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Rab は分子スイッチとして働く
Rab11 Rab11 GTP GDP
GDP/GTP交換因子 (GEF)
GTPase活性化因子 GTPからGDPへの加水分解
エフェクター
・細胞内物質輸送 (分泌、物質の取り込み) ・オルガネラ動態 ・細胞質分裂 ・細胞の運動,接着 など
スイッチ オフ
スイッチ オン
GDP (guanosine di-‐phosphate; グアノシン-‐5'-‐二リン酸) GTP (guanosine tri-‐phosphate; グアノシン-‐5'-‐三リン酸)
このような分子を 低分子量GTPase
という
図1
Rab11は様々な細胞内物質輸送を担う重要な低分子量GTPaseである
・膜タンパク質のリサイクリング ・分泌 ・細胞質分裂 ・細胞の運動,接着 など
Rab11 膜タンパク質
リサイクリング エンドソーム,
ゴルジ体
分裂溝に 局在化
Rab11 Rab11 GTP GDP
GDP/GTP交換因子 (GEF)
GTPase活性化因子 (GAP)
エフェクター
図2
Rab11の多彩な役割
• 細胞内と細胞表面の膜タンパク質のリサイクリング
(GLUT-‐4糖輸送体、トランスフェリン受容体,インテグリン等)
• 細胞からの分泌 (インスリン等) • 細胞の移動
• 細胞の伸張
• 細胞の分裂
など生命にとって非常に重要な役割を担っている.
ガン細胞の転移やアルツハイマー病,ハンチントン病等の 神経疾患との関連も示唆されている.
図3
RAB-11のGDP/GTP交換因子の探索
244 a.a.
431 a.a.
REI-1
REI-2
酵母 two-hybrid スクリーニング
新規結合因子 REI (RAB-eleven interacting protein)
・受容体のリサイクリング ・分泌 ・細胞質分裂 ・細胞の運動,接着 など
不活性型 Rab11
図4
REI-1/-2はショウジョウバエや哺乳動物にも存在する
455SH3BP5
431(K03E6.7)
477Poirot26% identity
244a.a.線虫REI-1
SH3-Binding Protein 5 domain Btk-binding motif
jq11 jq10
jq23
23% identity
BAR domain
a.a.
a.a.
a.a.
(C03C10.4)
REI-2
DeletionF-BAR domain
ヒト
ショウジョウバエ
図5
Rab11 Rab11
Mant-GDP
Mant-GDP
GDP/GTP交換因子活性測定法
蛍光色素
GTP類似物
蛍光 蛍光の減弱
GTP類似物
Mant-GDP 解離
GDP/GTP交換因子(GEF)
図6
366nm
443nm
励起
GTP類似物 (GMP-‐PMP) GTPと類似しているが、 GDPに加水分解されない
REI-1 はRAB-11 に対して強いGEF 活性を示す MANT-GDPの RAB-11からの解離
GTP analogue added
REI-‐1が存在するとRAB-‐11からMANT-‐GDPが すみやかに解離し、蛍光が減弱する.
蛍光
の強
さ (4
43nm
)
時間
図7
REI-1 のRab11 に対するGEF 活性は 種をこえて保存されている
(ヒト Rab11)
(ヒト REI-‐1)
(線虫 REI-‐1)
図8
蛍光
の強
さ (4
43nm
)
時間
0
50
100
150
200
250
300
350
400
N2 rei-1(jq10) rei-1(jq11) rei-2(jq23) rei-1(jq10);rei-2(jq23)
rei-1(jq11);rei-2(jq23)
emb w/shell
adults/larva
WT
400350300250200150100500
rei-2(jq23)
rei-1(jq11)
rei-1(jq10)
rei-1(jq10); r
ei-2(jq23)
rei-1(jq11); r
ei-2(jq23)
産仔数
胚性致死成虫
rei-1; rei-2 欠損線虫では産卵数が減少する
rei-1 (jq11)
rei-1 (jq10)
rei-2 (jq23)
rei-1 (jq11); rei-2
(jq23)
rei-1 (jq10); rei-2 (jq23)
正常 線虫
図9
正常卵 rei-1(jq10); rei-2(jq23) GFP::RAB-11
rei-1; rei-2 欠損胚ではRAB-11の位置が異常になる
正常卵においてRab11はドット状の 膜構造(ゴルジ体等)に存在する
rei-‐1; rei-‐2欠損卵においては Rab11はドット状の膜構造に あまり存在しなくなる
図10
0
50
100
150
200
WT
rei-‐1
rei-‐2
rei-‐1
;rei-‐2
WT
rei-‐1
rei-‐2
rei-‐1
;rei-‐2
2-‐cell 4-‐cell
GFP::RAB-‐11 Puncta Numbers
rei-1;rei-2 欠損卵ではRAB-11がドット状の膜構造に存在しない
2-cell 4-cell
rei-1 rei-1; rei-2
rei-2 WT
WT
GFP::RAB-11のドットの数
rei-1(jq10)
WT
rei-2(jq23) rei-1; rei-2
rei-1 rei-1; rei-2
rei-2 0
100 200 300 400 500 600 700 800
WT
rei-‐1
rei-‐2
rei-‐1
;rei-‐2
WT
rei-‐1
rei-‐2
rei-‐1
;rei-‐2
2-‐cell 4-‐cell
GFP::RAB-‐11 Total Intensity GFP::RAB-11の蛍光の強さ
2-cell 4-cell
rei-1 rei-1; rei-2
rei-2 WT WT rei-1 rei-1; rei-2
rei-2
図11
rei-1; rei-2 変異体の初期胚ではRAB-11の細胞分裂面への集積が減少する
40s
0s
80s
1-cell rei-1; rei-2 欠損卵 正常卵
40s
0s
80s
細胞分裂面
図12
rei-1, rei-1; rei-2 欠損卵では細胞分裂が遅延する 図13
180s 195s 210s 225s
0
50
100
150
200
250
WT N2 rei-1(jq10) rei-2(jq23) rei-1(jq10); rei-2(jq23)
*** ***
WT rei-1; rei-2
rei-2(jq23)
rei-1(jq10)
250
200
150
100
50
0Dura
tion
for c
ytok
ines
is (s
ec.)
細胞
分裂
時間
REI-1
ゴルジ体
RAB-11-GDP
細胞 分裂面
線虫初期胚におけるモデル
1. REI-1はゴルジ体で RAB-11を活性化
2. 活性化された RAB-11はゴルジ体や細胞分裂面へ局在化
・rei-1 変異体では RAB-11がゴルジ体,
細胞分裂面に 局在できない
ゴルジ体以降の 膜構造
細胞質分裂の遅延
RAB-11-GTP
図14
REI-‐1は線虫からヒトまで保存された まったく新しいタイプのRab11のGDP/GTP交換因子である
今後の展望 Rab11A,Rab11B アルツハイマー病の1つの原因である β アミロイドの産生に働くことが報告されており,アルツハイマー病の患者さんの遺伝子(exome)解析でも関連性が示唆されている (Udayarら, Cell Reports, 2013等). → Rab11活性を低下させると β アミロイドの産生が低下する
Rab11C(Rab25) 卵巣ガンや乳ガンにおいて高発現しており,この因子が細胞表面にあるα5β1インテグリンという因子を活発にリサイクリングさせることによって,細胞移動を促進し,ガン細胞の転移に関与すると考えられている(Dozynkiewiczら, Dev. Cell, 2012など). → Rab11C (Rab25) の活性を阻害すると卵巣癌の増殖を 阻害する (Fanら,Pathology, 2006)
ヒトREI-‐1 (SH3BP5) はこのような疾患に対する 創薬の新たなターゲットになる可能性がある.
図15