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Isolamento e Identificação da Caseína

Da Silva, Celso Júlio Página I

RESUMO

A caseína pode ser definida como a fracção da proteína do leite que sofre precipitação em pH =

4,6 a 20ºC, enquanto que o restante das proteínas do leite que não sofrem precipitação é chamado

colectivamente de proteínas do soro, são classificadas de acordo com a semelhança de suas

estruturas primárias (sequencia de aminoácidos), nas seguintes famílias: α-S1, α-S2, β e k-

caseínas, representando aproximadamente 38, 10, 35 e 15% respectivamente do total de caseína,

perfazendo quase 80% das proteínas totais do leite (3,2%). As caseínas têm maior interesse

económico que as proteínas do soro do leite (proteínas solúveis), pois, estão relacionadas com

rendimento do produto lácteo.

Observando-se que em 50.42g do leite submetida ao método de precipitação obtém-se 3.2g de

caseína, o que corresponde a 6.35% do teor de caseína. A luz dos resultados danos uma visão

que a percentagem em peso corresponde, de certo modo, ao valor teórico do conteúdo em

caseína no leite (80% do total no leite de vaca e 40% no humano).


Da Silva, Celso Júlio Página II

ÍNDICE

1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................................... 1

1.1. OBJECTIVOS...................................................................................................................... 2

1.1.1. Geral ............................................................................................................................. 2

1.1.2. Especifico ..................................................................................................................... 2

2. PARTE EXPERIMENTAL ..................................................................................................... 3

2.1. Materiais e Equipamentos ................................................................................................ 3

2.2. Procedimentos .................................................................................................................. 3

3. RESULTADOS E INTERPRETAÇÃO .................................................................................. 4

3.1. Equação para o Cálculo do Percentagem da caseína no leite ........................................... 4

3.2. ANALISE QUÍMICA DA CASEÍNA ................................................................................. 5

3.3. Resultados dos testes............................................................................................................ 5

3.4. OBSERVAÇÕES DOS TESTES ........................................................................................ 7

4. CONCLUSÕES ....................................................................................................................... 9

BIBLIOGRAFIA .......................................................................................................................... 10


Da Silva, Celso Júlio Página 1

1. INTRODUÇÃO

As proteínas são biomoléculas mais abundantes possuindo inúmeras funções, dentre elas a

indispensável função catalisadora exercida pelas enzimas, sem a qual não seria possível a

maioria das reacções celulares. São formadas por aminoácidos ligados por ligações químicas

extremamente fortes entre seus grupamentos funcionais amino (NH2) e ácido carboxílico

(COOH), as ligações peptídicas (VIEIRA, 2003).

As proteínas do leite podem ser classificadas em dois grandes grupos, as caseínas e as proteínas

do soro. A caseína pode ser definida como a fracção da proteína do leite que sofre precipitação

em pH = 4,6 a 20ºC, enquanto que o restante das proteínas do leite que não sofrem precipitação é

chamado colectivamente de proteínas do soro (OLIVEIRA, 2010). Não coagulam pelo calor

mais sim pela acção da renina, uma enzima encontrada no suco gástrico e pela acção de ácidos,

encontra-se na forma de sal de cálcio coloidal, juntamente com a gordura dão a cor branca do

leite.

O leite da vaca conte seis tipos de proteínas: 4 tipos de caseínas e 2 tipos de proteínas do soro.

Actualmente, as caseínas são classificadas de acordo com a semelhança de suas estruturas

primárias (sequencia de aminoácidos), nas seguintes famílias: α-S1, α-S2, β e k-caseínas,

representando aproximadamente 38, 10, 35 e 15% respectivamente do total de caseína,

perfazendo quase 80% das proteínas totais do leite (3,2%). As caseínas têm maior interesse

económico que as proteínas do soro do leite (proteínas solúveis), pois, estão relacionadas com

rendimento do produto lácteo, notadamente queijo. Ao redor de 95% da caseína do leite existe na

forma de partículas de dimensões coloidais, conhecidas como micelas (MARTINS, 2008).

A outra fracção compreende a proteína do soro de leite: 2 tipos (α-Lactoglobulina e β-

Lactoglobulina). A caseína é a principal proteína existente no leite. A estrutura da caseína é

ilustrada na Figura 1.



Figura 1. Desenho esquemático da micela de caseína (MARTINS, 2008).

Existem vários processos para a determinação da proteína no leite, dos quais se destacam:

Método de Kjeldahl, método de Formol (titulação), método semi-automático (negro de amido

“pro Milk”), método automático (por infravermelhos “Milk- scan”) (DIAS, 2010).

1.1. OBJECTIVOS

1.1.1. Geral

Conhecer o teor pelo método de precipitação da caseína no leite

1.1.2. Especifico

Isolar e Identificar a caseína do leite;

Confrontar os resultados obtidos dos testes com os expostos na literatura.



2. PARTE EXPERIMENTAL

2.1. Materiais e Equipamentos

Tabela 1: Materiais, Equipamentos, Reagentes e Amostra.

Espátula Papel de Filtro Erlenmeyer de

250mL

Vareta

de Vidro

Termómetro Vidro de

relógio

Cadinho de

Porcelana

Balança

analítica

Manta eléctrica Amostra de alimento – Leite em Pó.

Ácido acético Acetona Água

2.2. Procedimentos

Em um Erlenmeyer de 250mL, introduziu-se 50g de leite e 125mL de água e aqueceu-se

o frasco em banho de água, agitando a solução com uma vareta de vidro;

Quando a temperatura do banho alcançou cerca de 40ºc, removeu-se o frasco do banho e

adicionou-se 10 gotas de ácido acético 10% agitando. Observou-se a formação de

precipitado;

Filtrou-se o precipitado a vácuo e lavou-se com um volume de água e em seguida

transferiu-se para um frasco vazio;

Adicionou-se 25mL de acetona ao frasco, após a agitação da mistura por 5min, deixou-se

o precipitado em repouso e em seguida decantou-se o líquido, o qual contém as gorduras

e albuminas para um Béquer;

Ao resíduo adicionou-se 25mL de acetona e após a agitação da mistura por 5min,

colectou-se o sólido por filtração a vácuo e transferiu-se para um vidro de relógio, o qual

deixou-se a secar ao ar durante 2-3 dias.



3. RESULTADOS E INTERPRETAÇÃO

3.1. Equação para o Cálculo do Percentagem da caseína no leite

Para o cálculo do teor em cinzas usa-se a fórmula dada abaixo

Onde: W1 – Massa da Amostra

W2 – Massa do Papel de Filtro Vazio

W3 – Massa do Papel de Filtro com a Amostra

Tabela 2. Massa da amostra, massa do papel de filtro vazio, papel de filtro com a amostra e massa da amostra.

Peso (g)

W1 W2 W3 Massa da Caseína

50.42 2.42 5.62 3.2

Usando os dados da tabela 2 e a fórmula dada acima, calculou-se a percentagem da caseína no

leite.

Sabendo que as proteínas correspondem a 11,5% da composição do leite humano e a 34% do

Leite de vaca, observou-se que em 50.42g do leite submetida ao método de precipitação obtém-

se 3.2g de caseína, o que corresponde a 6.35% do teor de caseína.

Na base dos resultados, pode-se observar que os resultados obtidos, danos uma

visão que a percentagem em peso corresponde, de certo modo, ao valor teórico do conteúdo em

caseína no leite (80% do total no leite de vaca e 40% no humano).



3.2. ANALISE QUÍMICA DA CASEÍNA

Teste de Biureto

Este teste é utilizada para verificar a presença de peptídios com 3 ou mais resíduos de

aminoácidos. As proteínas ou peptídeos, quando tratados por uma solução diluída de sulfato de

cobre em meio alcalino, apresentam uma coloração púrpura característica.

Reacção da Ninidrina

Este teste é utilizada para verificar a presença de aminas em solução, dando positivo para

proteínas, peptídeos, aminoácidos, aminas primárias e amónia.

Teste de Metais Pesados

Este procedimento é realizado para verificar a influência de sais de metais pesados e de ácidos

fortes sobre a solubilidade da proteína, bem como a influência do pH sobre a carga líquida da

molécula polipeptídica.

Teste de xantoproteinas

É um teste para tirosina e triptofano ou, proteínas que contenham estes aminoácidos baseados na

reacção de nitração dos anéis aromáticos pelo acido nítrico aromático.

3.3. Resultados dos testes

1. Teste de biureto

Colocou-se 15 gotas das substâncias abaixa em cinco tubos de ensaios limpos e rotulados,

adicionou-se 5 gotas de NaOH a 10% e 2 gotas de CuSO4 em cada um dos tubos de

ensaio e observou-se:

a) Glicina 2% (incolor) a solução tornou-se azul clara;

b) Gelatina 2% (Rosa clara) a solução tornou-se Azul;

c) Albumina 2% (incolor) a solução tornou-se violeta;

d) Caseína isolada (1-100mg/ml de H2O) a solução tornou-se azul clara;

e) Tirosina 1% (incolor) a solução tornou-se azul clara.

O teste de biureto é positivo com a formação da cor violeta, portanto, glicina, gelatina, caseína

isolada e tirosina tiveram testes negativos enquanto que a albumina tive teste positivos.



2. Teste de Ninidrina

Colocou-se 15 gotas de cada uma das seguintes substâncias em cinco tubos de ensaios

limpos e rotulados e adicionou-se 5 gotas de ninidrina e aqueceu-se em banho de água em

ebulição durante 5min, e observou-se:

f) Glicina 2% incolor - com a adição da ninidrina a solução tomou a cor Violeta

g) Gelatina 2% Rosa clara - com adição da ninidrina a solução tomou a cor vermelho

h) Albumina 2% incolor - com adição da ninidrina a solução tomou a cor Violeta

i) Caseína isolada (1-100mg/mL de H2O) Turva – com adição da ninidrina a solução

tomou a cor Azul Claro

j) Tirosina 1% incolor – com adição da ninidrina a solução tomou a cor Violeta

O teste de ninidrina é positivo com a formação da cor azulada para aminoácidos em geral,

portanto, glicina, gelatina, albumina e tirosina tiveram testes negativos enquanto que a caseína

isolada teve testes positivos.

3. Teste de iões de metais pesados

Colocou-se 2mL de leite em 3 tubos de ensaio rotulados, adicionou-se algumas gotas de

cada uma das soluções dos seguintes iões, na seguinte ordem:

a) Pb2+

como Pb(NO3)2 no tubo 1 e observou-se a formação de precipitado branco

gelatinoso.

b) Hg2+

como Hg(NO3)2 no tubo 2 e observou-se a formação de precipitado branco

gelatinoso.

c) Na+ como NaNO2 no tubo 3 e observou-se que não ouve a formação de precipitado.

O teste de metais pesados é positivo com a formação de precipitado, portanto o tubo 1 e 2

tiveram testes positivos.



4. Teste de Xantoproteínas

Colocou-se 15 gotas de uma das seguintes substâncias em cinco tubos de ensaio limpos e

rotulados e a cada, adicionou-se 10 gotas de HNO3 concentrado com agitação. Aqueceu-

se cuidadosamente em banho de água quente e observou-se:

a) Glicina 2% com adição de HNO3 a solução tornou incolor, assim como com o

aquecimento a solução também tornou incolor

b) Gelatina 2% com adição de HNO3 a solução tornou incolor, assim como com o

aquecimento a solução também tornou incolor

c) Albumina 2% com adição de HNO3 a solução tomou a cor Vermelha e formando

precipitado, o mesmo se verificou com o aquecimento

d) Caseína isolada (1-100mg/mL de H2O) a solução com adição de HNO3 ficou turva,

mais com o aquecimento formou precipitado amarelo claro

e) Tirosina 1% com adição de HNO3 a solução tomou a cor amarela, o mesmo verificou-

se com o aquecimento

O teste de xantoproteina é positivo com a formação da cor amarela, portanto, glicina e gelatina

tiveram testes negativos enquanto que a albumina, caseína e Tirosina tiveram testes positivos.

3.4. OBSERVAÇÕES DOS TESTES

No teste de biureto, o NaOH, presente em solução, conduz a cadeia peptídica a um desarranjo

em sua estrutura tridimensional. Os íons Cu2+ presentes em solução, originados do sulfato de

cobre, formam um complexo com os aminoácidos, estabelecendo interacções com os átomos de

nitrogénio da cadeia peptídica. Este teste foi positivo para proteínas e peptídeos com três ou mais

resíduos de aminoácidos. O teste também é positivo para substâncias que contenham dois grupos

carbamínicos (-OC-NH2-) ligados directamente ou através de um único átomo de carbono ou

nitrogénio.

No teste de ninidrina, o aquecimento da solução de proteínas desestabelece a estrutura

tridimensional do peptídeo. A ninidrina reage com o grupamento amina (sendo positiva para

proteínas, peptídeos, aminoácidos, aminas primárias e amônia) presente nos aminoácidos,

formando como produto final um complexo de coloração azul-violeta



No teste de metais pesados, os catiões de metais pesados como Hg2+, Pb2+, formam

precipitados insolúveis de proteínas, denominados de acordo com o elemento formador

(exemplo: proteinato de mercúrio, proteinato de chumbo, etc.). Essa precipitação é mais intensa

quando o pH está acima do ponto isoelétrico (pI). Isso porque, acima do pI, a carga líquida sobre

a proteína é negativo, favorecendo a interacção com os catiões provenientes do sal. Quando a

proteína está abaixo do seu pI, a carga líquida total da molécula é positiva.

Teste de xantoproteínas,



4. CONCLUSÕES

A luz do proposto foi possível determinar o teor da caseína na amostra de leite em pó pelo

método de precipitação. O teor experimental da caseína obtido desta experiência encontra-se

dentro do intervalo do teor teórico, entretanto, pode-se assim dizer que, foi alcançado o objectivo

preconizado.

Com relação ao teste de análise química da caseína conclui-se que é possível determinar a

presença de proteínas em solução com o auxílio de algumas teste químicas conhecidas, bem

como a natureza de alguns aminoácidos presentes nestas proteínas. É possível identificar as

proteínas como moléculas carregadas e reconhecer os factores ligados a solubilidade das

proteínas em água.



BIBLIOGRAFIA

Dias, Ana M. C, (2010), Análises para o controlo da qualidade ao leite. Curso de

Especialização Tecnológica em Qualidade Alimentar. Instituto Politécnico de Coimbra,

Escola Superior Agrária, Coimbra, Portugal, p20;

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leiteiros do estado de São Paulo. Universidade de São Paulo, Escola Superior de

Agricultura “ Luiz de Queiroz”, Piracicaba, Brasil, p18-20;

Oliveira, Raphael R. (2010). Aplicação da Espectroscopia de Infravermelho Próximo

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Graduação em Ciência Animal, Universidade Federal de Goiás, Escola de Veterinária,

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Vieira, Ricardo (2003). Fundamentos de Bioquímica, Belém-Pará, Textos Didácticos, p4;

Walstra, P & Jenness, R.(1984). Dairy chemistry and phisics. New York, John Wiley &

Sons, p423.

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