Applied Biosystems 1

Quick Guide

Applied Biosystems 2

1. Turn on computer 기기는 실험하기 30분 전에 미리 켜놓는다. 2. Turn on instrument

3. Loading Plate

1) Door open ○1 기기 전방의 handle을 살며시 위로 들어올린다.

손가락을 다치지 않게 조심한다.

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○2 carriage를 끝까지 부드럽게 밀어준다.

Door를 너무 세게 다루지 말 것.

○3 96 well plate 또는 tube를 loading 한다. (A1 왼쪽 맨 위)

기기를 on 한 후 약 15분 후에는

block과 cover가 가열되므로 손이 닿지 않도록

조심한다.

2) Door close

○1 Carriage를 앞으로 다시 한번 살짝 밀어주면 자동으로 닫힌다.

○2 Door를 살며시 아래로 내려서 닫는다.

4. Operation of the 7000 SDS

1) Start the 7000 SDS software ○1 Double click the 7000 SDS software icon

: status bar의 상태는 ready와 disconnected

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○2 File → New → OK

: 각각의 종류를 선택 후 OK.

Disconnected

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2) Adding Detector Information to the Plate Document ○1 Tools → Detector Manager → File → New

Connected

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○2 Detector (Probe)의 Information을 기록한다.

: Quencher Dye의 경우 TAMRA로 하거나 MGB Probe의 경우

(none)으로 선택한다.

○3 연속하여 Detector를 추가 할 경우 Create Another를 click하여

계속 입력한다.

○4 입력이 완료되면 OK button을 누른다.

○5 Detector Manager에서 사용할 Detector를 선택한 후

Add to Plate Document를 누른다.

: Detector가 Well Inspector로 입력된다.

○6 Done button을 누른다.

Type New Detector (Unique gene)

Specific description of the detector

Select the Dye (FAM, VIC or SYBR)

Quencher :

TAMRA -> TAMRA

MGB or SYBR -> None

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3) Adding Detectors to the Wells of the Plate. ○1 지정하고자 하는 well을 선택한다.

○2 View → Well Inspector, or Icon click

○2 조건에 따라 Detector를 선택하고 sample name을 입력한다.

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○3 Task를 선택한다.

# Standard 입력 시 주의사항

- Task를 standard 선택 후 Quantity를 입력한다.

- standard의 농도 별로 sample name을 입력한다.

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# Passive reference를 선택한다. (master mix에는 기본적으로

ROX를 사용)

4) Thermal Cycling Conditions. ○1 Instrument Tab Click

○2 Repetitions, Temperature, Time을 각각의 조건 별로 설정한다.

(Assay on Demand, Assay by Design의 경우 초기 설정대로 쓴다.)

○3 Sample volume을 설정. (25 ~ 50 µl)

○4 Dissociation Protocol

# SYBR Green을 사용하는 assay인 경우 선택한다.

# 온도는 60 oC 고정.

Repetitions

Temperature Time

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5) Saving the Plate Document ○1 모든 설정이 완료되면 File → Save (*.sds) → 저장

# 계속하여 똑같은 설정을 사용할 경우 (*.sdt)로 save 한다.

# 저장한 Template (*.sdt)를 사용할 경우

: 4 -1) -○2 의 과정에서 Browse를 click → 저장한 template를 지정

→ OK.

○2 Start click

: button을 누른 후 Est Time Remaining을 확인하여 시간이

표시 되는지 확인한다.

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6) Stop : Run이 끝나면 Disconnect click → save

# sample이 들어있는 plate를 제거한 후 원래 들어있던 빈 plate를

다시 넣고 close.

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5. DATA Analysis

1) Result tab click → Amplification Plot tab click

2) 전체 well을 선택한 후 Analyze icon click.

3) O.B.T 원리를 이용하여 DATA를 분석한다. : Outlying, set Baseline, set the Threshold의 순으로 분석을 시행.

○1 Outlying

ⅰ) 같은 조건의 well을 선택하여 Amplication plot을 확인한다.

Y-축을 2번 click → log 선택 → OK

Click

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ⅱ) 잘못된 값을 가진 well을 확인한 후 선택한다. (CT값의 차이)

# 다른 방법으로 확인하는 방법으로 Ct vs Well Position을

선택하여 비교 할 수 있다.

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ⅲ) Result Tab → Plate Tab 선택

ⅳ) 잘못된 well의 Well Inspector를 열고 Detector 선택을 해제한다.

ⅴ) Amplication Plot Tab 선택.

ⅶ) Analyze icon click

○2 Set the Baseline

: baseline은 기본적으로 3 ~ 15 cycle로 정해져 있다.

Amplication Plot의 Y-축을 5-3)-○1 -ⅰ) 방법으로

linear로 바꾼다.

Click

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Amplication이 시작되는 부분에서 3~5 cycle 정도

앞에서 결정한다.

Analysis Setting Window를 연다.

: Analysis → Analysis Setting

Detector를 All로 선택.

Analysis setting에서 Baseline의 설정을 바꾼 후

OK & Reanalyze button을 누른다.

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○3 Set the Threshold.

ⅰ) Amplication Plot의 Y-축을 5-3)-○1 -ⅰ) 방법으로 log로

바꾼다.

ⅱ) Detector를 선택.

: Multiplexing 또는 Detector가 여러 종류일 경우

각각의 Detector 별로 Threshold를 setting해야 한다.

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ⅲ) Threshold 설정.

: Threshold는 기본적으로 0.2로 setting 되어있다.

ⅳ) Threshold line을 마우스로 click한 후 drag하여 위, 아래로

조절한다.

ⅴ) 조절한 후 Amplication Plot Tab. 의 오른쪽에 있는

Analyze를 click (위의 그림 참고)

ⅵ) Standard Curve Tab을 click한 후 Slope 와 R2 값을 확인한다.

: 위의 ⅳ) ~ ⅴ)의 과정을 반복하여 제일 좋은 Slope 값과

R2 값을 만든다.

# Slope : -3.32값과 가장 근접하게

R2 : 0.99 이상

4) Dissociation Curve : SYBR Green Dye를 사용하고, Dissociation Protocol을

선택 하였을 경우 이 DATA를 확인할 수 있다.

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○1 Result Tab → Dissociation Tab (Raw type)

: 왼쪽의 초록선을 이동하여 pick에 일치시키면 TM 값을 알 수 있다.

○2 오른쪽에 DATA Type에서 Raw나 Derivative를 선택할 수 있다.

# Derivative : fluorescence intensity의 변화량 / 단위시간을 표시

Raw : 온도가 올라갈수록 fluorescence intensity가

줄어드는 것을 보여주는 그래프

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6. Allelic Discrimination : Real-Time PCR (Absolute Quantitation)로 PCR을 끝낸 후 다시 reading한다.

1) Start the 7000 SDS software ○1 4 - 1) - ○1 과정과 동일하며 Assay를 Allelic Discrimination으로 선택.

○2 Tools → Detector Manager Click

: 4 – 2)의 방법으로 Detector를 설정한다.

○3 Tools → Marker Manager Click 하여 창을 연다.

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○4 Create Marker Click

: Marker의 이름을 정한 후 OK.

○5 Marker List에서 Marker를 선택한 후 오른쪽의 Detector를 선택한다.

(위의 그림 참고)

○6 Copy To Plate Document Click 후 Done.

○7 지정하고자 하는 well을 선택 후 4 – 3) - ○2 의 방법으로

Well Inspector 창을 연다.

○8 원하는 Marker를 선택한다.

○9 Instrument Tab → Pre-Read Click

○10 Save

2) Allelic Discrimination Data Analysis

○1 Result Tab → Allelic Discrimination Tab

○2 전체 well 선택

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○2 Marker를 선택

○3 Call에서 Allele Type 선택

○4 Icon을 click 한 후 Allele Type에 맞는 sample group 선택

: ○2 ~○3 의 과정을 반복하여 Group 별로 모두 선택한다.

# 정확한 결과를 얻기 위해서 NTC(no template control)와

Allele 1, 2의 control sample을 같이 실험해야 한다.

○5 Save

Marker

선택

Call the Allele

Types