Fundação Oswaldo Cruz Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas Pós Graduação em Pesquisa Clínica em Doenças Infecciosas

Laboratório de Imunoparasitologia

Projeto de Doutorado

Avaliação comparativa da resposta imune anti-Leishmania

de pacientes com leishmaniose tegumentar americana

tratados com diferentes esquemas utilizando

antimoniato de meglumina.

Por:Thalita Gagini Braga

Orientador: Dr. Armando de Oliveira Schubach

Co-orientador: Dr. Sergio Coutinho Furtado de Mendonça

2010

ÍNDICEPAG.

1. RESUMO 3

2. INTRODUÇÃO 4

3. JUSTIFICAIVA 14

4. OBJETIVO 15

4.1 Geral 15

4.2 Específico 15

5. METODOLOGIA 16

5.1 Grupo de Estudo 16

5.2 Critérios de elegibilidade 17

5.3 Critério para interrupção definitiva do tratamento do estudo 17

5.4 Critérios para retirada do estudo (mas não da análise de dados) 18

5.5 Testes sorológicos 18

5.5.1 Detecção de anticorpos anti-leishmania por Imunofluorescência Indireta 18

5.5.2 Detecção de anticorpos por ELISA 18

5.6 Dosagem de TNF- no soro 19

5.7 Obtenção de CMSP 19

5.8 Resposta proliferativa de linfócitos 20

5.9 Dosagem de citocinas em sobrenadantes de culturas de CMSP 20

5.10 Caracterização do fenótipo de células reativas a Leishmania 21

5.11 Quantificação das células produtoras de IFN- e IL-4 por Elispot 22

5.12 Análise estatística 23

6. RESULTADOS ESPERADOS 23

7. RESULTADOS 23

7.1 Dosagem de citocinas em sobrenadantes de culturas de CMPS 23

7.2 Caracterização do fenótipo de células reativas a leishmania 25

7.3 Avaliação clínico-epidemiológica 31

8. CRONOGRAMA 33

9. EQUIPE 34

10. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 35

11. ANEXOS 41

11.1 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIMENTO 41

11.2 CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO DO PROJETO GERAL- EM DIAS 45

2

3

1. RESUMO

Este projeto de doutorado está vinculado ao projeto intitulado “Ensaio clínico fase III para

leishmaniose tegumentar americana. Equivalência entre o esquema padrão e alternativos

com antimoniato de meglumina”, coordenado pelo Dr. Armando Schubach, que visa

comparar o tratamento antimonial recomendado pelo Ministério da Saúde do Brasil para o

tratamento da LTA com esquemas alternativos utilizando o mesmo fármaco. Devido à

grande diversidade das leishmanioses humanas, não existe um único esquema terapêutico

ideal para todas elas. Com freqüência, resultados obtidos em ensaios terapêuticos

individuais servem de base para recomendações de tratamento para outras formas de

leishmaniose causadas por outras espécies de Leishmania, em outros continentes, em

populações significativamente diferentes do ponto de vista genético, social, econômico e

cultural e submetidas a condições de vida distintas no que se refere a fatores que podem

interferir diretamente na eficácia e adesão ao tratamento, como disponibilidade de

atendimento médico especializado, distância deste atendimento e condições de transporte.

Idealmente, os regimes terapêuticos mais adequados deveriam ser estabelecidos para cada

área endêmica, com base na experiência regional. O projeto geral é um ensaio clínico de

fase III, controlado com o tratamento padrão, randomizado e duplo-cego. Nele participarão

pacientes com leishmaniose cutânea alocados em quatro grupos de 66 indivíduos que

receberão diferentes esquemas terapêuticos à base de injeções intramusculares de

Glucantime: I) 20mg Sb5+/kg/dia por 20 dias contínuos, II) 20mg Sb5+/kg/dia intermitente em 2

séries de 10 dias intercaladas com 10 dias de intervalo, III) 5mg Sb5+/kg/dia por 30 dias

contínuos, IV) 5mg Sb5+/kg/dia intermitente em 3 séries de 10 dias intercaladas com 10 dias

de intervalo. A evolução da resposta anti-Leishmania durante e após o tratamento tem sido

estudada e alguns parâmetros imunológicos têm sido propostos como marcadores de

evolução favorável, como a razão entre as produções das citocinas interferon- e

interleucina (IL)-10, a freqüência de células T CD8+ reativas a Leishmania e a diminuição

dos níveis séricos de TNF- e de anticorpos específicos. Este projeto tem como objetivo

avaliar possíveis diferenças na evolução da resposta imune contra o parasito associadas

aos diferentes esquemas terapêuticos. A resposta imune anti-Leishmania será estudada

antes e após o tratamento em pacientes dos quatro grupos através das seguintes técnicas:

dosagem de anticorpos séricos anti-Leishmania por imunofluorescência indireta e ELISA,

resposta proliferativa de células mononucleares de sangue periférico (PBMC),

caracterização das células reativas por técnica de citometria de fluxo multiparamétrica,

dosagem de citocinas (IFN-, IL-10, IL-5, IL-13, TNF-α, entre outras) nos sobrenadantes das

culturas de PBMC e avaliação das freqüências de células produtoras de citocinas relevantes

(IL-4 e IFN-) por ELISPOT. A evolução da resposta imune dos pacientes dos quatro grupos

4

será avaliada durante o tratamento por meio de citometria de fluxo multiparamétrica e

ELISA.

2. INTRODUÇÃO

As leishmanioses são um grupo de doenças causadas por diversas espécies do

gênero Leishmania, que se apresentam com um espectro de formas clínicas tegumentares e

viscerais, de caráter crônico, muitas vezes deformante e até fatal. Os quatro padrões

clínicos da doença no hospedeiro humano são leishmaniose cutânea (LC), leishmaniose

cutânea difusa (LCD), leishmaniose mucosa (LM), e leishmaniose visceral (LV) (Khatami, A.;

2007).

A classificação atual do gênero Leishmania segue o modelo taxonômico proposto por

Lainson & Shaw (1987), que dividem as leishmânias nos subgêneros Viannia e Leishmania.

No Brasil são reconhecidas pelo menos sete espécies de Leishmania responsáveis por

doença humana, sendo a LTA causada principalmente pela L. (V.) braziliensis, L. (V.)

guyanensis e L. (L.) amazonensis e, mais raramente, pela L. (V.) lainsoni, L. (V.) naiffi e L.

(V.) shawi, enquanto a L. (L.) chagasi é a responsável pela doença visceral. Cada espécie

apresenta particularidades concernentes às manifestações clínicas, a vetores, reservatórios

e padrões epidemiológicos, à distribuição geográfica e até mesmo à resposta terapêutica

(Siviero do Vale e Furtado, 2005).

Os parasitos do gênero Leishmania são flagelados da Família Trypanosomatidae,

Ordem Kinetoplastida, Filo Protozoa. A ordem Kinetoplastida caracteriza-se por apresentar

uma mitocôndria única (denominada cinetoplasto) rica em DNA mitocondrial, o kDNA

(Simpson, 1987; Wirth, 1990). Esta organela localiza-se anteriormente ao cinetossoma do

flagelo, perpendicularmente ao eixo maior do organismo, tendo sido muito estudada no

gênero Leishmania (Chakrabarty et al., 1962). As características morfológicas dos gêneros

que compõem a família Trypanosomatidae são bem homogêneas, sendo que todas as

espécies desta família são parasitos.

Os parasitos do gênero Leishmania são protozoários heteroxenos, que se

reproduzem por divisão binária, e apresentam em seu ciclo de vida duas formas evolutivas:

a forma promastigota, que é flagelada e extracelular, sendo encontrada no tubo digestivo do

hospedeiro invertebrado; e a forma amastigota, intracelular e sem movimentos, que parasita

as células do sistema fagocítico-mononuclear dos hospedeiros vertebrados. As

promastigotas apresentam corpo alongado, medindo entre 14 e 20 µm e flagelo livre. As

5

amastigotas têm corpo ovóide, medindo entre 2,1 e 3,2 µm e flagelo interno (Pessoa e

Martins, 1982).

Figur

a 1- Ciclo de vida da Leishmania spp. Adaptado de:

www.nature.com/.../v2/n11/fig_tab/nri933_F1.html

O parasito se reproduz no intestino do flebotomíneo e é introduzido no organismo do

hospedeiro pela picada, enquanto este faz seu repasto sangüíneo. No organismo, as formas

promastigotas são fagocitadas pelos macrófagos da pele sem sofrer destruição. Dentro do

macrófago, o parasito perde seu flagelo e adquire a forma amastigota, se reproduzindo

dentro das células de defesa e as destrói. Mais amastigotas são liberados no organismo,

continuando a infecção. Alguns tipos de leishmânia permanecem na pele, ou migram para

as mucosas (revestimento úmido) da boca ou do nariz, causando a leishmaniose

6

tegumentar. Outros migram para órgãos como o fígado e o baço, provocando a

leishmaniose visceral.

A adesão de Leishmania à membrana do macrófago é pré-requisito para sua

fagocitose. Diferentes moléculas integram a membrana de superfície das leishmânias, tais

como glicoproteínas (gp) e glicolipídios, fundamentais para sua interação com os

macrófagos, sendo a gp63 (gp63 ou PSP - “promastigote surface protease”) e o

lipofosfoglicano (LPG) as principais moléculas ligantes (Handman & Goding 1985, Russell &

Wilhelm 1986) . A pequena fração do inóculo infectante que consegue internalizar-se em

macrófagos, a partir da ligação direta dessas moléculas com receptores de membrana das

células, determina uma série de reações bioquímicas que podem levar à ativação ou à

inibição das funções parasiticidas da célula hospedeira. A ativação caracteriza-se pela

deflagração de processos oxidativos (sistema microbicida dependente de oxigênio) e

produção de óxido nítrico (Georges et al. 1990) .

À medida que ocorre o processo de fagocitose, os lisossomas das células fundem-se

aos vacúolos parasitóforos formados, resultando em uma modificação do seu

microambiente, que induz à transformação da forma promastigota para amastigota, que se

multiplica, rompendo a célula infectada para invadir novos macrófagos e dar continuidade à

infecção. Na forma amastigota, o parasito torna-se mais resistente e desencadeia menor

resposta oxidativa da célula hospedeira (Antoine et al. 1990) .

Os vetores da leishmaniose são dípteros da família Psychodidae, hematófagos

pertencentes aos gêneros Phlebotomus (Velho Mundo) e Lutzomyia (Novo Mundo), com

vasta distribuição nos climas quentes e temperados. São chamados popularmente no Brasil

de mosquito palha, biriguis e tatuquiras. Somente as fêmeas são hematófagas. São

geralmente de pequeno porte. Têm atividade crepuscular e pós-crepuscular, abrigando-se

durante o dia em lugares úmidos, sombrios e bem protegidos dos ventos (Rath, S. et al,

2003).

Os hospedeiros vertebrados das espécies envolvidas com as manifestações

tegumentares são animais silvestres como roedores, gambá, tamanduá, tatu, canídeos,

primatas e preguiça; e animais domésticos como cães, eqüídeos e o homem.

As leishmanioses ocorrem em quatro continentes, sendo consideradas endêmicas

em 88 países, dos quais 72 são países considerados em desenvolvimento. Segundo a

Organização Mundial da Saúde, 90% dos casos de LC ocorrem no Afeganistão, Brasil, Irã,

Peru, Arábia Saudita e Síria. Com mais de 12 milhões de infectados em todo o mundo, esta

zoonose encontra-se em expansão no Brasil, ocorrendo de forma endêmica no Norte,

7

Nordeste, Centro-Oeste e Sudeste (Rath, S; 2003). As manifestações clínicas da doença e a

resposta ao tratamento estão parcialmente relacionadas a espécie de Leishmania envolvida

(Lainson & Shaw 1987, Alexander & Russell 1992, Grogl et al. 1992, Navin et al. 1992, Belli

et al. 1998).

Por LTA, entende-se um conjunto de enfermidades causadas por várias espécies de

protozoários do gênero Leishmania, que acometem a pele e/ou mucosas das vias aéreo-

digestivas superiores do homem, e de diferentes espécies de animais silvestres e

domésticos das regiões tropicais e subtropicais. No Rio de Janeiro, a espécie predominante

é a Leishmania (Viannia) braziliensis. (Marzochi & Marzochi 1994). Em trabalho

desenvolvido em 2007, Azeredo-Coutinho e colaboradores relataram o primeiro caso

autóctone de leishmaniose cutânea difusa e também o primeiro caso de infecção em

humano causado por L. amazonensis no estado do Rio de Janeiro, onde apenas casos de

infecção por L. braziliensis haviam sido relatados.

A úlcera típica de LC é indolor e costuma localizar-se em áreas da pele expostas à

picada de insetos; com formato arredondado ou ovalado; medindo até alguns centímetros de

tamanho; base eritematosa, infiltrada e de consistência firme; bordas bem delimitadas e

elevadas; fundo avermelhado e com granulações grosseiras. A infecção bacteriana

associada pode causar dor local e produzir exsudato seropurulento que ao dessecar-se em

crostas recobre total ou parcialmente o fundo da úlcera (Pessôa & Barretto 1948, Marsden

1986) . Caso não tratadas, as lesões tendem à cura espontânea (Marsden et al. 1984, Costa

et al. 1990) em período de alguns meses a poucos anos, podendo também permanecer

ativas por vários anos e coexistir com lesões mucosas de surgimento posterior -

leishmaniose cutâneo-mucosa (LCM) (Pessôa & Barretto 1948, Marsden 1986) .

8

Quadro 1 - Diferenças entre as formas clínicas da leishmaniose tegumentar (Atlas de Leishmaniose Tegumentar Americana: diagnósticos clínico e diferencial).

Ministério da Saúde Editora do Ministério da Saúde, 2006).

A leishmaniose mucosa (LM) manifesta-se por lesões destrutivas, de evolução

arrastada, localizadas nas mucosas do nariz, boca, faringe e laringe. A forma mucosa pode

ocorrer vários anos após a cicatrização da lesão cutânea primária (Lainson 1983, Jones et

al. 1987) e acredita-se que seja conseqüente a metástases por via hemática (Llanos-

Cuentas et al. 1985). O mecanismo exato da produção da lesão mucosa, como as

leishmânias sobrevivem em latência no organismo humano durante anos e os fatores que

desencadeiam a doença são ainda desconhecidos. Sabe-se que as leishmânias

9

permanecem vivas em cicatrizes (Schubach A, et al. 1998). Sua sobrevivência depende da

presença de IL-10, uma citocina que inibe a resposta celular antígeno-específica, tornando

os macrófagos não responsivos aos sinais de ativação, causando uma supressão da

resposta imune (Nylén S. et al., 2007). Essa citocina possui um forte efeito inibitório da

produção e função do IFN- e da capacidade citotóxica e de apresentação de antígenos dos

macrófagos.

Diversos estudos têm demonstrado que a imunidade celular tem papel crucial na

cura da leishmaniose cutânea (Mendonça et al., 1986). A interação entre linfócitos T e

macrófagos é considerada indispensável na imunorregulação da leishmaniose cutânea;

entretanto ainda não se tem por completo esse conhecimento acerca de quais são os

mecanismos e como eles podem ser manipulados para aumentar a efetividade das drogas

usadas no tratamento. (Botelho ACC et al. 2009).

Mendonça e seus colaboradores sugeriram em 1995 que a ativação de respostas

protetoras ou não-protetoras, principalmente nos primeiros estágios da doença, é devida ao

tipo de padrão de citocinas que foi produzido por subpopulações distintas de linfócitos.

A IL-4 está associada com a forma ativa da doença, sendo detectada antes da

terapia antimonial, mas não após a cura (Da-Cruz et al, 2002). Altos níveis desta citocina

tem sido detectados em pacientes com lesões mucocutâneas crônicas e também em

leishmaniose visceral (Kharazmi A, et al. 1999). A IL-13 é uma citocina derivada do braço de

resposta celular Th2, com similaridades estruturais e biológicas em relação a IL-4. Estas

partilham ao menos um receptor. (Finkelman et al, 1999). A função exata da IL-13 ainda é

desconhecida, mas acredita-se que ela possa promover a produção de citocinas por células

Th2 (MacKenzie et al, 1998). Outros autores confirmam estes achados, concluindo que IL-4

e IL-13 atuam favorecendo a infecção, promovendo a resposta celular Th2 na leishmaniose

por L. major. Já a IL-5 e IL-10 parecem ter uma importante função, determinando o curso da

doença nos momentos iniciais da infecção, onde também ativam a resposta celular Th2

(Nashed BE, et al. 2000). A IL-5 foi originalmente reconhecida pela sua atividade como fator

de crescimento de células B, recentemente sua função no desenvolvimento de células B1 e

na produção de anticorpos foi descrita (Apostolopoulos et al. 2000).

O IFN- é uma citocina pró-inflamatória que atua ativando macrófagos, que capturam

os parasitos durante a infecção (Kharazmi, 1999). Da-Cruz e cols (1994) demonstraram que

linfócitos T reativos a L. braziliensis retirados do sangue de pacientes com LC e estimulados

in vitro foram capazes de produzir níveis muito maiores de IFN- em cultura do que células

de indivíduos controle não-infectados. Os níveis de IFN- foram maiores no final da terapia

10

do que antes desta, sugerindo que a capacidade de induzir produção de IFN- aumenta

durante o processo de cicatrização. Em outro estudo, aumento nos níveis de células T CD8+

e declínio de T CD4+, causando um equilíbrio nas proporções, também foi verificado (Da-

Cruz et al, 2002). Neste estudo foi sugerido que o aumento nos níveis de células T CD8+

reativas a Leishmania e a produção de IFN- podem ser importantes para a cicatrização das

lesões e provavelmente também para a proteção imunológica.

A presença da citocina pró-inflamatória fator de necrose tumoral (TNF) no sitio de

infecção é essencial para realizar a efetiva migração de um número suficiente de células

dendríticas apresentadoras de antígeno (Martin-Foncheta et al. 2003). Esta citocina é de

fundamental importância para a infiltração celular nos tecidos e tem importante função na

maturação de células dendríticas e subseqüente expressão do receptor de quimiocinas

CCR7(Ohl et al. 2004). TNF- faz sinergia com IFN- na indução da expressão de óxido

nítrico-sintase induzida (NOS2) e produção de óxido nítrico (NO) por macrófagos in vitro.

Além disso, a administração de TNF- recombinante a linhagens resistentes ou susceptíveis

de camundongos infectados com L. major melhora o curso da doença. Outras citocinas (IL-

2, IL-4, e IL-7), como o TNF-, atuam sinergicamente mediando a ativação dos macrófagos

para combater a infecção (Awasthi A, et al. 2004).

Freqüentemente, pacientes com LM referem lesões cutâneas compatíveis com LC e

apresentam "cicatrizes cutâneas sugestivas". Parte dos pacientes com LM refere ausência

de tratamento ou tratamento inadequado da lesão cutânea inicial, o que leva a se admitir

que as curas espontâneas e os tratamentos curtos e irregulares possam constituir risco para

o desenvolvimento de LM (D'Utra e Silva 1915, Pessôa & Barretto 1948, Walton et al. 1973,

Marsden 1986, Jones et al. 1987).

Apesar do uso medicinal de compostos de antimônio já ser conhecido desde a

Antiguidade, séculos antes da era cristã, para diversos fins terapêuticos, somente em 1912,

Gaspar de Oliveira Vianna observou que o tártaro emético era eficaz na terapêutica da LTA.

Três anos mais tarde, na Itália, também foi comprovada a eficácia desta droga no

tratamento da leishmaniose visceral.

Devido aos efeitos tóxicos associados ao emprego do tártaro emético, como

intolerância gastrintestinal e efeitos cardiotóxicos, os antimoniais trivalentes foram sendo

substituídos por compostos estibiados pentavalentes. Os antimoniais pentavalentes vêm

sendo empregados há mais de 60 anos e continuam sendo as drogas de primeira escolha

para o tratamento das leishmanioses (Goodwin 1995, Herwaldt 1999). As bases bioquímicas

11

para sua efetividade são ainda pouco definidas, mas acredita-se que a inibição da síntese

de ATP pode estar envolvida (Blum JA et al. 2009).

Além dos antimoniais, outras drogas tem sido empregadas no tratamento das

diversas formas de leishmaniose, entre as quais se destacam a pentamidina, anfotericina B,

o miltefosine, a paromomicina e o alopurinol. Tem-se relatado também o uso de anfotericina

B liposomal (Janvier F. et al. 2008).

A terapêutica com os antimoniais pentavalentes pode variar no que se refere ao

esquema terapêutico empregado, sua duração, à dose total e dose diária necessárias para

obtenção da cura clínica, assim como a ocorrência de recidivas ou resistência. Mesmo

sendo uma droga eficaz no tratamento da maioria dos casos, a má resposta terapêutica tem

sido descrita e parece estar aumentando em intensidade e prevalência (Grogl et al. 1992) .

A ausência de resposta ao estibogluconato de sódio e ao antimoniato de meglumina

demonstrada nas leishmanioses visceral e mucocutânea, tem sido reconhecida como um

sério problema. .

A Organização Mundial de Saúde preconiza que as doses de antimoniais não devem

ultrapassar 20 mg/kg/dia, não se ultrapassando o limite de 850 mg de antimônio, devido à

sua elevada toxidez. O antimônio pode ainda ser detectado no cabelo de pacientes tratados

com antimoniais pentavalentes até um ano após o termino do tratamento (Dorea JG, et al;

1987). Mialgias, dores abdominais, alterações hepáticas e distúrbios cardiológicos são

efeitos colaterais frequentemente associado ao uso destas drogas (Rath, S. 2003).

Figura 2 - Estrutura química do antimoniato de meglumina (Glucantime).

Os antimoniais pentavalentes parecem atuar no mecanismo bioenergético das

formas amastigotas da leishmania, através de glicólise e beta-oxidação que ocorrem nas

organelas denominadas glicossomas. Outro mecanismo aventado é o de ligação com sítios

sulfidrílicos, deflagrando a morte destes protozoários (Berman et al., 1985).

12

Alguns autores acreditam que a resposta favorável ao tratamento com antimoniais

pentavalentes dependeria do pico sérico alcançado ou da manutenção de uma

concentração sérica inibitória durante a maior parte do tempo (Chulay et al. 1988) . O

achado que o antimônio pentavalente é rapidamente excretado na urina, resultando em

níveis séricos subterapêuticos em poucas horas, levou à interpretação que o risco de

toxidez cumulativa era baixo e que os esquemas terapêuticos intermitentes seriam

farmacologicamente infundados (Rees et al. 1980, Oster et al. 1985, Berman 1988) . Outros

autores (Chulay et al. 1988, Mortari 2001, Miekeley et al. 2002) confirmaram aqueles

achados.

Diversos esquemas de tratamento antimonial têm sido utilizados para a LC. As

principais diferenças entre estes regimes terapêuticos disponíveis relacionam-se ao uso do

antimoniato de meglumina ou do estibogluconato de sódio; à administração contínua ou

intermitente, a dose diária total, à duração do tratamento, aos critérios usados para a

interrupção ou prolongamento do tratamento, e às espécies e linhagens de Leishmania

envolvidas (Schubach et al, 2005). Respostas clinicas insatisfatórias ou ausência de

resposta ao tratamento antimonial têm sido atribuídas ao emprego de baixas doses ou ao

curto tempo de administração antimonial (Berman, 1988).

Algumas formas de leishmaniose precisam de altas doses de antimonial ou

tratamento de longa duração, porque apresentam resistência à terapia ou resposta

insuficiente, como na leishmaniose mucosa causada por L. braziliensis (Grimaldi et al, 1989;

Berman, 1988). Isso pode ser devido a diversos fatores, entre eles a resposta imune

inadequada, tanto geneticamente, quanto por condições clínicas (doença associada ou

terapia imunossupresiva), problemas farmacocinéticos, esquemas errôneos de terapia,

fatores do parasito e heterogeneidade de grupos antimoniais (Grogl et al., 1989).

No Brasil, o Ministério da Saúde (MS) recomenda tratar os pacientes com LC com

antimoniato de meglumina na dose de 10-20 mg Sb5+/kg/dia durante 20 dias. Os pacientes

com LM devem utilizar 20mg Sb5+/kg/dia durante 30 dias. Em ambos os casos, deve-se

respeitar o limite máximo de três ampolas diárias. (Brasil et al. 2000). No entanto, outros

regimes de tratamento vêm sendo empregados por diversos autores. O tratamento com uma

ampola de antimoniato de meglumina, independentemente do peso corporal, por injeções

intramusculares, durante 10 dias, sendo repetidas três vezes com intervalos de 10 dias,

demonstrou alto percentual de cura sem desenvolvimento de lesões na mucosa (Oliveira-

Neto e Matos, 2006). O uso de uma ampola do antimoniato de meglumina independente do

peso corporal, por pelo menos 25 dias também foi testado. Como cada ampola contem 425

13

mg de Sb5+ em uma solução de 5 mL, com este regime a dose individual de antimônio tem

uma variação considerável (Oliveira-Neto et al, 1996).

Quadro 2 - Esquema terapêutico preconizado para as diversas formas clínicas de LTA (OMS).

O tratamento antimonial utilizando baixas doses demonstrou grande eficiência no

município do Rio de Janeiro, sendo menos tóxico aos pacientes e, na maioria das vezes, tão

efetivo contra a infecção quanto o tratamento com altas doses (Lopes et al., 1984). Azeredo-

Coutinho e colaboradores, em 2007, comprovaram que a espécie L. braziliensis, a principal

causadora de infecção no município, é altamente sensível ao Glucantime.

Foi provado que em diferentes regiões o esquema adequado e as doses necessárias

para se obter cura podem variar, devido à sensibilidade da espécie de Leishmania ao

antimonial. (Berman et al, 1988).

Recentemente o perfil fenotípico de células do sangue periférico de pacientes com

LTA de uma área endêmica em Minas Gerais, foi avaliado antes e depois de três diferentes

regimes terapêuticos. Grupos de pacientes foram tratados com Glucantime ou com

Leishvacin. O grupo A recebeu 17mg/kg/dia de Glucantime, em um esquema de tratamento

em séries de 10 dias; o grupo B recebeu de 100 a 500 l por dia de Leishvacin em séries de

10 dias e o grupo C recebeu ambos os tratamentos simultaneamente. Análises

comparativas destas células revelaram que os regimes terapêuticos não induziram

diferenças significantes na porcentagem de linfócitos CD3/CD4, linfócitos B CD19 ou células

NK. As razões entre CD4/CD8 e CD3/CD19 também permaneceram inalteradas. O perfil

fenotípico celular ex vivo observado neste estudo revelou que os diferentes tratamentos

empregados não alteraram significantemente a resposta imune exibida pelos pacientes,

tanto antes da terapia quanto após a cura (Botelho ACC et al. 2009).

14

Um estudo feito no município do Rio de Janeiro comparou a eficiência do tratamento

antimonial intermitente, frente ao esquema continuo (Azeredo-Coutinho, 2002). O esquema

de tratamento intermitente foi significativamente mais eficaz para cura do que o contínuo,

apresentando também menor índice de abandono do tratamento. Da mesma forma, quando

diferentes esquemas de tratamento intralesional para leishmaniose cutânea do Velho Mundo

foram comparados, o esquema intermitente foi significativamente mais efetivo do que o

tratamento contínuo (Tallab, T.M. et al., 1996).

As leishmanioses atingem milhões de pessoas no mundo, causando vitimas fatais, e

ainda não têm uma medida de controle eficaz. É necessário se estabelecer esquemas

terapêuticos menos dolorosos e menos tóxicos, que propiciem uma melhor adesão ao

tratamento.

3. JUSTIFICATIVA

A evolução clínica das leishmanioses é dependente da resposta imune mediada por

células (Bryceson AD et al, 1970; Castes M et al, 1983). Os estudos imunológicos sobre a

LTA têm focalizado dois objetivos principais: a caracterização da resposta imunológica

associada às diferentes formas do espectro clínico-patológico (Castes M et al, 1983;

Bacellar O et al, 2002) e a elucidação dos mecanismos imunológicos envolvidos na cura e

na patogênese desta doença (Coutinho SG et al, 2002; Castes et al, 1988). A evolução da

resposta imune anti-Leishmania durante e após o tratamento tem sido descrita tanto na

quimioterapia convencional com antimoniais pentavalentes (Coutinho SG et al, 2002;

Mendonça SC et al, 1986; Castes et al, 1989) quanto em terapias alternativas, como

imunoterapia (Castes M et al, 1989; Sharples CE et al, 1994; Cabrera et al, 2000; Botelho

ACC et al, 2009).

Alguns parâmetros imunológicos têm sido identificados como marcadores de uma

evolução favorável, tais como aumento da produção de IFN- (Cabrera et al, 2000; Coutinho

SG et al, 1998) e da proporção do fenótipo CD8+ entre as células reativas a antígenos de

Leishmania ( Da Cruz, et al. 1994) e diminuição da produção dos níveis séricos de TNF-

(Da-Cruz AM et al, 1996; D'Oliveira A Jr, et al, 2002) e de anticorpos específicos (Souza,

WJS et al. 1982). Neste sentido, é importante que este ensaio clínico, que pretende

comparar a eficácia e a segurança de diferentes esquemas de tratamento, se faça

acompanhar por um estudo que vise demonstrar a presença ou ausência de diferenças na

evolução da resposta imune específica para o parasito nos grupos submetidos aos

diferentes esquemas terapêuticos.

15

Para observação da existência de variações na resposta imune dos pacientes vamos

utilizar a técnica de citometria multiparamétrica, visando elucidar os mecanismos relativos à

resposta ao tratamento antimonial. A citometria multiparamétrica pode ser usada para

mensurar a função ou morte celular (pelo perfil de produção de citocinas e citotoxidez) célula

a célula. Esse tipo de analise prove mais dados com menor quantidade de amostras, o que

é muito eficiente quando o material dos pacientes é limitado (Chattopadhyay PK et al. 2008).

A análise multiparamétrica também permite uma identificação mais acurada das populações.

O aprofundamento destes estudos seria de grande importância para avaliação de

eventuais variações na resposta imunológica ao antimoniato de meglumina, assim como no

monitoramento da variabilidade genética e da possível existência de clones resistentes na

população de L. (V.) braziliensis circulantes nas áreas endêmicas do Estado do Rio de

Janeiro.

4. OBJETIVOS

4.1 Geral

• Caracterizar as respostas imunes associadas a diferentes esquemas utilizando antimoniato

de meglumina para o tratamento de pacientes com leishmaniose cutânea.

4.2 Específicos

• Comparar os níveis séricos de anticorpos anti-Leishmania por imunofluorescência indireta

e ELISA e de TNF- antes e depois da administração de cada esquema terapêutico.

• Comparar as respostas proliferativas de células mononucleares de sangue periférico dos

pacientes (CMSP) em culturas estimuladas com antígenos de Leishmania antes e depois da

administração de cada esquema terapêutico.

• Comparar os níveis de citocinas relevantes (IFN-, IL-10, IL-5, IL-13, TNF-) em

sobrenadantes das culturas de CMSP estimuladas com antígenos de Leishmania antes e

depois da administração de cada esquema terapêutico.

• Comparar as freqüências de células produtoras de citocinas relevantes (IFN- e IL-4) por

ELISPOT.

16

• Comparar as proporções entre os fenótipos de células T reativas a antígenos de

Leishmania por citometria de fluxo multiparamétrica antes, durante e depois da

administração de cada esquema terapêutico.

• Procurar identificar particularidades nas características das respostas imunes associadas a

cada um dos esquemas terapêuticos.

• Verificar a existência de associações ou correlações entre as características das respostas

imunes observadas em cada um dos grupos e o grau de eficácia de cada um dos tipos de

tratamento.

5. METODOLOGIA

5.1 Grupos de estudo

Cada paciente com LC será incluído em um dos seguintes grupos de tratamento com

antimoniato de meglumina (Glucantime, Aventis, São Paulo) por via IM:

1- 20mg Sb5+/kg/dia por 20 dias contínuos.

2- 20mg Sb5+/kg/dia intermitente em 2 séries de 10 dias intercaladas com 10 dias de

intervalo.

3- 5mg Sb5+/kg/dia por 30 dias contínuos.

4- 5mg Sb5+/kg/dia intermitente em 3 séries de 10 dias intercaladas com 10 dias de intervalo.

Neste subprojeto serão estudados 10 pacientes de cada grupo, selecionados

aleatoriamente. Coletas de 30 mL de sangue periférico para a obtenção de amostras de 25

mL de sangue heparinizado e 5mL de soro para os ensaios imunológicos serão realizadas

antes do tratamento e nas consultas dos dias 140 (3 meses após o término do tratamento

mais longo) e 410 (um ano após o término do tratamento mais longo) do cronograma do

estudo (anexo). Adicionalmente, amostras de 20 mL de sangue periférico serão coletadas

no dia 20 durante o esquema de tratamento.

17

5.2 Critérios de elegibilidade do projeto geral

Os critérios de elegibilidade, interrupção do tratamento e retirada do estudo

são comuns a todos os sub-projetos e estão sob responsabilidade dos clínicos do

Laboratório de Vigilância em Leishmaniose.

Critérios de inclusão

1. Leishmaniose cutânea com diagnóstico parasitológico por um ou mais dos seguintes

métodos: exame direto (raspado ou imprint), histopatológico, cultura, imunohistoquímica ou

PCR.

2. História de exposição em área endêmica do estado do Rio de Janeiro.

3. Ausência de tratamento anterior com antimoniato de meglumina.

Critérios de exclusão

1. Mulheres que não fazem uso de métodos contraceptivos ou o fazem de forma

inadequada.

2. Gestantes.

3. Menores de 13 anos.

4. Uso de terapia imunossupressora (corticoterapia, quimioterapia para câncer) ou uso de

medicações para tuberculose ou hanseníase.

5. Presença de alterações basais clínicas equivalentes a efeito adverso nível >Grau 3.

6. Presença de alterações basais laboratoriais equivalentes a efeito adverso nível >Grau 2.

7. Presença de alterações basais eletrocardiográficas equivalentes a efeito adverso nível

>Grau 4 e/ou QTc basal >0,46ms (equivalente a E A nível Grau 1).

5.3 Critério para interrupção definitiva do tratamento do estudo

1. Interrupção motivada por EA clínico, laboratorial ou eletrocardiográfico Grau 4.

2. Interrupção superior a 10 dias motivada por efeito adverso clínico, laboratorial ou

eletrocardiográfico Grau >3.

3. Interrupção espontânea do uso da medicação prescrita em quantidade superior a cinco

doses consecutivas, por falha de administração (não adesão).

5.4 Critérios para retirada do estudo (mas não da análise de dados)

1. Interrupção definitiva do esquema de tratamento para o qual foi aleatorizado, por

qualquer causa.

18

2. Necessidade de introdução de droga imunossupressora ou potencialmente tóxica

(quimioterapia para câncer, esquema para tuberculose ou hanseníase).

3. Doença intercorrente, sem relação com a droga estudada, mas com manifestações

equivalentes ou superiores a EA clínico Grau 3.

4. Necessidade de re-tratamento por má resposta terapêutica inicial ou tardia.

5. Desistência do paciente em prosseguir o estudo.

5.5 Testes sorológicos

Os testes sorológicos para detecção de anticorpos anti-Leishmania por imunofluorescência

indireta e ELISA e de TNF- serão realizados pelo VigiLeish seguindo protocolo próprio da

rotina.

5.5.1 Detecção de anticorpos anti- Leishmania por imunofluorescência indireta

Os soros serão diluídos em PBS progressivamente ½ nas proporções entre 1:40 até

1:640 e formas promastigotas serão utilizadas como antígeno. Após a aplicação do

antígeno, as lâminas secarão por 12 horas à temperatura ambiente. Adicionar-se-á 10l das

diluições nos orifícios das lâminas, incubando-as em câmara úmida por 30 minutos a 37oC.

Após esse período, as lâminas serão lavadas por 3 minutos em PBS e depois, por 3 minutos

em água destilada e secas em seguida. A diluição do conjugado anti-IgG humano (Sigma)

utilizada será de 1:100, em PBS contendo o reagente azul de Evans na proporção de 1:25.

A seguir serão adicionados 15l da solução do conjugado em cada orifício das lâminas,

sendo as etapas de incubação, lavagem e secagem repetidas como anteriormente. As

lâminas serão montadas com glicerina tamponada entre a lamínula. No microscópio de

fluorescência serão avaliados os soros, considerando-os como positivos quando

apresentarem uma fluorescência a partir da diluição 1:40 e como negativos quando não

apresentarem fluorescência.

5.5.2 Detecção de anticorpos por ELISA

As placas (marca NUNC, maxSorp) serão sensibilizadas com 100 L de extrato

antigênico total parcialmente solúvel de formas promastigotas de L. braziliensis em

concentrações previamente definidas por titulação em concentrações variáveis de proteína

(g/mL) diluídos em tampão carbonato-bicarbonato pH 9,6 e posteriormente incubadas

overnight (18 horas) a 8°C. Após 4 lavagens com PBS pH 7,2 com 0,05% de Tween 20

(PBS-T), em lavadora automática (Tecan – Columbus Washer), será adicionado em cada

poço 100µL das amostras de soro diluídas a 1:40 em PBS-Tween, 1% de leite desnatado

(Molico; PBS-TL), incubando-se por 1 hora a 37ºC. Seguindo-se a 4 novas lavagens, serão

19

adicionados 100µl de anti-IgG (Sigma) conjugada a peroxidase, diluídos em PBS-TL e

previamente titulados. Após 1 hora de incubação a 37ºC e quatro novas lavagens serão

adicionados 50µl de solução de 3,3’, 5,5’ de tetrametilbenzidina (substrato líquido para

ELISA; Sigma). As placas serão incubadas por 30 minutos na ausência de luz,

interrompendo-se a reação por adição a cada poço de 50µl de 2M H2SO4. Os valores de

Absorbância serão lidos a 450 nm em leitor automático de placas (Tecan - Spectran

Classic). A linha de corte ("cut off") será estabelecida como a média das leituras de

absorbância dos controles negativos mais duas vezes o desvio padrão das mesmas.

5.6 Dosagem de TNF- no soro

Os níveis de TNF- serão determinados nos soros por ELISA, como descrito em

publicação anterior (Da-Cruz et al. 1996) e segundo as especificações do kit Factor-

TestTMh TNF- ELISA Test Kit (Genzyme). Resumidamente, neste ensaio será utilizado

como padrão um recombinante de TNF- humano preparado em diluições seriadas fator 2

variando de 800 a 12 pg/mL. Uma microplaca de 96 poços será revestida com o anticorpo

monoclonal purificado específico para o TNF- humano e incubada durante a noite. As

amostras de soro e do padrão recombinante serão adicionadas em duplicata. A seguir, um

segundo anticorpo policlonal anti-TNF- humano produzido em coelho será adicionado aos

poços e sequencialmente após este será colocado um terceiro anticorpo, anti-IgG de coelho

marcado com biotina, produzido em cabra. O conjugado estreptoavidina-peroxidase será

distribuído em cada poço e em seguida adicionado uma solução substrato para revelar a

reação. A absorbância será medida utilizando filtro de 492nm. Os resultados serão

expressos em pg/mL.

5.7 Obtenção de CMSP

CMSP dos pacientes serão obtidas por centrifugação em gradiente de ficoll-hypaque

segundo metodologia previamente publicada (Mendonça et al. 1986) a partir de 25-30mL

de sangue periférico retirados de cada indivíduo por venopunção, utilizando-se tubos de

12mL com vácuo, heparinizados (Liquemine 500 UI, Roche).

O sangue heparinizado será diluído com 20mL de meio RPMI 1640 (Sigma)

suplementado com 10mM Hepes, 1,5mM/1 L-glutamina, antibióticos (penicilina 200UI/mL e

estreptomicina 200g/mL) e 0,04mM 2-mercaptoetanol (meio RMPI completo) e as células

mononucleares isoladas por centrifugação em gradiente de Ficoll-Hypaque (Histopaque-

1077, Sigma), 850g/20 minutos a 20 C. O anel será retirado com o auxílio de pipeta Pasteur

e as células obtidas lavadas 3 vezes, por centrifugação em RPMI completo 350g/10

minutos, a 20 C.

20

Após a contagem na câmara de Neubauer, a viabilidade das células será verificada

usando-se o corante Azul de Trypan (Sigma), e a concentração das células viáveis

posteriormente ajustada para 3x106/mL, em meio RPMI completo contendo 20% de soro AB

Rh+ inativado, de doador sadio humano.

5.8 Resposta proliferativa de linfócitos

Será realizada de acordo com técnica previamente descrita (Mendonça et al. 1986) .

Cem microlitros da suspensão de CMSP serão distribuídos nos poços de placas de

microtitulação de fundo plano (Nunc, Roskilde, Dinamarca). As culturas de CMSP serão

feitas em triplicatas de poços estimulados com 50g/mL de antígenos totais de Leishmania e

20g/mL de mitógeno (concanavalina A), separadamente. Como controle em cada

experimento com cada doador, três poços não receberão estímulo (“background”). Em todos

os poços, um volume final de 200l será atingido, através da adição de meio RPMI

completo. As células serão mantidas em cultura, por 5 dias, em incubadora a 37 C, em ar

umidificado contendo 5% de CO2.

Dezesseis horas antes da coleta, será adicionado, em cada poço, 1Ci de 3H

timidina (Armersham International, Buckinghamshire, Grã-Betanha, atividade específica de 5

Ci/mmol). As células serão finalmente coletadas em papel de filtro (Titertek, Flow

Laboratories, Huntsville, EUA), utilizando-se um multi-coletor "cell harvester" (Titertek, Flow

Laboratories). A intensidade da incorporação da timidina triciada será medida em um

contador de radiação beta (Packard, 1600CA, Boston, EUA) e os resultados expressos em

índices de estimulação (IE), calculados pela média de contagem dos poços contendo cada

estímulo dividida pela média das contagens dos poços controle. Serão consideradas

positivas as culturas de células que estimularam um índice de proliferação >2,5 em relação

ao background (Mendonça et al. 1986) .

5.9 Dosagem de citocinas em sobrenadantes das culturas de CMSP

A dosagem de TNF- em sobrenadantes de culturas de CMSP estimuladas com

antígenos de Leishmania seguirá protocolos já publicados (Matos et al. 2005) . E a

dosagem das citocinas IFN-, IL-10, IL-5 e IL-13 será feita por meio de kits ELISA Ready-

SET-Go da eBioscience, seguindo protocolo próprio.

Os sobrenadantes de cultura de CMSP obtidas dos indivíduos estudados e

independentemente estimuladas com o extrato total de Leishmania braziliensis (Lb) e de

concanavalina A (ConA) serão coletados às 24h (TNF-), 72h (IL-10 e IL-5) e 120h (IFN-)

após o início das culturas, e serão estocados em condições estéreis a -70ºC até o momento

21

da análise. A quantificação das respectivas citocinas será realizada em placas de 96 poços

de fundo plano (Maxisorp, Nunc), através de ensaio imunoenzimático (ELISA), utilizando-se

anticorpos monoclonais purificados e biotinilados específicos para cada citocina

(Pharmingen). A enzima utilizada será a peroxidase, acoplada a estreptoavidina, e a

revelação da reação será feita pela adição, em cada poço, de 100l de uma solução

contendo 0,1M de ácido cítrico anidro pH 4,35 (Sigma), 1mg/mL do cromógeno 2,2´-azino-

bis-(3-ethylbenz-thiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS, Sigma) e 10l do substrato peróxido de

hidrogênio a 30% (Sigma). Após 30-80 minutos à temperatura ambiente a leitura das

absorbâncias será efetuada em intervalos regulares de 15 minutos, em um leitor de ELISA

(Emax, Molecular Devices, EUA) utilizando-se um filtro de 405nm. As concentrações das

citocinas presentes nas amostras testadas serão determinadas pela comparação com curva

padrão, obtidas com as citocinas recombinantes (Pharmingen) em diluições seriadas fator 2,

variando de 0 a 2000pg/mL. Os resultados obtidos com a estimulação pelos antígenos

testados serão então descontados dos resultados das culturas não estimuladas. Quando a

dosagem de citocinas nas culturas não estimuladas for superior à das culturas estimuladas,

o resultado será considerado como zero.

5.10 Caracterização do fenótipo de células reativas a Leishmania

- Marcação multifuncional para citometria

Um total de 3x105 células obtidas de cada paciente serão estimuladas por 16 horas

na presença das frações antigênicas de Lb (10g/ml), ConA (60g/ml) e 2µg/ml de anticorpo

anti CD28. Durante as 14 horas finais de incubação serão adicionados a cada poço 10g/ml

de Brefeldina A. Culturas estimuladas exclusivamente com o anticorpo anti CD28 serão

utilizadas como controle negativo e, como controle positivo, as células serão estimuladas

com PMA (20µg/ml) e Ionomicina (1µM).

Após este período de incubação as células serão lavadas em PBS e colocadas em

uma solução de bloqueio (PBS/BSA, contendo 5% de leite desnatado) durante 5 minutos a

20oC. Posteriormente adicionam-se as combinações de anticorpos para marcação de

superfície (CD3, CD4, CD8, CD16, NKT, CD25 e FoxP3). Após uma incubação de 20

minutos sequem-se 2 lavagens com PBS/BSA. As células serão então fixadas em

paraformaldeído 4% por 10 min 20oC, lavadas com PBS/BSA e incubadas durante 1h, a 4oC,

em 100µl de tampão de permeabilização. Subsequentemente a permeabilização adiciona-se

a cada tubo a mistura de anticorpos para marcação intracelular de citocinas (IL-2, IL-4, IL-10,

IL-13, IL-17, IFN-, TNF- e TGF-). Após um período de incubação de 30 min a 4oC as

células serão lavadas 1 vez em PBS/BSA contendo 0,1%Saponina, uma segunda vez com

PBS/BSA, para que a Saponina seja removida, ressuspensas em 500µl de PBS/BSA e

22

posteriormente analisadas por citometria de fluxo. Um número de aproximadamente 50.000

eventos será adquirido dentro do “gate” de linfócitos vivos em um citômetro de fluxo Cyan

(Dako).

5.11 Quantificação das células produtoras de IFN- e IL-4 por Elispot

Numa placa de ELISPOT (ELIIP10SSP Millipore, EUA) serão colocados 50L da

solução de anticorpo de captura purificado a 10 g/mL em PBS estéril por poço. Estas

preparações serão incubadas por 18 h a 4 C, em seguida as placas serão lavadas três

vezes com PBS estéril utilizando 100 L/poço. As placas serão bloqueadas com meio RPMI

1640 (Sigma) suplementado com 10mM Hepes, 1,5mM/L L-glutamina, antibióticos

(penicilina 200UI/mL e estreptomicina 200g/mL) e 0,04mM 2-mercaptoetanol (meio RMPI

completo) adicionado de 10% SFB 100L/poço e incubadas a 37 C e 5% CO2 até o

momento da realização do ensaio. Serão então adicionadas 100 L/poço de suspensão

celular contendo 2 x 106 células/mL em meio RPMI completo com 20% de soro AB e depois

100 mL/poço de meio completo sem soro com o antígeno (Lb 10 g/mL) ou mitógeno (ConA

20 g/mL) ou sem estes estímulos (“background”). As placas serão incubadas por 40 h a 37

C e 5% CO2 e após este tempo, o conteúdo das placas será descartado e os poços serão

lavados quatro vezes com PBS/Tween 20 0,05% (Sigma). Será adicionado em cada poço

100L do anticorpo de detecção na concentração 1μg/mL em PBS/BSA 0,1% (Sigma). As

placas serão incubadas por 4 h a 37 C e 5% CO2 e lavadas por três vezes com 200L/ poço

de PBS/Tween. Cem microlitros de conjugado fosfatase alcalina/estreptavidina diluída

1:4000 em PBS/BSA serão adicionados e as placas incubadas por 4 h a 37 C. Após o

descarte do conteúdo dos poços serão adicionados 100L da solução substrato preparada

em tampão Tris com NBT e BCIP (Sigma). Após revelada a reação, o que geralmente ocorre

entre 5 e 10 minutos, todos os poços da placa serão lavados e secos. A leitura dos pontos

corados (“spots”) será feita utilizando o aparelho ImmunoSpot Analyser (Cellular Technology

Ltda - C.T.L).

5.12 Análise estatística

Será realizada através de testes não paramétricos, utilizando-se o programa

“Graphpad Prism” 5.  Os resultados serão considerados significantes quando p<0,05.

6. RESULTADOS ESPERADOS

23

Um possível resultado deste estudo seria a demonstração de que a evolução clínica

favorável obtida com um protocolo alternativo de tratamento antimonial estaria associada a

um perfil imunológico semelhante ao observado com o esquema convencional. Conclusão

semelhante foi obtida em estudos que compararam imunoterapia com quimioterapia

antimonial (Convit, et al. 1987; Botelho, et al. 2009). Por outro lado, caso diferenças de

eficácia sejam detectadas entre os esquemas utilizados, será interessante tentar identificar

as características da resposta imune associada ao esquema mais eficaz.

7. RESULTADOS

7.1- Dosagem de citocinas em sobrenadantes de culturas de CMSP pelo método de ELISA

Para realização dos ensaios imunoenzimáticos foram estudados pacientes incluídos no

ensaio clínico. Onze destes pacientes foram estudados antes do tratamento (AT), oito

pacientes no 20º dia de tratamento (DT), e 15 pacientes no dia 140 de acompanhamento

após o tratamento (PT). Foram estudados ainda quatro indivíduos sadios, sem exposição à

Leishmania e considerados como parte de um grupo controle. Os dados clínicos dos

participantes são apresentados na tabela 1.

Para análise do perfil de produção de citocinas pela técnica de ELISA foram coletados

sobrenadantes das culturas de CMSP, estimuladas com o mitógeno concanavalina A (ConA)

ou com extrato total de promastigotas mortas de Leishmania braziliensis (Lb), em 72 horas

de incubação a 37°C em atmosfera de CO2 (TNF-α, IL-10 e IL-5) e em 120 horas (IFN-γ e

IL-13). A dosagem foi realizada utilizando-se kits Ready Set-Go Human (e-Bioscience) e as

leituras feitas pelo equipamento Emax (Molecular Devices), que gera os resultados no

programa SoftMax Pro. Os gráficos comparam a média produção destas citocinas (em

pg/ml) em cada grupo de pacientes antes, durante e após o tratamento antimonial.

Grupos N. indivíduos Sexo Idade N. de lesões Montenegro

AT 21 M= 12 /F=

5

36±16,9 1,2±0,6 15,6±7,6

DT 11 M= 10 /F=

1

38,3±14,3 1,9±1,8 18,9±6,3

PT 19 M= 13 /F= 39,4±15,2 1,3±0,6 16,9±6,5

24

6

Controle 3 M= 0 /F= 3 26±1 --- ---

Tabela 1- Dados clínicos dos pacientes estudados utilizando-se a técnica de ELISA. Dados apresentados como médias ± desvios padrão

● IFN-gama

Quando as células foram estimuladas por ConA a produção foi maior no grupo

controle sadio em relação ao grupo AT e também DT (p< 0,05). O grupo pós-tratamento

(PT) também mostrou diferença significativa na produção de IFN-gama em relação ao grupo

AT (p< 0,05) (Figura 1).

Quando as células foram estimuladas com Lb, houve uma maior produção de IFN-

nos grupos AT e PT em relação ao grupo controle (p< 0,05) (Figura 2).

Figura 1- Produção de INF- nos grupos AT, DT, PT e Controle (Cont), em CMSP estimuladas por ConA. Os resultados foram descontados do controle não estimulado (background). Análise estatística feita pelo teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunn.

25

Figura 2- Produção de INF- nos grupos AT, DT, PT e Controle (Cont), em CMSP estimuladas por antígeno de Lb Os resultados foram descontados do controle não estimulado (background). Análise estatística feita pelo teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunn.

● IL-10

Nos grupos estimulados por ConA não houve diferença significativa entre os níveis

de citocina encontrados (Figura 4). Entretanto, quando estimulamos as células com antígeno

de Lb o grupo de pacientes PT apresentou diferença significativa (p< 0,05) na produção da

citocina em comparação ao grupo DT (Figura 5). Não são apresentados os resultados do

grupo controle nos gráficos de IL-10 porque não foi possível realizar a técnica até o

momento da redação do relatório.

26

Figura 4- Produção de IL-10 nos grupos AT, DT e PT, em CMSP estimuladas por ConA (Os resultados foram descontados do background). Análise estatística feita pelo teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunn.

Figura 5- Produção de IL-10 nos grupos AT, DT e PT, em CMSP estimuladas por antígeno de Lb (Os resultados foram descontados do background). Análise estatística feita pelo teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunn.

27

● IL-5

Não encontramos diferenças estatísticas entre os grupos de pacientes estimulados

tanto por ConA quanto por Lb, apenas observamos que a dosagem de IL-5 no grupo AT foi

maior do que nos outros grupos (Figuras 6 e 7).

Figura 6- Produção de IL-5 nos grupos AT, DT e PT, em CMSP estimuladas por ConA (Os resultados foram descontados do background). Análise estatística feita pelo teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunn.

Figura 7- Produção de IL-5 nos grupos AT, DT e PT, em CMSP estimuladas por antígeno de Lb (Os resultados foram descontados do background). Análise estatística feita pelo teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunn.

28

7.2- Caracterização do fenótipo de células reativas a Leishmania pela técnica de citometria

de fluxo

Ensaios foram realizados com CMSP de 4 pacientes antes do tratamento (AT), 7

pacientes no dia 140 de acompanhamento após o tratamento e ainda 5 doadores sadios

usados para controle dos experimentos. Os dados clínicos destes pacientes são

apresentados na tabela 2.

A avaliação do fenótipo das células mononucleares reativas ao antígeno de

leishmania e o perfil de produção de citocinas (IFN-γ, TNF-α, IL-2 e IL-10) por cada fenótipo

foi estudado por meio de citometria.

As CMSP foram estimuladas com 10g/mL de antígeno de Lb, 60g/mL de ConA

(controle positivo), ou apenas as células (Background) na presença de 2µg/mL de anti

CD28, então foram incubadas por 16 horas na presença de 10µg/mL de brefeldina A

(Sigma). As células receberam marcação intracelular e de superfície com anticorpos

monoclonais anti CD4 APC-Cy7, anti CD8 PE-TexasRed; anti CD25 PE-Cy5, anti IFN-γ PE-

Cy7, anti TNF-α FITC, anti IL-2 APC e anti IL-10 PE (eBioscience). Para avaliação destas

marcações, 30.000 eventos foram adquiridos dentro do gate de linfócitos vivos para cada

amostra, no citômetro Cyan (Dako) e analisadas no programa FlowJo.

Os resultados de produção de citocinas pelos fenótipos são expressos pelo índice de

intensidade média de fluorescência integrada (iMFI), que consiste na multiplicação da média

de intensidade de fluorescência de uma determinada citocina pela freqüência das células

produtoras dessa citocina.

Grupos N.

indivíduos

Sexo Idade N. de lesões Montenegro

AT 4 M= 3 /F= 1 28,7±11 1±0 17±0

PT 7 M= 6 /F= 1 42,1±16,9 1,4±0,7 12,4±4,3

Controle 5 M= 2 /F= 3 25,2±1,9 --- ---

Tabela 2- Dados clínicos dos pacientes estudados utilizando-se citometria de fluxo. Dados apresentados como médias ± desvios padrão.

● Porcentagem dos fenótipos CD4 e CD8

29

As células CD8+, quando foram estimuladas por ConA, não apresentaram diferença

entre os grupos estudados (dados não apresentados). Já quando o estímulo foi com Lb

encontramos diferença significativa no percentual de células após o tratamento (PT), quando

comparado com o grupo antes do tratamento (AT) (p < 0,05). O grupo de doadores sadios

(controle) não apresentou diferença significativa quando comparado aos outros grupos,

tendo percentual semelhante ao grupo PT (Figura 8). O fenótipo CD4 apresentou

porcentagens semelhantes em todos os grupos estudados (AT, PT e Ctrl), tanto no estímulo

por ConA quanto por antígeno de Lb (Figura 9).

Figura 8- Porcentagem de linfócitos TCD8+ estimulados por antígeno de Lb, nos grupos AT (azul), PT (vermelho) e Controle (verde). Análise estatística feita pelo teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunn.

30

Figura 9- Porcentagem de linfócitos TCD4+ estimulados por antígeno de Lb, nos grupos AT (azul), PT (vermelho) e Controle (verde). Análise estatística feita pelo teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunn

● iMFI de células com fenótipo CD4 e CD8 produzindo citocinas

O estímulo por antígeno de Lb foi eficiente na população CD4+, estimulando a

produção de IFN-γ. O grupo de pacientes PT apresentou diferença significativa (p < 0,05) na

produção desta citocina em comparação com o grupo de doadores sadios (controle). Os

pacientes AT apresentam níveis reduzidos de produção de IFN-γ estimulados por Lb,

semelhantes ao grupo controle (Figura 10). As células CD8+ não apresentaram o mesmo

perfil, não havendo diferença estatística entre os grupos (dados não apresentados).

A produção de TNF-α, por células CD4+, estimulada por Lb seguiu o mesmo padrão

visto em INF-γ, o grupo PT apresentou aumento significativo (p< 0,05) na produção da

citocina quando comparado com a grupo controle (Figura 11). Já em células CD8+ não foram

observados resultados significativos (dados não apresentados).

31

Figura 10- Intensidade Média de Fluorescência Integrada (iMFI) de células CD4+ que produziram IFN-γ, estimuladas por antígeno de Lb no grupos AT (azul), PT (verde) e Controle (amarelo). Análise estatística feita pelo teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunn..

Figura 11- Intensidade Média de Fluorescência Integrada (iMFI) de células CD4+ que produziram TNF-α, estimuladas por antígeno de Lb no grupos AT (azul), PT (verde) e Controle (amarelo). Análise estatística feita pelo teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunn.

32

A população de células CD4+, estimuladas por antígeno de Lb, apresentou maior

produção de IL-2 no grupo PT quando comparado com ambos os grupos AT e controle (p<

0,05) (Figura 12). O fenótipo CD8+ não apresentou diferenças significativas.

Figura 12- Intensidade Média de Fluorescência Integrada (iMFI) de células CD4+ que produziram IL-2, estimuladas por antígeno de Lb no grupos AT (azul), PT (verde) e Controle (amarelo). Análise estatística feita pelo teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunn.

● Análise dos fenótipos celulares de produção de citocinas por citometria

multifuncional

A análise de produção de citocinas por células multifuncionais foi feita nos grupos

AT, PT e controle sadio. Apresentamos apenas os dados referentes à população de células

CD4+, as células CD8+ não apresentaram diferenças entre os grupos e os tempos de

tratamento que fossem relevantes.

Observando os grupos antes e pós-tratamento percebemos o aparecimento da

população de células multifuncionais (que produzem simultaneamente IFN-, TNF- e IL-2)

no estímulo por antígeno de Lb, quando comparamos com o background (células não

estimuladas). As células estimuladas também apresentaram maior proporção de células que

produzem duas citocinas simultaneamente do que o background (Figura 13). O grupo PT

apresentou uma proporção maior de multifuncionais em comparação com o grupo AT, assim

como de células que produzem exclusivamente INF-γ (Figura 14).

33

Figura 13- Porcentagem de produção de citocinas por células CD4+ multifuncionais produzindo INF-γ, TNF-α e IL-2 simultaneamente (em amarelo), produção simultânea de duas citocinas (em laranja- TNF-α e IL-2; azul- INF-γ e IL-2 e roxo- INF-γ e TNF-α) ou de uma citocina (em verde- IL-2; vermelho- TNF-α e cinza- INF-γ) nos pacientes antes (AT) e após (PT) o tratamento e no grupo controle (Cont.). Células sem estímulo (Background) ou estimuladas por Lb.

34

Figura 14- Porcentagem de produção de citocinas por células CD4+ multifuncionais produzindo INF-γ, TNF-α e IL-2 simultaneamente (em amarelo), produção simultânea de duas citocinas (em laranja- TNF-α e IL-2; azul- INF-γ e IL-2 e roxo- INF-γ e TNF-α) ou de uma citocina (em verde- IL-2; vermelho- TNF-α e cinza- INF-γ) nos pacientes antes (AT) e após (PT) o tratamento e no grupo controle (Cont.). Células estimuladas por Lb descontadas das sem estímulo (Background).

35

7.3 Avaliação clinico-epidemiológica

Foi preparado um arquivo de banco de dados para coletar informações clínicas e

epidemiológicas dos pacientes, visando posteriormente analisar estatisticamente estes

dados, cruzando cada variável entre si e com os resultados laboratoriais.

Modelo de banco de dados dos pacientes do ensaio clínico:

PROJETO avaliação da resposta imune em pacientes tratados com diferentes esquemas de

Glucantime

NOME: ________________________________________ PRONT: ######

ENDERECO: ______________________________

CIDADE:______________________________ ESTADO:__

PROF: _________________________

NUMERO: <idnum> IDADE: __ SEXO:__ M/F/I

FORMA CLINICA: __________ LC/ LMC/ LCD

CARACT SP:______________________________ CULTURA:_ P/N

TEVOL:###.#meses TM:###.#mm NLESOES:###

LOCAL: __________________________________ C/T/MSD/MSE/MID/MIE

TTO: <A > sim-nao-ign ESQUEMA: _______________ 1 TTO BDC/ BDI/ ADC/ ADI

CURA: <A > sim-nao-ign TCURA: ###.# meses

DESFECHO:_______________ CURA/FALHA/RECIDIVA

OBS: ___________________________________

RESULTADOS:ELISA ATIFN_____pgml ATTNF____ ATIL10____ ATIL5____ ATIL13____

DTIFN_____ DTTNF____ DTIL10____ DTIL5____ DTIL13____

PTIFN_____ PTTNF____ PTIL10____ PTIL5____ PTIL13____

36

CITOMETRIAATCD8___ ATCD4___ ATCD25CD4___ CATIFN___ CATTNF___ ATIL12___ CATIL10___

DTCD8___ DTCD4___ DTCD25CD4___ CDTIFN___ CDTTNF___ DTIL12___ CDTIL10___

PTCD8___ PTCD4___ PTCD25CD4___ CPTIFN___ CPTTNF___ PTIL12___ CPTIL10___

ELISPOTEATIFN____ ATIL4____

EDTIFN____ DTIL4____

EPTIFN____ PTIL4___

37

8. CRONOGRAMA

ATIVIDADESANO 1 (2008) ANO 2 (2009) ANO 3 (2010) ANO 4 (2011)

1º semestre 2º semestre 3º semestre 4º semestre 5º semestre 6º semestre 7º semestre 8º semestre

Revisão e acompanhamento da literatura específica

Realização das disciplinas

Recrutamento dos voluntários

Alocação dos participantes nos grupos

Seleção aleatória dos participantes do subprojeto

imunológico

Coleta de material

Ensaios imunológicos

Análise de resultados

Apresentação de resultados em eventos científicos

Preparação de artigos para publicação

Redação da Tese

Defesa da tese

38

9. EQUIPE

- Armando de Oliveira Schubach - Médico infectologista e dermatologista, Doutor,

Coordenador interino do Laboratório de Vigilância em Leishmanioses do IPEC-Fiocruz.

Coordenador do Projeto Geral “Ensaio clínico fase III para Leishmaniose Tegumentar

Americana. Equivalência entre o esquema padrão e alternativos com antimoniato de

meglumina”. Orientador deste projeto de doutorado.

- Sergio Coutinho Furtado de Mendonça - Médico Infectologista, Doutor, Pesquisador Titular

e Chefe do Laboratório de Imunoparasitologia do IOC, Fiocruz. Co-orientador deste projeto

de doutorado.

- Thalita Gagini Braga – Bióloga, Mestre em Microbiologia Veterinária, Doutoranda,

Laboratório de Imunoparasitologia, IOC, Fiocruz. Responsável pela execução deste projeto

de doutorado.

- Rilza Beatriz Azeredo Coutinho - Médica Dermatologista, Doutora em medicina Tropical.

Participação na orientação da aluna nas técnicas imunológicas previstas no projeto.

- Paula Mello De Luca, Bióloga, Doutora, Assistente de Pesquisa do Laboratório de

Imunoparasitologia, IOC, Fiocruz. Participação na orientação da aluna nas técnicas

imunológicas previstas no projeto.

- Eliame Mouta Confort - Farmacêutica, Mestre, Doutoranda - Diagnóstico Sorológico

(Estudo da resposta imunológica humoral) - Laboratório de Vigilância em Leishmanioses,

IPEC, Fiocruz.

- Cláudia Maria Valete-Rosalino – Médica otorrinolaringologista, Doutora - Atendimento

otorrinolaringológico - Laboratório de Vigilância em Leishmanioses, IPEC, Fiocruz.

- Érica Camargo Ferreira e Vasconcelos - Médico Dermatologista, Mestre, Doutoranda-

Atendimento clínico - Laboratório de Vigilância em Leishmanioses, IPEC, Fiocruz.

- Marcelo Rosandisk Lyra - Médico Dermatologista, Mestre, Doutorando- Atendimento clínico

- Laboratório de Vigilância em Leishmanioses, IPEC, Fiocruz.

- Maurício Naoto Saheki - Médico Infectologista, Especialista - Atendimento clínico -

Laboratório de Vigilância em Leishmanioses, IPEC, Fiocruz.

39

- Maria Inês Fernandes Pimentel - Médica Dermatologista, Doutora - Atendimento clínico e

dermatológico - Laboratório de Vigilância em Leishmanioses, IPEC, Fiocruz.

- Mariza de Matos Salgueiro - Médica Clínica Geral, Especialista - Atendimento clínico -

Laboratório de Vigilância em Leishmanioses, IPEC, Fiocruz.

- Sandro Javier Bedoya Pacheco - Médico Epidemiologista, Doutor, Bolsista de Treinamento

e Capacitação Técnica (TCT) FAPERJ - Avaliação estatística e epidemiológica - Laboratório

de Vigilância em Leishmanioses, IPEC, Fiocruz

- Sonia Regina Lambert Passos - Médica Epidemiologista, Doutora - Coordenação

estatística e epidemiológica - Laboratório de Epidemiologia Clínica, IPEC, Fiocruz

10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Alexander J, Russell DG. The interaction of Leishmania species with macrophages. Adv Parasitol 31: 175-254, 1992.

Antoine JC, Prina E, Jouanne C, Bongrand P. Parasitophorous vacuoles of Leishmania amazonensis-infected macrophages maintain an acidic pH. Infect Immun 58: 779-787, 1990.

Armant M, Rubio M, Delespesse G, Sarfati M. Soluble CD23 directly activates monocytes to contribute to the antigen-independent stimulation of resting T cells. J. Immunol. 155: 4868–4875, 1995.

Apostolopoulos V, McKenzie IFC, Lees C, Matthaei KI, Young IG, A role for IL-5 in the induction of cytotoxic T lymphocytes in vivo, Eur. J. Immunol. 30: 1733–1739, 2000.

Azeredo-Coutinho RB, Mendonça SC An intermittent schedule is better than continuous regimen of antimonial therapy for cutaneous leishmaniasis in the municipality of Rio de Janeiro, Brazil. Rev Soc Bras Med Trop. Sep-Oct;35(5):477-81, 2002.

Azeredo-Coutinho RB, Mendonça SC, Callahan H, Portal AC, Max G. Sensitivity of Leishmania braziliensis promastigotes to meglumine antimoniate (glucantime) is higher than that of other Leishmania species and correlates with response to therapy in American tegumentary leishmaniasis. J Parasitol. Jun;93(3):688-93, 2007.

Awasthi A, Mathur AR & Saha T. Immune response to Leishmania infection. National Center for Cell Science, Indian J Med Res. 119: 238-258, 2004.

Bacellar O, Lessa H, Schriefer A, Machado P, Ribeiro de Jesus A, Dutra WO, Gollob KJ, Carvalho EM. Up-regulation of Th1-type responses in mucosal leishmaniasis patients. Infect Immun. 70(12): 6734-40, 2002.

40

Belli A, Rodriguez B, Aviles H, Harris E. Simplified polymerase chain reaction detection of new world Leishmania in clinical specimens of cutaneous leishmaniasis. Am J Trop Med Hyg 58: 102-109, 1998.

Berman JD. Chemotherapy for leishmaniasis: biochemical mechanisms, clinical efficacy, and future strategies. Reviews Infectious Diseases 10: 560-586, 1988.

Berman JD, Waddell D, Hanson BD. Biochemical mechanisms of the antileishmanial activity of sodium stibogluconate. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 27:916-920, 1985.

Blum JA, Hatz HCF. Treatment of Cutaneous Leishmaniasis in Travelers 2009. Journal of Travel Medicine; v.16 2: 123-131, 2009.

Botelho ACC, Mayrink W, Oliveira RC. Alterations in phenotypic profiles of peripheral blood cells from patients with human American cutaneous leishmaniasis following treatment with an antimonial drug and a caccine. Acta Tropica (2009).

Brasil, Ministério da Saúde, Fundação Nacional de Saúde. Manual de Controle da Leishmaniose Tegumentar Americana, Brasília, 62 pp, 2000.

Bryceson AD, Bray RS, Wolstencroft RA, Dumonde DC. Cell mediated immunity in cutaneous leishmaniasis of the guinea-pig. Trans R Soc Trop Med Hyg. 64(4):472, 1970.

Cabrera M, Blackwell JM, Castes M, Trujillo D, Convit J, Shaw MA. Immunotherapy with live BCG plus heat killed Leishmania induces a T helper 1-like response in American cutaneous leishmaniasis patients. Parasite Immunol. 22(2): 73-9, 2000.

Cabrera M, Rodriguez O, Monsalve I, Tovar R, Hagel I. Variations in the serum levels of soluble CD23, nitric oxide and IgE across the spectrum of American cutaneous leishmaniasis. Acta Tropica 88:145–151, 2003.

Castes M, Agnelli A, Verde O, Rondon AJ. Characterization of the cellular immune response in American cutaneous leishmaniasis. Clin Immunol Immunopathol. 27(2): 176-86, 1983.

Castes M, Cabrera M, Trujillo D, Convit J. T-cell subpopulations, expression of interleukin-2 receptor, and production of interleukin-2 and gamma interferon in human American cutaneous leishmaniasis. J Clin Microbiol. 26(6): 1207-13, 1988.

Castes M, Moros Z, Martinez A, Trujillo D, Castellanos PL, Rondon AJ, Convit J. Cell-mediated immunity in localized cutaneous leishmaniasis patients before and after treatment with immunotherapy or chemotherapy. Parasite Immunol. 11(3):211-22, 1989.

Chakrabarty B. An unusual case of rupture of the uterus. J Indian Med Assoc. 16;38:184-5, 1962.

Chattopadhyay PK, Hogerkorp CM, Roederer M. A chromatic explosion: the development and future of multiparameter flow cytometry. Immunology, 125, 441–449, 2008.

Chulay JD, Fleckenstein L, Smith DH. Pharmacokinetics of antimony during treatment of visceral leishmaniasis with sodium stibogluconate or meglumine antimoniate. Trans R Soc Trop Med Hyg. 82(1): 69-72, 1988.

Convit J, Rondon A, Ulrich M, Bloom B, Castellanos PL , Pinardi ME , Castes M, Garcia L. Immunoterapy versus chemotherapy in localized cutaneous leishmaniasis. The Lancet. 329: (8530) 401-405, 1987.

41

Costa JM, Vale KC, Franca F, Saldanha AC, Silva JO, Lago EL, Marsden PD, Magalhães AV, Silva CM, Serra Neto A. Spontaneous healing of leishmaniasis caused by Leishmania Viannia braziliensis in cutaneous lesions. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 23: 205-208, 1990.

Coutinho SG, Da-Cruz AM, Bertho AL, Santiago MA, De-Luca P. Immunologic patterns associated with cure in human American cutaneous leishmaniasis. Braz J Med Biol Res. 31(1):139-42, 1998.

Coutinho SG, Pirmez C, Da-Cruz AM. Parasitological and immunological follow-up of American tegumentary leishmaniasis patients. Trans R Soc Trop Med Hyg.; 96 Suppl 1: S173-8, 2002.

Da-Cruz AM, Bittar R, Mattos M, Oliveira-Neto MP, Nogueira R, Pinho-Ribeiro V, Azeredo-Coutinho RB and Coutinho SG.T-cell-mediated immune responses in patients with cutaneous or mucosal leishmaniasis: long-term evaluation after therapy. Clin. Diag. Lab. Immun. 9(2):251-56, 2002.

Da-Cruz AM, Conceição-Silva F, Bertho AL and coutinho SG. Leishmania-Reactive CD4+

and CD8+ T cells associated with cure of human cutaneous leishmaniasis. Infection and Immunity v. 62 n° 6 2614-2618, 1994.

Da-Cruz AM, de Oliveira MP, De Luca PM, Mendonca SC, Coutinho SG. Tumor necrosis factor-alpha in human american tegumentary leishmaniasis. Mem Inst Oswaldo Cruz. 91(2):225-9, 1996.

De Lima Barros MB, Schubach A, Francesconi-do-Valle AC, Gutierrez-Galhardo MC, Schubach TM, Conceicao-Silva F, de Matos Salgueiro M, Mouta-Confort E, Reis RS, de Fatima Madeira M, Cuzzi T, Quintella LP, da Silva Passos JP, Conceição MJ, de Almeida Marzochi MC. Positive Montenegro skin test among patients with sporotrichosis in Rio De Janeiro. Acta Trop. 93(1):41-7, 2005.

De Oliveira-Neto MP, Mattos Mda S. Successful therapeutic response of resistant cases of mucocutaneous leishmaniasis to a very low dose of antimony. Rev Soc Bras Med Trop.;39(4):376-8, 2006.

D'Oliveira A Jr, Machado P, Bacellar O, Cheng LH, Almeida RP, Carvalho EM. Evaluation of IFN-gamma and TNF-alpha as immunological markers of clinical outcome in cutaneous leishmaniasis. Rev Soc Bras Med Trop. 35(1):7-10, 2002.

Dorea J G, Costa JML, Holzbecher J, Ryan DE and Marsden PD. Antimony Accumulationin Hair duringTreatment of Leishmaniasis. CLIN. CHEM. 33: 11,2081-2062, 1987.

D'Utra e Silva O. Sobre a leishmaniose tegumentar e seu tratamento. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz 7: 213-248, 1915.

Feng Y, Mitchison TJ, Bender A, Young DW, Tallarico JA. Multi-parameter phenotypic profiling: using cellular effects to characterize small-molecule compounds. Nature Reviews, Drug Discovery. Volume 8, 2009.

Finkefman FD, Wynn TA, Donaldson DD & Urban JF. The role of IL 13 in hehninth-induced inflammation and protective immunity against nematode infections. Current Opinion in Immunology. 11: 420-426, 1999.

42

Georges E, Bradley G, Gariepy J, Ling V. Detection of P-glycoprotein isoforms by gene-specific monoclonal antibodies. Proc Natl Acad Sci U S A 87: 152-156, 1990.

Goodwin LG. Pentostan (sodium stibogluconate); a 50-year personal reminiscence. Transactions Royal Society Tropical Medicine Hygiene 89: 339-341, 1995.

Grimaldi Jr. G, Tesh RB, McMahon-Pratt D. A review of the geographical distribution and epidemiology of leishmaniasis in the New World. Am j Trop Med Hyg 41: 687-725, 1989.

Grogl M, Oduola AM, Cordero LD, Kyle DE. Leishmania spp.: development of pentostam-resistant clones in vitro by discontinuous drug exposure. Exp Parasitol 69: 78-90, 1989.

Grogl M, Thomason TN, Franke ED. Drug resistance in leishmaniasis: its implication in systemic chemotherapy of cutaneous and mucocutaneous disease. Am J Trop Med Hyg 47: 117-126, 1992.

Handman E, Goding JW. The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate. Embo J 4: 329-336, 1985.

Herwaldt BL. Leishmaniasis. Lancet 354: 1191-1199, 1999.

Janvier F, Morillon M, Olliaro P. Visceral leishmaniasis: clinical sensitivity and resistance to various therapeutic agents. Med Trop (Mars). 68(1):89-101, 2008.

Jones TC, Johnson WD, Jr., Barretto AC, Lago E, Badaro R, Cerf B, Reed SG, Netto EM, Tada MS, Franca TF, Wiese K, Golightly L, Fikrig E, Costa JML, Cuba CC, Marsden PD. Epidemiology of American cutaneous leishmaniasis due to Leishmania braziliensis. Journal of Infectious Diseases 156: 73-83, 1987.

Kharazmi A, Kemp K, Ismail A, Gasim S, Gaafar A, Kurtzhals JA, El Hassan AM, Theander TG, Kemp M. T-cell response in human leishmaniasis. Immunol Lett. 65: 1-2 105-8, 1999.

Khatami A, Firooz A, Gorouhi F, Dowlati Y. Treatment of acute Old World cutaneous leishmaniasis: a systematic review of the randomized controlled trials. J Am Acad Dermatol. 57(2):335.e1-29. Epub 2007 Mar 6, 2007.

Lainson R. The American leishmaniases: some observations on their ecology and epidemiology. Transactions Royal Society Tropical Medicine Hygiene 77: 569-596, 1983.

Lainson R, Shaw JJ. Evolution, classification and geographical distribution. In K Killick-Kendrick, The leishmaniasis in biology and medicine, Academic Press, London, p. 1-120, 1987.

Lainson R, Shaw JJ, Souza AA, Silveira FT, Falqueto A. Further observations on Lutzomyia ubiquitalis (Psychodidae: Phlebotominae), the sandfly vector of Leishmania (Viannia) lainsoni. Mem Inst Oswaldo Cruz.;87(3):437-9, 1992.

Llanos-Cuentas EA, Arana M, Cuba CAC, Rosa AC, Marsden PD. Leishmaniasis cutanea diseminada asociada a metastasis en mucosas, causada por Leishmania braziliensis: fracaso en el hallazgo de parasitos circulantes. Rev Soc Bras Med Trop 18: 271-272, 1985.

Loiseau PM, Bories C. Mechanisms of drug action and drug resistance in Leishmania as basis for therapeutic target identification and design of antileishmanial modulators. Curr Top Med Chem. 6(5):539-50, 2006.

43

Lopes UG, Momen H, Grimaldi Jr. G, Marzochi MCA, Pacheco RS, Morel CM. Schizodeme and zymodeme characterization of Leishmania in the investigation of focci of visceral and cutaneous leishmaniasis. Journal of Parasitology 70: 89-98, 1984.

Marsden PD. Mucosal leishmaniasis ("espundia" Escomel, 1911). Trans R Soc Trop Med Hyg 80: 859-876, 1986.

Marsden PD, Tada MS, Barreto AC, Cuba CC. Spontaneous healing of Leishmania braziliensis braziliensis skin ulcers. Trans R Soc Trop Med Hyg 78: 561-562, 1984.

Martin-Fontecha A, Sebastiani S, Hopken UE, Uguccioni M, Lipp M, Lanzavecchia A, Sallusto F. Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traYc and priming. J Exp Med 198:615–621, 2003.

Marzochi KB. Dengue in Brazil--situation, transmission and control--a proposal for ecological control. Mem Inst Oswaldo Cruz.;89(2):235-45, 1994.

McKenzie GJ, Emson CL, Bell SE, Anderson S, Fallon I, Zurawski G, Murray R, Grencis R & McKenzie AN. Impaired development of Th2 cells in IL 13-deficient mice. Immunity. 9: 423-432, 1998.

Mendonça SC, Coutinho SG, Amendoeira RR, Marzochi MC, Pirmez C. Human american cutaneous leishmaniasis (Leishmania b. braziliensis) in Brazil: lymphoproliferative responses and influence of therapy. Clin Exp Immunol.; 64(2): 269, 1986.

Mendonça SCF, Deluca PM, Mayrink W, Reston GT, Silva FC, Cruz AM, Álvaro LB, Costa CA, Genaro O, Toledo VPCP. Characterization of human T lynphocyte-mediated immune respponses induced by a vaccine against American tegumentary leishmaniasis. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53,195-201. 1995.

Mendonça SC, Russell DG, Coutinho SG. Analysis of the human T cell responsiveness to purified antigens of Leishmania: lipophosphoglycan (LPG) and glycoprotein 63 (gp 63). Clin Exp Immunol.; 83(3): 472-8, 1991.

Mendonca SC, Souza WJ, Nunes MP, Marzochi MC, Coutinho SG. Indirect immunofluorescence test in New World leishmaniasis: serological and clinical relationship. Mem Inst Oswaldo Cruz.; 83(3): 347-55, 1988.

Miekeley N, Mortari SR, Schubach AO. Monitoring of total antimony and its species by ICP-MS and on-line ion chromatography in biological samples from patients treated for leishmaniasis. Anal Bioanal Chem. 2002 372 3: 495-502, 2001.

Ministério da Saúde, Secretaria de Vigilância em Saúde, Departamento de Vigilância Epidemiológica – Atlas de leishmaniose tegumentar americana: diagnósticos clínico e diferencial / Brasília: Editora do Ministério da Saúde, 2006. 136 p.: il. color. – (Série A. Normas e Manuais Técnicos)

Mittal MK, Rai S, Ashutosh , Ravinder , Gupta S, Sundar S, Goyal N. Characterization of natural antimony resistance in Leishmania donovani isolates. Am J Trop Med Hyg. 76(4):681-8, 2007.

Mortari SR. Determinação da concentração total de antimônio e de suas espécies químicas em amostras clínicas de pacientes com leishmanioses. Departamento de Química. Pontifícia Universidade Católica (PUC), Rio de Janeiro, p. 142, 2001.

44

Nashed BF, Maekawa Y, Takashima M, Zhang T, Ishii K, Dainichi T, Ishikawa H, Sakai S, Hisaeda H, Himeno K. Different cytokines are required for induction and maintenance of the Th2 type response in DBA/2 mice resistant to infection with Leishmania major. Microbes and Infection. 2: 1435−1443, 2000.

Navin TR, Arana BA, Arana FE, Berman JD, Chajon JF. Placebo-controlled clinical trial of sodium stibogluconate (Pentostam) versus ketoconazole for treating cutaneous leishmaniasis in Guatemala. Journal of Infectious Diseases 165: 528-534, 1992.

Ohl L, Mohaupt M, Czeloth N, Hintzen G, Kiafard Z, Zwirner J, Blankenstein T, Henning G, Forster R. CCR7 governs skin dendritic cell migration under inXammatory and steady-state conditions. Immunity 21:279–288, 2004.

Oliveira Neto MP, Schubach A, Araujo ML, Pirmez C. High and low doses of antimony (Sbv) in American cutaneous leishmaniasis. A five years follow-up study of 15 patients. Mem Inst Oswaldo Cruz. 91(2):207-9, 1996.

Oster CN, Chulay JD, Hendricks LD, Pamplin CL, 3rd, Ballou WR, Berman JD, Takafuji ET, Tramont EC, Canfield CJ. American cutaneous leishmaniasis: a comparison of three sodium stibogluconate treatment schedules. American Journal Tropical Medicine Hygiene 34: 856-860, 1985.

Pessôa SB, Barretto MP. Leishmaniose Tegumentar Americana. Ministério da Educação e Saúde, Serviço de Documentação, Rio de Janeiro, 527 pp, 1948.

Rees PH, Keating MI, Kager PA, Hockmeyer WT. Renal clearance of pentavalent antimony (sodium stibogluconate). Lancet 2: 226-229, 1980.

Rodgers MR, Popper SJ, Wirth DF. Amplification of kinetoplast DNA as a tool in the detection and diagnosis of Leishmania. Exp Parasitol 71: 267-275, 1990.

Russell DG, Wilhelm H. The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages. J Immunol 136: 2613-2620, 1986.

Schubach A, Marzochi MC, Cuzzi-Maya T, Oliveira AV, Araújo ML, Oliveira AL, Pacheco RS, Momen H, Conceicao-Silva F, Coutinho SG, Marzochi KB. Cutaneous scars in American tegumentary leishmaniasis patients: a site of Leishmania (Viannia) braziliensis persistence and viability eleven years after antimonial therapy and clinical cure. Am J Trop Med Hyg. 58(6):824-7, 1998.

Sharples CE, Shaw MA, Castes M, Convit J, Blackwell JM. Immune response in healthy volunteers vaccinated with BCG plus killed leishmanial promastigotes: antibody responses to mycobacterial and leishmanial antigens. Vaccine.; 12(15):1402-12,1994.

Simpson L. The mitochondrial genoma of Kinetoplastid protozoa: genomic organization, transcription, replication and evolution. Annual Review of Microbiology 41: 363-382, 1987.

Siviero do Vale, E. C. e Furtado, T. Leishmaniose tegumentar no Brasil: revisão histórica da origem, expansão e etiologia. Anais Brasileiros de Dermatologia VOLUME 80 - Nº. 4: Anais - 80 anos 2005. Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância Epidemiológica.

Souza, Wilson J. S. de; Coutinho, Sergio Gomes; Marzochi, Mauro Célio de Almeida; Toledo, Luciano Medeiros de; Gottlieb, M. V. - Utilização da reação de imunofluorescencia

45

indireta no acompanhamento da terapeutica da leishmaniose tegumentar americana.. Mem. Inst. Oswaldo Cruz; 77(3):247-53, 1982.

Susanne Nylén, Radheshyam Maurya, Liv Eidsmo, Krishna Das Manandhar, Shyam Sundar, and David Sacks. Splenic accumulation of IL-10 mRNA in T cells distinct from CD4+CD25+ (Foxp3) regulatory T cells in human visceral leishmaniasis. The Journal of Experimental Medicine Vol. 204, No. 4, 16, 805–817, 2007.

Susanne Rath, Luciano Augusto Trivelin, Talitha Rebecca Imbrunito, Daniela Maria Tomazela, Marcelo Nunes de Jesús e Percy Calvo Marzal. Antimoniais Empregados no Tratamento da Leishmaniose: Estado da Arte. Quim. Nova, Vol. 26, No. 4, 550-555, 2003.

Tallab TM, Bahamdam KA, Mirdad S, Johargi H, Mourad MM, Ibrahim K, el Sherbini AH, Karkashan E, Khare AK, Jamal A.Cutaneous leishmaniasis: schedules for intralesional treatment with sodium stibogluconate. Int J Dermatol. 35(8):594-7, 1996.

Walton BC, Chinel LV, Eguia y Eguia O. Onset of espundia after many years of occult infection with Leishmania braziliensis. American Journal Tropical Medicine Hygiene. 22: 696-698, 1973.

Yardley V, Ortuno N, Llanos-Cuentas A, Chappuis F, Doncker SD, Ramirez L, Croft S, Arevalo J, Adaui V, Bermudez H, Decuypere S, Dujardin JC. American tegumentary leishmaniasis: Is antimonial treatment outcome related to parasite drug susceptibility? J Infect Dis. 15;194(8):1168-75, 2006. Epub 2006 Sep 8.

11. ANEXO

11.1 Termo de consentimento livre e esclarecido

INSTITUIÇÃO: Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas - Fiocruz

COORDENADOR DA PESQUISA: Armando de Oliveira Schubach

ENDEREÇO: Av. Brasil 4365 - Manguinhos - Rio de Janeiro - RJ - CEP 21040-900

TELEFONES: (0xx21) 3865-9525 / 3865-9541 / FAX (0xx21) 3865-9541

NOME DO PROJETO DE PESQUISA:

Ensaio clínico fase III para Leishmaniose Tegumentar Americana. Equivalência entre o esquema padrão e alternativos com antimoniato de meglumina

NOME DO VOLUNTÁRIO: ___________________________________________________

46

Este documento procura esclarecê-lo sobre o problema de saúde em estudo e sobre a pesquisa

que será realizada, prestando informações, detalhando os procedimentos e exames, benefícios,

inconvenientes e riscos potenciais.

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença causada por parasitos chamados

Leishmanias e que se apresenta como feridas na pele de difícil cicatrização. Algumas vezes, a LTA

pode se tornar mais grave, envolvendo as mucosas de revestimento interno do nariz e da garganta,

mesmo vários anos após a cicatrização da ferida na pele. Atualmente, não temos como saber qual

paciente adoecerá de novo e qual permanecerá curado definitivamente.

No Brasil, o Ministério da Saúde (MS) recomenda tratar os pacientes com LTA com antimoniato de

meglumina em altas doses (20mg/kg de peso/ dia) durante 20 a 30 dias, respeitando o limite máximo

de 3 ampolas diárias. Entretanto, alterações nos rins, coração, fígado, pâncreas e no sangue são

freqüentes. Além de dores nas juntas e desconforto no local de aplicação das injeções por via

intramuscular.

No Laboratório de Vigilância em Leishmanioses (VigiLeish) do IPEC, Fiocruz, uma dose baixa de

antimoniato de meglumina (5 mg por kilograma de peso por dia) tem se revelado eficaz e bem

tolerada no tratamento de pacientes com LTA. Os pacientes com a forma cutânea são tratados por 30

dias. Os pacientes com forma mucosa são tratados continuamente, por um mínimo de 30 dias,

preferencialmente sem interrupção, até a cicatrização das mucosas, o que costuma ocorrer entre 30 e

90 dias de tratamento. Pacientes idosos ou com outras doenças associadas são tratados com doses

baixas em séries de 10 dias com intervalos de 10 dias sem medicação. Pacientes que apresentem

contra-indicação para receber o tratamento por via intramuscular ou que apresentem sinais de

intoxicação durante o tratamento, poderão ser tratados com uma ou duas aplicações de antimoniato

de meglumina diretamente na lesão de pele.

Nossa experiência acumulada sugere que os esquemas de tratamento alternativos apresentam os

mesmos bons resultados que o esquema padrão recomendado pelo MS, porém, com menos efeitos

adversos. Entretanto, somente após a conclusão deste estudo, poderemos sugerir ao MS que altere

as recomendações para o tratamento da LTA.

Agora que o seu diagnóstico de LTA foi confirmado, você está sendo convidado a participar de

uma investigação clínica a ser realizada no IPEC-Fiocruz, com os seguintes objetivos:

Avaliar a resposta ao tratamento da LTA com o uso de diferentes doses ou formas de aplicação de

antimoniais

Descrever o comportamento dos antimoniais no corpo humano de acordo com os diferentes

esquemas de tratamento

Comparar a resposta imunológica de pacientes tratados com os diferentes esquemas

47

Caracterizar os isolados de Leishmania e verificar a sensibilidade ao antimonial

A sua participação neste estudo é voluntária. Você poderá recusar-se a participar de uma ou todas

as etapas da pesquisa ou, mesmo, se retirar dela a qualquer momento, sem que este fato lhe venha

causar qualquer constrangimento ou penalidade por parte da Instituição. O seu atendimento médico

não será prejudicado caso você decida não participar ou caso decida sair do estudo já iniciado. Os

seus médicos poderão também interromper a sua participação a qualquer momento, se julgarem

conveniente para a sua saúde.

A sua participação com relação ao Projeto consiste em autorizar que a indicação do seu

tratamento para forma cutânea de LTA, com antimoniato de meglumina por via intramuscular, seja

feita por sorteio para um dos seguintes grupos: 1) dose alta por 20 dias contínuos; 2) dose alta em 2

séries de 10 dias; 3) dose baixa por 30 dias contínuos; 4) dose baixa em 3 séries de 10 dias. Caso

haja alguma contra-indicação para você receber qualquer desses esquemas, o tratamento será

realizado com uma ou duas aplicações da medicação, com um intervalo de duas semanas,

diretamente na lesão de pele. Em caso de forma mucosa você poderá ser sorteado para um dos

seguintes grupos: 1) dose alta por 30 dias; 2) dose baixa diariamente até a cura. Os médicos que irão

avaliar o seu tratamento não saberão qual o esquema utilizado e você não saberá se estará tratando

com dose alta ou baixa, para não serem influenciados no julgamento.

Também será necessária a sua autorização: 1) para a utilização de documentação fotográfica ou

filmagem de suas lesões para estudo; 2) para que parte do material coletado periodicamente para a

realização de exames para acompanhamento da evolução da sua doença, assim como os resultados

destes exames de rotina e do seu tratamento sejam utilizados neste estudo; 3) para que parte das

amostras coletadas seja estocada a fim de servir para outros estudos que tenham como finalidade a

melhor compreensão da doença, o desenvolvimento e avaliação de novos métodos diagnósticos;

avaliação da resposta ao tratamento etc., desde que tal estudo seja previamente analisado e

autorizado por um Comitê de Ética em Pesquisa.

Participando deste estudo você terá algumas responsabilidades: seguir as instruções do seu

médico; comparecer à unidade de saúde nas datas marcadas; e relatar a seu médico todas as

reações que você apresentar durante o tratamento, tanto positivas quanto negativas. Os exames e

procedimentos aplicados lhe serão gratuitos. Você receberá todos os cuidados médicos adequados

para a sua doença. Caso você necessite de atendimento médico, durante o período em que estiver

participando do estudo, mesmo fora do seu agendamento, procure o Instituto de Pesquisa Clínica

Evandro Chagas - Fiocruz. Em caso de necessidade ligue para o Dr. Armando de Oliveira Schubach,

Dra. Cláudia Maria Valete Rosalino, Dra. Rilza Beatriz, Dra. Érica Vasconcellos, Dra. Mariza

Salgueiro, Dra. Ana Cristina nos telefones acima. Caso você apresente qualquer problema que

necessite de internação, a equipe médica providenciará seu leito no Instituto de Pesquisa Clínica

Evandro Chagas - Fiocruz.

48

Sua identidade será mantida como informação confidencial. Os resultados do estudo poderão ser

publicados sem revelar a sua identidade e suas imagens poderão ser divulgadas desde que você não

possa ser reconhecido. Entretanto, se necessário, os seus registros médicos estarão disponíveis para

consulta para a equipe envolvida no estudo, para o Comitê de Ética em Pesquisa, para as

Autoridades Sanitárias e para você.

Você pode e deve fazer todas as perguntas que julgar necessárias antes de concordar em

participar do estudo, assim como a qualquer momento durante o tratamento. O seu médico deverá

oferecer todas as informações necessárias relacionadas à sua saúde, aos seus direitos, e a eventuais

riscos e benefícios relacionados à sua participação neste estudo.

Inconvenientes e riscos principais conhecidos até os dias atuais: O medicamento glucantime

costuma causar efeitos indesejáveis, não deve ser utilizado na gravidez e seu uso em mulheres em

idade reprodutiva deve ser acompanhado de uso de método anticoncepcional eficaz como

preservativo de látex masculino ou feminino ("camisinha"), diafragma feminino ou anticoncepcional

oral ("pílula").

Formas de ressarcimento: Sempre que necessário, nos dias de seu atendimento, poderá ser

fornecida alimentação conforme rotina do Serviço de Nutrição e Serviço social do IPEC para

pacientes externos.

Benefícios esperados: Espera-se que, ao final do tratamento, você esteja curado da LTA,

embora as consultas de retorno por vários anos após o tratamento sejam necessárias para a

confirmação da cura. Os resultados deste estudo poderão não beneficiá-lo diretamente, mas no

futuro, poderão beneficiar outras pessoas, pois se espera que este estudo contribua para que o

acompanhamento do tratamento de pacientes com LTA possa ser feito de forma mais eficaz e

segura.

Declaro que li e entendi todas as informações referentes a este estudo e que todas as minhas

perguntas foram adequadamente respondidas pela equipe médica, a qual estará à disposição para

responder minhas perguntas sempre que eu tiver dúvidas.

Recebi uma cópia deste termo de consentimento e pelo presente consinto, voluntariamente, em

participar deste estudo de pesquisa.

_________________________________________________ ___________

Nome paciente: Data

_________________________________________________ ___________

Nome médico: Data

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11.2 Cronograma de execução do projeto geral-em dias

Procedimento Pré- tto 1 10 20 30 40 50 80 110 140 230 320 410 590 770

Biópsia de pele6 x

Clínico x x x x x x x x

Audio/Vestibular x x8 x x x x x x

Dermatológico x x x x x x x x x x x x x x x

ORL x x8 x x x x x x x x x

Odontológico x x8 x x x x x x x x x

Fotografia x x x x x x x x x x x x

Adesão x x x x2,3,4 x4 x4

Início tto x

Final tto x1 x2,3 x4

Ficha inclusão x

Coagulograma x

Teste Gravidez x

Hemograma x x x x x x5

Bioquímica x x x x x x5

Sorologia LTA x x x x x x x x x x x x x

ECG x x x x x x5

EA Clínicos x x x x x x5

Ficha finalização7 x

Grupo 1; 2) Grupo 2; 3) Grupo 3; 4) Grupo 4; 5) no caso de efeitos adversos (EA) clínicos,

laboratoriais ou eletrocardiográficos (ECG) presentes no dia 80, monitorar até a sua

normalização; 6) raspado, imprint, histopatológico, cultura, PCR, imunohistoquímica e

imunopatologia (repetir antes do re-tratamento nos casos de reativação); 7) Na consulta de

conclusão ou no caso de retirada precoce do estudo; 8) caso não tenha sido feita no pré-tto

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