CARBOXÍLICOS POR CG
a) Esterificação
a1) metanol / BF3 : R-COOH + H3COH R-COOCH3 + H2O
a2) diazometano : R-COOH + H2C R-COOCH3 + N2
a3) metanol / ácido: R-COOH + H3COH R-COOCH3 + H2O
b) Sililação (-COOH + -OH; -SH; -NH2; =NH)
b1) hexametildisilazano (HMDS) / trimetilclorosilano (TMCS)
R-OH + (CH3)3-Si-NH-Si-(CH3)3 (HMDS) + (CH3)3-Si-Cl (TMCS) R-O-Si-(CH3)3 (éter silílico) + NH4Cl
b2) bis-trimetilsililacetamida (CH3)3-Si-O-C(CH3)=N-Si-(CH3)3
R-OH + BSA R-O-Si(CH3)3 + H3C-C(=O)-NH-Si-(CH3)3
b3) bis-trimetilsililtrifluoracetamida (BSTFA)
(CH3)3-Si-O-C(CF3)=N-Si-(CH3)3
N
N
94
DETERMINAÇÃO DE AMINOÁCIDOS (I)
M.Y. Khuhawar , A.D. Rajper. Journal of Chromatography B, 788 (2003) 413–418
Agente derivatizante: 2-hidroxi-naftaldeído (HN) Analitos: Ácido g-aminobutírico (GABA) e outros aminoácidos Característica: separação por HPLC e detecção espectrofluorescente
To the solution (1 ml) containing GABA (5.6–140mg) separately or GABA (5.6–140 mg),
glycine (30–750mg), tyramine (39–975 mg), lysine (58–1460mg) in a mixture was added
0.6 ml borax buffer pH 8 and 1 ml of derivatizing reagent HN (0.3% w/v in methanol).
The solution was heated on a water bath at 80oC for 10 min and was allowed to cool.
The final volume was adjusted to 5 ml with methanol. The solution (5 ml) was injected
on Phenomenex C18, 5mm (150x4.6 mm I.D.) and eluted with methanol: water (62:38
v/v) with a flow-rate 1 ml/min. The detection UV was at 330nm.
Derivado de glicina-HN Derivado de GABA-HN
95
DETERMINAÇÃO DE AMINOÁCIDOS (II)
Q. Weng, W. Jin Analytica Chimica Acta 478 (2003) 199–207
Agente derivatizante: naftaleno-2,3-
dicarboxaldeído (NDA) / CN-
Analitos: serina (Ser), alanina (Ala), taurina (Tau) e
glicina (Gly)
Característica: separação por CE e detecção
eletroquímica
Limite de detecção: 3,0.10-7 mol.L-1 (serina)
96
DETERMINAÇÃO DE AMINAS ALIFÁTICAS
Li-Wei Cao, Hong Wang, Xin Liu, Hua-Shan Zhang. Talanta 59 (2003) 973-979
Agente derivatizante: 2,6-dimetilquinoline-4-(N-succinimidil)-formiato
Analitos: aminas alifáticas primárias e secundárias
Característica: derivados fortemente fluorescentes
Limite de detecção: 1,94.10-10 mol.L-1 (detecção espectrofluorescente)
p-toluidina
acetaldeído
Ácido pirúvico
2,6-dimetilquinolina-4-
formiato
N-hidroxi
succinimida N,N´ diciclo hexil
carbodiimida
DETERMINAÇÃO DE ISOCIANATOS
Agente derivatizante: 4-Nitro-7-piperazino-2,1,3-benzoxadiazol(NBDPZ) Analitos: mono e di isocianatos no ar
Característica: separação por CE e detecção eletroquímica
Limite de detecção: 11-35 (UV-vis) e 5-9 (fluorescência) nmol.L-1
M. Vogel, U. Karst Anal. Chem. 2002, 74, 6418-6426
HPLC - Coluna: Discovery RP 18 (Supelco, Deisenhofen,
Germany); particle size 5mm; pore size 200 Å; 150 mm x 3 mm.
4-chloro-7-
nitro-2,1,3-
benzoxadiazol
piperazina
isocianatos
NBDPZ-uréia
7/28/2016 98
REVISÃO DE MÉTODOS DE DERIVATIZAÇÃO
T. Fukushima, N. Usui, T. Santa, K. Imai.
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30 (2003) 1655
Técnicas: HPLC e CE Detecção: fluorescência e quimioluminescência Aplicação: bioamostras Abrangência: 180 artigos (1982-2002) Destaque: CE com fluorescência induzida a laser ld = atto
(10-18) a yocto (10-21) mol e tempo de análise ~ min.
VANTAGENS E DESVANTAGENS DA HPLC
28/07/2016 Prof. Mauricio X. Coutrim – DEQUI - UFOP 99
Vantagens:
1. Menor tempo de análise (min a hs)
2. Alta resolução
3. Resultados quantitativos (erros < 0,5%)
4. Boa sensibilidade (deteção ~10-12g)
5. Versatilidade (só limitada para gases)
6. Automatização Desvantagens:
1. Alto custo instrumentação ($ 30 a 60 mil)
2. Operação cara (reagentes de alta pureza)
3. Requer acessórios para análise qualitativa
4. Não há um detector universal e sensível
5. Requer muita experiência para utilização
HPLC x HRGC
28/07/2016 Prof. Mauricio X. Coutrim – DEQUI - UFOP 100
Principal vantagem da HRGC (Cromatografia Gasosa Alta
Resolução / coluna capilar):
Serve para amostras gasosas
Análises com muitos analitos mais rápidas
Vantagens da HPLC:
Possui duas fases interagindo com a amostra
Possui uma variedade maior de mecanismos de separação
Separa compostos termicamente instáveis
A injeção da amostra é facilmente reproduzida
HPLC e HGGC são técnica complementares