relatÓrio de pÓs doutorado prodoc...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DO SOLO
RELATÓRIO DE PÓS-DOUTORADO PRODOC/CAPES
PROJETO:
FUNGOS ECTOMICORRÍZICOS EM POVOAMENTOS FLORESTAIS EXÓTICOS E FRAGMENTOS DE MATAS NATIVAS
DO BIOMA PAMPA
Dr. Diego Pascoal Golle
Santa Maria/RS, Abril/2011.
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SUMÁRIO 1 DADOS DO PROJETO ................................................................................................ 3
2 DADOS DO ESTÁGIO................................................................................................... 3
3 RAZÃO DO ENCERRAMENTO ANTERIOR AO PRAZO PREVISTO............... 5
4 RESUMO......................................................................................................................... 6
5 INTRODUÇÃO............................................................................................................... 7
6 OBJETIVOS.................................................................................................................... 11
7 ATIVIDADES REALIZADAS...................................................................................... 12
8 ATIVIDADES PREVISTAS x ATIVIDADES DESENVOLVIDAS...................... 19
9 PUBLICAÇÕES............................................................................................................ 20
10 REFERÊNCIAS........................................................................................................ 21
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1 DADOS DO PROJETO
Projeto: Fungos ectomicorrízicos em povoamentos florestais exóticos e fragmentos de matas
nativas do bioma Pampa
Submetido ao: EDITAL MEC/CAPES Nº 029/2010 - Seleção pública de propostas de
projetos de pesquisa voltados ao Programa de Apoio a Projetos Institucionais com a
Participação de Recém-Doutores – PRODOC
Coordenadora do Projeto:
Prof. Dra. Zaida Inês Antoniolli – Programa de Pós-Graduação em Ciência do Solo/UFSM
Instituição de Execução do Projeto:
Universidade Federal de Santa Maria - Centro de Ciências Rurais – Departamento de Solos
Av. Roraima, 1000 – Bairro Camobi – Santa Maria/RS
(55) 3220-8108 CEP 97.105-900
Vigência:
Agosto de 2010 a Julho de 2012.
2. DADOS DO ESTÁGIO
Período de realização
De novembro de 2010 a março de 2011.
Dados do pós-doutorando
Nome
Diego Pascoal Golle
Formação profissional
Biólogo (Ciências Biológicas, Universidade de Cruz Alta, 2005), Mestre em Engenharia
Florestal (Universidade Federal de Santa Maria, 2007) e Doutor em Engenharia Florestal
(Universidade Federal de Santa Maria, 2010).
Atuação profissional atual
Professor Adjunto da Universidade de Cruz Alta (UNICRUZ).
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Endereço profissional
Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais in vitro, prédio 1, sala 111, Campus
Universitário. Rodovia Municipal Jacob Della Méa, km 5,6; Parada Benito, Cruz Alta, Rio
Grande do Sul. Cep: 98.020-290, Telefone: (55) 3321 1525.
E-mail: [email protected]
Dados da orientadora
Nome
Zaida Inês Antoniolli
Formação profissional
Bióloga (Ciências Biológicas, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, 1984),
Especialista em Biotecnologia (Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 1988), Mestre
em Fitotecnia (Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 1988), Doutora em Ecology of
Mycorrhizal Molecular Aspects (University of Adelaide, 1999).
Atuação profissional atual
Professora Associada do Departamento de Solos da Universidade Federal de Santa Maria.
Endereço profissional
Laboratório de Microbiologia e Biologia do Solo e Ambiente, Sala 3310, Departamento de
Solos, Centro de Ciências Rurais, Prédio 42. Avenida Roraima, número 1000, Cep: 97.105-
900. Telefone: (55) 3220 8108.
E-mail: [email protected].
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3 RAZÃO DO ENCERRAMENTO ANTERIOR AO PRAZO PREVISTO
O projeto intitulado “Fungos Ectomicorrízicos em Povoamentos Florestais Exóticos e
Fragmentos de Matas Nativas do Bioma Pampa” foi submetido ao EDITAL MEC/CAPES Nº
029/2010 - Seleção pública de propostas de projetos de pesquisa voltados ao Programa de
Apoio a Projetos Institucionais com a Participação de Recém-Doutores – PRODOC, tendo
obtido sua aprovação no mesmo ano. As atividades referentes ao projeto, assim como
indicação do bolsista, iniciaram no mês de novembro de 2010, entretanto, a implementação da
bolsa só ocorreu no mês de dezembro de 2010. O encerramento do projeto estava previsto
para agosto de 2012.
As atividades do pós-doutorando bolsista PRODOC Diego Pascoal Golle encerraram
no dia 31 de março de 2011, em virtude de sua contratação para integrar o corpo docente da
Universidade de Cruz Alta (UNICRUZ) no dia 01 (primeiro) de abril de 2011. Optou-se pelo
encerramento do pós-doutorado pois a própria bolsa modalidade PRODOC possui, entre
outras atribuições, a função de formar pesquisadores e docentes para a atuação no Ensino
Superior brasileiro, vindo de encontro ao motivo pelo qual encerrou-se precocemente as
atividades do bolsista.
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4 RESUMO
O Bioma Pampa é o mais desconhecido dos biomas brasileiros. Sua fisionomia e
biodiversidade foram fortemente alteradas por pressões antrópicas e, frente à implantação de
grandes áreas de monoculturas florestais, o bioma permanece suscetível. As ectomicorrízas
encontram-se associadas às raízes de essências florestais e desempenham papel fundamental
na absorção de água e nutrientes por estas plantas. Contudo, dados referentes à diversidade
destes organismos no Pampa são extremamente escassos. Face ao exposto, torna-se urgente a
necessidade de pesquisas ligadas ao conhecimento da biodiversidade e prospecção destes
importantes recursos genéticos, os quais podem auxiliar na sua conservação e no
desenvolvimento sustentável do país, além de servirem como indicadores da qualidade
ambiental. Este projeto de pós-doutoramento teve como objetivos: realizar uma revisão sobre
o atual estado do conhecimento de fungos ectomicorrizicos (fECM) epígeos e hipógeos,
dando-se ênfase especial aos pertencentes a este último grupo; avaliar a biodiversidade de
fungos ectomicorrízicos ocorrentes em povoamentos de monoculturas florestais e fragmentos
de matas nativas do Bioma Pampa, utilizando-se métodos morfológicos e moleculares; obter
isolados que viabilizem a produção de inoculantes; e avaliar a compatibilidade de
ectomicorrizas em espécies silviculturais exóticas e nativas por meio de técnicas de cultura de
tecidos. Realizou-se uma ampla revisão sobre os fungos ectomicorrízicos e seu estudo no sul
do Brasil, dando-se especial ênfase aos fECM hipógeos, visto que apresentam importância
significativa, mas são menos estudados que os demais em função de seu hábito de
crescimento. Expedições foram realizadas em povoamentos homogêneos de espécies exóticas
e em fragmentos de matas nativas do Bioma Pampa, onde foram coletados fungos (juntamente
com o solo) os quais foram – e alguns estão sendo - identificados morfologicamente. Além
disso, realizou-se a extração do DNA genômico destes fungos e a amplificação via reação em
cadeia da polimerase da região do Espaço Interno Transcrito (ITS) do rDNA destes fungos.
Estes produtos de PCR foram purificados e estão em fase de sequenciamento para a posterior
comparação com dados do GenBank e construção de análises filogenéticas. Da mesma forma,
procurou-se isolar os fungos coletados para posterior obtenção de inóculos. Está sendo dada
continuidade aos trabalhos pelo grupo de pesquisas do Laboratório de Microbiologia e
Biologia do Solo e Ambiente/UFSM.
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5 INTRODUÇÃO
O Bioma Pampa, compartilhado pela Argentina, Uruguai e Brasil, distribui-se de
forma predominante na maior parte do Rio Grande do Sul (64%), sendo sua ocorrência restrita
a este único Estado. O Pampa tem sido submetido à forte ação antrópica, tendo como
consequência a alteração significativa de sua fisionomia e biodiversidade. Poucas pesquisas
contemplam a avaliação dos organismos existentes neste ambiente, o qual pode ser
considerado como o menos conhecido dos biomas nacionais. Estudos nesse sentido podem
contribuir com novas descobertas, que auxiliariam em estratégias de conservação e na
utilização de seres vivos de interesse no desenvolvimento científico e tecnológico.
Em diversos ambientes, observa-se a importância da presença de micorrizas no
desenvolvimento das plantas e na manutenção da dinâmica de ecossistemas. Dos vários tipos
de micorrizas existentes, as ectomicorrizas destacam-se em locais onde há presença de
espécies lenhosas. Contudo, a presença destes fungos nos fragmentos de mata nativa e em
povoamentos florestais exóticos ocorrentes no Bioma Pampa não é conhecida até o presente
momento. Dados dessa natureza podem representar informações fundamentais para a
sustentabilidade, para o conhecimento de organismos presentes e de novas espécies, como
indicadores da qualidade ambiental e, adicionalmente, no isolamento e utilização
biotecnológica destes fungos na indústria e na produção vegetal. No entanto, no tocante aos
campos sulinos, as áreas de florestas nativas, não frequentemente características destes
ecossistemas, encontram-se apenas como fragmentos esparsos, os quais necessitam de
medidas urgentes de conservação. Em contrapartida, o uso de monoculturas florestais tem
sido intensivo na região, como a descoberta de uma nova vocação econômica, porém, com
estudos ainda em discussão sobre os possíveis impactos desta atividade no Pampa.
Frente a esta realidade, destaca-se a necessidade de catalogação e conhecimento da
biodiversidade de fungos ectomicorrízicos do Pampa, o que pode ser realizado por meio de
técnicas clássicas – como estudos morfológicos baseados em microscopia estereoscópica e
ótica - e análises moleculares, as quais são, atualmente, essenciais frente ao grande
desenvolvimento nesta área, contribuindo de forma significativa para a sistemática. Desta
forma, pode-se também caracterizar espécies que estejam sobre forte pressão ambiental e em
risco de extinção. Adicionalmente, é possível a aquisição de informações de grande relevância
sobre a associação destes organismos com espécies florestais, exóticas ou nativas, que
ocorrem de forma natural ou cultivada no Pampa. Esta caracterização também permitirá traçar
comparativos entre a diversidade de ectomicorrizas em povoamentos florestais de
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monoculturas (Eucalyptus spp., Pinus spp., e Acacia spp.) em relação a diversidade de
ectomicorrizas em fragmentos florestais nativos.
Outro fator de fundamental importância é a possibilidade de conhecimento destes
novos recursos genéticos, possibilitando a prospecção de ectomicorrizas para uso em plantios
florestais, por meio da produção de inóculos, contribuindo-se assim uma produção mais
sustentável. Sabendo-se que estes organismos são específicos quanto a sua atuação
mutualística, isolar e avaliar a sua especificidade e ação no desenvolvimento de mudas nativas
e exóticas por meio do cultivo de tecidos pode contribuir para a descoberta de novos isolados
e/ou espécies realmente compatíveis, que contribuirão para o desenvolvimento econômico de
base florestal no país, sabendo-se da importância desta atividade. Conforme a Sociedade
Brasileira de Silvicultura (SBS, 2007), o setor florestal possui participação em 3,5% do
Produto Interno Bruto do país, o que equivale a US$ 37,3 bilhões, gerando 4,33 milhões de
empregos em florestas plantadas e 2,58 milhões de empregos em florestas nativas.
5.1 O Bioma Pampa
De acordo com dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2004),
o Bioma Pampa, também conhecido como campos sulinos, abrange aproximadamente 176
km2, o que equivale a 64% do território gaúcho e a 2,07% do território do país. Este bioma
caracteriza-se por seu relevo ondulado contendo suaves elevações (SUERTEGARAY, 1998),
onde predomina a vegetação formada por campos - compostos principalmente por gramíneas
e plantas herbáceas – e, ocasionalmente, a presença de fragmentos florestais, arbustos e
árvores (CARVALHO; BATELLO, 2009). Atualmente, são criadas na região em torno de 13
milhões de cabeças de gado e cinco milhões de ovelhas, as quais utilizam a pastagem da
região (95%) como fonte de forragem.
Embora bastante antropizado, os poucos estudos realizados no Pampa mostram a
existência de uma biodiversidade bastante significativa. BOLDRINI (1997) estimou a
existência de aproximadamente três mil espécies de gramíneas, dados que, segundo
OVERBECH et al. (2007) devem estar subestimados. Ademais, o Bioma Pampa serve de
habitat para 385 espécies de pássaros e cerca de 90 espécies de mamíferos terrestres
(BILENCA; MIÑARRO, 2004). Apesar de haver preocupação com relação ao tema da
biodiversidade, o foco das atenções tem se voltado predominantemente para os recursos
animais e vegetais, sendo menor atenção dispensada à porção menos evidente, porém não
menos importante, que são os microrganismos do solo. Ao nosso conhecimento, são escassos
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os trabalhos sobre a biodiversidade de fungos micorrízicos no Bioma Pampa. Estes dados
remetem a necessidade de urgentes discussões e pesquisas, buscando auxiliar na sua
conservação e no seu desenvolvimento econômico.
Face ao exposto, o estudo de ectomicorrizas associadas aos ambientes florestais
exóticos e nativos do Bioma Pampa, auxiliará significativamente para o melhor conhecimento
da biodiversidade destes organismos, corroborando com as necessidades de conservação
ambiental. Outrossim, conhecimentos importantes também podem ser gerados em termos de
avaliação da variabilidade genética destes fungos e da utilização destes recursos na
bioprospecção, tendo em vista seu importante papel na utilização biotecnológica.
5.2 Fungos ectomicorrízicos (fECM)
As micorrizas são associações mutualísticas entre fungos e as raízes das plantas
(BRUNDRETT et al., 1996), sendo que estas associações simbióticas são abundantes,
ocorrendo em 75 a 80% das plantas (SMITH; READ, 1997). Embora as micorrizas
arbusculares e as ectomicorrizas sejam de maior importância econômica e também as mais
conhecidas, Brundrett et al. (1996) relataram sete tipos de associações micorrízicas
conhecidas: a) micorrizas arbúsculo-vesiculares (MAV) – também chamadas de micorrizas
arbusculares (MA) -; b) ectomicorrizas (ECM); c) ectendomicorrizas; d) orquidóides; e)
ericóides; f) monotropóides; e g) arbutóides.
Os fungos ectomicorrízicos são muito importantes nos ecossistemas, pois sua
associação mutualística com plantas de diferentes espécies auxilia na absorção de nutrientes,
água e na proteção da planta hospedeira em relação aos patógenos e estresses abióticos
(SMITH; READ, 1997). Nos ecossistemas florestais, o papel das ectomicorrízas é ainda mais
pronunciado, atuando fortemente nos ciclos biogeoquímicos, na dinâmica das comunidades
vegetais e na manutenção da estrutura do solo (RILLIG; MUMMEY, 2006; MORRIS et al.,
2009).
A maioria, os fungos ectomicorrízicos pertencem à classe Basidiomycota, como os
gêneros: Amanita, Hebeloma, Hysterangium, Laccaria, Lactarius, Rhizopogon, Russula,
Scleroderma, Suillus, Tricholoma entre outros (VELLINGA et al., 2009). Têm sido
considerada extremamente favorável a associação destes fungos às espécies florestais
cultivadas como o Pinus spp., Eucalyptus spp. e a Acacia spp. Porém, não há nenhum relato
no que se refere às espécies ocorrentes no Bioma Pampa, o qual está inserido em um contexto
de produção silvícola, além da escassez de conhecimento sobre associações entre
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ectomicorrizas e espécies florestais nativas, onde não são conhecidos, a priori, dados para o
bioma em questão. Conforme citam NARA; HOGETSU (2004), o papel das ectomicorrizas é
fundamental na recuperação de áreas impactadas ambientalmente, como é o caso do Pampa,
que possui a predominância de solos arenosos, de grande susceptibilidade à ação humana.
Ademais, sabendo-se da alta especificidade apresentada por ectomicorrizas, pode-se obter
isolados de interesse para a produção florestal brasileira por meio de testes neste sentido.
Nos campos sulinos, estudos morfológicos de ectomicorrizas caracterizam resultados
muito importantes no conhecimento da biodiversidade de espécies. Porém, nos dias atuais, o
uso da biologia molecular é indispensável, como se observa nos trabalhos de Gomes et al.
(2002); Tedersoo et al. (2007); Morris et al. (2009), entre outros. Dentre as diversas
ferramentas moleculares disponíveis, tem sido consenso o uso daquelas baseadas no
sequenciamento do espaço interno transcrito (internal transcribed spacer – ITS) do rDNA de
fungos, auxiliando na caracterização da espécie e na construção de estudos filogenéticos.
A região ITS é composta por regiões não codificantes localizadas entre regiões
altamente conservadas do rDNA responsáveis pela codificação da subunidade menor e maior
dos ribossomos (BRIDGE; ARORA, 1998). São de fácil amplificação, possuem natureza
multicópia e permitem a diferenciação entre espécies. Além disso, em estudos de código de
barras (barcode) de fungos a região ITS vem sendo escolhida como prioritária.
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6 OBJETIVOS
6.1 Objetivo geral
Caracterizar a biodiversidade de fungos ectomicorrízicos ocorrentes em povoamentos
de monoculturas florestais e fragmentos de matas nativas do Bioma Pampa por meio de
métodos morfológicos e moleculares, bem como obter isolados que viabilizem a produção de
inoculante e estudar a compatibilidade de ectomicorrizas em espécies silviculturais exóticas e
nativas por meio da cultura de tecidos, contribuindo para o conhecimento da biodiversidade e
utilização dos fungos micorrízicos do Bioma Pampa.
6.2 Objetivos específicos
coletar fungos ectomicorrízicos associados a monoculturas florestais cultivadas e à
matas nativas do Bioma Pampa;
identificar e descrever morfologicamente as espécies de fungos ectomicorrízicos
coletadas;
identificar as espécies a partir de técnicas moleculares;
comparar a diversidade de ectomicorrizas presentes em solos com florestas nativas e
solos onde há presença de monocultivos florestais.
determinar a compatibilidade entre isolados de fungos ectomicorrízicos e espécies
florestais exóticas e nativas, por meio do cultivo de tecidos.
capacitar recursos humanos para o desenvolvimento de pesquisas na área, abrangendo
o estudo de ectomicorrizas, biologia molecular e cultura de tecidos; treinando
estudantes de graduação, pós-graduação e um profissional em pós-doutoramento.
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7 ATIVIDADES REALIZADAS
7.1 Revisão sobre fungos ectomicorrízicos de hábito hipógeo
Os fungos ectomicorrízicos (fECM) podem ser classificados como epígeos, que são
aqueles que emitem suas estruturas reprodutivas acima do solo, e como hipógeos, os quais
mantêm suas estruturas reprodutivas abaixo do solo. Há, atualmente, um grande número de
trabalhos referentes ao estudo de fungos epígeos, em detrimento aos trabalhos com fungos
hipógeos. Este fato deve-se, possivelmente, a maior facilidade de se coletar e identificar
fungos epígeos, enquando a busca a campo de fungos hipógeos é mais laboriosa e a
identificação destes mais complicada, requerendo, muitas vezes, o uso de ferramentas de
biologia molecular para a confirmação dos dados.
Embora o um número escasso de trabalhos com ectomicorrizas de hábito hipógeo,
especialmente no Sul do Brasil, estas espécies representam recursos genéticos com grande
potencial para aplicações biotecnológicas e, ademais, a necessidade de conhecimento destes
fungos é fundamental para sua conservação.
Portanto, foi realizada uma revisão bibliográfica, a qual foi submetida para publicação
na revista Ciência Rural, no intuito de compilar dados que possam colaborar para a realização
de mais estudos de fECM hipógeos, bem como divulgar este importante grupo e incentivar
pesquisadores à atuação na área.
7.2 Coletas realizadas no Bioma Pampa e entorno
Após reuniões para definir os locais de coleta, com base na abrangência do bioma
Pampa, realizou-se incursões para os municípios gaúchos de Alegrete, Rosário do Sul,
Dilermano de Aguiar, Santiado, Minas do Camaquã, Jaguari e São Vicente do Sul. Estes dois
últimos estão em área de transição e, por esta razão, foram incluídos, levando-se em
consideração a importância e a grande biodiversidade característica de regiões ecotonais.
Registros das coletas podem ser observados na Figura 1. Diversas coletas foram realizadas até
o momento, entretanto, tendo em vista a grande escassês de chuvas no bioma Pampa
brasileiro no período entre novembro de 2010 e março de 2011, as coletas resultaram em
número razoável de fungos encontrados, devido à baixa umidade do solo que impediu o
desenvolvimento das estruturas reprodutivas dos fungos. Entretanto, os trabalhos estão tendo
continuidade no intuito de coletar mais fungos ectomicorrízicos.
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Figura 1 – Viagens prospectivas realizadas pelo grupo de pesquisas no Bioma Pampa e entorno, onde
observa-se coletas em: a - Jaguari; b - fragmentos folorestais próximos a Minas do Camaquã; c – Santiago; d - Alegrete; e - Dilermano de Aguiar; f - Rosário do Sul, no mesmo dia em que se esteve em São Vicente do Sul. UFSM, 2010/2011.
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7.3 Análises morfológicas
Para coletar fECMs, realizou-se incursões tanto em áreas de fragmentos florestais
nativos (de forma geral compostos por capões) como em áreas com povoamentos de
monoculturas florestais. Antecedendo a retirada dos basidiomas de seu local de origem, os
espécimes foram fotografados e realizou-se o registro de dados como: data, local de coleta,
coordenadas geográficas, coletor, e característica das estruruturas reprodutivas (coloração,
consistência, inserção no solo, forma e mensurações). Os fungos foram removidos
cuidadosamente, entretanto, manteve-se parte do solo onde estavam inseridos e o folhiço
circundante. O material foi numerado e acondicionado em sacos de papel para o transporte até
o Laboratório de Biologia do Solo e do Ambiente, do Departamento de Solos da Universidade
Federal de Santa Maria.
Em laboratório, as raízes presentes no solo coletado juntamente com o fungo foram
peneiradas e passaram por lavagens. Após, receberam um número de identificação e foram
mantidas em solução de etanol a 70%. Posteriormente, procuraram-se evidências da
ocorrência de associações das raízes com hifas dos fungos coletados, utilizando-se para esta
finalidade microscópios estereoscópicos e ópticos.
Já para os basidiomas coletados, parte do material foi desidratado em estuda,
mantendo-se os mesmos a 50 °C até atingirem massa constante (entre dois e sete dias,
dependendo do tamanho do fungo). Posteriormente, foram mantidos em sacos de papel e
caixas de papelão cuidadosamente armazenadas para manter o acervo herborizado. A
descrição dos basidiomas seguiu as metodologias usuais em micologia como, por exemplo, as
chaves de classificação e guias específicos para grupos de fungos. As análises macroscópicas
foram efetuadas a olho desarmado, bem como com o auxílio de microscópios estereoscópicos
e equipamentos de mensuração como réguas e paquímetros. Também foi utilizada a
visualização de estruturas menores, como esporos e hifas, em microscópio óptico, dispondo-
se os cortes entre lâmina e lamínula, contendo solução de azul de metileno a 1%.
Como a maior parte das coletas realizadas até o momento ocorreram em época de
escassez hídrica, dificultando a ocorrência de estruturas reprodutivas e, por esta razão,
dificultando o andamento dos trabalhos, também coletou-se amostras de solo contendo raízes
de espécies arbóreas dos fragmentos florestais e povoamentos monoculturais visitados. O
objetivo destas coletas foi observar a presença de associações micorrízicas nas raízes das
árvores, o qual evidencia-se pela presença de morfotipos característicos.
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Amostras do solo de aproximadamente 50 cm3 foram retiradas e armazenadas em
sacos plásticos com acréscimo de água destilada, objetivando-se manter a umidade por 24 h.
Posteiromente, o material foi peneirado deixando-se apenas as raízes presentes. Com o auxílio
de microscópios estereoscópicos, procurou-se evidenciar a ocorrência de morfotipos, bem
como manto fúngico nas raízes. Exemplo das caracterizações de registro fotográfico, análises
em laboratório, análises com auxílio de microscópios estereoscópicos e ópticos realizadas
tanto para os fungos coletados como para os morfotipos estão ilustradas na Figura 2.
Figura 2 – Aspecto geral de dados registrados durante a caracterização macro e
micromorfológica onde observa-se: a - registro do basidioma em campo; b - mensurações dos basidiomas realizadas em laboratório; c - análise de morfotipos com auxílio de microscópios estereoscópicos; d - análise com microscopia ótica das hifas, evidenciando com a seta a presença de fíbula, estrutura característica de basidiomicetos. Santa Maria, RS, UFSM, 2011.
Para o isolamento, seguiu-se a metodologia proposta por Brundrett et al. (1996) onde,
após desinfestação superficial dos basidiomas em etanol a 70%, estes foram partidos ao meio
retirando-se, com o auxílio de pinças e alça de platina, parte do interior do contexto, a qual foi
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inoculada em meio de cultura MNM modificado (MARX, 1969). Todo este procedimento
ocorreu em câmara de fluxo laminar asséptico. Após, este material foi mantido para
crescimento em estufas com temperatura controlada de 25°C e com repicagens periódicas de
acordo com o crescimento micelial.
7.4 Análises moleculares
Durante as viagens prospectivas, parte das estruturas reprodutivas (basidiomas)
coletadas foi mantida em tubos de precipitação para microcentrífuga contendo 1 mL do
detergente catiônico CTAB (cloreto de cetiltrimetilamônio) a 2%. Posteriormente, este
material foi congelado, sendo mantido a – 20°C. Parte do material também foi armazenada em
tubos de precipitação para microcentrífuga contendo sílica gel, o que confere uma forma
alternativa de armazenagem. O material em sílica gel permaneceu em temperatura ambiente
(aproximadamente 25ºC). Todo o material foi armazenado em, no mínimo, duas replicatas. Já
para os morfotipos coletados (após análise das raízes presentes no solo), utilizou-se o
armazenamento em tubos de precipitação para microcentrífuga contendo água ultrapura. Este
material foi congelado e mantido em freezer a – 20°C. As extrações de DNA dos basidiomas,
bem como a amplificação via PCR da região ITS do rDNA já foram efetuadas. As extrações
dos morfotipos estão em andamento, procurando-se fazer adequações aos protocolos.
Para a extração de DNA genômico utilizou-se o kit de extração DNeasy® Plant Mini
Kit (Qiagen), seguindo-se as instruções de uso do fabricante. O tecido fúngico foi retirado do
CTAB e seccionado em porções de aproximadamente 20 mg. A reação em cadeia da
polimerase (PCR) seguiu o protocolo descrito por Lupatini et al. (2008) com modificações. A
reação foi realizada em um volume total de 25 µL, tendo como componentes: 10 ng de DNA
template, 25 pmoles de cada oligonucleotídeo iniciador (ITS 1 e ITS 4), 10 mM de Tris-HCl
(pH 8,3), 50 mM do tampão de reação, 2 mM de MgCl2, 2,5 µM de cada um dos dNTPs
(dGTP, dCTP, dATP, dTTP) e 1 unidade de Taq DNA polimerase (Invitrogen®). Para a
amplificação da região do espaço interno transcrito (ITS) do rDNA foram empregados os
oligonucleotídeos iniciadores ITS 1 (5’ TTC CGT AGG TGA ACC TGC GG 3’) e ITS 4 (5’
TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3’) descritos por WHITE et al. (1990). As reações de
amplificação foram efetuadas por meio de uma desnaturação inicial a 94°C por 2 minutos,
seguida por 35 ciclos que consistiram de: desnaturação a 94°C por 1 minuto, anelamento a
55°C por 1 minuto, e extensão a 72°C por 1 minuto e 30 segundos. Por fim, realizou-se uma
extensão final a 72°C por 10 minutos.
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Posteriormente à amplificação, realizou-se a eletroforese dos produtos de PCR em gel
de agarose a 1,5%. A eletroforese foi conduzida em cuba horizontal contendo o gel submerso
em tampão TBE 1X (90 mM Tris-borato, 2 mM EDTA, pH 8,0). Para corar as bandas de
DNA e visualizá-las em transluminador, foi realizada a adição de 10 mg mL-1 de brometo de
etídeo, sendo o registro fotográfico efetuado com o uso do aparato Cânon Snot S2IS (Figura
3).
Figura 3 – Eletrofores dos produtos de PCR obtidos a partir do uso de
primers que flanqueiam a região ITS do rDNA. A primeira coluna evidencia o padrão 100 pb, onde foram destacados os fragmentos de 850 e 650 pb. Observa-se as bandas formadas a partir da amplificação dos fungos onde a letra “G”, seguida de diferentes números, representa o registro de coleta e “C-“ o controle negativo. Santa Maria, RS, UFSM, 2011.
A purificação dos produtos de PCR utilizou o protocolo baseado no uso de PEG 8000
a 13% descrito por DUNN & BLATTNER (1987). Adicionou-se um volume de solução de
PEG 8000 (PEG a 13%, NaCl a 1,6M) homogeneizando-se cuidadosamente com o auxílio de
micropipeta. Este material permaneceu nesta condição overnight. Posteriormente, o material
foi centrifugado por 15 minutos a 13.000 rpm. Descartou-se a solução de PEG e o material
passou por uma etapa de limpeza com a adição de 200 µL de etanol a 70%, seguido de uma
centrifugação por 10 minutos a 13.000 rpm. O procedimento de limpeza foi repetido por três
vezes. Por fim, os pellets foram secos à temperatura ambiente com posterior eluição em 8 µL
de água ultrapura, conforme propõe SAMBROOK et al. (1989).
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O material foi enviado para sequenciamento onde serão utlizados os oligonucleotídeos
iniciadores ITS 1 e ITS 4. O sequenciamento será realizado no sequenciador Mega BACE
5000 (Amersham Bioscience), seguindo-se o protocolo fornecido pelo fabricante. Após as
sequências serão analisadas para se obter a sequência concenso, com auxílio do programa
STADEN (STADEN et al. 1992-2000), assim como será realizado o alinhamento de
sequências por meio do algoritmo ClustalW. As sequências do GenBank serão escolhidas
utilizando-se o Algoritmo Megablast, disponível na plataforma BLAST do NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) e as análises filogenéticas serão realizadas com auxílio do
programa MEGA (TAMURA et al., 2006).
7.5 Participações em atividades de Ensino
Considerando-se que a maior parte do período em que foi realizado o pós-
doutoramento correspondeu ao período de férias da Universidade Federal de Santa Maria, as
atividades de ensino ficaram agendadas para este primeiro semestre de 2011. Contudo,
mesmo com o encerramento do pós-doutorado, será realizada a participação na disciplina de
Biologia do Solo, oferecida pelo Programa de Pós-Graduação em Ciência do Solo, onde será
trabalhado sobre o uso de técnicas moleculares no estudo da biodiversidade do solo.
19
8 ATIVIDADES PREVISTAS X ATIVIDADES DESENVOLVIDAS
Tabela 1 – Cronograma de atividades previstas e desenvolvidas. Manteve-se o
cronograma inicial, proposto para três anos de projeto. As atividades já
executadas encontram-se marcadas em azul. ANO 2010
ATIVIDADES J F M A M J J A S O N D
Revisão de literatura X X X X X
Viagens de prospecção e coleta X X X X X
Identificação e acondicionamento do material X X X
Caracterização morfológica X X X
ANO 2011
ATIVIDADES J F M A M J J A S O N D
Revisão de literatura X X X X X X X X X X X X
Extração de DNA X X X X
Amplificação Via PCR X X X X
Purificação das Sequências X X X X
Sequenciamento X X X X
Análise de resultados parciais X X
Publicação de resultados X X
Relatório Parcial X
ANO 2012
ATIVIDADES J F M A M J J A S O N D
Revisão de literatura X X X X X X X
Isolamento de inoculo X X
Estabelecimento in vitro de culturas assépticas de espécies florestais
X X X
Análise da compatibilidade in vitro entre ectomicorrizas e essências florestais
X X X X
Análises de resultados X X X
Publicação de resultados X X
Relatório final X X
20
9 PUBLICAÇÕES
Conforme se observa na Figura 4, foi submetida uma revisão bibliográfica intitulada
“Fungos Ectomicorrízicos Hipógeos no Sul do Brasil“ à Revista Ciência Rural (ISSN 0103-8478). As atividades de pesquisa e a participação no grupo continuarão, objetivando-se a obtenção de resultados e a publicação destes em veículos científicos de impacto.
Figura 4 – Atestado de submissão de artigo científico à Revista Ciência Rural (ISSN
0103-8478). Santa Maria, RS, UFSM, 2011.
21
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