rapporto n° 31/2011 del 12 dicembre 2011 · 2018. 9. 6. · tel. +39 059 798778 – fax +39 059...
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NANODIAGNOSTICS srl Rapporto n°31/2011
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RAPPORTO n° 31/2011
Del 12 dicembre 2011
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RAPPORTO
N° 31/2011
VALUTAZIONE DI REPERTI BIOPTICI TRAMITE INDAGINE
NANODIAGNOSTICA DI MICROSCOPIA ELETTRONICA A SCANSIONE E
MICROANALISI A RAGGI X.
Committente : Motta Lorenzo
Materiale in esame : biopsie di linfonodi e biopsia osteo-midollare
Responsabile: Dott. Stefano Montanari
Firma:
Data: 12 dicembre 2011
Il presente rapporto si compone di 38 (trentotto) pagine compresa la copertina.
Nota: I risultati sono da riferirsi solo al materiale esaminato e per il tipo di applicazione richiesta. In caso di riproduzione del presente documento, il Committente s’impegna a farlo solo in modo integrale. Un’eventuale riproduzione parziale deve essere autorizzata per iscritto da Nanodiagnostics srl.
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INDICE
1. Introduzione .................................................................................................................. 4
2. Materiali ......................................................................................................................... 6
3. Tipi di analisi eseguite ................................................................................................... 7
4. Preparazione dei campioni ............................................................................................ 7
5. Risultati ......................................................................................................................... 7
Reperto 1, sezione di linfonodo n. 201465-1 .................................................................... 8
Reperto 2, sezione di BOM n. 202367 ........................................................................... 17
6. Conclusioni .................................................................................................................. 32
7. Legenda ...................................................................................................................... 32
8. Riferimenti bibliografici ................................................................................................ 32
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1. Introduzione
Nanodiagnostics srl è un’azienda di consulenze scientifiche nei settori della
medicina, dell’industria e dell’ecologia. L’attività principale è il rilevamento tramite una
tecnica innovativa di microscopia elettronica ambientale di micro- e nanoparticelle
inorganiche in qualsiasi mezzo (tessuti biologici, alimenti, farmaci, cosmetici, campioni
ambientali, ecc.).
L’indagine si avvale principalmente di un FEG - ESEM (Field Emission Gun -
Environmental Scanning Electron Microscope, FEI Company, Olanda), cioè un
microscopio elettronico a scansione ambientale a emissione di campo, opportunamente
modificato.
Quest’analisi offre la possibilità di osservare campioni biologici in “wet mode”, vale a
dire in condizioni di normale idratazione, a pressione atmosferica, senza la necessità di
essiccarli e di renderli elettroconduttivi tramite una ricopertura di carbone oppure di metalli
quali l’oro e il palladio. Applicando protocolli da adattare ad ogni tipo di osservazione, una
simile caratteristica consente di esaminare campioni biologici, comprese cellule vive,
senza intaccarne l’integrità, e di ripetere l’osservazione ogni volta lo si desideri. Il
principale obiettivo dell’indagine, l’individuazione di micro- e nano-particolato inorganico
eventualmente contenuto nell’esemplare in studio, viene raggiunto senza alcun
processamento del campione.
Ognuno dei preparati viene osservato in tutta la sua estensione sotto il microscopio
in diverse modalità: SED (elettroni secondari) e BSE (elettroni retrodiffusi), in basso vuoto
(0,98 Torr), a 25-30 KV e con spot vari, a seconda dell’ingrandimento (da 6 a 4), con una
distanza di 10 mm.
Sul particolato rilevato si punta la sonda microanalitica a raggi X per determinarne
la composizione chimica. Una microanalisi a raggi X a dispersione d’energia (EDS, cioè
Energy Dispersive Spectroscopy), misurando l’energia caratteristica che i vari elementi
costituenti il campione restituiscono sotto forma di radiazioni X dopo essere stati colpiti dal
fascio elettronico emesso dalla sorgente, fornisce la composizione chimica elementare del
particolato rinvenuto. Ogni reperto è stato debitamente fotografato ed archiviato insieme
con lo spettro degli elementi individuati.
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L’analisi non è distruttiva ed è ripetibile, con la sola eccezione dei fluidi, spesso
impossibili da recuperare.
L’indagine può essere svolta su campioni di origine biologica come biopsie,
autopsie, liquidi organici o alimenti, ma è eseguibile anche su molti altri tipi di materiali
quali, ad esempio, campioni ambientali, farmaci o cosmetici. Essendo l’oggetto principale
dell’indagine di natura inorganica non biodegradabile, non ci sono difficoltà nell’individuare
particolato del genere sia in campioni freschi sia in campioni d’archivio.
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2. Materiali
Sono pervenuti al laboratorio i seguenti reperti del paziente MOTTA LORENZO (data
nascita 12/10/81 ): due blocchetti in paraffina n. 201465 1 e 2 con biopsie di linfonodi e
un blocchetto in paraffina n. 202367 con biopsia osteomidollare (BOM).
La diagnosi indicata nel referto allegato alle biopsie di linfonodi è di linfoma di
Hodgkin. Il campione proviene dall’Istituto di anatomia e Istologia Patologica
dell’Università degli Studi di Palermo.
Dei campioni pervenuti sono stati analizzati la biospia di linfonodo n. 201465-1
(reperto 1) e quello di BOM n. 202367 (reperto 2).
Il campione è stato ricodificato presso il nostro laboratorio come 727GW.
Reperto 1 – linfonodo
Reperto 2 - BOM
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3. Tipi di analisi eseguite
Lo studio ha comportato l’utilizzo della tecnica di microscopia elettronica a
scansione ambientale (FEG – ESEM Quanta 250, FEI) per verificare l’eventuale presenza
di polveri ambientali, e di microanalisi a raggi X (EDS) per valutarne la composizione
chimica come descritto al paragrafo 1. Nessun processamento è stato eseguito sul reperto
che è stato, quindi, esaminato tal quale. La metodica, risultato del progetto comunitario
europeo QLRT-2002-147 (Nanopathology), permette di valutare anche la presenza di
particelle di dimensioni nanometriche (vedi riferimenti bibliografici 1- 59).
4. Preparazione dei campioni
Dai blocchetti in paraffina pervenuti in laboratorio sono state tagliate mediante
microtomo Leitz (Germania) alcune sezioni istologiche da 12 micron di spessore ciascuna.
Le sezioni sono state poi depositate su supporti di acetato e si è proceduto alla loro
deparaffinizzazione mediante dissoluzione con xilolo. Successivamente, le sezioni sono
state montate su supporto (stub) per mezzo di un disco biadesivo di Carbonio e quindi,
dopo essiccazione in stufa a 40 °C per 6 ore, sono state osservate al microscopio
elettronico.
5. Risultati
Le analisi di microscopia elettronica hanno messo in evidenza la presenza di
particolato con composizione chimica diversa (vedi Tabelle I e II).
I risultati morfologici e chimici del campione sono mostrati nelle immagini
successive. I picchi dello spettro che non riportano indicazioni dell’elemento a cui si
riferiscono sono picchi secondari di un elemento già segnalato in coincidenza del picco
principale.
Nota: l’elenco degli elementi nelle tabelle osserva il criterio di maggior rappresentatività
dell’elemento nello spettro EDS. La successione degli elementi inizia da quelli con il picco
EDS più alto.
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Reperto 1, sezione di linfonodo n. 201465-1
La tabella riassume tutte le analisi più significative eseguite sul campione.
Tab. I. Analisi EDS del reperto 1.
N. analisi Descrizione Elementi presenti
1 linfonodo immagine morfologica ‐ 100 x
2 linfonodo immagine morfologica ‐ 500 x
3 linfonodo 2000 x ‐ segnale tessuto: C,O,P,Cl,S,Mg,Ca
4 detrito 4 m detrito Ca: Ca
particolare
5 detrito 3,5 m detrito FeCr: Fe,O,Cr
particolare
6 detrito 2 m detrito Au: Au
particolare
7 detrito 0,6 m particolare di 7 ‐ detrito FeCr: Fe,Cr
8 detrito 3,5 m detrito AlSi:Al,O,Si,Ca
particolare
9 sferule 0,1‐1 m sferule FeCr: Fe,Cr
particolari
Analisi 1 e 2 della tabella I. Le figure mostrano un’area della sezione di linfonodo a
differenti ingrandimenti (100x – 500x).
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Analisi 3 della tabella I. La figura mostra una zona della sezione ad alto
ingrandimento (2000x) in corrispondenza della neoformazione. L’analisi chimica evidenzia
la composizione del segnale emesso dal tessuto biologico in un’area priva di detriti:
Carbonio, Ossigeno, Fosforo, Cloro, Zolfo, Magnesio e Calcio.
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Nota: tutti gli spettri di seguito riportati sono stati ottenuti mediante sottrazione del segnale
di fondo emesso dal tessuto intorno ai detriti.
Analisi 4 della tabella I. Le figure mostrano una zona della sezione a due diversi
ingrandimenti (1000x e 6000x) (Figg. A e C - vedi scala) in cui è visibile un detrito da 4
micron. L’analisi EDS (Fig. B) mostra che esso è composto esclusivamente da Calcio.
A B
C
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Analisi 5 della tabella I. Le figure mostrano una zona della sezione a due diversi
ingrandimenti (1000x e 16000x) (Figg. A e C - vedi scala) in cui è visibile un detrito da 3,5
micron. L’analisi EDS (Fig. B) mostra che esso è composto da Ferro, Ossigeno e Cromo.
A B
C
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Analisi 6 della tabella I. Le figure mostrano una zona della sezione a due diversi
ingrandimenti (2000x e 15000x) (Figg. A e C - vedi scala) in cui è visibile un detrito da 2
micron composto da Oro, come mostrato dall’analisi EDS (Fig. B).
A B
C
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Analisi 7 della tabella I. La figura mostra un particolare ad alto ingrandimento
(16000x) delle immagine A di analisi 6 in cui è visibile un detrito da 0,6 micron. L’analisi
EDS mostra che esso è composto da Ferro e Cromo.
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Analisi 8 della tabella I. Le figure mostrano una zona della sezione a due diversi
ingrandimenti (1000x e 10000x) (Figg. A e C - vedi scala) in cui è visibile un detrito da 3,5
micron. L’analisi EDS (Fig. B) mostra che esso è composto da Alluminio, Ossigeno, Silicio
e Calcio.
A B
C
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Analisi 9 della tabella I. La figura mostra una zona della sezione ad alto
ingrandimento (2000x) in cui sono visibili numerose sferule di diametro compreso tra 0,1 e
1 micron. L’analisi EDS mostra che esse sono composte da Ferro e Cromo.
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Analisi 9-bis della tabella I. Le figure mostrano la stessa zona della sezione con un
particolare a più alto ingrandimento (16000x) dell’immagine precedente in due differenti
modalità: elettroni retrodiffusi (BSE) ed elettroni secondari (SE). L’immagine in SE
dimostra che le sferule sono inglobate nel tessuto.
Analisi 9-ter della tabella I. La figura mostra un particolare ad altissimo
ingrandimento (60000x) dell’immagine precedente. Sono visibili alcune sferule
nanometriche inglobate nel tessuto.
BSE SE
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Reperto 2, sezione di BOM n. 202367
La tabella riassume tutte le analisi più significative eseguite sul campione.
Tab. II. Analisi EDS del reperto 2.
N. analisi Descrizione Elementi presenti
1 BOM immagine morfologica ‐ 100 x
2 BOM immagine morfologica ‐ 500 x
3 trabecola decalcificata 2000 x ‐ segnale trabecola: C,O,S
4 cellule emopoietiche 2000 x ‐ segnale cellule: C,O,P,S
5 accumulo detriti detriti FeCrNi: Fe,Cr,Ni,Mn,Si
particolare
6 accumulo detriti particolare di 5 ‐ detriti FeCrNi: Fe,Cr,Ni,Mn,Si
7 detriti 1,1 m detriti FeCrNi: Fe,Cr,Ni,Mn,Si
particolare
8 detrito 1,8 m detrito Fe: Fe,O,P,Ca
particolare
9 detrito 1,5 m detrito sferoidale Fe: Fe,Cu
10 detrito 2,5 m detrito sferoidale Fe: Fe,S
11 detriti 0,8 e 1 m detriti FeCrNi: Fe,Cr,Ni,Mn,Si
particolare
12 detriti 0,9 e 1,2 m detriti FeCrNi: Fe,Cr,Ni,Mn,Si
13 detrito 0,2‐0,6 m detriti FeCrNi: Fe,Cr,Ni,Mn,Si
particolare
14 detrito 2,6 m detrito FeCrNi: Fe,Cr,Ni,Mn
particolare
15 accumulo accumulo Si,Mg,Fe,Ba,S,Cr,Ca,Ni
particolare
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Analisi 1 e 2 della tabella II. Le figure mostrano un’area della sezione di biopsia
osteo-midollare a differenti ingrandimenti (100x – 500x). Sono ben visibili le trabecole
ossee decalcificate e le cellule del midollo.
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Analisi 3 della tabella II. La figura mostra una zona della sezione ad alto
ingrandimento (2000x) in corrispondenza di una trabecola ossea decalcificata. L’analisi
chimica evidenzia la composizione del segnale emesso dal tessuto biologico in un’area
priva di detriti: Carbonio, Ossigeno e Zolfo.
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Analisi 4 della tabella II. La figura mostra una zona della sezione ad alto
ingrandimento (2000x) in corrispondenza di una zona con cellule emopoietiche. L’analisi
chimica evidenzia la composizione del segnale emesso dal tessuto biologico in un’area
priva di detriti: Carbonio, Ossigeno, Fosforo e Zolfo.
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Nota: tutti gli spettri di seguito riportati sono stati ottenuti mediante sottrazione del segnale
di fondo emesso dal tessuto intorno ai detriti.
Analisi 5 della tabella II. Le figure mostrano una zona della sezione a due diversi
ingrandimenti (1300x e 20000x) (Figg. A e C - vedi scala) in cui è visibile un accumulo di
detriti. L’analisi EDS (Fig. B) mostra che essi sono composti da Ferro, Cromo, Nichel,
Manganese e Silicio.
A B
C
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Analisi 6 della tabella II. La figura mostra un particolare ad alto ingrandimento
(5000x) delle immagine A di analisi 5 in cui sono visibili alcuni detriti di composizione
identica ai precedenti come evidenziato dall’analisi EDS.
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Analisi 7 della tabella II. Le figure mostrano una zona della sezione a due diversi
ingrandimenti (1000x e 8000x) (Figg. A e C - vedi scala) in cui sono visibili due detriti da
1,1 micron. L’analisi EDS (Fig. B) mostra che anch’essi sono composti da Ferro, Cromo,
Nichel, Manganese e Silicio.
A B
C
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Analisi 8 della tabella II. Le figure mostrano una zona della sezione a due diversi
ingrandimenti (1500x e 12000x) (Figg. A e C - vedi scala) in cui è visibile un detrito da 1,8
micron. L’analisi EDS (Fig. B) mostra che esso è composto da Ferro, Ossigeno, Fosforo e
Calcio.
A B
C
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Analisi 9 della tabella II. La figura mostra una zona della sezione ad alto
ingrandimento (6000x) in cui è visibile un detrito sferoidale da 1,5 micron. L’analisi EDS
mostra che esso è composto da Ferro oltre ad una piccola quantità di Rame.
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Analisi 10 della tabella II. La figura mostra una zona della sezione ad alto
ingrandimento (6000x) in cui è visibile un detrito sferoidale da 1,5 micron. L’analisi EDS
mostra che esso è composto da Ferro e Zolfo.
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Analisi 11 della tabella II. Le figure mostrano una zona della sezione a due diversi
ingrandimenti (2000x e 12000x) (Figg. A e C - vedi scala) in cui sono visibili due detriti da
0,8 e 1 micron. L’analisi EDS (Fig. B) mostra che essi sono composti da Ferro, Cromo,
Nichel, Manganese e Silicio.
A B
C
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Analisi 12 della tabella II. La figura mostra una zona della sezione ad alto
ingrandimento (16000x) in cui sono visibili due detriti da 0,8 e 1 micron. L’analisi EDS
mostra che essi sono composti da Ferro, Cromo, Nichel, Manganese e Silicio.
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Analisi 13 della tabella II. Le figure mostrano una zona della sezione a due diversi
ingrandimenti (5000x e 24000x) (Figg. A e C - vedi scala) in cui sono visibili alcuni detriti di
dimensioni comprese tra 0,2 e 0,6 micron. L’analisi EDS (Fig. B) mostra che essi sono
composti da Ferro, Cromo, Nichel, Manganese e Silicio.
A B
C
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Analisi 14 della tabella II. Le figure mostrano una zona della sezione a due diversi
ingrandimenti (1500x e 12000x) (Figg. A e C - vedi scala) in cui è visibile un detrito da 2,6
micron. L’analisi EDS (Fig. B) mostra che è composto da Ferro, Cromo, Nichel e
Manganese.
A B
C
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Analisi 15 della tabella II. Le figure mostrano una zona della sezione a due diversi
ingrandimenti (1000x e 6000x) (Figg. A e C - vedi scala) in cui è visibile un accumulo.
L’analisi EDS (Fig. B) mostra che è composto da Silicio, Magnesio, Ferro, Bario, Zolfo,
Cromo, Calcio Nichel.
A B
C
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6. Conclusioni
L’indagine di microscopia elettronica mostra con grande evidenza la presenza di
numerosissime nanoparticelle aggregate principalmente costituite da Ferro e Cromo nella
sezione di linfonodo e di Ferro, Cromo e Nichel (acciaio) nella biopsia osteo-midollare.
Sono chiaramente riscontrabili anche particelle più grossolane d’Oro e calcificazioni.
Particolarmente interessanti le particelle sferiche (analisi 9, 9-bis e 9-ter) classiche di una
formazione ad alte temperature compatibili con quelle delle esplosioni di ordigni bellici e
segno inequivocabile dell’esposizione ambientale cui il soggetto è stato sottoposto.
Prescindendo dalle calcificazioni che si ritrovano spesso nei tessuti tumorali con le
caratteristiche di quelli esaminati nella circostanza, il particolato rinvenuto è di sicura
origine esogena, non è biocompatibile e non è biodegradabile. Quindi è potenzialmente
patogeno.
7. Legenda
Al = Alluminio
Au = Oro
Ba = Bario
C = Carbonio
Ca = Calcio
Cl = Cloro
Cr = Cromo
Cu = Rame
Fe = Ferro
Mg = Magnesio
Mn = Manganese
Ni = Nichel
O = Ossigeno
P = Fosforo
S = Zolfo
Si = Silicio
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