Reação de Polimerização em Cadeia - PCR

1-Introdução

2-Automatização da PCR

3-Sistema de reação

4-Iniciadores – primers

1-Introdução

Kary Mullis1985 – Cetus Corporation

A PCR é um sistema para a replicação do DNA in vitro, que permite que uma seqüência “alvo”de DNA seja amplificada em milhares de cópias em apenas algumas horas

2-Automatização da PCR

• O isolamento da DNA polymerase termoestável da bactéria Thermus aquaticus, a Taq polymerase.

• Ciclos com oscilações entre altas e baixas temperaturas, controladas por computador

Termociclador

2-Automatização da PCR

Etapas básicas da PCR:

• 1- desnaturação térmica do DNA molde• 2- Anelamento de oligonucleotídeos

sintéticos – iniciadores• 3- Polimerização das novas fitas a partir

dos iniciadores

2-Automatização da PCR

Em um microtubo...

• DNA a ser amplificado (pequenas quantidades)

• Solução tamponada contendo:– DNA polimerase– Iniciadores– dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

– Cofator enzimático MgCl2– Água milliQ

3-Sistema de reação

4-Iniciadores - primers

• Tamanho – entre 10 a 30 bases• Composição de bases - ~50% de

G/C• Seqüências – não devem ter

complementaridades intra ou inter molecular

• Cálculo da Tm

Cálculo da Tm - temperatura de anelamento dos iniciadores

• Do inglês: melting temperature• Temperatura na qual se tenta obter o equilíbrio

entre a formação e a dissociação dos híbridos gerados pelo estabelecimento de pontes de hidrogênio

• Para o cálculo:• Tm= 2(A+T) + 4(G+C)

4-Iniciadores - primers