rakennusten mikrobikasvuston toteaminen
TRANSCRIPT
14.04.2023 1Uusien menetelmien kehittäminen mikrobikasvun tunnistamiseksi/ Valkonen
Uusien menetelmien validointi mikrobikasvun tunnistamiseksi
Kaisa Jalkanen,
Maria Valkonen, Martin Täubel, Asko Vepsäläinen, Matti Peltonen, Marjo Niittynen, Anne Hyvärinen
14.04.2023 Uusien menetelmien kehittäminen mikrobikasvun tunnistamiseksi/ Valkonen 2
Tausta ja tavoite
• Rakenteissa olevan mikrobikasvun ja epätavanomaisen mikrobilähteen tunnistamiseen käytetty perinteisesti viljelyä– Tulkintaohjeet Asumisterveysoppaassa
• Uusille, nopeille menetelmille on kasvava tarve terveysvalvonnan piirissä
• Tavoitteena testata uusia menetelmiä suhteessa viljelyyn– Mycometer– Kvantitatiivinen PCR (polymeraasiketjureaktio,
qPCR)
14.04.2023 Uusien menetelmien kehittäminen mikrobikasvun tunnistamiseksi/ Valkonen 3
Menetelmät: Viljely
• Perinteinen, eniten kokemusta
• Raja-arvot/tulkintaohjeet olemassa eri näytetyypeille– Rakennusmateriaali, pintanäyte, ilmanäyte
• Havaitsee vain elinkykyiset, käytetyissä olosuhteissa kasvavat mikrobit– lämpö, ravinteet/kasvatusalusta, valo jne
14.04.2023 Uusien menetelmien kehittäminen mikrobikasvun tunnistamiseksi/ Valkonen 4
Menetelmät: Viljely
• Hidas – Materiaalit ja pinnat: Sonikointi, ravistelu, maljoille viljely– Inkubointi päiviä – viikkoja (sädesienet 2 vkoa)
• Vaatii näytteen lukijalta ammattitaitoa– tunnistus visuaalinen
• Edulliset reagenssikustannuksetBotrysporium
Aspergillus versicolor / sydowii
Aspergillus penicilloides / restrictus
14.04.2023 Uusien menetelmien kehittäminen mikrobikasvun tunnistamiseksi/ Valkonen 5
Menetelmät: Mycometer
• Mittaa sienissä olevaa NAHA-entsyymiä (β-N-acetylhexosaminidase)– Kaikki sienet sisältävät NAHAa
• Kertoo sienten kokonaispitoisuudesta (ei erottele lajistoa)
• Nopea, helppo, kenttäkäyttöinen
• Inkubointi ~ 1/2h + valmistelut
14.04.2023 Uusien menetelmien kehittäminen mikrobikasvun tunnistamiseksi/ Valkonen 6
Menetelmät: Mycometer
• Ei pidempiaikaista kokemusta tai raja-arvoja– Menetelmän kehittäjän luoma asteikko A-C
• Eri sienissä eri määriä NAHA-entsyymiä
• Menetelmä on herkkä havaitsemaan homeen entsyymiaktiivisuutta– Ei havaitse hiivoja, bakteereja, aktinomykeettejä
• Virhelähteitä: mm. kasveissa ja niistä jalostetuissa elintarvikkeissa (esim. jauhot), eläimissä (mm. hyönteisten osat), veressä, ihossa, siitepölyssä NAHAa
Mycometer: Pintanäyte
• Otetaan 3x3 cm alalta
• Pumpulipuikolla sapluunan avulla
• Inkubointi (n. ½ h)
• Mittaus fluorometrillä
14.04.2023 Mycometer/Neuvottelupäivät 7
Mycometer: Materiaalinäyte
• Pieni pala rakennusmateriaalia (100-300 mg)– Punnittava
• Analyysi (inkubointi) kuten pintanäytteelle– Mittaus fluorometrillä
• Tuloksen tulkinta eroaa - eri asteikko!– Huom! Materiaalinäytteille kaksi eri tulkintataulukkoa, riippuen
siitä sisältääkö sementtiä vai ei
14.04.2023 Mycometer/Neuvottelupäivät 8
Mycometer
Luokka A
• ”puhdas”, ei homekasvua (tai likaa)
Luokka B
• Sienten biomassan määrä kohonnut
• Pinta likainen? Pölyä (jossa sieni-itiöitä)?
• Vanha vaurio?
Luokka C
• Voimakas biomassapitoisuus
14.04.2023 Esityksen nimi / Tekijä 9
14.04.2023 Uusien menetelmien kehittäminen mikrobikasvun tunnistamiseksi/ Valkonen 10
Menetelmät: qPCR
• Voidaan mitata halutun DNA:n määrää näytteessä fluoresoivien merkkiaineiden avulla reaaliaikaisesti
• Mitä enemmän näytteessä tarkasteltavaa DNA:ta, sitä nopeammin se alkaa monistua
• Mittaa sitä, mitä etsitään – pitää tietää, mitä etsii– Ryhmä- tai lajispesifisiä sovelluksia
14.04.2023 Uusien menetelmien kehittäminen mikrobikasvun tunnistamiseksi/ Valkonen 11
Menetelmät: qPCR
• Nopeahko (1-2 vrk, qPCR ajo vain 1-2h)– DNA-eristys
• Vaatii erilliset laboratoriotilat
• Työnä kevyehkö (automatisoitavissa), vaatii kuitenkin paljon validointityötä laboratoriolta
• Työntekijän altistumisen väheneminen
14.04.2023 Uusien menetelmien kehittäminen mikrobikasvun tunnistamiseksi/ Valkonen 12
Aineisto
• Mycometerin ja viljelymenetemän vertailu– 227 rakennusmateriaalinäytettä– 115 pintanäytettä
• Joista 59 vaurio-vertailuparia
• qPCR:n ja viljelymenetelmän vertailu– 945 rakennusmateriaalinäytettä– 184 ilmanäytettä
14.04.2023 Uusien menetelmien kehittäminen mikrobikasvun tunnistamiseksi/ Valkonen 13
Mycometer vs. viljely
• Menetelmät mittaavat eri asiaa – Elinkyky vs. NAHA-entsyymin aktiivisuus
• Verrattiin menetelmiä käyttämällä viljelyn vaurioluokituksen raja-arvoja – Rakennusmateriaalit 10 000 pmy/g – Pintanäytteet 1 000 pmy/cm2
• Viljely Asumisterveysoppaan (2009) mukaan
14.04.2023 Uusien menetelmien kehittäminen mikrobikasvun tunnistamiseksi/ Valkonen 14
Mycometer vs. Viljely: Rakennusmateriaalit
N Mycometer katogoria A(sis. myös alle määritysrajojen
olevat näytteet)
Mycometer katogoria B
Mycometer katogoria C
Viljelytulos < 10 000 PMY/g
147 107 24 16
Viljelytulos > 10 000 PMY/g 80 22 30 28
Näytteiden sijoittuminen eri luokkiin, kun viljelytulos jaoteltu 10 000 pmy/g sienten maksimikokonaispitoisuuden mukaan:N=227
14.04.2023 Uusien menetelmien kehittäminen mikrobikasvun tunnistamiseksi/ Valkonen 15
Mycometer vs. Viljely: Pintanäytteet
N Mycometer katogoria A (sis. myös alle määritysrajojen
olevat näytteet)
Mycometer katogoria B Mycometer katogoria C
Viljelytulos < 1 000 pmy/cm2
112 71 30 12
Viljelytulos > 1 000 pmy/cm2
3 0 0 3
Näytteiden sijoittuminen eri luokkiin, kun viljelytulos jaoteltu 1 000 pmy/cm2 sienten maksimikokonaispitoisuuden mukaan:N=115
14.04.2023 Mycometer/Neuvottelupäivät 16
Kokpit M2
Kokpit DG-18
THG Sädesienet Muut THG
Sienten max.
kokpit¤
Myco-meter
Kokpit M2 1
Kokpit DG-18 0.931*** 1
THG 0.649*** 0.626*** 1
Sädesienet 0.519*** 0.502*** 0.566*** 1
Muut THG 0.594*** 0.574*** 0.946*** 0.431*** 1
Max. Kokpit ¤ 0.969*** 0.984*** 0.638*** 0.501*** 0.586*** 1
Mycometer 0.455*** 0.397*** 0.361** 0.260* 0.310** 0.492*** 1
Korrelaatiot (Spearmanin korrelaatiokerroin)
PintanäytteetKok pit M2 Kokpit
DG-18THG Säde-
sienetMuut THG Sienten max.
Kokpit ¤Myco-meter
Kokpit M2 1 Kokpit DG-18 0.909*** 1
THG 0.689*** 0.659*** 1
Sädesienet 0.640*** 0.632*** 0.573*** 1
Muut THG 0.675*** 0.642*** 0.996*** 0.541*** 1
Max. Kokpit ¤ 0.960*** 0.966*** 0.711*** 0.648*** 0.694*** 1
Mycometer 0.590*** 0.625*** 0.599*** 0.470*** 0.590*** 0.652*** 1
***merkitsevä p-arvon tasolla <0.0001, **merkitsevä p-arvon tasolla <0.001, *merkitsevä p-arvon tasolla <0.01
¤ = se sienimalja (DG-18 tai M2), jolla kasvanut suurempi pitoisuus
Materiaalinäytteet
14.04.2023 Uusien menetelmien kehittäminen mikrobikasvun tunnistamiseksi/ Valkonen 17
Mycometer vs. Viljely: PintanäytteetVaurio – vertailu -asetelma
Viljely Mycometer
N(yht. 59)
Vertailu(pmy/cm2)
Vaurioepäily(pmy/cm2)
N(yht. 59)
VertailuMycometer-
kategoria
VaurioepäilyMycometer-
kategoria
56 alle 1 000 alle 1 000 26 A A
3 alle 1 000 yli 1 000 21 A B
0 yli 1 000 yli 1 000 12 A C
0 B tai C A, B tai C
• 59 vaurio-vertailuparia– Samasta huoneesta samanlaiselta pinnalta vertailunäyte
• Viljelyllä lähes kaikki alle 1 000 pmy/cm2
• Mycometer: kaikissa näytteissä vaurio vertailu
14.04.2023 Uusien menetelmien kehittäminen mikrobikasvun tunnistamiseksi/ Valkonen 18
Yhteenveto Mycometer-menetelmästä
• Mycometerillä analysoidut rakennusmateriaalit suhteessa viljelyyn: ”vääriä positiivisia” ja ”vääriä negatiivisia” – Näytteen epähomogeenisuus?
• Pintanäytteiden viljelyssä vaurioluokitusraja 1 000 pmy/cm2 korkea
• Pintanäytteiden vertailu-vaurio-asetelmassa Mycometer-menetelmä vaikuttaa erittäin lupaavalta– Erottelee paremmin vaurio- ja vertailupinnat kuin viljely
14.04.2023 Uusien menetelmien kehittäminen mikrobikasvun tunnistamiseksi/ Valkonen 19
qPCR vs. viljely
• Mittaa eri asiaa; elinkyky vs. DNA (mahd. myös kuolleissa soluissa)– qPCR voi havaita myös kuolleet mikrobit
Aineisto
Tähän mennessä:
• 945 rakennusmateriaalinäytettä
• 184 ilmanäytettä• 72 kosteusvaurioituneista kohteista• 70 ei-vaurioituneista kohteista• 56 ulkoilmanäytettä
14.04.2023 Uusien menetelmien kehittäminen mikrobikasvun tunnistamiseksi/ Valkonen 20
qPCR vs. viljely
• Viljeltiin Asumisterveysoppaan (2009) mukaan
• DNA eristetty tunnetusta määrästä viljelysuspensiota
• Analysoitu yhteensä 18 eri qPCR –sovellusta → keskitytty lupaaviin sovelluksiin
• Tavoitteena antaa raja-arvo(t)
14.04.2023 Uusien menetelmien kehittäminen mikrobikasvun tunnistamiseksi/ Valkonen 21
Tulokset: qPCR vs. ViljelyIlmanäytteet
• Verrattiin vaurioituneita ja ei-vaurioituneita koteja:– Havaittiin kokonaissienipitoisuuksien
eroavan selkeämmin qPCR:n avulla mitattuna kuin viljelyllä
Sienipitoisuus - viljely
p=0.026*
Sienipitoisuus - qPCR
p=0.006 **
Sisäilma vaurio Sisäilma vertailu Ulkoilma Sisäilma vaurio Sisäilma vertailu Ulkoilma
Pen/Asp - qPCR
p<0.0001**
Sisäilma vaurio Sisäilma vertailu Ulkoilma
14.04.2023 Uusien menetelmien kehittäminen mikrobikasvun tunnistamiseksi/ Valkonen 22
qPCR vs. viljelyRakennusmateriaalinäytteet
• Verrattiin menetelmiä käyttämällä viljelyn vaurioluokituksen raja-arvoja – Rakennusmateriaalit 10 000 pmy/g ja viljelytuloksen perusteella
määritettyä kolmiluokkaista aineistoa (pitoisuus ja lajisto)
• qPCR-analyysien optimaalisia raja-arvoja etsittiin suhteessa viljelyyn:– Sensitiivisyys ja spesifisyys molemmat mahdollisimman korkeita
tai ROC-käyrän AUC-arvo on mahdollisimman suuri
Sensitiivisyys: qPCR-menetelmällä positiiviseksi osoitettujen näytteiden osuus kaikista viljelyssä positiivisiksi osoittautuneista näytteistä
Spesifisyys: qPCR-menetelmällä negatiiviseksi osoitettujen näytteiden osuus kaikista viljelyssä negatiivisiksi osoittautuneista näytteistä
14.04.2023 Uusien menetelmien kehittäminen mikrobikasvun tunnistamiseksi/ Valkonen 23
qPCR vs. viljelyRakennusmateriaalinäytteet
Kriteerejä:• Mahdollisimman suuret, yhtäaikaiset sensitiivisyyden ja
spesifisyyden arvot
• Receiver operating characteristic (ROC)-käyrät kaksiluokkaista viljelytulosta vastaan → käyrän AUC- (area under curve) arvon suurinta arvoa käytettiin yhtenä raja-arvojen valintakriteerinä
• Raja-arvot, jotka tuottivat korkean spesifisyyden yksittäiselle määritykselle (≥90%)
• Kumulatiivisten jakaumien tarkastelu
14.04.2023 Uusien menetelmien kehittäminen mikrobikasvun tunnistamiseksi/ Valkonen 24
qPCR vs. viljelyRakennusmateriaalinäytteet
Tuloksia
• Yksittäisten qPCR-määritysten sensitiivisyys sai maksimissaan arvon 78 %, kun tarkastellaan 7 jatkotutkimuksiin valittua qPCR-määritystä
• Sensitiivisyyden tulee olla vähintään n. 90 % useamman määrityksen yhdistäminen välttämätöntä– Yhdistämällä 2 tai 3 qPCR-määritystä sensitiivisyys- ja
spesifisyysarvot paranivat verrattuna vain yhteen määritykseen
– Neljän määrityksen kombinaatio muutti tulosta enää hyvin vähän
14.04.2023 Uusien menetelmien kehittäminen mikrobikasvun tunnistamiseksi/ Valkonen 25
qPCR rakennusmateriaalit - yhteenveto
• Yhdistämällä 2 tai 3 qPCR-määritystä sensitiivisyys- ja spesifisyysarvot paranivat
• Parhaaksi yhdistelmäksi havaittiin:Sienten yleisaluke (nk. ”unifungi”) + Penicillium/Aspergillus/Paecilomyces varioti-ryhmän aluke
• Streptomyces spp. –määritys tarpeen myös– Ei lisää spesifisyyttä/sensitiivisyyttä– Joskus tilanteita, joissa ei homekasvua mutta runsas
sädesienipitoisuus
14.04.2023 Mycometer/Neuvottelupäivät 26
Kiitos
MetropoliLab: Seija Kalso, Anu Bäckroos
Rovaniemen kaupungin terveysvalvonta: Sini-Sisko Kilpeläinen, Jaakko Leinonen
Kuopion kaupungin terveysvalvonta: Heikki Kallunki
Hengitysliitto: Tapio Rokkonen
Kuvat © Maria Valkonen, Katja Saarnio, Kaisa Jalkanen ja www.mycometer.com