reālā laika pcr
DESCRIPTION
Reālā laika PCR. MSc.biol. Laila Zepa 2014. PCR. Interesējošā DNS tiek savairota tik lielā daudzumā, ka piemaisījumi netraucē izpēti. Var pavairot DNS fragmentu no dažiem bp līdz veseliem genomiem un vēl vairāk. PCR reakcijas sastāvs. Paraugs (pavairojamā DNS). - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
![Page 1: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/1.jpg)
Reālā laika PCR
MSc.biol. Laila Zepa2014
![Page 2: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/2.jpg)
Interesējošā DNS tiek savairota tik lielā daudzumā, ka piemaisījumi netraucē izpēti.
Var pavairot DNS fragmentu no dažiem bp līdz veseliem genomiem un vēl vairāk.
PCR
![Page 3: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/3.jpg)
PCR reakcijas sastāvs
Paraugs (pavairojamā DNS).
dNTPi (nukleīnskābju sastāvdaļas- timīns [T],
citozīns [C], guanīns [G] un adenīns [A]).
Polimerāze (enzīms, kas replicē DNS/RNS).
Praimeri (īsi DNS fragmenti, kas palīdz
polimerāzei sākt DNS sintēzi).
Sāļi (darbojas kā reakcijas stabilizatori un katalizatori).
![Page 4: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/4.jpg)
PCR aparatūra
![Page 5: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/5.jpg)
PCR reakcijas norise
Denaturācija (kausēšana)Paaugstinātā to atdalās DNS dubultspirāles pavedieni.
Praimeru piesaistīšanās
Polimerāzes piesaistīšanās un jaunā pavediena sintēze
![Page 6: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/6.jpg)
DNS paraugs
1. cikls
2. cikls
4. cikls
3. cikls
mērķa fragments
22
23
24
25
![Page 7: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/7.jpg)
Cikls
Kopiju skaits
Cikls
Kopiju skaits
Cikls Kopiju skaits
1 4 13 16384 25 67108864
2 8 14 32768 26 134217728
3 16 15 65536 27 268435456
4 32 16 131072 28 536870912
5 64 17 262144 29 1073741824
6 128 18 524288 30 2147483648
7 256 19 1048576 31 4294967296
8 512 20 2097152 32 8589934592
9 1024 21 4194304 33 17179869184
10 2048 22 8388608 34 34359738368
11 4096 23 16777216 356871947673
6
12 8192 24 33554432
![Page 8: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/8.jpg)
PCR pielietojums
kvalitatīva DNS pavairošana;
infekciju slimību diagnostika;
tiesu medicīna; mutāciju detektēšana; ĢMO detektēšana; ...
![Page 9: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/9.jpg)
PCR produkta vizualizēšana / kvantificēšana agarozes gēlā
Vāja precizitāte (etīdija bromīda krāsošana spēj izšķirt tikai lielas daudzuma atšķirības).
Relatīvi zema jutība (nepieciešams liels daudzums izejmateriāla).
Šaurs dinamiskais diapazons (mērķa molekulu izejas koncentrācijas izmaiņu diapazons, kurā iegūtais rezultāts ir precīzs / ticams (<2log)).
Iegūtais rezultāts nav kvantitatīvs (ir datorprogrammas, kas spēj zonu spilgtumu pārvērst skaitļos, bet ar zemu precizitāti).
![Page 10: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/10.jpg)
PCR fāzes
![Page 11: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/11.jpg)
Reālā laika PCR (qPCR) – kādēļ? Nepieciešamība kvantitatīvi raksturot konkrētas mRNS (kDNS) vai gDNS daudzumu paraugos
Teorētiski pastāv kvantitatīva sakarība starp mērķa parauga daudzumu reakcijas sākumā un PCR produkta daudzumu katrā ciklā
![Page 12: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/12.jpg)
Reālā laika PCR
Vienlaicīga DNS fragmenta amplifikācija un daudzuma noteikšana
DNS daudzums tiek mērīts pēc katra cikla
Fluorescentas DNS krāsvielas/iezīmes Fluorescences pieaugums ir
proporcionāls izveidoto amplikonu daudzumam
![Page 13: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/13.jpg)
Amplifikācijas grafiks
![Page 14: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/14.jpg)
Reālā laika PCR (qPCR)
![Page 15: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/15.jpg)
Optiskā sistēma
Gaismas avots Filtrs Detektors
Enerģija, kas ierosina fluoroforu
Atlasa ierosināšanai un detekcijai piemēroto viļņa garumu
Pārvērš fluorescences emitēto gaismu elektriskā signālā
• Halogēna vai ksenona lampas• Lāzeri• Gaismu izstarojošas diodes
• Šaura diapazona filtri• Plaša diapazona filtri
• Fotopavairotāja signālu caurule• Lādiņa saites• Fotodiodes
![Page 16: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/16.jpg)
DNS
+
Praimeri+
MasterMix(buferis (ar MgCl2), dNTPi, polimerāze, H2O, fluorescentā
iezīme)
qPCR reakcija(fluorescences detekcija)
datu analīze
qPCR reakcijas sastāvs
![Page 17: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/17.jpg)
Fluorescējošās iezīmes
Hidrolīzes zondes
TaqMan Molekulārās bākas Molekulārie
skorpioni
Hibridizācijas zondes
Light Cycler
Fluorescējošās krāsvielas
Oxazole Yellow
SYBR green PicoGreen
![Page 18: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/18.jpg)
Fluorescējošās iezīmes
Hidrolīzes zondes
TaqMan Molekulārās bākas Molekulārie
skorpioni
Hibridizācijas zondes
Light Cycler
Fluorescējošās krāsvielas
Oxazole Yellow
SYBR green PicoGreen
![Page 19: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/19.jpg)
SYBR GREEN (fluorescējoša krāsviela) dsDNS saistoša krāsviela.
Emitē spēcīgu fluorescējošu signālu, kad saistījusies ar dsDNS.
Detektē sākot no 1000 molekulām.
Izmanto:
Analīzēs, kur nav vajadzīgs tik liels specifiskums, kā zondu analīzēs.
Vispārējai reakcijas efektivitātes pārbaudei pirms zondu analīzes.
![Page 20: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/20.jpg)
SYBR GREEN (fluorescējoša krāsviela)
Nespecifiska saistīšanās - var saistīties pie jebkuras dsDNS (praimeru dimēri, nespecifiski amplificētas dsDNS).
Reakcijas beigās nepieciešama disociācijas līknes analīze (lai konstatētu iespējamu nespecifisku saistīšanos).
Garāks fragments rada spēcīgāku signālu.
![Page 21: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/21.jpg)
Disociācija Katrs paraugs tiek uzkarsēts ik pa 0.1°C un tad mērīta fluorescence.
SYBR Green krāsa spīd tikai tad, kad ir saistījusies ar dsDNS, tādēļ pie noteiktas T° fluorescence pazūd, jo fragments būs sadalījies par ssDNS.
Vienāda garuma fragmenti disociēs pie vienas un tās pašas T°, kas būs novērojams kā krass fluorescences kritums.
Dažāda garuma fragmenti disociēs pie dažādām T° un būs redzami vairāki fluorescences līmeņa kritumi, kas liecinās par nespecifiska fragmenta veidošanos reakcijā un ka tādēļ rezultāts nav pilnīgi ticams.
![Page 22: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/22.jpg)
Flu
ore
scen
ces
inte
nsi
tāte
s ap
gri
ezt
a v
ērt
ība
Disociācija
![Page 23: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/23.jpg)
FRET princips Fluorescējošās iezīmes
Hidrolīzes zondes
TaqMan Molekulārās bākas Molekulārie
skorpioni
Hibridizācijas zondes
Light Cycler
Fluorescējošās krāsvielas
Oxazole Yellow
SYBR green PicoGreen
![Page 24: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/24.jpg)
FRET princips
• FRET– pēc apstarošanas ierosinātā molekula lielāko daļu enerģijas atdod blakus esošajai molekulai, kuras ierosināšanas enerģija ir ļoti līdzīga pirmās molekulas izdalītajai.
• Nepieciešami nelieli attālumi (pm – nm) starp donoru un akceptoru.
![Page 25: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/25.jpg)
Fluorescējošās iezīmes
Hidrolīzes zondes
TaqMan Molekulārās bākas Molekulārie
skorpioni
Hibridizācijas zondes
Light Cycler
Fluorescējošās krāsvielas
Oxazole Yellow
SYBR green PicoGreen
![Page 26: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/26.jpg)
TaqMan (hidrolīzes zondes)
20-30 bp gari oligonukleotīdi (ssDNS)
5’ galā ir fluorescenta iezīme – reportieris (R)
3’ galā ir fluorescences dzēsējs (Q)
![Page 27: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/27.jpg)
TaqMan (hidrolīzes zondes)
Kušana (95°C)
![Page 28: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/28.jpg)
TaqMan (hidrolīzes zondes)
Kušana (95°C)
![Page 29: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/29.jpg)
TaqMan (hidrolīzes zondes)
Kušana (95°C)
![Page 30: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/30.jpg)
TaqMan (hidrolīzes zondes)
Zondes piesaistīšanās (60°C)
![Page 31: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/31.jpg)
TaqMan (hidrolīzes zondes)
Praimeru piesaistīšanās (60°C)
![Page 32: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/32.jpg)
TaqMan (hidrolīzes zondes)
Zondes piesaistīšanās (60°C)
![Page 33: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/33.jpg)
TaqMan (hidrolīzes zondes)
DNS sintēze un zondes šķelšana (60°C)
![Page 34: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/34.jpg)
TaqMan (hidrolīzes zondes)
DNS sintēze un zondes šķelšana (60°C)
![Page 35: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/35.jpg)
TaqMan (hidrolīzes zondes)
DNS sintēze un zondes šķelšana (60°C)
![Page 36: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/36.jpg)
TaqMan (hidrolīzes zondes)
DNS sintēze un zondes šķelšana (60°C)
![Page 37: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/37.jpg)
TaqMan (hidrolīzes zondes)
DNS sintēze un zondes šķelšana (60°C)
![Page 38: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/38.jpg)
TaqMan (hidrolīzes zondes)
DNS sintēze un zondes šķelšana (60°C)
![Page 39: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/39.jpg)
5’galā ir fluorescenta iezīme – reportieris (R).
3’ galā fluorescences dzēsējs (Q).
Dzēsējs tuvāk reportierim.
Mērķa sekvencei komplementāra tikai zondes vidusdaļa.
Terminālie 10 – 15 nukleotīdi ir savstarpēji komplementāri.
Zondei kniepadatas struktūra.
Molekulārās bākas (hidrolīzes zondes)
![Page 40: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/40.jpg)
Molekulārās bākas (hidrolīzes zondes)
![Page 41: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/41.jpg)
Fluorescējošās iezīmes
Hidrolīzes zondes
TaqMan Molekulārās bākas Molekulārie
skorpioni
Hibridizācijas zondes
Light Cycler
Fluorescējošās krāsvielas
Oxazole Yellow
SYBR green PicoGreen
![Page 42: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/42.jpg)
Tās ir vienīgās zondes, kuras lietojot, tieši mēra FRET.
Reakcijas maisījumā ir 2 veidu zondes:
donori, kam 3’ gals ir iezīmēts ar reportieri (FAM) – molekulas ir ierosinātas,
akceptori , 5’ gals ir iezīmēts ar akceptora molekulu (TAMRA, ROX).
Hibridizācijas zondes
![Page 43: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/43.jpg)
Uz Real Time PCR balstītas metodes Absolūtā kvantificēšana
Relatīvā kvantificēšana
Genotipēšana (kvalitatīvi dati)
CNV detekcija (kvantitatīvi dati)
Plus/mīnus detekcija (kvalitatīvi dati)
Reversā transkripcija (kvantitatīvi dati)
![Page 44: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/44.jpg)
Real Time PCR vs PCR
![Page 45: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/45.jpg)
HRM (high resolution meltcurve)
Kombinē fluorescentu krāsu, kušanas līknes un statistiskās analīzes principus
dsDNS kušana atkarīga no GC satura, fragmenta garuma un sekvences
Vienas bāzes izmaiņa ir detektējama
Pielieto: gēnu skenēšana, genotipēšana, DNS metilācijas analīze, DNS fingerprintings
![Page 46: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/46.jpg)
HRM uzdevums
Sekvence, kura satur mutantu nukleotīdu (G) kūst augstākā temperatūrā, nekā normālā sekvence.
![Page 47: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/47.jpg)
PCR SNP genotipēšanas dati Tiek izmantotas 2
TaqMan zondes iezīmētas ar dažādām fluorescentajām krāsvielām.
Atkarībā no SNP alēles viena zonde pie DNS saistās labāk nekā otra.
Fluorescences intensitātes attiecība ļauj automātiski noteikt genotipu
![Page 48: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/48.jpg)
PCR SNP genotipēšanas dati
![Page 49: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/49.jpg)
qPCR dati
Slieksnis (treshold) - fluorescences intensitātes robeža, pēc kuras reakcija pāriet eksponenciālajā fāzē
![Page 50: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/50.jpg)
Ct (Cycle threshold) –cikls, pie kura PCR amplifikācija ir sasniegusi eksponenciālo fāzi.
qPCR dati
![Page 51: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/51.jpg)
Atšķaidījumi (1/3)
qPCR reakcijas efektivitātes noteikšana
![Page 52: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/52.jpg)
Ja reakcija ir 100% efektīva – jeb, ja katrā ciklā eksponenciālajā fāzē molekulu daudzums divkāršojas, - slīpumam jābūt apm -3,33
qPCR reakcijas efektivitātes noteikšana
![Page 53: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/53.jpg)
Negatīvā kontrole
Negatīvās kontroles tika aizmirstas - nevaram novērtēt rezultāta autentiskumu, lai gan duplikāti ir ļoti labi.
![Page 54: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/54.jpg)
Negatīvā kontrole
Negatīvās kontroles nav negatīvas - students ir sašķaudījis stobriņos – rezultāti nav interpretējami.
Arī gēna duplikāti dod atšķirīgus rezultātus (ievieš kļūdu).
![Page 55: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/55.jpg)
Negatīvā kontrole
Negatīvās kontroles nav negatīvas - students ir sašķaudījis stobriņos, bet tomēr daudz mazāk, jo to fluorescence sasniedz slieksni daudz vēlāk nekā īstajā paraugā (normāli būtu, ja tās būtu detektējamas pie kāda 37 cikla, pie 29. tomēr nav labi).Duplikāti ir ļoti labi.
![Page 56: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/56.jpg)
qPCR datiKvantificēšanas stratēģijas
Absolūtā RelatīvāMērķis: noteikt cik molekulu (pg) specifiskās DNS/mRNS ir paraugā
Līdzekļi: standartlīkne, kas iegūta no DNS atšķaidījumiem ar precīzi zināmu koncentrāciju
Rezultāts: mRNS,DNS kopijas/g audu,/ml asiņu u.c.
Pielietojums: ĢMO, vīrusu titra noteikšana u.c.
Mērķis: salīdzināt gēna ekspresijas līmeni dažādos paraugos vai noteikt cik reižu atšķiras divu gēnu ekspresija paraugos
Līdzekļi: mērķgēna ekspresijas līmeņa normalizēšana pret references gēna/-u ekspresijas līmeni
Rezultāts: X-reižu atšķirīgs ekspresijas līmenis dažādos paraugos
Pielietojums: gēnu ekspresijas pētījumi
![Page 57: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/57.jpg)
qPCR datiRelatīvā kvantificēšana
Salīdzinošā Ct metode (delta delta Ct metode)
1) Ct mērķa gēns – Ct references gēns = deltaCt
2) Delta delta Ct = delta Ct paraugam – delta Ct kalibrācijas paraugam
3) Reižu atšķirības = 2-delta delta Ct
![Page 58: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/58.jpg)
Real Time PCR +1. Nav nepieciešama fragmentu pēcreakcijas
vizualizācija gēlā.
2. Datorizēta datu analīze
3. Īsāks analīzes laiks (2 soļu reakcija)
4. Pietiek ar 1000X mazāk (k,g)DNS (ļoti jutīga)
5. Kvantitatīvi ļoti precīza - spēj detektēt 1.1X mērķmolekulu daudzuma atšķirības
6. Plašs dinamiskais diapazons – līdz pat 10 log
7. Specifiskā produkta amplifikācijas pārbaude ar disociācijas līknes metodi (precīza izšķirtspēja)
![Page 59: Reālā laika PCR](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081417/56813760550346895d9ef031/html5/thumbnails/59.jpg)
1. Dārgāka aparatūra
2. Dārgāki reaģenti
3. Vairāku gēnu amplificēšanai vienlaicīgi nepieciešams rūpīgs plānojums un bieži neveiksmīgs rezultāts
4. Reakcijas sagatavošana prasa lielāku uzmanību un rūpību (īpaši kvantificēšanas eksperimentiem)
Real Time PCR -