LA REACIÓNANTÍGENO - ANTICUERPO

Concepto de reacción Ag - Ac• Cuando un Ac entra en

contacto con un Ag contra el que está dirigido, ambos se unen formándose un complejo Ag-Ac.

• La unión Ag-Ac es reversible.• La permanencia de la unión

depende de:• Grado de adaptación entre

ambas moléculas.• Fuerza y estabilidad de los

enlaces que las unen.

Características de la Características de la Interacción Antígeno - Interacción Antígeno - AnticuerpoAnticuerpo

EspecíficaEspecífica ReversibleReversible Dependiente de pHDependiente de pH Sensible a la TemperaturaSensible a la Temperatura Sensible a la fuerza iónicaSensible a la fuerza iónica

Enlaces que intervienen en la unión Ac-Ag • No son covalentes. Son cuatro tipos:

1. Electrostáticos: Entre grupos iónicos (NH3+ y -COO-) de Prots. distintas.

2. Puentes de hidrógeno entre grupos polares hidrofílicos (-OH, -NH2, -COOH).

3. Hidrofóbicos: Gr. No polares hidrófobos en medio acuoso (cadenas laterales de algunos AA.)

4. De van der Waals: Fuerzas intermoleculares débiles de origen eléctrico que se ejercen a distancia entre moléculas.

• Las fuerzas de unión de cada uno de ellos son menores que en los covalentes, pero en conjunto consiguen una considerable energía de unión.

COMPLEMENTARIEDAD DE EPÍTOPE Y PARATOPE

• EPÍTOPE Y PARATOPE han de tener estructuras complementarias que encajan entre sí.

• Se forman varios enlaces no coovalentes simultáneamente.

• La distancia entre Ag y Ac es muy pequeña en el punto de unión, lo que incrementa la fuerza de esa unión.

AFINIDAD DEL ANTICUERPO• Es la fuerza de unión

entre el Ac con su Ag• Determina la

atracción entre ellos.• Esa fuerza es la suma

de las fuerzas de los enlaces que intervienen en la unión.

AVIDEZ DEL ANTICUERPO• Es una medida de la fuerza de unión y

estabilidad del complejo:Ag multivalente – Ac multivalente.• Ac multivalentes: Tienen más de un

punto de unión para Antígenos.• Ag multivalentes: Tienen varios

determinantes antigénicos (más de un punto de unión para los Ac).

• La fuerza de unión es mayor que la suma de las afinidades de cada uno de los puntos de unión

Cinética de la ReacciónCinética de la Reacción(ecuación válida solo para moléculas monovalentes)(ecuación válida solo para moléculas monovalentes)

k’

Hapteno + Ac ( Hapteno-Ac)

k

k’

Ka=k

=(Hapteno-Ac)

(Hapteno)(Ac)

[Ac] la concentración de sitios libres de Ac [Ac] la concentración de sitios libres de Ac [Ac-H] la concentración de sitios ocupados del Ac[Ac-H] la concentración de sitios ocupados del Ac

Equilibrio de diálisisPara calcular Ka

ESPECIFICIDAD DEL ANTICUERPO

• Si un anticuerpo reacciona solo con un Ag: Es muy específico.

• Si un Ac reacciona con varios Ag: Tiene una especificidad baja. Se habla de REACTIVIDAD CRUZADA.

• Esto ocurre porque varios antígenos tienen uno o más determinantes antigénicos iguales o similares, capaces por tanto de unirse al mismo Ac.

REACCIONES ANTIGENO ANTICUERPO

APLICACIÓN AL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

Los anticuerpos como sondas para buscar antígenos de

interés

EspecificidadEspecificidad SensibilidadSensibilidad EstabilidadEstabilidad Versatilidad en el diseño: ELISA, IFI, Western blot, Versatilidad en el diseño: ELISA, IFI, Western blot,

etc.etc. Tiempo de ejecución razonable: minutos a Tiempo de ejecución razonable: minutos a ~ ~ hrshrs Costo convenienteCosto conveniente Infraestructura mínimaInfraestructura mínima

Ventajas

Inmunización conCarrier-hapteno

Antisuero

Análisis de los Ac. unidos a:

Hapteno libre

Hapteno en otra Proteína

Hapteno al mismo carrier

Los anticuerpos como sondas para buscar antígenos de interés

Ej. Haptenos (drogas, toxinas, hormonas, etc).

Técnicas InmunoanalíticasTécnicas Inmunoanalíticas- Reacción de precipitación En medio líquido

Floculación

Nefelometría Precipitación de complejos Inmunes

En gel Inmunodifusión doble

Inmunodifusión radial Inmunoelectroforesis Rocket electroforesis Contrainmunoelectroforesis Inmunoelectroforesis cruzda bidimensional de Laurel

- Reacción de aglutinación

Aglutinación pasiva Aglutinación directa

- Fijación y actividad hemolítica del complemento

- Reacciones en fase sólida

o ELISA

o Western blot

REACCIONES DE INMUNOPRECIPITACIONCARACTERISTICAS:

Ag solublesAc de clase Ig GReacción poco sensibleReacción muy específicaIntervienen Ac policlonales frente a Ag polivalentes

•Modalidades:• Inmunoprecipitación simple en tubo• Inmunodifusión o Inmunoprecipitación en medio sólido:

Inmunodifusión simple: en tubo (Oudin)En placa o Radial (Mancini)

Inmunodifusión doble o radial (Ouchterlony)Inmunoelectroforesis (Grabar y Willians)ContrainmunoelectroforesisInmunoelectroforesis en cohete (Rocket y Laurel)Inmunoelectroforesis bidimensional.

Reacciones de Precipitación yReacciones de Precipitación yFloculación en soluciónFloculación en solución

Exce

so

AcExceso Ag

Equivalencia

Tiroglobulina agregada (mg)

Prec

ipita

do d

e pr

oteí

nas (

mg)

Reacciones de sueros humanos de pacientes con Tiroiditis de Hashimoto auotoinmune.

Inmunodifusión DobleInmunodifusión Doble (o de Ouchterloni)(o de Ouchterloni)

Ej: Mezcla de antígenos y suero polivalente

AS (pozo central) : Antisuero de conejo anti-suero humanoHSA: Albúmina humana purificadaHIg: Inmunoglobulina humana purificada

Suero humano

HSA

Suero humano

HIg

Ensayo Immunoturbidimétrico

Suero + Ag complejos insolubles

Aumenta turbidez de la solución

y puede ser medida ópticamente

Turbidez proporcional a la cantidad

de proteínas en la muestra

Sensibilidad de método se puede incrementar con los anticuerpos Unidos a látex: mayores agregados

Inmunodifusión RadialInmunodifusión Radial

Anticuerpo incorporado al gel

El tamaño de los halos es proporcional a la

concentración del antígeno

Ag

• REACCIONES DE AGLUTINACION• Características:• Ag particulados, generalmente poliantigénicos• Ac de clase Ig M e Ig G• Reacción con Ag superficiales.• Reacción bastante sensible• Reacción relativamente específica• Intervienen Ac policlonales frente a Ag polivalentes.

• Modalidades:Aglutinación directa:Cualatitativa/cuantitativaEn tubo/en portaAglutinación pasiva:Prueba de Coombs directa e indirectaHemaglutinación pasivaPrueba de LátexPruebas de coaglutinación

Reacciones de AglutinaciónReacciones de Aglutinación

Aglutinación Directa: Las partículas o células tienen un antígeno intrínseco.

Aglutinación Pasiva: partículas o células a las cuales se le agrega el antígeno

Se considera aglutinación cuando el antígeno esparticulado y tiene como tamaño mínimo el bacteriano

Reacciones mediadas Reacciones mediadas por Complementopor Complemento

Lisis celular

REACCIONES DE FIJACION DEL COMPLEMENTO

Reacción positiva (No hemolisis)

Reacción Negativa (Hemolisis)

Reacciones en fase sólidaReacciones en fase sólida

ELISA Western blots Inmunofluorescencia Cromatografía de Afinidad

ELISAELISA(Enzime linked (Enzime linked immunosorbent assay ) immunosorbent assay )

Detección de anticuerpos Detección de Antígeno

Determinación de antígenos Determinación de antígenos por ELISApor ELISA

Competencia Sándwich

[ Ag ]

Den

sida

d óp

tica

[ Ag ]

Den

sida

d óp

tica

Caso de Haptenos Caso de Proteínas

Método indirecto• También conocido como método Sándwich

(Antígeno-anticuerpos-anticuerpo), se basa en la fijación de un antígeno a la fase sólida, el cual atrapa los anticuerpos homólogos en la muestras que posteriormente son identificados con un anticuerpo específico marcado con una enzima. En estos casos la cantidad de antígeno es directamente proporcional a la cantidad de producto enzimático formado.

POZO DE LA PLACA DE ELISAPOZO DE LA PLACA DE ELISA

MUESTRA DEL PACIENTEMUESTRA DEL PACIENTE

TMBTMB

STOPSTOP

Antígeno en Antígeno en PlacaPlaca

PP

Anticuerpos anti-IgG Anticuerpos anti-IgG Humana marcados con Humana marcados con

PeroxidasaPeroxidasa

TÉCNICA DE SANDWICH

Anticuerpos IgG en la Anticuerpos IgG en la Muestra del pacienteMuestra del paciente

Directo

• Detecta al antígeno y se basa habitualmente en la captura de este por anticuerpos específicos unidos a una fase sólida

• El antígeno presente en la muestra se combina con el anticuerpo fijado.

• El antígeno se detecta con otro anticuerpo específico conjugado a una enzima, se adiciona un sustrato para la enzima y se mide la intensidad de color.

POZO DE LA PLACA DE ELISAPOZO DE LA PLACA DE ELISA

MUESTRA DEL PACIENTEMUESTRA DEL PACIENTE

TMBTMB

STOPSTOP

Antígeno en Antígeno en La muestraLa muestra

PP

Anticuerpos IgG Anticuerpos IgG marcados con marcados con

PeroxidasaPeroxidasa

TÉCNICA DIRECTA

Placa con AnticuerposPlaca con AnticuerposIgG contra el AgIgG contra el Ag

POZO DE LA PLACA DE ELISAPOZO DE LA PLACA DE ELISA

MUESTRA DEL PACIENTEMUESTRA DEL PACIENTE

TMBTMB

STOPSTOP

Placa con AnticuerposPlaca con AnticuerposDe Captura De Captura

contra IgM Humanacontra IgM Humana

Anticuerpos IgM en la Anticuerpos IgM en la Muestra del Muestra del

pacientepaciente

Antígeno en Antígeno en soluciónsolución

PPAnticuerpos Anticuerpos anti-antígeno anti-antígeno marcados con marcados con

PeroxidasaPeroxidasa

TÉCNICA DE INMUNOCAPTURA

Método competitivo• Se basa en la competencia que se establece entre

un antígeno marcado enzimáticamente y el mismo antígeno sin marcar (muestra objetivo) al ser colocados frente a una cantidad limitada del anticuerpo homólogo fijado a la fase sólida. En estos casos la cantidad de antígeno es indirectamente proporcional a la cantidad de producto enzimático formado.

Western blotWestern blot

Anticuerpo específico

Anti-anticuerpo-Enzima

Sustrato

Precipitado producto enzimático

Quimioluminiscencia

Inmunofluorescencia indirectaInmunofluorescencia indirecta

Anticuerpo anti-Acrosina

Anticuerpo anti-Ag de embrión de ratón

Se puede hacer con células vivas o fijadas,

con o sin permeabilizar.

Cromatografía de AfinidadCromatografía de Afinidad

Anticuerpo

Anticuerpo no unido

Buffer de elusión

Elución de Anticuerpo

Ej: Purificación de un anticuerpo uniendo el antígeno a una resina (sp). Sin embrago, también se puede hacer lo contrario.

Quimioluminiscencia• Es el fenómeno que ocurre en las luciérnagas:

• una reacción química con un muy alto rendimiento energético produce una molécula potencialmente fluorescente.

• (No hay excitación luminosa como en la fluorescencia)

• Usualmente son reacciones redox catalizadas por enzimas que involucran O2 o H2O2 y un sustrato orgánico oxidable. La energía se libera como luz visible.

Quimioluminiscencia

Oxidante(H2O2,, perborato Na)

Luminol

PON2

Intermediarioelectrónicamente excitado

Luz, 425 nm

(3-aminoftalhidrazida)

aminoftalato

Quimioluminiscencia• Se utiliza para detectar concentraciones muy bajas de moléculas, menor límite de detección que en los otros métodos enzimáticos.

• Se marcan Ag o Ac con sustancias que participan en la reacción quimioluminiscente (luminol, peroxidasa).

• Se detecta la señal quimioluminiscente Se hacen en fase sólida, o en técnicas homogéneas

Electroquimioluminiscencia• Ej.: determinación de TSH

• Incubación a 37º

Muestra con TSH

Partícula magn

Streptavidina

Anti-TSH-biotina

•anti-TSH-Ru(bipy)3

Electroquimioluminiscencia

• Ejemplo: TSH

IMÁN

ELECTRODO

Anal Chim Acta, 378, 1(1999)

Electroquimioluminiscencia• Marca: Ru(bipy)2+

3

• Ru 2+Ru 3+

En presencia de N(Pr)3, en un ánodo, el pasaje de la forma +3 a +2 va acompañado de quimioluminiscencia.,

Con partículas magnéticas y un imán asociado al electrodo, se realiza la reacción allí.