PRACTICA N 1Mtodo de conteo directo: Mtodo de BreedI. INTRODUCCINLos recuentos microscpicos directos permiten determinar el nmero de clulas microbianas, por observacin directa en el microscopio. Presentan una gran ventaja ya que la muestra puede utilizarse tal cual, (si es lquida como leche o cultivos puros en medio lquido), o puede prepararse una dilucin tal como se realiza para otros mtodos de recuento. Se basa en contar microrganismos en una cantidad conocida de muestra utilizando frotis coloreados, cmaras del tipo de las de contar glbulos, o las especialmente diseadas para contar hongos en alimentos como la cmara de Howard. Se determina el nmero TOTAL de clulas presentes (VIABLES Y NO VIABLES). Ocasionalmente se pueden utilizar colorantes que indiquen diferentes estados metablicos de las clulas. Por ejemplo en un recuento en cmara de un cultivo de levaduras con azul de metileno, se pueden distinguir las clulas VIABLES (no absorben el colorante, se vern transparentes) de las NO VIABLES (absorben el colorante y se vern azules). El mtodo de Breed es un mtodo de recuento directo bastante simple, fcil y eficaz a pesar de ser un mtodo antiguo (1911). Este mtodo de Conteo Directo al Microscopio (CMD) es usado mayoritariamente para el diagnstico microbiolgico de la leche y se lo considera un mtodo rpido para estimar el grado de contaminacin bacteriano de la leche pero que no est diseado para el conteo rutinario de la leche cruda ya que el conteo en placa es ms preciso, ms prctico y ms barato que un conteo directo ejecutado adecuadamente. Si el mtodo se contemplara como un mtodo para estimar la calidad de la leche con propsito de pago, su uso sera limitado para pequeo nmero de muestras con alto contenido bacteriano (2.3 x 106 ufc/mL) debido a la insensibilidad del mtodo. El mtodo de Breed tambin es usado para diagnstico de mastitis bovina (diagnstico subclnico). En sta, el coloreado con azul de metileno nos permite ver adems leucocitos y clulas somticas, tambin se pueden usar coloraciones por los mtodos de LevowitzWeber o BroadhurstPaley que permiten observar especficamente clulas somticas en leche. II. OBJETIVOS Hacer un recuento toral de microorganismos que hay en una muestra.III. MATERIALES Y MTODOSA. Materiales Microscopio calibrado Lminas portaobjeto Lmina patrn de Breed Pipeta calibrada Colorante de Gram o Azul de metileno Muestra Aceite de cedroB. Mtodos1. Estandarizacin del Equipo:a. Se coloca la lmina patrn que tiene una tabla macromtrica marcada, que tiene divisiones de 0.1 a 0.01 m; con el objetivo de inmersin, proceder as: Medir el campo en mm. hasta el tercer decimal. Determinar el rea del campo en mm2; aplicando la frmula de superficie del crculo: Ao = r2b. Clculo del factor microscpico: Se mide con exactitud el rea del microscopio en mm2. Luego se divide 100 entre el rea encontrada (X = 100 x Acampo). Luego, para hallar el factor microscpico se multiplica este valor hallado por 100 (FM = X x 100) Se indica que los microscopios tiene un factor de microscopio de 300,000 a 600,000.2. Preparacin de la Pelcula: a. Se lava la lmina, desengrasndola. Una vez hecho se coloca sobre la lmina patrn, en este caso al carecer de ella se coloca una lmina de cartn que tenga una cuadrado de 1 cm2.b. Enseguida colocar la muestra previamente homogenizada (20 veces).c. Con la pipeta calibrada se coloca 0.01 ml. de la muestra en la lmina. Esta se extiende por toda el rea del cuadrado de la lmina patrn. d. Luego debe hacerse el secado lento para evitar el resquebrajamiento de la pelcula; en especial cuando la muestra se trata de leche.e. Teir la pelcula por el Mtodo de Gram3. Examen Microscpico: a. Contar en el microscopio los microorganismos por campo utilizando lente de inmersin. Se cuenta a lo largo de toda la pelcula. b. Se cuenta como mnimo 20 campos y un mximo 100 campos. c. Cuando se cuentan los microorganismos se deben de contar como uno solo: aquellas bacterias que estn solas, los agregados, los grupos, los cocos o bacilos en cadenas. 4. Cmputo y clculo del microorganismo: a. Se contar un mnimo de 10 campos. b. Luego se sacar un promedio del nmero de microorganismos por campo y se multiplica por el factor microscpico. c. Luego, como la muestra usada fue de 0.01 mL, multiplicaremos el resultado anterior obtenido por 100 para pasarlo a la misma unidad (mL).IV. RESULTADOS Clculo del promedio de microorganismo por campo:# de Campo12345678910# de Mos.100981328510111596118110115Promedio de microrganismos por campo (n):

Clculo del rea del microscopio:Radio hallado: 50 m

Clculo del factor microscpico:rea del cuadrado= 1 cm2 = 108 m2

Clculo del nmero de clulas por mL:Volumen de la muestra (V)= 0,01 mL

Figura N 1: Observacin microscpica de la muestra sometida a tincin GRAM

V. COMENTARIOSEl mtodo de Breed es un mtodo rpido, econmico y prctico. A pesar de esto, se presenta mucho error, debido a la subjetividad que presenta; tambin se usa mayormente para muestras lquidas ms no para slida, porque puede causar confusin.Se debe tener mucho cuidado en cuanto a la limpieza y esterilidad de los materiales a usar para obtener lo ms ptimos resultados.VI. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS DAVILA F., Nuria y J. E., HERNANDEZ G. (2006) Mtodos de ensayos rpidos de deteccin de microorganismos en la leche. Revista Electrnica de Veterinaria REDVET, Vol. VII, N 07, obtenido el 24 de enero de 2016 en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n070706/070603.pdf OLIVAS E., ALARCN L. (2004) Manual de Prcticas de Microbiologa Bsica y Microbiologa de Alimentos: Programa de Nutricin. Universidad Autnoma de Ciudad Jurez. Mxico.