reacciones de pardeamiento enzimatico semana 16
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REACCIONES DE PARDEAMIENTO ENZIMATICO
I. OBJETIVOS
Observar el pardeamiento enzimático que ocurre en la manzana
II. MARCO TEORICO
PARDEAMIENTO ENZIMÁTICO
El pardeamiento enzimático aparece fundamentalmente en los tejidos vegetales
cuando se daña por ejemplo por un corte, siendo el color parduzco que aparece al
estar al contacto con el aire un pardeamiento enzimático. El tejido produce esta
coloración como defensa contra el crecimiento de mohos, pero sin embargo
afectará al aspecto visual del alimento.
Este fenómeno se debe a la acción de unas enzimas, las FENOLASAS. Como
sustrato de estas enzimas están los compuestos fenólicos por lo que afectan a los
pigmentos con estructura fenólica. La acción de las fenolasas se divide en dos
actividades.
Actividad cresolasa, que provoca la oxidación de los fenoles dando orto-difenoles.
Actividad catenolasa, que forma ortoquinonas que reaccionan entre ellas
produciendo compuestos que dan color parduzco.
El enzima responsable del pardeamiento enzimático recibe el nombre de
polifenoloxidasa, fenolasa o tirosinasa, en este último caso especialmente cuando
se hace referencia a animales, ya que en ellos la tirosina es el principal substrato.
También se ha utilizado el término cresolasa, aplicado a la enzima de vegetales.
Se descubrió primero en los champiñones, en los que el efecto de pardeamiento
tras un daño mecánico, como el corte, es muy evidente.
En el campo de los alimentos, el pardeamiento enzimático puede ser un problema
muy serio en frutas, patatas y otros vegetales, e incluso en la industria del vino, al
producir alteraciones en el color que reducen el valor comercial de los productos, o
incluso los hacen inaceptables para el consumidor. Estas pérdidas son muy
importantes en el caso de las frutas tropicales, productos trascendentales para la
economía de muchos países poco desarrollados.
A pesar del nombre genérico de “pardeamiento” (“browning” en inglés), los colores
formados son muy variables, marrones, rojizos o negros, dependiendo del
alimento y de las condiciones del proceso. En algún caso, como en las pasas,
otras frutas secas, la sidra, el té o el cacao, el pardeamiento enzimático contribuye
al desarrollo de los colores característicos de estos productos, aunque como se ha
indicado, en otros muchos constituye un problema grave. Además de la alteración
del color, los productos formados pueden reaccionar con las proteínas,
insolubilizándolas. Por otra parte, puede producirse también una pérdida
nutricional, ya que aunque la polifenoloxidasa no oxida directamente al ácido
ascórbico, esta vitamina puede destruirse al reaccionar con intermedios de la
reacción.
La reacción de pardeamiento enzimático
El pardeamiento enzimático es un conjunto complejo de reacciones, que se inicia
por la o las reacciones catalizadas de forma enzimática. La primera de ellas,
cuando el sutrato presente es un monofenol, es su transformación en difenol. La
segunda, la transformación del difenol en quinona. En el caso de la tirosina
(monofenol) se forma primeramente la dopa (difenol) y luego la dopaquinona
(quinona).
A partir de la formación de la quinona, la reacción progresa de forma espontánea.
Las quinonas se pueden convertir en trifenoles por reacción con el agua, y
posteriormente oxidarse a hidroxiquinonas. Todas estas sustancias son muy
reactivas, dando lugar a polímeros y reaccionando con otras sustancias presentes
en el alimento, especialmente proteínas. Los productos finales, llamados
melaninas, son de color muy oscuro, o negro, e insolubles en agua. Estos
polímeros tienen propiedades antimicrobianas, y podrían ser un mecanismo de
defensa de los vegetales contra infecciones.
Substratos
Los sustratos de la reacción pueden ser monofenoles o difenoles. En los
vegetales, el sustrato más extendido es probablemente el ácido clorogénico, en el
que el grupo fenólico se encuentra unido a un resto de azúcar, que se encuentra,
entre otros, en manzanas, peras, melocotones, ciruelas, uvas, aguacates y
patatas. En algunos vegetales se encuentran además DOPA, dopamina, p-cresol,
ácido cafeico y otros fenoles.
Las polifenoloxidasas son también en muchos casos capaces de oxidar aminas
aromáticas para formar o-aminofenoles.
Control de la reacción de pardeamiento
El control natural de la actividad de la polifenoloxidasa se produce
fundamentalmente mediante la compartimentalización de los sustratos. El enzima
se encuentra en los plástidos y cloroplastos (en los vegetales superiores), y
también en el citoplasma celular, mientras que los compuestos fenólicos que
pueden servir de sustratos se acumulan en vesículas. Cuando se rompe la
compartimentalización por un daño mecánico, como el triturado, corte o
congelación y descongelación, la reacción de pardeamiento se puede producir.
También se produce la inhibición del enzima por los productos de la reacción.
Además de manteniendo la compartimentalización, la reacción de pardeamiento
se puede frenar actuando sobre diferentes factores:
Evitando el contacto del oxígeno con la superficie de corte
Bajando al temperatura
Reduciendo el pH
Desnaturalizando el enzima
Generalmente estos factores actúan de forma combinada. Así, el descenso de pH
puede actuar inicialmente reduciendo la actividad del enzima, (su pH óptimo está
entre 5 y 7), pero también, si es suficientemente bajo, desnaturalizándola de forma
irreversible.
Los reductores pueden actuar de varias formas, entre ellas revertiendo la reacción
de quinonas a fenoles. También pueden actuar directamente sobre el centro activo
del enzima, transformando el cobre 2 en cobre 1, que se disocia más fácilmente.
El sulfito y la cisteína, además de reaccionar con las quinonas reduciéndolas a
difenoles, inactivan el enzima. Los sulfitos presentan el problema de su toxicidad
diferenciada para algunas personas, un pequeño porcentaje de los asmáticos, que
pueden sufrir crisis severas con cantidades incluso inferiores a los límites legales.
Consecuentemente, existe una tendencia a reducir la utilización de sulfitos,
aunque no siempre es posible.
Un inhibidor muy eficiente la actividad de la polifenoloxidasa de los crustáceos es
el ácido bórico, aunque actualmente está prohibido su uso, dados los riesgos de
toxicidad.
Para que se produzca este pardeamiento es necesario, por lo tanto, la presencia
de los tres componentes: enzima, substrato más el oxígeno. Como nada se puede
hacer o muy poco con el substrato oxidable, los métodos hoy en uso tienden a
inhibir la enzima o a eliminar el oxígeno y algunas veces se combinan ambos
métodos.
a) Inactivación de la enzima mediante calor. Tiene la ventaja de que no se
aplica aditivo alguno, pero presenta el inconveniente de que la aplicación de calor
en frutas frescas produce cambios en la textura, dando sabor y aspecto a cocido.
Para evitar estos inconvenientes se regula el tiempo de calentamiento,
acortándolo justo al mínimo capaz de inactivar la enzima por un escaldado
inmediato. Se puede controlar la inhibición enzimática por la prueba del catecol. La
inhibición es lenta a 75°, pero se hace rápida a 85°C.
b) Inactivación de la enzima mediante inhibidores químicos:
Anhídrido sulfuroso: Es uno de los más efectivos y económicos inhibidores
químicos hoy usados en la industria alimentaría, aunque su olor y sabor
desagradables pueden comunicarse al alimento cuando se emplea en grandes
cantidades. Su uso no es aconsejable en alimentos ricos en tiamina y vitamina C,
pues las destruye. En el caso de la tiamina, el SO2 es capaz de romper el anillo
tiazólico de la vitamina, separando el anillo de pirimidina, con lo que pierde su
carácter vitamínico.
La polifenoloxidasa es muy sensible al SO2, pero la reacción debe realizarse antes
que se formen las quinonas por oxidación del substrato, pues éstas oxidan al SO2,
por lo que pierde entonces su propiedad de inhibir la enzima.
Acidos: Bajo un pH 2,5 cesa la actividad enzimática, que es óptima entre 5 y 7.
Aunque luego se vuelva al pH original de la fruta, la enzima no se recupera,
impidiéndose así el pardeamiento. Entre los ácidos más usados está el málico,
que se agrega al prensar la fruta: caso de la manzana, de la cual es uno de sus
componentes naturales; también se usa, pero en menor proporción, el ácido
cítrico.
Acido ascórbico: Este ácido es el más recomendado para evitar o minimizar el
pardeamiento enzimático, por su carácter vitamínico inofensivo. El ácido ascórbico
por sí mismo no es un inhibidor de la enzima: actúa sobre el substrato, de modo
que puede adicionarse después de haberse formado las quinonas; Tiene la
propiedad de oxidarse a ácido dehi-hidroascórbico, reduciendo la quinona a fenol.
Esto lo hace el ácido ascórbico hasta que se haya transformado totalmente en
dehidroascórbico que ya no puede reducir las quinonas, de manera que éstas
continúan, entonces, su oxidación hasta la formación de melanoides. El ácido
dehidroascórbico aún puede ser perjudicial al formar, en la esterilización posterior,
melanoides con los aminoácidos presentes; por » eso la adición de ácido
ascórbico no es eficaz en cerezas, ciruelas y frutillas. Sin embargo, si se agrega a
otras frutas exceso de ácido ascórbico para inactivas totalmente la enzima, se
logra prevenir el pardeamiento en forma efectiva y permanente.
Productos especialmente propensos a empardecer por oxidación química, cómo
manzanas, peras, duraznos, damascos, ciruelas y plátanos entre las frutas, y
papas, espárragos, zanahorias entre las hortalizas, deben mantenerse,
inmediatamente después de cortadas o peladas, en agua adicionada de 0,1-0,2 %
de ácido ascórbico y de 0,2% de ácido cítrico.
Además, para evitar alteraciones de color por oxidación química en las conservas
enlatadas, es conveniente agregar por cada litro de líquido de relleno 0,5-1 g de
ácido ascórbico (y 0,25-0,50 g de ácido cítrico, según lo admita el producto en
cuanto al sabor). Para mantener el color de conservas de champiñones y otros
hongos es conveniente una adición de 0,15-0,20 g por litro y para el choucroute se
agrega a la salmuera 1-2 g/kg de ácido ascórbico, poco antes del envase.
Otros inhibidores químicos: Entre las sales propuestas para controlar el
pardeamiento la más usada es NaCl, cuya acción impide la actividad de la
polifenol-oxidasa frente al ácido clorogénico. Una sumersión en solución acuosa
diluida de NaCl (0,3%) se usa mucho cuando se quiere evitar por corto tiempo el
obscurecimiento de frutas peladas, como rodajas de manzanas, antes de ser
sometidas al procesamiento; Su contenido en ácido ascórbico sé mantiene,
entonces, constante durante varias horas.
Se aplica el bloqueo de los hidróxilos fenólicos por adición de complejantes con el
cobre de la enzima, como el ácido cítrico (0,2%) y boratos
(0,2% + 0,01% SO2). También la cisteína y otros dadores de SH se unen a los
fenoles, dando complejos incoloros, previa reducción de las quinonas.
El uso de jugos de piña o de limón para evitar el pardeamiento en preparaciones
caseras, se basa en el contenido de compuestos sulfhidrílicos del primero y en
ácidos cítrico y ascórbico del segundo.
c) Eliminación del oxígeno: La exclusión o limitación de la influencia del O2 del
aire al trabajar y envasar rápidamente el material y en caso necesario con ayuda
del vacio o en atmósfera inerte representan medidas satisfactorias para mantener
ciertas frutas al estado lo más natural posible, especialmente en lo que se refiere a
textura y sabor. Para frutas destinadas a la congelación, se usa también azúcar y
jarabe para cubrir la superficie, retardando así la entrada del oxigeno atmosférico.
Los agentes quelantes, capaces de eliminar los átomos de cobre del centro activo
del enzima, y consecuentemente inactivarla, son inhibidores muy eficientes.
Pueden utilizarse el EDTA, pirofosfato, y especialmente el ácido cítrico, que
combina el efecto de la acidez con la capacidad secuestrante de metales.
Algunas otras sustancias, como el ácido benzoico y otros compuestos aromáticos,
actúan reduciendo la actividad del enzima al competir con los sustratos. Y, por
supuesto, la desnaturalización térmica, por ejemplo mediante escaldado con
vapor, es un sistema muy eficaz, cuando puede utilizarse.
III. PARTE EXPERIMENTAL
Tratamiento de los tejidos de manzana y su efecto en reacción de
pardeamiento
1) Utilizar cuarta parte de una manzana y cortarla en dos trozos. Desmenuza
uno de los trozos y ponerlo en un vidrio de reloj junto al trozo entero.
Comparar el pardeamiento que se produce en las dos muestras.
2) Cuando el trozo entero esté marrón, dividirlo en tres partes mediante rotura
y por corte. Observar el color del interior del trozo de manzana y hallar cual
pardea más rápidamente, sí la superficie rota o cortada.
3) Utilizando zumo de manzana: Poner 10mL en un tubo de ensayo y otros
10mL en una placa petri.
¿En cuál de las dos muestras se encontrará mayor grado de pardeamiento?
La alteración de la estructura celular de la manzana no alcanza más allá del
substrato, la reacción de los compuestos fenólicos se activa por contacto con
oxigeno atmosférico.
El efecto del calor en la reacción
Obtener zumo de manzana de la manera que se ha descrito. Poner
aproximadamente 10mL de zumo en cada uno de los tubos de ensayo A, B, C y D.
Tubo A.- Calentarlo a la llama del mechero y dejar que su contenido hierva
durante un minuto.
Tubo B.- Ponerlo en un baño de agua a 50ºC.
Tubo C.- Ponerlo en un baño de agua a 100ºC.
Tubo D.- Mantenerlo a la temperatura de la habitación.
Dar las razones por las que afirma que pardeamiento del zumo de manzana es
una reacción enzimático.
Poner a hervir un trozo de manzana durante un minuto, dejándolo después
expuesto al aire.
¿Cuál es la diferencia si se compara con una muestra que no ha sufrido la acción
del calor?
El efecto del pH
Utilizando trozos de manzana. Poner 5 trozos de manzana sobre vidrio de reloj y
empaparlos de una de las siguientes disoluciones:
A ácido cítrico al 1%
B ácido cítrico al 0.5%
C zumo de limón
D agua
E solución de carbonato de ácido de sodio al 1%
Dejarlos varias horas y comparar el pardeamiento que haya tenido lugar.
(El grado de reaccion alcanza su maximo con valores de pH entre 6 y 8. Con pH
menor que 3 se inhibe casi completamente la reacción)
El efecto de ácido ascórbico
El ácido ascórbico es antioxidante natural, razón por lo cual inhibe el
pardeamiento, pero llega un momento en que el mismo llega a oxidarse y de esta
manera se inutiliza su acción. Por esto, si se añade ácido ascórbico hay un retraso
en la aparición del pardeamiento. El retraso es aún mayor, consiguiendo una
concentración alta de ácido ascórbico en la tecnología de alimentos.
Poner 5 trozos de manzana sobre vidrios de reloj y tratar cada uno, con una de las
cinco soluciones siguientes:
A ácido ascórbico al 5%
B ácido ascórbico al 2.5%
C ácido ascórbico al 1%
D agua
E ácido clorhídrico 2M
Anotar el tiempo en que cualquier trozo llega a ponerse marrón que el trozo E.
Este actúa como testigo cuyo pardeamiento es imposible por la adición de ácido
clorhídrico 2M.
¿Por qué no se puede utilizar el ácido clorhídrico 2M para inhibir el pardeamiento
de las frutas?
IV. RESULTADOS Y OBSERVACIONES
Tratamiento de los tejidos de manzana y su efecto en reacción de
pardeamiento
¿En cuál de las dos muestras se encontrará mayor grado de pardeamiento?
Al romper parte de la manzana y cortar la otra parte con un cuchillo, se pudo
observar que la primera de estas comenzó a cambiar a un color marrón mas
rápido q la segunda.
El efecto del calor en la reacción
¿Cuál es la diferencia si se compara con una muestra que no ha sufrido la acción
del calor?
A medida que vamos incrementando la temperatura el pardeamiento es mas lento
con respecto a un trozo de manzana dejado a temperatura ambiente.
El efecto de ácido ascórbico
A medida que incrementamos la concentración de ácido ascórbico el
pardeamiento disminuye con respecto al tiempo.
¿Por qué no se puede utilizar el ácido clorhídrico 2M para inhibir el pardeamiento
de las frutas?
Porque el ácido clorhídrico degrada la materia orgánica y también es perjudicial
para el consumo humano.
V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
El pardeamiento enzimático se puede evitar impidiendo el contacto con el
oxígeno. Esto se hace sumergiendo en el agua y escaldando los productos
para inactivar las fenolasas. La adición de ácidos (cítricos o málicos por
ejemplo) hará que la encima no se encuentre en su pH óptimo de actuación.
Se pueden usar agentes secuestrantes ya que la enzimas tiene cobre en su
estructura por lo que sí lo queremos evitamos la acción de la fenolasa
aunque esta medida no la podemos utilizar en muchos casos.
El ácido ascórbico actúa de varias formas; por un lado gasta el oxígeno
porque se oxida la vitamina C al ser reductor, eliminando el oxígeno del
medio. Por otro lado reacciona con las ortoquinonas y desplaza la reacción
hacia la formación de orto-difenoles.
Procurar que las muestras de manzana no se oxiden rápidamente antes de
haber efectuado la experiencia ya que si esto sucede no podremos observar
los resultados.
VI. BIBLIOGRAFÍA
Dona B. Ott. Manual de laboratorio d los Alimentos.
http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/enzimas/tirosinasa.html
www.arrakis.es/~lluengo/pproteinas.html