reações ag-ac interaÇÕes antÍgeno-anticorpo testes ... · um substrato incolor em um produto...
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03/06/2015
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Reações Ag-Ac
Testes Sorológicos /
Técnicas de Imunodiagnóstico
Prof. Helio José Montassier
INTERAÇÕES
ANTÍGENO-ANTICORPO
Detecção, quantificação e
caracterização de
anticorpos (Acs) ou de
antígenos (Ags) e seu uso
como ferramenta para
pesquisa e diagnóstico
IMUNODIAGNÓSTICO: Diagnóstico laboratorial por
meio de técnicas imunológicas
SERVE PARA PROCURAR (DETECTAR / IDENTIFICAR /
MENSURAR):- Anticorpos ou Antígenos no organismo
vertebrado suspeito de estar infectado com um determinado
agente infeccioso, usando-se técnicas sorológicas de
Precipitação, Aglutinação, Fixação de complemento,
Neutralização ou Imunoensaios com Acs ou Ags
marcados que utilizam sinalizadores da interação Ag-Ac com
conjugados ligantes, como Imunofluorescência,
Radioimunoensaio, Imunoenzimáticos, Imunofluorimétricos e
Quimioluminiscência .
Interação Ag-Ac: Conceito Inicial
É uma associação bimolecular semelhante à
interação de enzimas com seus substratos ou de
hormônios com seus receptores, com uma
distinção bem evidente o Ac não provoca nenhuma
alteração química irreversível na molécula de Ag,
podendo, portanto, o produto formado (Ag-Ac) se
dissociar nos seus 2 componentes; isto é, Ag e Ac
livres /solução/suspensão.
Ag + Ac AgAc (Imunecomplexos)
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INTERAÇÕES Ag-Ac
Reações reversíveis.
Ligações não covalentes:
-Pontes de hidrogênio
-Interações hidrofóbicas
-Interações de Van der Waals
-Ligações iônicas
RESPOSTA DE ANTICORPOS
Especificidade Habilidade do Ac distinguir seu imunógeno de outros Ag.
Quantidade N° de células B x taxa de síntese do Ac x persistência após sua produção.
Isotipo Determina a persistência (meia vida in vivo diferente).
A composição determina a função dos Ac e os locais onde são encontrados.
Afinidade Força de ligação do Ag com o Ac, em um único sítio. Quanto maior a afinidade entre Ac e Ag, menos Ac será necessário.
Avidez: força total de ligação, nos dois sítios.
Reações Cruzadas: É a habilidade de uma população de moléculas de Acs reagirem com mais de um Ag
Avidez x Afinidade Reatividade Cruzada entre Ag-Ac
• É a habilidade de um Ac reagir através de seu
parátopo com mais que um determinante antigênico.
• É a habilidade de uma população de moléculas de
Acs reagirem com mais de um Ag
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MÉTODOS SOROLÓGICOS
1) Reagentes não marcados
• Reação de precipitação
• Reação de aglutinação
2) Reagentes marcados
• RIA
• ELISA
• Imunofluorescência
• Western Blotting
• Testes Imunocromatográficos
MÉTODOS
PRECIPITAÇÃO - Imunodifusão dupla
- Imunodifusão radial
- Imunoeletroforese
AGLUTINAÇÃO - Aglutinação direta e indireta
- Inibição da aglutinação
- Teste de Coombs
IMUNOENSAIOS - RIA
- ELISA
- Imunofluorescência e Citometria de Fluxo
- Western Blotting
- Testes Imunocromatográficos
APLICAÇÕES
- Pesquisa
- Diagnóstico
- Soroepidemiologia
PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO
Precipitação: Formação de complexos Ag/Ac.
Aglutinação: É o agrupamento de partículas antigênicas após a interação com Acs específicos, usualmente por moléculas de Acs que se ligam a Ags na superfície de partículas adjacentes.
As reações de precipitação e de aglutinação decorrem, respectivamente da ligação entre o Ac e Ag solúveis ou particulados.
REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO
Interação entre Acs [IgG(*) e IgM(-)] e Ags solúveis
Ac precisa ser bivalente ou c/ valência maior
Ag precisa ser bi ou polivalente
A reação pode ser afetada pelo n° de sítios de ligação que cada Ac possui para seu Ag VALÊNCIA
PRECIPITADO
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É importante levar-se em conta como ocorre a
ligação Ag-Ac em diferentes concentrações
dos mesmos. Observe abaixo: TÉCNICAS DE PRECIPITAÇÃO EM GEL
IMUNODIFUSÃO
IMUNODIFUSÃO DUPLA
As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação:
Pode ser visualizada pós lavagem do gel , para remoção das proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com corante
Radial & Double Immunodiffusion
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Permite a quantificação do antígeno ou do anticorpo.
O processo continua até ser atingida a zona de equivalência, com os complexos precipitando-se em um anel (halo) em torno do orifício.
IMUNODIFUSÃO RADIAL
Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica.
As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus PM e cargas elétricas.
Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde.
Ag e Ac formam arcos de precipitação.
IMUNOELETROFORESE
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Ac + Ag multivalente particulado
Título: maior diluição que ainda causa aglutinação (semi-quantitativo)
Pó-zona: excesso de Ac
Potencial Zeta: alguns Ag podem apresentar carga elétrica (repulsão)
Agregação visível de
partículas = Eritrócitos,
bactérias, fungos e látex
REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO
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2) Reagente (anticorpo anti A, B):
AGLUTINAÇÃO DIRETA
1) Amostra de sangue na placa teste:
Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO)
Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação
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3) Controle negativo:
4) Mistura-se:
AGLUTINAÇÃO DIRETA
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5) Leitura do resultado:
Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação
visível (aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como
ilustrado acima.
AGLUTINAÇÃO DIRETA
Hemaglutinação
p/ determinação
de grupos
sanguíneos A,
B e O.
TESTE DE COOMBS
Ac antiimunoglobulinas (Robert
Coombs);
DHRN – mãe produz IgG anti-Rh;
Não aglutinam os eritrócitos;
Direto: Ac ligados aos
eritrócitos fetais;
Indireto: Ac anti-Rh não
aglutinantes no soro materno.
Permite detectar
incompatibilidades Rh, prevenindo
contra DHRN.
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Teste de aglutinação quantitativa
Título: recíproca da > diluição com resultado +
Efeito Prozona
Aglutinação / Hemaglutinação
Definição – teste de aglutinação feito com um antígeno solúvel adsorvido a uma partícula (por ex. Cels./hemácias ou partículas de látex)
Aplicações
– Medida de anticorpos para antígenos solúveis (por ex. Ags sols. do Toxoplasma gondii)
Aglutinação Passiva /Hemaglutinação
(+)
(-)
AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA)
Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de
Chagas:
• As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi (ligação
covalente) e então distribuídas nos poços da placa.
• O soro teste e os controles positivos e negativos,
devidamente diluídos, são adicionados aos poços da
referida placa.
• Se houver Ac específico contra o Ag, as hemácias se
aglutinam e formam uma camada no fundo do poço.
Quando não existe Ac específico, as células formam um
botão no fundo do poço.
Aglutinação Positiva
Negativa
Ag solúveis associados a outras superfícies
(Partículas de látex ou superfície de hemácias)
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Exemplo: presença de hCG na urina (gravidez)
INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO
Resultado negativo:
(ausência de hCG na
urina).
Ocorre aglutinação,
pois os anticorpos
anti-hCG não são
bloqueados na
incubação inicial,
porque não havia o
hormônio na urina.
Livres, podem
aglutinar as partículas
revestidas de hCG.
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-As infecções bacterianas frequentemente induzem a
produção de Acs séricos específicos para Ags de
superfície das Bactérias.
-A presença de tais Acs pode ser detectada pelas
reações de aglutinação bacteriana.
-Os títulos dos Acs séricos de um indivíduo suspeito
é definido como a recíproca da maior diluição do
soro que produz uma reação positiva de aglutinação.
-O título aglutinante de um soro pode ser usado para
o diagnóstico de infecções bacterianas.
Aglutinação Bacteriana
Aglutinação Bacteriana
Reagentes marcados (enzimas,
fluorocromos, isótopos)
Tipos: - RIA
- ELISA
- IFA / CITOMETRIA DE FLUXO
- WESTERN BLOTTING
- Testes Imunocromatográficos
IMUNOENSAIOS
Princípio da técnica:
Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente)
a uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por
radiações UV, emite luz no espectro visível.
Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo
conjugado pode ser usado para detectar um determinado antígeno e
vice-versa.
A reação é feita em lâminas de microscopia (um pouco mais finas
que as comuns) e a observação tem lugar num microcópio com luz UV
(microscópio de fluorescência).
Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína –
FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT).
Tipos: direta, indireta ou saduíche.
IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)
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REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA
REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA
IFA direta:
Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes,
em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células
tumorais.
IFA indireta:
Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença
de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto-
imunes.
É uma técnica onde se consegue alta sensibilidade (fluorescência é mais
intensa) e especificidade.
APLICAÇÃO DA IMUNOFLUORESCÊNCIA REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA
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REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA
Vantagens: limiar de detecção; específica; reprodutível;
simples execução; determinação de classes e subclasses de
anticorpos
Desvantagens: microscópio de fluorescência; diminuição da
fluorescência sob irradiação; subjetividade na leitura;
ausência de automação
Ferramenta que detecta e quantifica células individuais marcadas
por fluorocromos, passando em uma corrente através de um
feixe de Laser.
Separa as células por fluorescência ativada.
Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo diferente.
É um teste qualitativo e quantitativo.
APLICAÇÕES
Tipo de população/subpop. de linfócitos/
leucócitos;
Quantidade, tamanho, granulosidade;
Isolamento de populações celulares;
Monitoramento Cels TCD4 / CD8 - HIV
CITOMETRIA DE FLUXO
Identificação e separação de células baseadas na dispersão de luz e
fluorescência sob feixe de laser
Estudo de populações de leucócitos luz dispersa tamanho e
forma da célula
Identificação de populações e/ou subpopulações de linfócitos T e B
FACS (fluorescence-activated cell sorter) separação de uma única
célula
Barrientos et al., 2000
CITOMETRIA DE FLUXO / APLICAÇÕES:
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CITOMETRIA DE FLUXO – Esquema de
Funcionamento da Técnica
CITOMETRIA DE FLUXO – PREPARO
DA AMOSTRA
CITOMETRIA DE FLUXO – PREPARO
DA AMOSTRA CITOMETRIA DE FLUXO – RESULTADOS
Gating strategy to define lymphocyte subsets. (i) Histogram (univariate) plot of CD3 expression;
this one-dimensional graph corresponds to a typical bar chart and is called “histogram” in flow
cytometry. (ii) Pseudocolor plot of CD3 versus CD4. This display gives a better view on the
distribution of CD3 expression than the histogram, in particular for **CD3 low expressing cells; note
both axes are logarithmic, unlike the linear axes of scatter plots in Figure 2. (iii) Cartoon detailing
interpretation of quadrant gates of (ii). CD3+CD4+ cells are displayed in the top right quadrant (46.2%
of lymphocytes). CD, cluster of differentiation.
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IMUNOHISTOQUÍMICA / IMUNOCITOQUÍMICA
Detecção e localização de antígenos celulares/teciduais
Anticorpos conjugados com enzimas conversão de substrato
incolor em produto colorido (deposição pode ser observada
diretamente ao microscópio óptico)
Enzimas mais utilizadas: Peroxidase; Fosfatase Alcalina, -
Galactosidase e Glicose Oxidase
Método direto Acs primários conjugados (detecção de antígenos)
Método indireto Acs secundários conjugados (detecção de
antígenos ou anticorpos)
Desvantagens: atividade enzimática endógena, armazenamento
inadequado dos conjugados
TESTE DE IMUNOPEROXIDASE
Como são detectados / mensurados os níveis
de Anticorpos em Fluidos Biológicos?
TÉCNICAS DE ELISA
Ensaio Imunoadsorvente
Ligado à Enzima - ELISA
O teste detecta, identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um
dos dois conjugados com enzimas.
O produto final corado surge por ação da enzima que converte
um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato
alterado pela enzima induz mudança de cor de uma substância
indicadora).
A quantidade de Ag ou Ac produto final corado, através
de leitura em fotocolorímetro.
Principais tipos de ELISA: indireto, sanduíche, competição e
captura.
Fosfatase alcalina
Peroxidase
B-galactosidase
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Para que o ELISA é usado:-
-Mensurar os níveis de Acs específicos contra um
determinado Ag e/ou microrganismo.
-Detectar / Identificar vírus (Ags)
-Mensurar hormônios
-Mensurar marcadores de reações inflamatórias
(citocinas, proteínas de fase aguda)
TIPOS DE ELISA: Direto e Indireto
PLACA
UTILIZADA
ELISA Indireto
ELISA Direto ou Sanduíche
?
?
COMPETITIVE ELISA – Ab Detection
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COMPETITIVE ELISA – Ag Detection
( - )
(+)
TESTES DE ELISA
Aplicações do ELISA:
Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e
de Pesquisa
Vantagens:
Teste de alta sensibilidade
Permite quantificar Ag ou Ac das amostras
Seguros e de baixo custo
RADIOIMUNOENSAIO - RIA Marcações:
I125: emite raios gama
H3: raios beta
Reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade (em torno de 10-12g)
Desvantagem a manipulação de isótopo radioativo.
Aplicações:
Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios,
proteínas séricas, drogas, vitaminas e Ac. Pesquisa
WESTERN BLOTTING
Eletroforese de
proteínas.
Identifica
antígenos ou
anticorpos.
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WESTERN BLOTTING WESTERN BLOTTING
TESTE DE IMUNOCROMATOGRAFIA / IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA
TESTE DE IMUNOCROMATOGRAFIA / IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA
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