rdc 53/2015 tornando prático o
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RDC 53/2015 – Tornando prático o
estudo de perfil de degradação
Ministrante: Caroline Lima de Oliveira
RDC 53/2015 – ESTUDO DE PERFIL DE DEGRADAÇÃO
AGENDA
• Premissas dos estudos de degradação forçada → Planejamento dos ensaios de degradação forçada
• Premissas para o desenvolvimento de métodos indicativos de estabilidade → Planejamento estratégico
• Balanço de massas → justificativas técnicas e ortogonalidade
• Relatório de perfil de degradação → Elaboração
• Estudo de caso e discussão final
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Premissas dos estudo de degradação forçada
• Planejamento dos ensaios de degradação forçada
• Hidrólise ácida e Hidrólise básica
• Oxidação por peróxido
• Oxidação por íons metálicos
• Calor
• Umidade
• Luz
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Premissas dos estudo de degradação forçada
• Planejamento dos ensaios de degradação forçada
• Hidrólise ácida e Hidrólise básica
• Oxidação por peróxido
• Oxidação por íons metálicos
• Calor
• Umidade
• Luz
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Planejamento dos ensaios de degradação forçada
• Quais as literaturas e conhecimentos prévios recomendados?
DRUG MASTER FILE
QUÍMICA ORGÂNICA
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Planejamento dos ensaios de degradação forçada
• Quais os conceitos relevantes que extraímos de todas essas literaturas?
Solubilidade
pKa
Log P
Susceptibilidade de grupos químicos a condições de estresse
Máximos de absorção e Perdas de cromóforos
Viabilidade de se realizar determinada condição de estresse
Ortogonalidade
Justificativas técnicas
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Planejamento dos ensaios de degradação forçada
Conhecendo o Log P do ativo (s) e Produtos de degradação
Tretinoína
Log P: 6,04
Hidroquinona
Log P: 1,37
Compostos polares Compostos apolares
Log P → Coeficiente de partição:
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Planejamento dos ensaios de degradação forçada
Conhecendo o Log P do ativo (s) e Produtos de degradação → Ivabradina e seus produtos de degradação (PDs)
Molécula de Ivabradina
PDs da Ivabradina
(*) Pikul. P et al - Forced Degradation Studies of Ivabradine and In Silico Toxicology Predictions for Its New Designated Impurities
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Planejamento dos ensaios de degradação forçada
Conhecendo o Log P do ativo (s) e Produtos de degradação→ Ordem de eluição de PDs → Fase reversa
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• Log P:
• Melhor diluente para uma melhor recuperação/extração do ativo e de seus produtos de
degradação presentes no IFA isolado ou no produto acabado.
• Previsão de ordem de eluição em cromatografia por fase reversa;
• Escolha do aditivo de fase móvel ou proporção aquosa/orgânica da fase móvel;
Premissas dos estudo de degradação forçada → Planejamento dos ensaios de degradação forçada
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Planejamento dos ensaios de degradação forçada
Conhecendo a solubilidade do ativo (s) e produtos de degradação → pKa
• Parâmetro chave para avaliar a solubilidade por pH → pKa
• Ácidos fracos: Doadores de prótons
• Bases Fracas: Receptores de prótons
• Para IFAs que são ácidos fracos: solubilidade em água aumenta exponencialmente quando o pH ultrapassa
o valor de seu pKa. Caso o ácido possua mais de um grupo ionizável, a cada pKa ultrapassado a solubilidade
aumentará de forma ainda mais elevada.
• Para IFAs que são bases fracas: Cada vez que o pH cai abaixo de um de seus pKas a solubilidade em água
aumenta de forma ainda mais elevada.
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Planejamento dos ensaios de degradação forçada
Ácido acetilsalicílico → Carater Ácido
pKa: 3,41
Conhecendo a solubilidade do ativo (s) e Produtos de degradação → pKa
Chemicalize
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Planejamento dos ensaios de degradação forçada
Conhecendo a solubilidade do ativo (s) e Produtos de degradação → pKa
Diazepam → Carater básico
pKa: 2,92
Chemicalize
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Planejamento dos ensaios de degradação forçada
• pKa:
• Necessidade de neutralização ou ajuste de pH para ensaios aquosos de degradação forçada;
• Necessidade de co-solvente para ensaios aquosos de degradação forçada;
• Viabilidade de se atingir um endpoint de concentração de degradante;
• Definição de fase móvel.
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Planejamento dos ensaios de degradação forçada
Qual o meu “n” de amostras a serem degradadas?
Medicamento com
1 ativo
Matéria-prima (IFA)
Produto
Placebo
Associação
2 ou mais ativos
Matérias-primas isoladas
Produto
Placebo real (presença de ativos)
Branco do processo
Branco do processo
Cada IFA isolado + excipientes
v
Mais de um fabricante de IFA?
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Planejamento dos ensaios de degradação forçada
Qual amostra de medicamento utilizar no estudo de degradação forçada?
• Lote bancada → exigência mínima → usar preferencialmente o mesmo lote em todo o estudo;
• Avaliação crítica sobre lote técnico e lote piloto → Avaliar impactos do escalonamento!
• Mesmo medicamento com diferentes concentrações (Fórmula proporcional) → Utilizar
qualquer apresentação;
• Formulações quantitativamente diferentes → utilizar a maior relação excipiente e ativo →
menor concentração de ativo;
• Formulações qualitativamente diferentes → Avaliar o estresse para todas as formulações.
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Premissas dos estudo de degradação forçada
• Planejamento dos ensaios de degradação forçada
• Hidrólise ácida e Hidrólise básica
• Oxidação por peróxido
• Oxidação por íons metálicos
• Calor
• Umidade
• Luz
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Hidrólise ácida e hidrólise básica
• A hidrólise envolve a reação de clivagem de ligações a partir de moléculas de água:
• Água presente em quantidades significativas em IFAs (hidratos), em excipientes e em nosso ambiente.
• Catalisada por meio ácido ou básico;
• Dependente de fatores como: sais e tampões, força iônica, solventes e excipientes.
• É dependente do pKa da molécula a ser estudada → É necessário que as moléculas estejam ionizadas e
tenham bons grupos abandonadores para favorecer a ocorrência de hidrólise.
• Grupos funcionais mais passíveis de hidrólise ácida e básica: Ésteres; lactonas; amidas; lactamas.
Éster Lactona Amida Lactama
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Hidrólise ácida e hidrólise básica
• Hidrólise catalisada por ácido
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Hidrólise ácida e hidrólise básica
• Hidrólise promovida por base (consumo da base)
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Hidrólise ácida e hidrólise básica
• Na presença de agentes nucleofílicos (H2O):
• Ésteres gerando ácidos carboxílicos e álcool;
• Lactonas gerando ácidos carboxílicos com abertura do anel lactônico.
Moléculas ionizadas:
Favorecimento da reação
de hidrólise
Baertschi, S.W., Alsante, K. M. and Reed, R.A. Pharmaceutical Stress Testing: prediction drug degradation, ed. 2ª, v. 210, 2011.
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Hidrólise ácida e hidrólise básica
• Na presença de agentes nucleofílicos (H2O):
• Amidas gerando ácidos carboxílicos e aminas;
• Lactanas gerando ácidos carboxílicos com abertura do anel lactâmico.
Baertschi, S.W., Alsante, K. M. and Reed, R.A. Pharmaceutical Stress Testing: prediction drug degradation, ed. 2ª, v. 210, 2011.
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Hidrólise ácida e hidrólise básica
• Como um excipiente pode favorecer a hidrólise?
• Excipientes que são higroscópicos;
• Excipientes que possuem impurezas que podem agir como ácidos e bases.
Excipientes Como podem favorecer a hidrólise?
Celulose Absorve água
Fosfato de cálcio dibásico anidro / diidratado Ácido (pH 2,5)/ pode liberar água
Estearato de magnésio Absorve água; básico sob condições de umidade
Óxido de silício Absorve água
Croscamelose Absorve água; básico sob condições de umidade
Acidulantes ( Ácido cítrico, Ácido ascórbico) Confere baixo pH
Carbonato de cálcio Confere alto pH
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Hidrólise ácida e hidrólise básica
• Se problemas de solubilidade forem encontrados, utilizar co-solventes preferencialmente
apróticos em volume suficiente para solubilizar o IFA → avaliar quão diluído foi seu agente
estressante.
O uso do metanol como co-solvente em casos específicos precisa ser avaliado → Avaliar criticamente o
perfil de degradação!
pH ácido pH neutro pH básico
Acetonitrila Acetonitrila Acetonitrila1
DMSO N-metil Pirrolidona DMSO
Ácido acético Diglima
Ácido propiônico p-Dioxano
1. 1M de NaOH e acetonitrila são miscíveis somente para soluções contendo 20% de acetonitrila ou menos. Caso seja observada a
formação de uma mistura de duas fases, alterar o co-solvente.
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Hidrólise ácida e hidrólise básica
• Caso o uso de co-solventes não solucione o problema do ensaio insolúvel sob um pH aplicado:
• Avaliar o uso de tampões com pH controlado → Avaliar o pka da molécula e definir em qual pH a
mesma não encontra-se neutra → Trabalhar com valores de pH que mimetizem condições
ácidas e básicas!
• Preparar uma solução mais concentrada da amostra a ser testada e estressar uma alíquota
deste preparo → Concentração final do ensaio deve se a definida em metodologia!
• Avaliar se a formulação apresenta excipientes incompatíveis com pH ácidos ou básicos → pH
básico - Hipromelose
Se as estratégias não forem bem-sucedidas, utilizar o histórico como justificativa para não atingir o
endpoint ou até mesmo a não realização da condição!
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Premissas dos estudo de degradação forçada
• Planejamento dos ensaios de degradação forçada
• Hidrólise ácida e Hidrólise básica
• Oxidação por peróxido
• Oxidação por íons metálicos
• Calor
• Umidade
• Luz
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Oxidação por peróxido de hidrogênio e íons
metálicos (Cu II e Fe III)
• A reação de oxidação é um dos mecanismos mais comuns de degradação dos fármacos.
• Baseia-se na transferência de elétrons provenientes de metais para formar ânions e cátions
reativos e no ataque nucleofílico do IFA ao peróxido:
• Moléculas muito funcionalizadas e de caráter mais básico tendem a sofrer oxidação:
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Oxidação por peróxido de hidrogênio e íons
metálicos (Cu II e Fe III)
Grupamentos químicos mais suscetíveis a oxidação: Ligações alfa de Éteres e aminas, aminas
secundárias e terciárias e sulfetos.
Ligação alfa de éteres e aminas → carbono alfa reage com o radical hidroperoxila ROO. formando
hidroperóxido com sucessiva degradação a éster e aldeído → Atenção para condições drásticas de
oxidação e formação de PDs secundários.
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Oxidação por peróxido de hidrogênio e íons
metálicos (Cu II e Fe III)
Grupamentos químicos mais suscetíveis a oxidação: aminas primárias, aminas secundárias e
terciárias.
• Quando desprotonadas são mais suscetíveis a oxidação → avaliar o pka, pois o pH da solução
de peróxido é ácido;
• Aminas primárias: Formação de hidroxilaminas → PDs instáveis e de difícil isolamento →
ALERTA para Balanço de massas!
• Aminas secundárias, terciárias e heterocíclicas: Formação de n-oxides;
ATENÇÃO: Para terciárias → Muito comum observar na estabilidade de longa duração → reação
com peróxido presente nos excipientes da formulação ( exemplos: PEGs, polisorbatos, povidona,
crospovidona).
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Oxidação por peróxido de hidrogênio e íons (Cu
II e Fe III)
Grupamentos químicos mais suscetíveis a oxidação: aminas primárias, aminas secundárias e
terciárias.
Para aminas primárias e secundárias → formação de hidroxilaminas
Para aminas terciárias → formação de óxidos de aminas terciárias → n-óxidos
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Oxidação por peróxido de hidrogênio íons (Cu II
e Fe III)
Grupamentos químicos mais suscetíveis a oxidação: Sulfetos oxidados a sulfóxidos e sulfonas
ATENÇÃO: Desprotonação também favorece o mecanismo de oxidação!
Mecanismo semelhante a oxidação de aminas terciárias → SN2
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Oxidação por peróxido de hidrogênio e íons
metálicos (Cu II e Fe III)
• Íons metálicos:
• Cu II e Fe III → CuCl2 (cloreto cúprico) ou FeCl3 (cloreto férrico)
• Condição: 24 horas.
• Sempre a temperatura ambiente: Se houver a possibilidade de processo de redox a
temperatura não influenciará!
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Oxidação por peróxido de hidrogênio e íons
metálicos (Cu II e Fe III)
• Aminoácidos são espécies extremamente suscetíveis a íons metálicos → formação de
quelatos!
• Compostos heterocíclicos tendem a formar quelatos;
• Compostos com a presença de enxofre → altamente reativo na presença de íons
metálicos
• Exemplo: Acetilcisteína → Presença de enxofre → Vários estados de oxidação
→ Baixa reprodutibilidade.
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Oxidação por peróxido de hidrogênio e íons
metálicos (Cu II e Fe III)
Premissas de preparo do ensaio: Oxidação por peróxido
• Co-solventes adequados: Álcoois de cadeia pequena (Metanol e etanol) → controlam o poder
oxidativo do peróxido.
• Utilizar balões âmbar → Luz catalisa reações de oxidação!
• Evitar o uso de acetonitrila → Extremamente reativa na presença de peróxido → Formação do
radical reativo formil cianeto extremamente reativo a compostos funcionalizados (éteres e amidas,
aminas secundárias e terciárias, sulfetos e fenóis) com caráter básico.
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Oxidação por peróxido de hidrogênio e íons
metálicos (Cu II e Fe III)
Premissas de preparo do ensaio:
• Para o ensaio de íons metálicos: Avaliar se há a presença de excipientes que sejam complexantes: EDTA por
exemplo forma quelatos que são insolúveis impossibilitando o ensaio.
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Planejamento dos ensaios de degradação forçada
Avaliação do T0 em estresses úmidos: preparar o ensaio com o seu produto ou IFA direto no degradante
avolumando com diluente na sequencia e analisando → sem nenhum período de incubação.
• Definição de preparo de amostra → Resolução de problemas de limitação analítica;
• Definição de preparo de amostra referência;
• Investigação de alta susceptibilidade do IFA frente a condição de estresse → Degradação instantânea;
• Investigação de limitação técnica para a realização do ensaio → Justificativa para não chegar no endpoint ou
até mesmo não realizar o ensaio;
• Evitar perder dias de estudo, principalmente o endpoint de tempo de exposição é atingido;
• Definição da necessidade de se realizar a etapa de neutralização ou correção para o pH do referência (pH
ótimo) em virtude do peak shape do ativo.
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Premissas dos estudo de degradação forçada
• Planejamento dos ensaios de degradação forçada
• Hidrólise ácida e Hidrólise básica
• Oxidação por peróxido
• Oxidação por íons metálicos
• Calor
• Umidade
• Luz
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Calor
• Fármacos com ligações fracas possuem maior tendência a pirólise → Por ex: Ligações sigmas de
carbono e um átomo eletronegativo;
• Descarboxilação também é muito comum → -CO2.
• Calor seco → Amostras devidamente preparadas em balão âmbar e fechado a 60°C em ESTUFA.
• Recomendação: Única variável é o tempo → não aumentar a temperatura ou fazer uso de
banho-maria ou refluxo
Falta de reprodutibilidade
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Mecanismo de reações sob calor
• Rearranjos → transformações químicas em moléculas sob a presença de calor agem como nucleófilos e
eletrófilos:
• Isomerização conformacional → Ocorre quando os átomos ligados aos carbonos de compostos
saturados estão em conformações diferentes em virtude da rotação do eixo da ligação.
Baertschi, S.W., Alsante, K. M. and Reed, R.A. Pharmaceutical Stress Testing: prediction drug degradation, ed. 2ª, v. 210, 2011.
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Mecanismo de reações sob calor
• Rearranjos → transformações químicas em moléculas sob a presença de calor agem como
nucleófilos e eletrófilos:
• Polimerização → carbonos eletrofílicos podem reagir com nucleófilos em cadeia e
formar dímeros, trímeros entre outros polímeros: Polimerização da ampicilina
Baertschi, S.W., Alsante, K. M. and Reed, R.A. Pharmaceutical Stress Testing: prediction drug degradation, ed. 2ª, v. 210, 2011.
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Premissas dos estudo de degradação forçada
• Planejamento dos ensaios de degradação forçada
• Hidrólise ácida e Hidrólise básica
• Oxidação por peróxido
• Oxidação por íons metálicos
• Calor
• Umidade
• Luz
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Umidade
• Condição de umidade → 75 %UR → Susceptibilidade comum para moléculas que ionizam em pH
neutro - Hidrólise
• Amostras devidamente preparadas em balão âmbar aberto com a menor temperatura possível
de preferência em CÂMARA DE ESTABILIDADE qualificada.
• A única variável é o tempo → não aumentar a temperatura ou umidade.
• Aplicado a amostras sólidas e semissólidas de produto acabado.
• Suspensão extemporânea → expor o pó da suspensão a umidade e depois ressuspender para
análise.
RDC 53/2015 – ESTUDO DE PERFIL DE DEGRADAÇÃO – ESTADO DA ARTE
Premissas dos estudo de degradação forçada
• Planejamento dos ensaios de degradação forçada
• Hidrólise ácida e Hidrólise básica
• Oxidação por peróxido
• Oxidação por íons metálicos
• Calor
• Umidade
• Luz
RDC 53/2015 – ESTUDO DE PERFIL DE DEGRADAÇÃO – ESTADO DA ARTE
Premissas dos estudo de degradação forçada → Fotólise → Preparo do ensaio de Luz branca e
luz UV
• Sólidos e Semissólidos: camada fina e uniforme de pó/creme/pomada.
• Amostras líquidas: em frasco do tipo headspace “deitados”.
• Cuidado com sombra e efeito estufa!
• Controle escuro → avaliação de um possível aquecimento na câmara.
Sólidos e Semissólidos Líquidos
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Fotólise → Preparo do ensaio de Luz branca e
luz UV
• Luz branca: 1,2 klux hora
• Exposição: 1 a 2 ciclos
• UV: 200 Watt.hora/m²
• Exposição: 1 a 2 ciclos
• A única variável é a exposição a radiação → Não aumentar o tempo de exposição após
conclusão dos ciclos!
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Fotólise → Luz branca e luz UV
• Grupamentos mais suscetíveis a degradação por luz: carbonilas, nitroaromáticos, n-Oxides, alcenos,
arilcloretos, sulfetos e polienos.
• Isomerização
Baertschi, S.W., Alsante, K. M. and Reed, R.A. Pharmaceutical Stress Testing: prediction drug degradation, ed. 2ª, v. 210, 2011.
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Desenvolvimento de métodos indicativos de estabilidade
• Escolha da técnica analítica → Seletividade e Especificidade do método
• Definição da concentração de trabalho
• Preparo da amostra
• Pureza cromatográfica (via DAD e MS)
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Desenvolvimento de métodos indicativos de estabilidade
• Escolha da técnica analítica → Seletividade e Especificidade do método
• Definição da concentração de trabalho
• Preparo da amostra
• Pureza cromatográfica (via DAD e MS)
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Desenvolvimento de métodos indicativos de estabilidade
• Escolha da técnica analítica → Seletividade e sensibilidade do método
• Deve ter seletividade para o IFA em presença dos seus prováveis produtos de degradação.
• Deve ser capaz de ser sensível o bastante para quantificar os prováveis produtos de
degradação do IFA, nas concentrações limites.
• Precisão e exatidão no limite quantificação (≤ limite de notificação);
• Avaliar sempre a influencia da fase móvel na linha de base
SENSIBILIDADE E SELETIVIDADE COMO ATENDER?
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Desenvolvimento de métodos indicativos de estabilidade
• Escolha da técnica analítica → Seletividade do método
Para seletividade → escolhendo a técnica de separação → HPLC/UPLC; GC;
1. O IFA e seus possíveis produtos de degradação apresentam polaridades semelhantes, Log P
próximos?
2. pKa próximos?
3. Os PDs são voláteis em detrimento ao IFA ou vice-versa?
4. Qual o melhor modo de eluição?
5. Qual a melhor fase estacionária?
6. Método já deve ser compatível com a espectrometria de massas para uma futura identificação?
7. Qual melhor amostra a ser utilizada para definição de seletividade?
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Desenvolvimento de métodos indicativos de estabilidade
• Escolha da técnica analítica → Sensibilidade do método
Para sensibilidade → escolhendo a técnica de detecção→ DAD, Espectrometria de massas, CAD,
fluorescência, light scattering, RID, entre outros.
Detector de arranjo de diodos → DAD → Pureza de pico
1. O ativo e seus PDs possuem cromóforos?
2. Qual o máximo de absorção do ativo? É o mesmo dos seus PDs? Será apenas um comprimento de onda
no método?
3. Os aditivos e solventes utilizados na fase móvel oneram a avaliação de pureza de pico ou linha de base?
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Desenvolvimento de métodos indicativos de estabilidade
• Quando a presença de aditivos comprometem a linha de base e a precisão e exatidão do LOQ é reduzida:
1. Quanto menor a
concentração de EDTA
menor a perturbação
da linha de base e
mais precisas e exatas
são as replicatas;
2. Relação sinal/ruído
favorecida.
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Desenvolvimento de métodos indicativos de estabilidade
• Escolha da técnica analítica → Seletividade e Especificidade do método
• Definição da concentração de trabalho
• Preparo da amostra
• Pureza cromatográfica (via DAD e MS)
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Desenvolvimento de métodos indicativos de estabilidade
• Definição da concentração de trabalho e preparo de amostra → Definição de dose máxima
diária (DMD) e os limites de notificação e identificação a serem trabalhados
Há informação
de
DMD na bula?
Ir com a DMD
no site coifa da
ANVISA
Avaliar bulas de medicamentos
referência / discutir junto a equipe
médica (estudo clínico) na
ausência do medicamento
referência
Ir com a DMD
no site coifa
da ANVISA
RDC 53/2015 – ESTUDO DE PERFIL DE DEGRADAÇÃO – ESTADO DA ARTE
https://coifa.anvisa.gov.br/calculos.html
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Desenvolvimento de métodos indicativos de estabilidade
• Definição da concentração de trabalho e Preparo da amostra
O preparo da amostra (100%) é definido pelos valores dos limites de notificação e identificação
Critérios:
• Sinal/ruído do Limite de notificação (LN) e Limite de identificação (LI) → > 20 no mínimo;
• Assimetria de pico do LN e LI → 0,8 a 1,2 → satisfatórios.
LI LN
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Desenvolvimento de métodos indicativos de estabilidade
• Definição da concentração de trabalho e Preparo da amostra
• Para impurezas desconhecidas: Os produtos de degradação desconhecidos podem ser quantificados a
partir de solução de padrão do fármaco no limite de identificação.
• limite de quantificação: ≤ limite de notificação para impurezas desconhecidas.
LI LN
PRECISÃO E EXATIDÃO - LOQ
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Desenvolvimento de métodos indicativos de estabilidade
• Escolha da técnica analítica → Seletividade e Especificidade do método
• Definição da concentração de trabalho
• Preparo da amostra
• Pureza cromatográfica (via MS e DAD)
Motivos de indeferimento:
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Desenvolvimento de métodos indicativos de estabilidade
• Pureza cromatográfica (via MS e DAD)
• O que o guia 4/2015 traz de exigências para pureza de pico?
• Pico do ativo no LN e no LI
• Picos de impurezas
• Pico do ativo na concentração 100% após estresse
Não é necessário apresentar pureza de pico → baixas concentrações
Apresentação de pureza de pico
RDC 53/2015 – ESTUDO DE PERFIL DE DEGRADAÇÃO – ESTADO DA ARTE
Desenvolvimento de métodos indicativos de estabilidade
• Pureza cromatográfica → via DAD Os espectros ao longo do pico são avaliados
e comparados com o ápice do pico
Sem diferenças espectrais o pico está puro?
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Desenvolvimento de métodos indicativos de estabilidade
• Pureza cromatográfica → via DAD
• Garantimos a ausência de isômeros do ativo?
• Qual o valor de Absorbance threshold a ser utilizado?
• Há balanço de massas?
• Foi necessária saturação de pico para atingir limites tão baixo?
• Qual a diluição aplicada?
• Fase móvel interfere na avaliação de pureza de pico? Uso de cut-off? Justificativa técnica?
• IDEAL: USO DE OUTRAS TÉCNICAS COMO LC/MS, NMR, IR por exemplo.
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Desenvolvimento de métodos indicativos de estabilidade
• Pureza cromatográfica → via MS → Mais sensível e específico que o DAD
• Os espectros de massas são registrados sucessivamente sobre todo o intervalo de eluição do pico suspeito.
• Se durante a varredura desse espectro massas adicionais forem detectadas, o cromatograma de massas
correspondente é extraído → Comparação com o espectro de massas do padrão do ativo na mesma
concentração.
• Impureza não detectada por DAD → sem cromóforo ou baixa concentração → MS oferece detecções
altamente específicas sem interferências, para o monitoramento e identificação de impurezas.
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Desenvolvimento de métodos indicativos de estabilidade
• Pureza cromatográfica
Mundo real → ANVISA: Avaliação da pureza de pico e o balanço de massas são
complementares. Para técnicas sem o peak purity (FL, LS, CAD, RID) → utilizar técnicas
complementares
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Balanço de massas (BM)
• Justificativas técnicas para falta de balanço de massas
• Uso de técnicas ortogonais
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Balanço de massas (BM) → Quando o BM se apresentar abaixo de 100%?
1º ponto ser questionado: Metodologia de preparo de amostra
• Ainda estamos com problemas de solubilidade do IFA?
• O preparo do referência está muito distinto ao do ensaio?
• O problema foi observado apenas para o produto?
• Placebo interfere na recuperação dos PDs? Mudança de aspecto prejudica a recuperação do ativo e PDs?
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Balanço de massas (BM) → Quando o BM se apresentar abaixo de 100%?
1º ponto ser questionado: Metodologia de preparo de amostra
• Instabilidade dos PDs e do IFA em solução?
• É necessário um diluente específico para avaliar os PDs formados?
• Ensaios secos também estão sem BM aceitável?
• Corrigiu-se pelo teor?
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Balanço de massas (BM) → Quando o BM se apresentar abaixo de 100%?
2º ponto ser questionado: Quando o problema pode ser o método?
• O que houve com o sinal analítico do ativo e seus PDS?
• As impurezas podem não estar sendo eluídas pela coluna escolhida?
• Impurezas saem no vzero? Redesenvolvimento!
• Há coeluição com o IFA? Possível para amostras com picos do ativo saturados! Temos pureza de pico?
• Possibilidade de modificação do grupo cromóforo: desvio de fator resposta de determinado PD?
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Balanço de massas (BM) → Quando o BM se apresentar abaixo de 100%?
Quando o problema pode ser o método?
• Comparou-se o espectro de UV de cada impureza com o do(s) IFA(s), verificando se houve alteração dos máximos de
absorção UV e na relação entre esse máximo e algum outro comprimento de onda de baixa absorbância?
• Possibilidade de destruição do grupo cromóforo e consequente não detecção de determinada impureza? → Análise em
outro comprimento de onda ou uso de técnicas ortogonais (LC-MS/MS, GC/MS, RMN (Apenas para a MP);
• Degradação secundária? → Controlar a degradação para obter apenas 10%;
• Perda por volatilização? Uso de frascos headspace e avaliação pela técnica de GC/MS;
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Balanço de massas (BM) → Quando o BM se apresentar abaixo de 100%?
Após as investigações citadas, obtidas as respostas que não condenem o método:
Justificativa técnica é factível e embasada para a ausência de BM adequado!
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Balanço de massas (BM)
• Como calcular?
• Justificativas técnicas para falta de balanço de massas
• Uso de técnicas ortogonais
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Balanço de massas (BM) → Justificativas técnicas e ortogonalidade
• Com toda a análise crítica dos resultados realizadas, as possíveis justificativas:
Sem uma técnica ortogonal:
Justificar pela hipótese de desvio de fator resposta analítica no DAD:
• Para desconhecidas → avaliar os espectros de absorção quando o software fornecer e comparar com o
do ativo;
• Para conhecidas → Quantificação contra padrão da impureza;
• Mais de um comprimento de onda? Como calcular o BM?
• PDs de ativos associados de difícil discriminação?
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Balanço de massas → Justificativas técnicas e ortogonalidade
• Com toda a análise crítica realizada dos resultados obtidos, as possíveis
justificativas:
• Inviabilidade do uso de desvio de fator resposta analítica no DAD → Perdas de cromóforos;
• Uso de técnica ortogonal com adaptação do método para que o perfil cromatográfico seja o
mesmo independente do detector: MS; CAD; LS, entre outros;
• Preparar a amostra de estresse para análise em outros detectores;
• Apresentar os novos cromatogramas mostrando a presença de pico não observado por DAD;
• Aplicação do método nas amostras de estabilidade→ Há a necessidade de 2 técnicas na
avaliação de estabilidade real?
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Ferramentas de identificação → Uso do LC/MS
O método de rotina é compatível com o detector de espectrometria de massas?
Para ser compatível:
Fluxo ideal de fase móvel: inferior a 0,5 ml/min;
Fase móvel ideal: Aditivos e tampões voláteis, água e solventes orgânicos de alta
pureza.
Para métodos de rotina não compatíveis → avaliar a seletividade após adaptação!
Seria uma premissa de desenvolvimento de método indicativo de estabilidade já
compatível?
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Ferramentas de identificação → Uso do LC/MS → Aditivos de fase móvel voláteis
Aditivos pKa /pkb
Ácido fórmico pka 3,8
Ácido trifluoroacético pka 0,5
Ácido acético pka 4,8
Formiato de amônio pka 3,8 / 9,2
Acetato de amônio pka 4,8 / 9,2
Bicarbonato de amônio pka 6,3 / 9,2 / 10,3
Hidróxido de amônio pkb 4,7
Ácido Heptafluorobutírico (HFBA) pka 0,4
di n-butilamina acetate pka 11,3
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Ferramentas de identificação → Uso do LC/MS → Técnicas hifenadas
RDC 53/2015 – ESTUDO DE PERFIL DE DEGRADAÇÃO – ESTADO DA ARTE
Ferramentas de identificação → Uso do LC/MS → Técnicas hifenadas
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Premissas dos estudo de degradação forçada → Planejamento dos ensaios de degradação forçada
Bom desenho experimental e análise crítica
Guia 4/2015
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Como elaborar um relatório de estudo de perfil de degradação?
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Relatório → Como elaborar um relatório de estudo de perfil de degradação: Análise crítica
Estudo de perfil de degradação
segundo o Guia 4/2015
Parte crítica: Introdução, Discussão do perfil e
conclusão
Parte experimental: Degradação forçada
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Relatório → Como elaborar um relatório de estudo de perfil de degradação: Análise crítica
Introdução:
• Pesquisa / Levantamento bibliográfico / Desenho Experimental;
• DMF: impurezas de síntese, produtos de degradação conhecidos ou não, condições de estresse
(validação), estabilidade do IFA;
• Susceptibilidade da molécula: literatura, predição (Zeneth®);
• Compatibilidade: histórico, literatura, predições (Zeneth®);
• Estudo de estabilidade: acelerada ou de longa duração;
• Especificações: RDC 53/15, compêndios oficiais;
Guia 4/2015
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Relatório → Como elaborar um relatório de estudo de perfil de degradação: Análise crítica
Metodologia:
• Apresentar todos os detalhes do método cromatográfico e de detecção:
• Preparo detalhado da fase móvel; tipo de coluna, uso de temperatura, volume de injeção, dentre outros
parâmetros relevantes.
• Apresentar o uso de mais de um comprimento de onda ou qualquer alteração no intervalo de varredura do
DAD.
• Preparo das amostras:
• Preparo dos padrões (LN e LI) do IFA e das impurezas nas especificações;
• Preparo da amostra referência (Branco, IFA, PA e Placebo);
• Preparo das amostras para o estudo de estresse (Branco, IFA, PA e Placebo) → Descrever uso de co-
solventes, neutralização, limitação analítica.
Guia 4/2015
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Relatório → Como elaborar um relatório de estudo de perfil de degradação: Análise crítica
Discussão do perfil de degradação e conclusão:
• Discutir cada ensaio de estresse separadamente:
• Comparação do perfil do IFA isolado e quando presente no produto acabado;
• Em caso de mais de um fabricante de matéria prima, avaliar o perfil cromatográfico e discutir
sobre a semelhança ou não entre os fabricantes.
• Avaliar criticamente se houve ou não o favorecimento da degradação quando há interação do
IFA com os excipientes no produto acabado;
• Se houverem impurezas conhecidas, sinalizá-las na discussão.
• Discutir se os produtos de degradação encontrados no estresse foram observados nas
amostras de estabilidade acelerada, longa duração ou aceleradíssima → Degradação potencial
versus a degradação real;
• Discutir mecanismos de degradação, se possível.
Guia 4/2015
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Relatório → Como elaborar um relatório de estudo de perfil de degradação: Análise crítica
Discussão do perfil de degradação e conclusão:
• Dados brutos
• Apresentação dos cromatogramas de forma organizada;
• Apresentar 2 escalas com visualização do pico principal (125%) e dos produtos de degradação (5% do
125%);
• Apresentação dos seguintes parâmetros cromatográficos:
• Resolução;
• Pureza do pico (relevante somente para os picos dos IFAs) para todas as condições de estresse;
• Assimetria;
• Eficiência da coluna (n° de pratos teóricos).
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Relatório → Como elaborar um relatório de estudo de perfil de degradação: Análise crítica
Discussão do perfil de degradação e conclusão:
• Balanço de massas
• Tabela comparando a porcentagem de degradação do(s) IFA(s) com a porcentagem de
aumento de impurezas;
• Discussão sobre o balanço de massas;
• Quedas inferiores a 10% do seu ativo em endpoint aplicado;
• Justificativas técnicas para déficit de balanço de massas;
• Uso de ortogonalidade.
Guia 4/2015
RDC 53/2015 – ESTUDO DE PERFIL DE DEGRADAÇÃO – ESTADO DA ARTE
Relatório → Como elaborar um relatório de estudo de perfil de degradação: Análise crítica
Discussão do perfil de degradação e conclusão:
• Conclusão
• Perfil de degradação “potencial” comparado ao perfil de degradação real;
• Discussão sobre o impacto das condições de produção no resultado do perfil de
degradação;
• Discussão sobre os fatores de armazenamento que podem interferir na estabilidade do
produto.
Guia 4/2015
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Relatório → Como elaborar um relatório de estudo de perfil de degradação: Análise crítica
Etapa de identificação
• Identificação
• Após sinalização de PD acima do LI nas amostras de estabilidade, como reportar?
• Injeção de um padrão caracterizado ou farmacopeico de uma substância → Mesmo Tr e o mesmo
espectro de UV no método indicativo de estabilidade;
• Um mecanismo de degradação proposto que leve a uma estrutura confirmada com uma técnica
espectroscópica de caracterização (espectros de massas, de RMN, infravermelho);
• Caracterização conclusiva, realizada com pelo menos duas técnicas espectroscópicas diferentes
(espectros de massas, de RMN, infravermelho).
Guia 4/2015
RDC 53/2015 – ESTUDO DE PERFIL DE DEGRADAÇÃO – ESTADO DA ARTE
Relatório → Como elaborar um relatório de estudo de perfil de degradação: Análise crítica
Com um estudo bem conduzido:
O perfil de degradação real e qualquer desvio de qualidade do produto deve ser
detectado pelo método indicativo de estabilidade (MIE) e sua origem rastreável
(degradação forçada).
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Estudo de caso: BM justificado por identificação e fator resposta
Molécula C → Degradação em fotólise sem balanço de massas
PD de fotólise da
Molécula CMolécula C
A identificação do PD por massas e RMN explicou a falta de BM na condição de fotólise → Eliminação da
conjugação → Redução da absortividade →1. FR diferente de 1; 2. Máximo de absorção diferente do ativo.
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Estudo de caso: BM justificado por identificação e fator resposta
• Molécula C → Necessidade de 3 comprimentos de onda para apresentação do perfil de degradação e definição de balanço de
massas.
Embora o comprimento de onda 252 nm seja o mais discriminativo de impurezas, não há
fechamento de BM → Sempre avaliar os demais comprimentos
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Estudo de caso → Construindo um racional preliminar para estudo de perfil de
degradação para cafeína em comprimido analgésico com associação de mais 2 ativos
(Paracetamol + Orfenadrina)
pKa: -1,16
Log P: - 0,55
Extremamente solúvel em água
independente do pH aplicado
Carater altamente básico
Cafeína → base estrutural: xantina, com a diferença de possuir apenas aminas terciárias.
Estrutura química complexa, contendo bastante heteroátomos e funções orgânicas → poucos produtos de
degradação relatados e previstos na literatura.
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Estudo de caso → Construindo um racional preliminar para estudo de perfil de
degradação para cafeína em comprimido analgésico com associação de mais 2 ativos
(Paracetamol + Orfenadrina)
• Altamente suscetível a hidrólise básica → literatura científica e DMF;
• Estável nas demais condições de estresse → atenção para os demais ativos → estresse do
placebo real determinará a seletividade;
• Sem necessidade de uso de co-solvente para avaliação do IFA isolado e presente no
medicamento;
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Estudo de caso → Construindo um racional preliminar para estudo de perfil de
degradação para cafeína em comprimido analgésico com associação de mais 2 ativos
(Paracetamol + Orfenadrina)
• Cafeidina principal PD da cafeína sob hidrólise básica;
• As impurezas conhecidas apresentam estruturas
semelhantes → Método gradiente e mais aquoso no
início da corrida!
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Estudo de caso → Construindo um racional preliminar para estudo de perfil de
degradação para cafeína em comprimido analgésico com associação de mais 2 ativos
(Paracetamol + Orfenadrina)
• Paracetamol se apresenta em uma concentração 8 vezes maior que a cafeína no medicamento;
• Paracetamol mais lábil que a cafeína → baixa resolução dos seus PDs com os PDs da cafeína;
• UPLC;
• Uso de comprimentos de onda distintos:
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Estudo de caso → Construindo um racional preliminar para estudo de perfil de degradação
para cafeína em comprimido analgésico com associação de mais 2 ativos (Paracetamol +
Orfenadrina)• Sem Balanço de massas adequado na condição de hidrólise
básica:
• Impurezas desconhecidas com máximos de absorção em
205 nm → péssimo para avaliação de pureza da Cafeína →
275 nm para avaliação!
• Justificativa de desvio de absortividade;
• Cafeidina: FR diferente de 1 → cálculo contra o padrão da
impureza conhecida.
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Conclusão
Para um adequado atendimento a RDC 53/2015:
Análise crítica sempre, seja ela experimental ou teórica!