1. IntroduoA microbiologia uma cincia que visa no somente o estudo dos microrganismos, mas como tambm de suas atividades. Denomina-se microrganismo as Bactrias, Fungos (bolores, leveduras e orelha de pau), Vrus (limiar da vida), Algas e Protozorios. Reside tambm como rea de interesse ao microbiologista o estudo da distribuio natural do microrganismo, suas relaes entre espcies, alm de suas relaes com outros seres vivos, podendo causar efeitos benficos, indiferentes ou prejudiciais, bem como s alteraes fsicas e qumicas que podem provocar ao meio ambiente.Apresentando uma estrutura celular bastante simples, as bactrias diferem das clulas animais e vegetais, pois elas tendem a no apresentam as mesmas caractersticas, podendo assim apresentar diversas variaes em sua forma, tamanho, virulncia, etc. Podem ser encontradas de maneira isolada ou agrupadas em colnias (fig.01), sendo uma forma de vida unicelular e procarionte, com muitas delas possuindo organelas de locomoo, como flagelos e clios. Como s vezes necessitam se manter vivas em ambientes inadequados sua condio at poderem encontrar uma melhor condio de sobrevivncia, elas podem possuir esporos (formaes que conferem resistncia s bactrias). As que no possuem esporos so denominadas de vegetativas. Um dos motivos do estudo das bactrias por que muitas delas so causadores de inmeras doenas, como ttano, febre tifoide, pneumonia, sfilis, tuberculose, etc. A infeco pode ocorrer de diversas formas, como por exemplo, atravs do contato, do ar, alimentos, gua, etc.Figura 01 Colnia de bactrias em placa de petri.

Uma tcnica de extrema importncia em microbiologia a assepsia e a esterilizao dos meios, solues e dos materiais que se usam, sejam de vidro ou metal. Considera-se que um meio est estreo quando o mesmo no contm nenhuma forma viva de microrganismo. Uma das tcnicas que se pode usar para se obter a esterilizao a autoclavao, que utiliza do aparelho (fig.02) para esterilizar os objetos atravs do calor mido sob presso. J a assepsia o que se denomina as condies, gestos e atitudes que servem para manterem o estado de ausncia de microrganismos contaminantes no meio em que atua.Figura 02 Autoclave.

Cultivo de bactrias feito nos denominados Meios de Cultura, que so uma juno de substncias fornecedoras de nutrientes que sero necessrias para que o microrganismo cresa fora de seu meio natural. J que os microrganismos possuem uma variada diversidade metablica, necessria a existncia de igualmente variados tipos de meios de cultura, para que possam satisfazer as diversas exigncias nutricionais. Mas s fornecer nutrientes no o suficiente para manter o microrganismo vivo, havendo tambm a necessidade de que o meio nutritivo oferea pH, presso osmtica, umidade, temperatura, atmosfera (aerbia, microaerbia ou anaerbia), dentre outras caractersticas favorveis para a sobrevivncia da espcie.Podem se classificar os meus de cultura quanto ao seu estado fsico, sendo eles slidos, semisslidos e lquidos. Inicialmente, os nicos meios nutritivos existentes para cultivo de microrganismos eram lquidos. Foi apenas em 1880 que Robert Koch (fig.03) e sua equipe introduziram os meios de cultura slidos, os quais permitiram o estudo de espcies isoladas (culturas puras), separando-as de espcies contaminantes. Quando contm agentes solidificantes, principalmente o gar, denominado slido. J semisslidos so aqueles cuja quantidade de gar ou gelatina d apenas uma consistncia intermediria, permitindo o crescimento de microrganismos em tenses variadas de oxignio. Os lquidos, por sua vez, no apresentam em sua composio nenhum agente solidificante, tendo a consistncia de caldo, muito utilizado para ativao das culturas, repiques de microrganismos, provas bioqumicas, dentre outras anlises. Figura 03 Robert Koch.

O que fornece as primeiras informaes para que um microrganismo seja identificado o seu crescimento em diferentes meios, portanto uma etapa de extrema importncia para a anlise de microrganismos. Para que os resultados sejam satisfatrios e que no haja contaminao das amostras, existem cuidados e procedimentos que se devem tomar nos mais diversos casos: quando distribuir o meio antes de autoclavar, os tubos no precisam estar esterilizados; quando distribuir o meio aps a autoclavao, os tubos, frascos, placas, pipetas e vidrarias ou materiais auxiliares obrigatoriamente devem ser estreis e os meios devem ser autoclavados com as tampas semiabertas, para que a esterilizao seja por igual em todo o contedo dos tubos - tampas fechadas no permitem a entrada do vapor. Estes passos, se seguidos corretamente e feitos com cuidado, iro garantir os melhores resultados possveis.

2. Objetivo

Se familiarizar e treinar na prtica as diversas tcnicas que englobam as analise de microrganismos, como esterilizao, o preparo de meios de cultura, utilizao de manobras asspticas para o manuseio de amostras com bactrias e seus respectivos procedimentos de inoculao, para posteriormente observar o crescimento bacteriano.

3. Materiais e Reagentes

1. 2. Agar nutritivo;3. gua destilada;4. Ala de inoculao;5. Algodo;6. Autoclave;7. Barbante;8. Bico de Bunsen;9. Caldo nutritivo;10. Cepa: Serratia marcescens;11. Erlenmeyer;12. Tubos de ensaio.13. Estante para tubo de ensaio;14. Jornal;15. Lata de alumnio;16. Luva;17. Pra de suco;18. Pina;19. Pipeta graduada;

4. Procedimentos

Para evitar acidentes laboratoriais, conseguir com xito uma cultura pura e evitar possveis contaminaes dos meios de cultura com microrganismos presentes no meio ambiente, utilizam-se de tcnicas de esterilizao e manobras asspticas, que so indispensveis para a deteco de microrganismos. Para tanto, seguiram-se as regras as seguintes regras de assepsia e segurana: A ala de platina deve ser flambada antes e depois de qualquer operao de inoculao. Para tanto, devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada na chama de 2 a 3 vezes. A posio correta para a flambagem da ala que a mesma faa um ngulo de 45 em relao mesa de trabalho. Antes de retirar o material para a elaborao da inoculao deve-se esfriar a ala na parede interna do tubo ou na tampa da placa de Petri, evitando a morte dos microrganismos devido alta temperatura da ala aps esterilizao; Para a inoculao em tubos de ensaio, deve-se flambar rapidamente a boca dos mesmos logo aps a retirada do tampo de algodo (boneca). Este dever ser mantido seguro pelo dedo mnimo da mo que est segurando a ala. Aps a retirada do material com a ala, flambar novamente a boca do tubo e recolocar o tampo de algodo. Flambar a ala aps o uso. No pousar os tampes sobre a bancada; As pipetas utilizadas em Microbiologia so previamente embrulhadas em jornal e esterilizadas. Para uso, torcer o papel na regio central da pipeta, retirar primeiramente o papel na parte superior e depois a inferior (correspondente ponta da pipeta). Esta sequncia evita que a pipeta seja contaminada pelas mos do operador. Uma vez usada, a pipeta deve ser colocada dentro de uma cuba de vidro ou plstico, contendo desinfetante; As placas de Petri devero ser abertas prxima ao bico de Bunsen para evitar contaminao com germes do ar. Uma vez inoculadas, as placas devem ser incubadas em estufas com tampa voltada para baixo.

Para o cumprimento do objetivo proposto, foi necessria a realizao de 02 prticas para alcanar o resultado final.

4.1 Prtica I: Esterilizao

Primeiramente, desinfetou-se a superfcie da bancada de trabalho com lcool 70% antes e aps o trabalho prtico; Preparou-se uma rolha de algodo (tambm chamada de "boneca") que tampasse completamente a boca do erlemeyer, para evitar que o interior deste entrasse em contato com o ar externo; Envolveu-se toda a parte superior do erlenmeyer com jornal, e amarrou-se com um barbante. Ento, identificou-se apropriadamente, anotando no jornal o nome do grupo e a data do experimento; Vedou-se a parte superior das pipetas com algodo; Envolveu-se as pipetas com jornal, amarrando com barbante e identificando o lado da ponta, o nome do grupo, o volume da pipeta e a data do experimento; Formou-se duas colunas com as placas, com 5 de cada lado, envolvendo-as a seguir com jornal, identificando a parte superior, o nome do grupo e a data do experimento; Levou-se todas as vidrarias previamente vedadas e envolvidas no jornal para autoclave; Autoclavaram-se os materiais por aproximadamente 20 minutos;

4.2 Prtica II: Manobras Asspticas e Inoculao de Microrganismos

Com cuidado, acendeu-se o bico de Bunsen para dar incio as quatro manobras asspticas que foram realizadas, atentando-se as regras de assepsia e segurana dispostas acima.I. Manobra 01: Transferncia de caldo nutritivo estril para tubo vazio estril.Primeiramente, identificaram-se os tubos utilizados com: nome dos responsveis, data do preparo, turma e numerao dos tubos (o tubo 1 continha caldo nutritivo puro; o tubo 2 estava vazio; o tubo 3 continha o caldo nutritivo recebe a bactria; o tubo 4 possui caldo nutritivo com gar, tornando-o slido). Em seguida, ligou-se o bico de bnsen, de forma que se tivesse uma chama de cor azul (local de maior taxa de energia). Ao redor da chama determina-se um rea chamada de zona estril de segurana (por volta de 15cm). Utilizando uma das pipetas, e trabalhando dentro da zona de proteo da chama, pipetou-se 2mL de cada um dos caldos nutritivos para os tubos vazios. importante ressaltar que a parte superior dos tubos devem ser flambados toda vez que os mesmos forem abertos e fechados. Em seguida os tubos foram fechados e ambos colocados na estufa 36C por 48h para que posteriormente pudesse ser observado o crescimento bacteriano.As pipetas aps serem utilizadas foram levadas uma soluo de limpeza, a qual utilizada para preencher a pipeta repetidas vezes e depois deixada de molho dentro da prpria soluo, onde posteriormente ser levada autoclavao e lavagem.

II. Manobra 02: Inocular uma CEPA (Serratia marcescens) em um caldo nutritivo estril.

Primeiramente, identificaram-se os tubos utilizados com: nome dos responsveis, data do preparo, turma, nome do microrganismo utilizado: Serratia marcescens. Liga-se o bico de bunsen e esquenta-se a ala de inoculao na chama para esterilizao (fig.05), at a mesma atingir uma colorao avermelhada (rubra), seguindo tcnica adequada, como descrito anteriormente. Com o bico de Bunsen ainda aceso e a ala estril, pde-se dar incio a inoculao. Seguindo, aproximou-se o tubo com a CEPA da rea de segurana do bico e com a ala estril, flambando-se a boca do tubo nota-se que importante esperar a ala esfriar para no matar a colnia mergulhou-se a ala na soluo. Em seguida, o tubo novamente flambado, tampa-se a CEPA e recoloca-se a mesma na estante. Aproximou-se tubo contendo o meio de cultura, que fora flambado quando aberto, mergulhando-se a ala com a CEPA no meio logo em seguida. Flamba-se novamente o tubo antes de fechar, o meio fora tampado e recolado na estante, e a ala de inoculao fora esterilizada novamente.Figura 05: Tcnica de inoculao em meio lquido.

III. Manobra 03: Inocular uma CEPA (Serratia marcescens) em um tubo contendo Agar nutriente inclinado.Nesta manobra repetiram-se os procedimentos realizados na manobra 02, diferenciando-se somente no modo de inoculao. Para tanto, identificaram-se os tubos utilizados com: nome dos responsveis, data do preparo, turma, nome do microrganismo utilizado: Serratia marcescens. Liga-se o bico de bnsen e esquenta-se a ala de inoculao na chama para esterilizao, at a mesma atingir uma colorao avermelhada (rubra). Com o bico de Bunsen aceso e a ala estril, pde-se iniciar a inoculao. Em seguida, aproxima-se o tubo com a CEPA rea de segurana do bico de Bunsen e, com a ala de inoculao j estril, flamba-se a boca do tubo, mergulha-se a ala na soluo, aps esperar aproximadamente 15 segundos para a mesma resfriar, evitando matar a colnia de bactrias com o calor excessivo. A partir deste ponto, flambou-se a boca do tubo novamente, tampou-se a CEPA e recolocou-se a mesma na estante. Aproximou-se o tubo de ensaio contendo o meio de cultura de gar nutriente inclinado, e com cuidado para no ferir o meio, passado a ala de inoculao na superfcie do meio com movimentos a formar linhas sinuosas em zig-zag (fig.04). O meio tampado, recolocado na estante, a ala esterilizada novamente. Os tubos so levados para estufa por 36C por 48h para posteriormente observar-se o crescimento bacteriano. Figura 04: Tcnica de inoculao com gar inclinado.

5. Resultados e Discusso

Durante a realizao da primeira prtica (esterilizao) foram abordados termos que so de grande importncia e que no devem ser confundidos, como: desinfeco, esterilizao e limpeza. Antes de iniciar qualquer trabalho e aps o seu trmino, assim como as mos do tcnico, a superfcie de todas as bancadas devem ser desinfetadas. Este processo definido como eliminao ou destruio de todos os microrganismos na forma vegetativa, independente destes serem patognicos ou no pode ocorrer de ocasionar a destruio de algumas bactrias na forma esporulada, mas no se tem o controle e a garantia desse resultado. No caso das vidrarias, as mesmas precisam estar estreis, por isso so levadas ao processo de autoclavagem neste aparelho o aumento da presso permite a morte de todo e qualquer tipo de organismo que poderia estar infectando as vidrarias, inclusive esporos de bactrias, que so resistentes o suficiente para sobreviver a 100C. Sabendo disso, pode-se prosseguir com os demais procedimentos com a preocupao de contaminao reduzida.Os procedimentos da segunda prtica foram baseados na aprendizagem do preparo de meios de cultura. Os cultivos de bactrias exigem diferentes fontes de nutrientes, os quais sempre devem ser acrescentados a formulao dos meios destes microrganismo como, por exemplo, fonte de carbono, fonte de energia, fonte de enxofre e fsforo, e, at mesmo, vitamina em caso de microrganismos fastidiosos. Estes meios so a juno de substancias fornecedoras de nutrientes para que o microrganismo cresa fora de seu habitat natural. Deve-se considerar que os microrganismos possuem uma diversidade metablica muito grande, tendo-se a necessidade de existir variados tipos de cultura, para que desta forma seja possvel atender as exigncias nutricionais de todos os microrganismos. Para tanto, atualmente observa-se a existncia de meios de cultura com sete funes diferentes: meio seletivo, enriquecido, diferenciado, de dosagem, de contagem, de identificao e estocagem. Os meios de cultura tambm podem ser classificados de acordo com o seu estado fsico (vide introduo). Para tanto, criaram-se os meios: lquido e o meio com gar (agente solidificante) inclinado. Todos os procedimentos foram feitos em repetibilidade, pois, de acordo com a ISO 11.133, este um dos critrios essencias para o controle de qualidade interno e, com documentao apropriada ir permitir o monitoramento efetivo dos meios de cultura, o que contribui para a gerao de dados precisos e exatos. Com as devidas esterilizaes e preparo dos meios de cultura, fez-se possvel a terceira prtica manobras asspticas e inoculao de microrganismos. Inicialmente, realizou-se a transferncia de caldo nutritivo estril para tubo vazio estril como manobra 01 para que pudesse ser visualizado como efetivar o procedimento de inoculao sem contaminar o meio. Tal objetivo fora atingido, pois aps 48 horas na estufa 36C (temperatura tima para o crescimento da bactria), observou-se que ambos os tubos de ensaio apresentaram aparncia lmpida, ou seja, no houve crescimento de bactria em nenhum dos tubos, j que caso tivesse ocorrido o meio apresentaria uma aparncia turva.

Manobra 02: Inocular uma CEPA (Serratia marcescens) em um caldo nutritivo estril.A inoculao em meio lquido um procedimento bastante indicado pelo fato de possibilitar a rpida multiplicao de microrganismos, sendo um ensaio qualitativo para o crescimento bacteriano. Com o auxlio de uma ala de inoculao previamente flambada, realizou-se a inoculao da Serratia marcescens. Este gnero de bactria gram-negativa e anaerbia facultativa que produz colnias com pigmento avermelhado e circulares. Com base nestas informaes, conclui-se que o experimento fora bem sucedido, j que os tubos inoculados apresentaram colorao vermelha aps serem levados a estufa por 48 horas em uma temperatura de 36C. Tanto em condies aerbias e anaerbias, o controle da temperatura importante para se obter o crescimento dos microrganismos na taxa adequada. Enquanto muitos microrganismos crescem em temperatura ambiente ou at mesmo em condies extremas, outros tm a melhor taxa de crescimento a 37C e, assim, devem ser mantidos em estufas com a temperatura regulada.

Manobra 03: Inocular uma CEPA (Serratia marcescens) em um tubo contendo Agar nutriente inclinado.Este procedimento, assim como o procedimento de inoculao em meio lquido, pode ser utilizado como um ensaio qualitativo para o crescimento bacteriano. Contudo, este tambm muito utilizado como meio de estocagem quando se utiliza esta manobra para inoculao de um meio de estocagem evita-se a adio de glicose e outros acares, pois desta forma seria fornecido aos microrganismos uma das fontes de nutrientes, fazendo com que seu crescimento continuasse, provocando alteraes na cultura. O cultivo contendo gar nutriente inclinado mais indicado quando se deseja priorizar microrganismos aerbicos, pois desta forma aumenta-se a superfcie de contato com o ar, aumentando consequentemente a rea oxigenada.6. Concluso

Aps o termino de todas as etapas do procedimento de anlise, e da espera pelos resultados e a discusso feito sobre os mesmo, pode-se chegar concluso que a prtica foi bem sucedida.No que tange a esterilizao e a familiarizao com esta tcnica, o experimento foi devidamente cumprido e obteve resultados satisfatrios, j que foi possvel no s observar a tcnica, mas tambm sua importncia. Podendo observar-se, alm disso, a eficincia do mtodo de autoclavao, que foi o utilizado para a prtica em questo. Conclui-se que para que se possa obter um resultado satisfatrio em um experimento envolvendo microorganismos, necessrio evitar qualquer tipo de contaminao do meio a ser analisado atravs da assepsia e autoclavagem.

6. Referncia Bibliogrfica

BAGLIANO. O Que Microbiologia? In: Portal Educao. Disponvel em: - Acesso em 30/1/2015

COSTA. Tcnicas de Esterilizao e Desinfeco. In: Universidade da Madeira. Disponvel em: - Acesso em 29/1/2015

Equipe ICB. Procedimentos Bsicos em Microbiologia: tcnicas asspticas e cultivo de microrganismos. In: Departamento de Microbiologia. Disponvel em: < http://www.icb.ufmg.br/mic/index.php?secao=material&material=42> - Acesso em 30/1/2015

Equipe Toda Biologia. Bactrias. In: Toda Biologia. Disponvel em: - Acesso em 29/1/2015

NASCIMENTO. Produo e Preparo de Meios de Cultura. In: Merck. Disponvel em:< http://abrapaalimentos.com.br/documentos/simposio%209/Palestras/Palestra%203%20-%20Jorge%20Salim%20Nascimento.pdf> - Acesso em 30/1/2015

NICSIO. Meios de Cultura. In: Biomedicina Brasil. Disponvel em: - Acesso em 30/1/2015

Disciplina: Microbiologia

Manobras asspticas e inoculao

CAM 171Professora: Danielle BisaggioAlunos: Igor MachadoGabriella SantosLuiz Feliphe TarginoMichelle de OliveiraRaquel RibeiroFernanda Ceclia

Nilpolis, 5 de Fevereiro de 2015