Real-Time PCR

Trend, tool, technic

20044055 이규석

20074022 김궁

목차

1.Real time pcr 소개

2.Real time pcr 응용

endpoint detection method (agarose gel electrophoresis)와

반대로

각 PCR 단계에서 방출되는 fluorescence를 측정

Real-Time PCR

Ct : Threshold Cycle

(증폭이시작되는 Cycle)

dRn : Passive Dye (ROX)와

Reporter dye의 차이

Rn : Reporter dye의 signal 수치

•PCR산물을 형광물질을 이용 - 실시간으로 모니터링,

측정

•PCR에 의해서 증폭이 시작되는 시점을 이용한 분석

Real-time PCR의 원리

* 비특이적 증폭에 의한 영향이 없음

* 증폭이 실시간으로 측정

*생성물의 post-PCR processing이 불필요-(high throughput, low contamination risk)

* 신속 (30 minutes to 2 hours)

* 전통적인 PCR보다 RNA 시료가 1/1000배 이하로필요

* 높은 특이성, 고감도, 높은 재현성

*전통적인 PCR에 비해 경제적

Real-time PCR의 장점

Real-time PCR의 단점

* 복합적인 기능을 수행할 수 없다.

* PCR 을 준비함에 있어 높은 기술력과지원을 요구로 한다.

* PCR 장치의 가격이 매우 높다

Real-Time PCR PCR

세밀함 High Low

특수성 High

-특별한 probe 사용Low

-오직 크기만 구별한다

실시간 결과 Yes

-특별한 형광물질을 통한No

-EtBr staining

검출 방법 특벼란 probe를 이용한 형광물질 검출

Agarose gel

Electrophoresis

검출범위 넓은범위 좁은범위

반응시간 1시간내외 3~5시간

Real-time PCR vs. Conventional PCR

Advantage of Real-Time PCR

Primer 설계를 위한 조건

-표적 DNA서열에 안정되게 annealing 할 수있어야한다.

-PCR 반응 효율이 좋아야 한다.

- 특이성이 높아야 한다 (template DNA 상에mispriming 이 없어야 한다.

Real time PCR을 통한 검출방법

-Interchelating (SYBR green 1) 을 이용한검출 방법

-Probe(Taqman probe)를 통한 방법

Real time PCR 의 검출방법의선택

-real time PCR에서는 PCR 증폭산물을 형광을 통해검출한다. 검출방법은 크게 interchelating 법과 probe를이용하는 2가지 방법이 있다. Interchelating 법은double strand DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별로PROBE를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를구축할 수 있다는 장점이 있는 반면 검출 특이성은

그다지 높지 않다. 형광표식 PROBE를 이용하는 방법은비용은 많이 들지만 검출 특이성이 높아 비슷한 서열까지도구별해서 검출 할 수 있다. 검출방법은 실험목적에 따라서선택 가능하다

Interchelating (SYBR Green)

-SYBR Green 1는 double strand DNA에 결합하여 형광을 나타내는 시약이다.

-SBYR Green 1 시약은 pcr 반응으로합성된 double strand DNA에 결합하여형광을 발하며 이 형광강도를 검출하여증폭산물의 생성량을 측정할 수 있다.

*분석함에 있어서 특별히 probe를 기초로한분석이 필요가 없을경우

*Probe로 분석하기 이전에 일반적인 전사의screening 이 필요할 경우

SYBR Green을 선택해야 할경우

SYBR Green를선택하지 않아야 할 경우

*복합 적인 반응을 기대 할경우

* 거의 드문 전사의 확장

*낮은 수준의 병원체 검출

Taqman probe 법-5’ 말단은 형광물질로 3’말단은 quencher 물질로 수식한oligonucleotide(taqman probe)를 pcr 반응액에첨가하는 방법이다 taqman probe는 annealing step 에서template DNA에 특이적으로 HYBRIDIZE 하지만, probe 상에 quencher(억제자)에 의해 형광 발색이억제된다. Extention 반응시에 taq DNA polymerase 가 갖는 5’3’ exonuclease 활성으로 template에hybridize 한 taqman probe가 분해되어 형광색소가probe에 의한 억제가 해제되어 형광을 나타낸다.

Real time pcr의 한계

-대규모의발현을 분석하는과정에서는시간과경비 측면에서불리하다.

--검출능력을충분히 활용하기위해서는조직세포가아닌 단일세포수준의유전자발현 프로파일작성이필요하며 .

이를위해별도의 세포분리 기술을사용하고있는 실정이다

Real-Time PCR의 경향

-Realtime PCR의 검출한계가 점점높아지고 있어서 picogram 단위의시료를 사용하여도 분석이가능해 지고 있다.

-pubmed 에서 qPCR관련 논문들이매년 급속도로 늘고 있는 걸로보아서 real time PCR 연구가급속도로 성장하고 있다

Nanopore DNA sequencing

Nanopore DNA sequencing 의 장점

-형성된 나노포어를 통해 이동함으로써 DNA base를 직접적으로 확인할 수가있다.

-같은 정보를 얻기위해서 걸리는 시간이 수일 수시간 으로 짧아 졌다

-경제적으로도 저렴하다.

발전 가능성

- 암치료의 부분에서도 암의 발전과 관련된DNA 변형과 같은 것도 nanopore의 전기적 신호를 통해 알아낼 수가 있을 것이다.

Lab – on – a – chip

랩 온어 칩미소한 하나의 칩 위에 분석을 위해서, 미량의생체 시료의 채취 운반 처리 측정하기 위한 마이크로 유체소자(마이크로 밸브, 마이크로 펌프, 마이크로 채널, 마이크로 필터, 혼합기 등), 항원이나 유전자와 같은 생물분자를 이동조작하기 위한 바이오 필터, 시료를 분석 감지하기 위한 반응기 및 센서(면역센서, 생화학센서 등), 마이크로 유체 소자를 구동시키기 위한 엑츄에이터, 주변 회로부 등의 소자를MEMS공정을 이용하여 집적화 시킨 작은 화학/생물 마이크로 프로세서이다. 즉, 수 ㎠ 정도되는 하나의 칩 위에서 생체 시료의 전처리 과정, 운송, 제어, 분석과 모두 일어나게 하는 것.한마디로 하나의 실험실에서 하는 실험과정을칩위에서 모두 해결하는 것.

Lab-on-a-chip의 응용분야

◎ 질병 진단 : 의료◎ 신약물질 스크리닝 : 제약◎ 신약물질의 타겟 발굴 : 의료, 제약◎ 독성시험 : 제약, 식품, 화장품◎ 약리, 약효시험 : 제약◎ 환경오염물질(예: 다이옥신 등) 탐지 : 환경, 식품◎ 독성물질 탐지(예: 신경가스 등) : 환경◎ 바이러스 검출 : 환경, 식품

마이크로미터 이하의 단일생체분자의 형상이나 이들 분자의 실시간 다이나믹스를측정하여 효소중합연쇄반응(PCR) 없이도 마이크로이하의 생체시료에 대해 분자수준에서 검출하여 질병을 진단할 수 있는 응용가능성을 보여 주었다

[Qpcr의 의학적 응용분야]

-신종플루

-Real-time PCR을 이용한 원유시료 유래

황색포도상구균의 신속 검출

신종플루 에서의 real time pcr의 이용

인플루엔자 바이러스는 RNA 바이러스이기 때문에

그 바이러스를 검출하기 위해서는 RNA를 DNA로

변화하는 Reverse Transcriptase를 사용해야 하고,

그 양을 측정하기 위해서는 또는 빠른 측정을

위해서는 Real –Time PCR을 사용해야 하기

때문이다.

Real-time PCR을 이용한 원유시료 유래 황색포도상구균의 신속 검출

감사합니다