RAKENDUSBIOLOOGIA

Koostas Kersti Veskimets

Funktsionaalne toit… toidule on lisatud midagi, et see

parandaks inimese tervist.

Biokeefir, biojogurt – lisatud probiootilisi baktereid, mis parandavad seedimist, immuunsüsteemi.

“Hellus” sisaldab Eestis patenteeritud Lactobacillus fermentum ME-3, mis hävitab düsenteeria, salmonelloosi ja ateroskleroosi…

Ka meditsiin kasutab biotehnoloogiat juba terve sajandi

• Antibiootikumid seentest ja bakteritest (penitsilliin ja etratsükliin)

A. Fleming avastas penitsilliini 1929.a • Alkaloidid, mida kasutatakse

Parkinsoni tõve ja migreeni raviks.

Põllumajanduses

• Silo valmistamisel

• Mügarbakterid küntakse mulda.

• Biotõrje (taimekaitsevahendid) –

- seentest saadud ensüümid peletavad putukaid ja seenhaigusi.

- feromoonidega meelitatakse kahjurid lõksu

- bakteritoksiin (Bt-toksiin on parim) tapab putukaid selektiivselt ja inimesele mõju ei avalda.

Tööstuses

Bioplast – laguneb looduses kiiremini. Biogaas – prügimägede lagundamine

bakterite abil Bakterid lagundavad prügimäed alkoholiks.B. toodavad ämblikuniiti – ülitugev materjalBakterid toodavad puuvilla.Bakterid puhastavad maaki.Bakterid puhastavad reovett (aktiivmuda).

Pesuvahendites

Ensüümid saadakse bakteritest ja seentest. Intelligentsed pesupulbrid lagundavad lipiide, valke, polüsahhariide jne.

RAKU- JA EMBRÜOTEHNOLOOGIA

Kloonimine on geneetiliselt identsete järglaste saamine,

Ka vegetatiivne paljunemine on kloonimine.

Meristeempaljundus on uuem meetod:

Meristeemrakud on diferentseerumata ja paljunemisvõimelised.

Nad on totipotentsed – “kõikvõimelised”.

Hübridoomitehnoloogia ja monoklonaalsed antikehad

• Teatud antigeen viiakse hiiresse.• Hiires tekivad vastavaid antikehi tootvad

B-lümfotsüüdid.• B-lümfotsüüdid viiakse kokku kasvajarak-

kudega – need on hübridoomid.• Selektiivsöötmel jäävad ellu ja paljunevad

ainult hübridoomid.• Nüüd on puhaskultuur ühte tüüpi antikehi

tootvatest, hästi paljunevatest rakkudest.

Antigeen

Antikehasid tootvad B-lümfotsüüdid

Kasvajarakudpaljunevad hästi

Monoklonaalsed antikehad

Rakud ühen-datakse

Monoklonaalsete antikehade tootmine

http://www3.niaid.nih.gov/topics/immuneSystem/frontiersImages.htm

Monoklonaalseid antikehi kasutatakse:

1. Antigeenide määramiseks

2. Teatud valkude puhtaks eraldamiseks

3. Haiguste avastamiseks

4. Rasedustestis. Testjoon värvub ainult siis, kui proov sisaldab kooriongonadotropiini.

http://thejenniferblog.files.wordpress.com/2008/01/pregnancy_test.jpg

Embrüosiirdamine ja viljastamine in vitro

Superovulatsioonil küpseb lehmal palju munarakke. Pärast seemendamist pestakse embrüod välja. Nende hulgast valitakse parimad ja viiakse surrogaatemasse.

Katseklaasi (in vitro) viljastamise meetod 1970a

Miks tehakse?

Heade omadustega loomalt saab palju järglasi.

Embrüod säilivad sügavkülmutatult, saab transportida.

Embrüosiirdamine inimesel

Esimene laps sündis Inglismaal 1978.a., Eestis 1993.a.

Nüüd on neid üle 2 miljoni.

Lastetuid abielupaare on Eestis 10 – 20%.

Asendusema ei ole Eestis lubatud.

In vitro viibib embrüo ainult 2-5 päeva.

Munarakud võetakse otse munasarjast nõelpipetiga.

Imetajate kloonimine

Embrüonaalkloonimine:

Varase embrüo rakud on totipotentsed, need eraldatakse ja viiakse mitmetesse emasloomadesse.

Igast rakust saab areneda tervikorganism.

Kõik nad on geneetiliselt omavahel samad.

Tuumkloonimine

Tuumkloonimine

s.t. keharaku tuuma viimisel munarakku on saadud uus organism.

1997.a. saadi esimene tuumkloonitud lammas Dolly.

Katse näitas, et imetajate tuumas on kogu organismi arenguks vajalik aktiivne geneetiline info olemas.

Kas Dollyl on ainult tuumadoonori geenid?

http://www.millerandlevine.com/cloning/dolly-fig-13-13.jpg

Udararakust võeti tuum

Munaraku tuum eemaldati

Rakud liideti elektri-impulsiga

Rakk jagunes nagu embrüo

Embrüo siirdati kolmandale lambale

Sündis kloon – Dolly

Kloonitud on hiiri, küülikuid, kasse, lambaid, kitsi, sigu, muulasid, veiseid, hobuseid jne.

Pole suudetud kloonida ahve, konni.

Tegelikult enamus katsetustest ei õnnestu: nt. hobune saadi 328 katsetuse tulemusel.

Kloonide eluiga on normaalsest lühem. Miks?

Tegelikult ei ole kloonid väljanägemiselt ja omadustelt identsed.

Ka ühemunakaksikute sõrmejäljed on erinevad.

Miks kloonida?

1. Transgeensete organismide saamiseks

2. Mudelhiired luuakse, et leida ravimeid inimese haigustele.

3. Hävimisohus olevate liikide säilitamiseks: võetakse hävimisohus looma tüvirakust tuum ja viiakse see lähedase liigi munarakku. Munarakk siirdatakse tagasi looma emakasse. Sünnib hävimisohus liigi esindaja.

Inimese kloonimine?

Miks ebaeetiline?Põhjenda, kas Georg Otsa, Lennart Meri, Arvo

Pärdi kloonid oleksid samade omadustega?Reproduktiivsel kloonimisel saadakse

tervikorganism.Terapeutilisel kloonimisel tehakse embrüo in

vitro ja kasutatakse selle rakke raviotstarbel.Selline kloonimine legaliseeriti Suurbritannias

2001.a.

Tüvirakud ja rakuteraapia

Selgroogsete tüvirakud on diferentseerumata või vähediferentseerunud rakud.

Rakuteraapia – tüvirakke kasutatakse kahjustunud kudede taastamisel.

Parimad on sügoodi esimestel jagunemistel tekkinud rakud – totipotentsed.

Embrüoplasti rakud võivad ainete toimel areneda igaks koeks.

Nabaväädi tüvirakud saavad ka erinevateks kudedeks. (säilitatakse sügavkülmas)

Täiskasvanu tüvirakud:Ammu on tuntud vereloometüvirakud.Viimased uurimused näitavad, et kõikides

kudedes on omad tüvirakud, ka närvikoes.Mida aktiivsem inimene, seda enam

neuronid paljunevad!Pealegi saab juba ükskõik millise keharaku

suunata teatud ainetega arenema ükskõik mis suunas.

Sea rakkudega saab ka inimesi ravida!

GEENITEHNOLOOGIA

…on biotehnoloogia haru, kus eesmärgi saavutamiseks viiakse geene (geeni osi) ühest organismist teise või muudetakse muul viisil geene saadakse GMO.

Organisme, kellele on viidud võõraid geene, nim. transgeenseteks.

Esimene transgeenne bakter tehti 1973.a.Nokautorganism – organism, kellel teatud

geen on maha surutud.

Geenide ülekandmine on võimalik restriktaaside abil.

Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks – need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad – “kleepuvad otsad”.

Selliste otstega DNA juppe on komplemen-taarsuse tõttu võimalik mugavalt liita.

Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA.

Restriktaas

Restrikataas(sama)

Kleepuvad otsad ühinevad

Rekombinantneplasmiid

Lõigatudvektor

Lõigatud DNA

Vektor

Kuidas geenid kohale viia?

1. Bakteri plasmiidiga

2. Viirustega

Kui neile on soovitud geen lisatud, nime-tame teda geenivektoriks.

3. Kullapüstoliga

4. Taimedesse Agrobakteriga

Kuidas kergesti aru saada, et soovitud geen on üle kandunud?

Üle viidavale geenile on markergeen ka külge pandud (näiteks helenduv-GFP)

Nüüd kasutataksegi GFP geeni markerina:Kui uuritava geeni lõppu, enne stopp-

koodoneid, on sisestatud GFP geen, siis vastava valgu süntees ei peatu enne, kui ka GFP-valk on valmis.

Nii saab iga valgu translatsiooni toimumist organismis uurida.

Miks bakterirakus ei hakka inimese geen kohe tööle?

Meie ja teiste loomade, seente ja taimede geenis on intronid ja eksonid.

Pärast transkriptsiooni lõigatakse intronid välja ja ainult kokkuliidetud eksonid moodustavad mRNA , mille alusel sünteesitakse valk.

Kui tahame bakterisse geeni viia, siis peame selle mRNA alusel tegema DNA - õnneks on avastatud pöördtranskriptaas, mis selle töö ära teeb.

Nüüd teeb bakter sama valku, mis see geen inimese rakuski teeb.

Bakterid toodavad inimese valke alates

1978.a.Esimene oli insuliin.Inimese kasvuhormoonErütropoietiin aneemia raviksInterferoon, mis reguleerib immuunsüsteemiVere hüübimisfaktoridDifteeria ja teetanuse vaktsiinPärmseened teevad Bhepatiidi vaktsiiniPutukarakud toodavad papilloomi vaktsiini

Transgeensed loomad

Esimene transgeenne hiir saadi 1981.a. roti kasvuhormooniga kasvas 2 X suuremaks.

Miks hiiri kasutatakse kõige rohkem?

Transgeensete suurimetajate saamine on keerukas: munarakk kahjustub, embrüosiirdamine ei ole sageli edukas jne.

Tarus plaanitakse luua lehm, kes toodab insuliini (Sulev Kõks ja Ülle Jaakmaa).

Näited ravimeid tootvatest loomadest • GM-kitse piimas antikehad kasvajate vastu• GM-lehma piimas laktoalbumiin enneaegsetele

lastele• GM-sead toodavad inimese hemoglobiin

Geenitehnoloogia loomade tõuaretuses

• Sigade ja lammaste kaal kasvas 30%

• Kalkunite munevus suurenes

• Lihaloomad, kelle tailiha ja rasva osakaal on täpselt määratud

• Forell jt kalad kasvasid 2 korda suuremaks

Transgeensed taimed

Et saavutada:

- putukaresistentsus Bt-toksiini määrav geen on viidud taimesse ja mürke polegi vaja (tomat, mais, puuvill, kartul),

- viirusresistentsus, (papaia)

- herbitsiidiresistentsus (peet, mais, puuvill, lina, raps, soja, riis)

- suurem saagikus,

- lamandumis- ja külmakindlus,

- viljade pikem säilivusaeg

GM-taimede kasvatamise levik USA-s 2005.a. seisuga:

• Soja 89%

• Mais 61% (maisi saagikus on tõusnud 30%)

• Puuvill 83%

• Riis

• Raps

• Suurimad kasvatajad: USA, Argentiina, Kanada, Hiina.

Sordiaretuse ajaloost?

• 10 000.a. tagasi põllumajanduse algus – valiti juhuslikult.

• 19. saj. selektiivne ristamine• 20. saj. algus mutagenees ja selektsioon• 1987.a. esimesed GM-taimed• 1990-nendad GM-taimede levik USA-s, Aasias jm.• 1998.a. EL keelustas kõik GMO-d.• Nüüd on Euroopas lubatud, kui taodelda luba

(ülikeeruline, meeletu paberi, aja ja raharaiskamine)

GMO-aretuse poolt:

• Kiiremad tulemused• Geenid teistelt liikidelt• Geenide avaldumist saab reguleerida• Teatakse täpselt, millist geeni üle kantakse,

mis muutub uues sordis.• Põldudel kasutatakse vähem

keskkonnamürke.See on täppissordiaretus.

GMO-aretuse vastu:

• Kahjurid võivad muutuda immuunseks.

• Geenid võivad üle kanduda umbrohule.

• Erinevate organismide geenide koostoime võib olla ettearvamatu.

• GM-taimede maitseomadused on tavaliselt halvemad.

Geeninokaut

Geen lülitatakse välja.On loodud sadade geenide suhtes “nokauti

löödud” hiiri. Tehnika on keeruline: 1. Geenivektor (vigane geen+marker) viiakse

hiire embrüonaalsetesse tüvirakkudesse.2. Vektor satub ristsiirdega genoomi.3. Selektiivsöötmel jäävad ellu mutantsed

rakud, need on nokautrakud.

4. Nokautrakud siiratakse uude embrüoblasti

5. Tekib kimäärne embrüo

6. See embrüo viiakse hiire emakasse

7. Sünnivad kimäärsed hiired (neid hoitakse)

8. Järgneva ristamise tulemusena sünnib ka homosügootseid nokauthiiri.

.• Mudelhiired –

haiguste uurimiseks.• Organite

kasvatamiseks

GM-loomade baasil.

Geeniteraapia

Inimesel on teada üle 3000 päriliku puude.

Kaks võimalust:

1. Asendada haige geen tervega

2. Vaigistada haige geen.

Neid tegevusi ei tehta munarakuga, need ei pärandu järglastele.

On kohati häid tulemusi, kuid enamasti mitte.

Immuunpuudulikkuse ravi oli 1990.a. suhteliselt edukas

Parkinsonitõve ravi ajutiselt.

Geenivaigistamiseks kasutatakse mikro-RNA molekule. Kui mi-RNA-d ühinevad mRNAga, siis viimane lagundadakse.

Nii saaks ravida Huntingtoni haigust.

Geenivaigistamine on täiesti uus suund!

Muid geenitehnoloogia rakendusi

1. Molekulaargeneetiline diagnostikaEnamasti põhineb mutantsete geenide

äratundmisel.

DNA-kiibid - võrdlus DNA-lõigud, millega patsiendi geene kõrvutada – saab tuvastada haiguse ja siis vastavalt määrata ravi.

Paljude haiguste puhul on see juba võimalik: rinnavähk, tsüstiline fibroos, sirprakuline aneemia, kurtus, Huntingtoni tõbi jne.

Albiino jänes hüppab ringi nagu iga tavaline jänku, kuid pimedas toas UV-valgusel hakkab helenduma.

Helenduv kärss

Embrüodiagnostika

2. DNA-sõrmejälgede metoodika

Võrreldakse 10 või enama lookuse pikkust: Lookusi saab DNA-st välja lõigata ja paljundada

väga kiiresti polümerasse ahelreaktsiooni (PCR) meetodit kasutades.

Lõigatud fragmendid on erineva pikkusega, kuid lahuses segamini.

See proov pannakse geeli, geel pannakse elektrolüüsi vanni.

DNA-lõigud jooksevad + pooluse poole, seda kiiremini, mida lühemad nad on.

PCR metoodika:

Ependorfis segatakse kokku:

nukleotiidid (kõiki nelja erinevat)

DNA-polümeraas

oma DNA lahus

praimerid - lühikesed DNA lõigud, mis on

komplementaarsed analüüsitava DNA-

piirkonna mõlema “otsaga”.

Ependorf pannakse 3 tunniks PCR-masinasse.

PCR-masinas toimub DNA uuritavate lõikude paljundamine tänu pidevale temperatuuride vaheldumisele:

92oC - DNA denatureerub

58C - praimerid liituvad

72oC - DNA-polümeraas

käivitab replikatsiooni.

See tsükkel kordub

masinas 34 korda.

Fragment, mida tahetakse paljundada

PCR

Kuumutamisel 90-ni DNA denatureerub

Praimerid ühinevad madalamal temp-l

DNA-polümeraas saab replikatsiooni alustada ainult 3` otsast

Kuumutatakse 90 –ni, DNA denatureerub

Praimerid ühinevad

DNA-polümeraas replikeerib, alustades 3`otsast

Need 2 fragmenti on esimesed tulemused.

Tsüklit korratakse 34X, saadakse

30 miljonit