reações de nitrosilação marcelo g. de oliveira prof. associado – instituto de química –...
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Reações de
Nitrosilação
Marcelo G. de Oliveira
Prof. Associado – Instituto de Química – UNICAMP
(e de Nitrosação
também)
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Células endoteliais
Hemácias
Células
musculares
lisas
Vaso sanguíneo
vasodilatação
Vasoconstrição
agregaçãoantiagregação
Fat. trombogênicos
Fat. anticoagulantesFat. mitogênicos
Inib. crescimento
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Vasodilatação produzida pelo NO endógeno
1987 - Ignarro et al. - Proc. Natl. Acad. Sci USA 84, 9265 EDRF = NO
1998 - Furchgot, Ignarro and Murad – Prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina
Ach +
CaCa2+
e-NOS
O2
+
L-Arginina
NO
+
L-Citrulina
NO
GC
GTP cGMP
Relaxamento
Células endoteliais Células musculares lisas
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SISTEMA DIGESTIVO
Promove a dilatação estomacalAtiva os movimentos peristálticos
NO
SISTEMA NERVOSO
NeurotransmissorInibição da contração da musculatura lisa
Plasticidade neuronalMemória de longo prazo
SISTEMA MUSCULAR
Regula o tônus muscularVasodilatação localizada
SISTEMA IMUNOLÓGICO
Agente bactericidaInibe a replicação de vírus
Destoi células tumorais
SISTEMA CIRCULATÓRIO
Vasodilatação de veias e artérias Controle da pressão sanguínea Liberação de O2 a partir da HbO2
Controle do fluxo sanguíneo nos rins
Funções bioquímicas do NO
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Oxido Nítrico
2 p
2 s
2 pzb
*z
bx y
*z y
2 s
s *
sb
N a t o m i c o r b i t a l O a t o m i c o r b i t a l
N O N O
Diagrama de Orbitais Moleculares do NO
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By: Steven Hunt, June 18, 1997
You've just cut your finger on the edge of a piece of paper. In a flash, you stick your finger in your mouth, thinking that will make it better. Well…your hunch is not that far off. In fact, licking your wounds is one of those instinctive things most people don't think about much, but according to researchers in Britain, it's not only instinctive. It has healing properties to boot.In the same way that dogs and other animals are often seen licking their wounds, humans too, it's been found, can do better by licking their injuries than by leaving them alone. Dr. Nigel Benjamin, a clinical pharmacologist with St. Bartholomew's and the London School of Medicine and Dentistry, has discovered that it all comes down to how saliva reacts with skin."We'd been looking at nitrite in saliva for some time," Benjamin states, "mainly because we'd been interested in nitric oxide and its effects in disease processes." That's because nitric oxide - the compound that results when saliva interacts with the skin - has for several years been known to play a role in the body's fight against germs. But Benjamin and his London colleagues were interested in finding out whether licking your wounds had any real effect on the healing process."We looked at the comparison of what happens when you use saliva to wet your skin compared to just normal saline," Benjamin explains. "And we found that the saliva produces loads of nitric oxide." With nearly 10 times the amount of nitric oxide on licked skin compared to non-licked skin, Benjamin says, "there is a definite function for this nitric oxide in order to protect us when we wound ourselves from contamination by unwanted bacteria."
Scientists discover a reason to lick your wounds
By: Steven Hunt, June 18, 1997
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Ações do NO no Sistema Imunológico
Macrófagos Neutrófilos
2NO + O2 = 2 NO2 = N2O3
N2O3 + H2O = 2 HNO2 = 2 NO2-- + 2 H+
NO3-
NO em excesso choque séptico
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AÇÃO CITOTÓXICA DO NO CONTRA BACTÉRIAS VÍRUS E CÉLULAS TUMORAIS
Inativação de enzimas:-do ciclo de Krebs-da síntese de DNA
-de funções mitocondriais
APOPTOSE NECROSE
NO
Reação com:
-Centros Fe-S (Fe4S4)
- RSH
- R-tirosila
Desaminação
do DNA
Oxidação de
membranas
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Fe - NO NO + Fe(II) ou Fe(III) (NITROSILAÇÃO)
R-SNOO2/Cu2+/O2
.-
NO + R-SH
(NITROSAÇÃO)
NO + R-NH2
O2/Cu2+/O2.-
R-NNO
NO = ligante nitrosila
CO = ligante carbonila
-SNO = NITROSOTIOL
-NNO = NITROSAMINA
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NO, Superóxido e Peroxinitrito
NO + O2.- ONOO-
NO O2.-
Oh NO !!
ONOO- em excesso choque séptico
ONOO- + H+ NO2. + OH.
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Ativação da Guanilato Ciclase solúvel:Uma reação de NITROSILAÇÃO
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ATEROSCLEROSE
DISFUNÇÃO
ENDOTELIAL
DISFUNÇÃO
ENDOTELIAL
Hipertensão
Oclusão arterialVasoespasmo
Falha na regulação da produção endógena de Óxido Nítrico (NO)
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Nitratos de
Isosorbida
[Fe(CN)5NO]2-
GC
GTP cGMP
Células Endoteliais Células musculares lisas
GTP cGMP
Relaxamento
Relaxamento
NO
NO
CH CH2
O
NO2
CH2
O
NO2
NO2
O
GC
NO
Doadores exógenos de NO
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Nitroprussiato de sódio
Shishido, SM, de Oliveira MG, Prog. React. Kinetic Mech. 26, 239, 2001
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II
+
e-
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NO NPS red
NO NPSCN NPS
CN NPS red 2089
[FeII(CN)5H2O]3-
2038
52
56
60
64
68
72
% T
rans
mitâ
ncia
2200 2150 2100 2050 2000 1950 1900 1850
Número de onda / cm-1-1
NPS + cisteina (pH 7.4)
Variação espectral no IV
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[FeII (CN)5NO+]2- + RS-
[FeII (CN)5H2O]3- + NO + 1/2 RSSR
(Aquoferrocianeto)
2038 cm-1
[FeI (CN)5NO+]3- + 1/2 RSSR
(NPS reduzido)
2089 cm-1
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300
0,1
0,2
0,3
Abs
orbâ
ncia
400 500 600 700 800
Comprimento de onda / nm
Espécie transiente
521
[FeII(CN)5H2O]3-
338
NPS + cisteina (pH 10)
Variação espectral (UV/VIS)
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N
Fe
CN
NC CN
CNNC
OSR
N
Fe
CN
NC CN
CNNC
O
SR
3
ADUTO INTERMEDIÁRIO NO
ATAQUE NUCLEOFÍLICO
DO ÂNION TIOLATO AO NO DO NPS
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MODELO ANIMAL
RATOS WISTAR: - Normotensos - Agudamente hipertensos (L-NAME)
Pressão arterial Média (MAP) (Artéria femural)Infusões intravenosas de:
NACNPS
+
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QUEDA DA PRESSÃO ARTERIAL MÉDIA (MAP)
APÓS A INFUSÃO DE NPS e (NPS + NAC)
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0 SNP SNP +NAC SNP SNP+NAC
*
M
AP
(m
mH
g)
Normotensive rats Hypertensive rats
Normotensos
hipertensos
Ricardo, KF, Shishido SM, de Oliveira, MG, Krieger, MH, Nitric Oxide Biology and Chemistry: 7, 57, 2002
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-S- H+
NO
------------ H2O-S•
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S-NITROSOTIOIS(RSNOs)
S-nitroso-L-cisteina
CS N
O
181 Å3
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Sintetizando S-nitrosotiois
NOgás Solução de tiól
ÃO ACONTECE NADA!!!N
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Oxido Nítrico
2 p
2 s
2 pzb
*z
bx y
*z y
2 s
s *
sb
N a t o m i c o r b i t a l O a t o m i c o r b i t a l
N O N O
Diagrama de Orbitais Moleculares do NO
NO + RSH RSNO + H+ + e-
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2 NO + O2 2 NO2 N2O4
NO
N2O3
O2N-NO O2N
- NO+
O2N
- NO+ + RS- H+ RS-NO + H+ NO2
-
S-NITROSAÇÃO DE TIOIS
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HO-••• NO+ + RS-•••H+
S-NITROSAÇÃO DE TIOISEM SOLUÇÃO AQUOSA
4NO + O2 + 4 RSH 4RSNO + 2 H2O
N2O3 + H2O 2 HNO2 2 HO- ••• N O+ 2H+ + 2NO2
-
RS-NO + H2O
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Sistema de nitrosação
PATENTE REQUERIDA (INPI, 2001)
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S-nitrosotiois: Transições eletrônicasC
S NO
nO (s)
nO* (a)nN* (a)
nN (s)
N atomic orbitals O atomic orbitals
nN*
(Anti)
nN*
(Syn)
*
250 300 350 400 450
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
Ab
sorb
an
ce
Wavelength (nm)
500 550 6000.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Wavelength (nm)
Ab
sorb
an
ce
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0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Ab
sorb
ân
cia
300 400 500 600
Comprimento de onda / nm
0.0
0.5
1.0
Ab
s.
em
=
545 n
m
0 50 100Tempo/ s
Controle da síntese de S-nitrosotiois por borbulhamento
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Estruturas dos S-nitrosotiois sintetizados
S-nitrosocisteina
(CisNO)
S-nitroso-N-acetilcisteina
(SNAC)
S-nitrosoglutationa
(GSNO)
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-60
-50
-40
-30
-20
-10
02.8 11 26 34 43 51 107 214 428 571 714 854
Dose (x10-2 mol/kg body wt)
M
AP
(m
mH
g)
Normotensive rats
-60
-50
-40
-30
-20
-10
02.8 11 26 51 107 214 428
Dose (x10-2 mol/kg body wt)
M
AP
(m
mH
g)
Hypertensive rats
Dose-resposta da PAM na administração de
SNAC em ratos
NORMOTENSOSAGUDAMENTE
HIPERTENSOS (L-NAME)
![Page 33: Reações de Nitrosilação Marcelo G. de Oliveira Prof. Associado – Instituto de Química – UNICAMP (e de Nitrosação também)](https://reader034.vdocuments.pub/reader034/viewer/2022052522/552fc10a497959413d8c0f8e/html5/thumbnails/33.jpg)
POTÊNCIA E DURAÇÃO DO EFEITO HIPOTENSOR DA SNAC E DO NPS EM
RATOS WISTAR NORMOTENSOS
Ricardo, K F, Shishido SM, de Oliveira, MG, Krieger, MH, Nitric Oxide Biol.and Chem. 7, 57 (2002)
10
8
6
4
2
0
(B)
SNP SNAC SNP SNAC
Tim
e (m
in)
MA
P (
mm
Hg)
SNP SNAC
-10
-20
-30*
(A)
PBS infusion PBS+MB infusion Azul de Met.
Potência
Duração do efeito
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Proteína
S- H+
NO
RS-NO
SNO
R-S H
S
![Page 35: Reações de Nitrosilação Marcelo G. de Oliveira Prof. Associado – Instituto de Química – UNICAMP (e de Nitrosação também)](https://reader034.vdocuments.pub/reader034/viewer/2022052522/552fc10a497959413d8c0f8e/html5/thumbnails/35.jpg)
Ratos Wistar
- Diabéticos (ob/ob)
- Nocaute iNOS (C57BL/6)
(controle + Dieta hipercolesterolêmica –24 semanas)
MODELO ANIMAL Efeito da administração de GSNO na nitrosação
do receptor de insulina
(Modelo de Resistência à Insulina)
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ATEROSCLEROSE
RESISTÊNCIA
À iNSULINA
RESISTÊNCIA
À iNSULINA
DIABETES TIPO 2
DISLIPIDEMIAHIPERTENSÃO
AUMENTO NA PRODUÇÃO DE iNOs
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Ligação da Insulina ao Receptor de insulina trans-membrana
Receptor de insulina
Membrana plasmática
Insulina
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Autofosforilação dos resíduos de tirosina do receptor de Insulina
Membrana plasmática
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Cadeia A da Insulina Cadeia B da Insulina
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Monômero da Insulina
![Page 41: Reações de Nitrosilação Marcelo G. de Oliveira Prof. Associado – Instituto de Química – UNICAMP (e de Nitrosação também)](https://reader034.vdocuments.pub/reader034/viewer/2022052522/552fc10a497959413d8c0f8e/html5/thumbnails/41.jpg)
Nitrosação da subunidade do Receptor de Insulina
RS-NO
-RSH -RS-NO
RS-H
S S
![Page 42: Reações de Nitrosilação Marcelo G. de Oliveira Prof. Associado – Instituto de Química – UNICAMP (e de Nitrosação também)](https://reader034.vdocuments.pub/reader034/viewer/2022052522/552fc10a497959413d8c0f8e/html5/thumbnails/42.jpg)
Detecção da nitrosação do receptor de insulina pelo
Método fluorimétrico DAN/NAT
2 (Receptor - S-NO) (Receptor- S – S - Receptor) + 2 NO
2 NO + O2 2 NO2- + H2O 2 HNO2
HgCl2
NH2
NH2
NO
NO2-
H2O
+
NH2
N
H
NO
NH2
N N OH2+
2,3 Diaminonaftaleno (DAN) - H2O
NN
NH2
+N
N
NH
2,3 naftotriazola (NAT) Intermediário I
HNO2
2,3 naftotriazol (NAT)
pH 1-2
30 min, 37C
pH 11-12
H+
excit = 375 nm
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Espectro de emissão do Naftotriazol
e curva de calibração com NO2-
Limite de detecção: < 5 nmol L-1
400 440 480 5200
100
200
300
400(B)(A)
In
tens
idad
e de
flu
ores
cênc
ia
Comprimento de onda / nm
0 100 200 300 400
0
200
400
600
800
[NaNO2] / nmolL
-1
Intensidade de fluorescência em = 407 nm
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420 480 5400
20
40
60
80
100
Ctr
HC
Adiposo
In
tens
idad
e de
flu
ores
cênc
ia
Comprimento de onda / nm420 480 540
HC
CtrCtr
Hepático
420 480 540
HC
Muscular
Detecção da nitrosação dos substratos de receptores de
Insulina (IRS1) em imunoprecipitados (ratos ob/ob)
Carvalho-Filho, M.A., Ueno, M., Seabra, A.B., Carvalheira, B.C., de Oliveira, M.G., Veloso, L.ª, Curi, R., Saad, M.J.ª, J. Biol Chem. 2004 - Submetido
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Efeitos da GSNO na: atividade da tirosina-quinase,
captação de glicose e síntese de glicogênio
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COLABORAÇÕES
FCM/UNICAMP IB/UNICAMP
Prof. Mário Saad Profa. Marta H. Krieger
Prof. Francisco R.M. Laurindo
INCOR/USP
ICB/USP
Profa. Sílvia R.B.Uliana
UNIV. EDINBURGOProf. Richard Weller
FM/USPProfa. Claudia P.M.S de Oliveira