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RELATRIO TCNICO FINAL
Ttulo do Projeto: Rastreamento e deteco de Salmonella enteritidis atravs do gene
invA, pela tcnica de PCR em tempo real, na Avicultura de corte e postura de ovos nas
granjas comerciais do Estado do Esprito Santo.
Nome do Coordenador do Projeto: Fabrcio Antonio Ferreira Martins No do Processo: 42798850/2008 Instituio (por extenso): Instituto Tommasi de Pesquisa e Desenvolvimento O projeto vem sendo apoiado pela FAPES/FINEP desde 12 / 2008 Perodo em que se refere o Relatrio: 04/2009 10/2009 Resumo das Atividades Executadas no Perodo de vigncia do auxlio. I - Principais objetivos do projeto original: Rastrear e detectar Salmonella enteritidis atravs do gene invA pela tcnica de PCR em
tempo real na Avicultura de corte e de postura de ovos nas granjas comerciais do
Estado do Esprito Santo, visando o mercado internacional (exportao) e o mercado
interno.
II - Principais etapas executadas no perodo visando ao alcance dos objetivos: II.1 Seleo das granjas, coleta e encaminhamento das amostras biolgicas:
A seleo dos avicultores, coleta e encaminhamento das amostras biolgicas foi
realizado pelo Mdico Veterinrio, Gabriel Silva Braga (CRMV:0780/VP), gerente de
veterinria da COOPEAVI (Cooperativa Agropecuria Centro Serrana Santa Maria de
Jetib).
II.2-Coleta de Ovos:
As coletas dos ovos foram realizadas na COOPEAVI pelo Mdico Veterinrio Gabriel
Silva Braga CRMV: 0780/VP. Entre o perodo de 10/12/2008 31/10/2009, foram
coletados um total de 798 ovos. (Fotos 01 e 02).
Foto 01: Chegada dos Ovos na COOPEAVI.
Foto 02: Coleta dos ovos pelo Mdico Veterinrio.
II.3-Coleta de Swab de Cloaca:
Foram coletados entre 12/2008 10/2009, 204 amostras de swabs de cloaca pelo
Mdico Veterinrio Gabriel Silva Braga CRMV: 0780/VP. A escolha dos Avicultores e
das aves foram aleatrios pelo prprio Mdico Veterinrio. (Fotos 03 e 04)
Foto 03: Vista interna de uma das granjas onde foi realizado a coleta de swab de cloaca
Foto 04: Coleta de swab de cloaca
II.4 Transporte e encaminhamento das amostras biolgicas: As amostras biolgicas foram acondicionadas em caixas devidamente identificadas e
encaminhadas diretamente para o Instituto Tommasi de Pesquisa e Desenvolvimento
(foto 05).
Foto 05: Caixa onde os Ovos e Swabs de cloaca foram acondicionados para serem encaminhados ao Laboratrio.
II.5 Realizao dos testes laboratoriais: Aps o recebimento das amostras no Instituto Tommasi de Pesquisa e
Desenvolvimento, foi realizado um cadastro no sistema do laboratrio, onde gerado
um registro de cada material a ser analisado de cada avicultor, fato importante na
rastreabilidade das amostras pesquisadas, que a grande novidade da avicultura
mundial nesta primeira dcada do sculo XXI. Na Unio Europia, onde o consumidor
muito mais exigente, o processo j comeou e foram criados vrios programas para
identificar toda a vida da ave at a venda da carne ou dos ovos no supermercado.
Aps o cadastro, os Swabs foram diretamente enriquecidos em gua peptonada e
posteriormente, de acordo com sugesto do consultor no relatrio parcial, foram
colocados em meio seletivo, inibindo o crescimento de outras bactrias (Selenito
Cistina). J os ovos foram colocados em um recipiente estril (gema, clara e casca), e
enriquecidos em gua peptonada e caldo BHI, e posteriormente foram semeados em
meio especfico de crescimento (meio SS - Salmonela Shiguella).
Para realizao das anlises moleculares e microbiolgicas, foi obtido junto ao Instituto
Adolfo Lutz (IAL) um controle positivo de Salmonella enteritidis, lote 03/07, utilizado
como controle padro positivo para todas as anlises realizadas. Todas as amostras
biolgicas foram realizado tanto anlise molecular como cultura microbiolgica. As fotos
abaixo (Foto 06 e 07) mostram a extrao da gema e clara dos ovos e posteriormente
as amostras enriquecidas em meio BHI, gua peptonada e meio seletivo selenito
cistina, sendo que aps determinado tempo foram semeadas em meio SS.
Foto 6: Extrao da gema e clara dos ovos para deteco de Salmonella enteritidis.
Foto 7: Amostras de swab enriquecidas em gua Peptonada e aps em meio seletivo Selenito Cistina.
II.6 - Deteco e amplificao do material gentico:
Saber quais sero as necessidades da indstria avcola no futuro um desafio
constante e, para isso, o Instituto Tommasi, junto com a FAPES/FINEP e a COOPEAVI,
utilizou o que h de mais moderno em tecnologia nas granjas do estado do Esprito
Santo, diagnstico molecular metodologia PCR em tempo real, para termos um
produto livre de Salmonelose para o consumidor. Esta metodologia identifica o DNA
alvo com maior sensibilidade, uma vez que a deteco da amplificao feita atravs
da captao de fluorescncia. Esta tcnica tambm apresenta maior especificidade,
devido utilizao de uma sonda especfica para o fragmento alvo na reao.
A amplificao e a deteco do DNA so realizadas simultaneamente em um sistema
fechado, dispensando procedimentos adicionais como a corrida eletrofortica dos
produtos em gel de agarose e fotodocumentao. Com a eliminao destas etapas, os
resultados obtidos pelo PCR em tempo real so mais rpidos (menos de 24 horas,
desde a extrao do DNA at o resultado final), quando comparada com a PCR
convencional.
Para amplificao e deteco do material gentico de Salmonella enteritidis, utilizamos
um conjunto de Primers (iniciador e reverso) e uma sonda especficos para amplificar o
gene invA, que tem a funo de aumentar a capacidadade de invaso das Salmonelas,
pois, sorotipos que no possuem o gene invA so incapazes de expressar invABC,
dessa maneira so deficientes para invadir clulas de mamferos, indicando que o
operon invABC tem um papel importante na invaso bacteriana nas clulas.
Alm do controle positivo de Salmonella enteritidis obtido junto ao Adolfo Lutz, toda
corrida de amplificao foi acompanhada de um Controle Interno de Reao (IPC), que
vai validar a amplificao molecular.
As reaes de PCR so realizadas em um PCR em tempo real (7300 real time PCR
System - Applied Biosystems) (Foto 08).
FOTO 08 7300 Real Time PCR System
II.7 Cronograma de atividades:
Tabela 01: Cronograma de atividades.
Atividade Trimestre I Trimestre II Trimestre III Trimestre IV Seleo das granjas que iro participar do projeto
X
Treinamento dos tcnicos para coleta e logstica das amostras
X
Coleta das amostras nas granjas
X X X X
nalise molecular das amostras selecionadas
X X X X
Relatrios parciais
X
Divulgao dos resultados para controle da doena para a Coopeavi
X X X X
Divulgao dos resultados na mdia (Jornais, revistas, congressos etc.)
X
Relatrio final X
Tabela 02: Cronograma de coleta de ovos e swabs de cloaca no 1 semestre.
Tabela 03: Cronograma de coleta de ovos e swabs de cloaca no 2 semestre.
III - Apresentao e discusso sucinta dos resultados obtidos, deixando claro o
avano, terico, experimental ou prtico obtido pela pesquisa (os resultados
formais - publicaes - so solicitados no item VIII).
III 1: Resultados das anlises moleculares:
Todas as anlises moleculares das amostras pesquisadas como ovo (tanto a gema
como a clara), casca dos ovos e swabs de cloaca foram indetectveis para Salmonella
enteritidis. O que foi confirmado com as culturas microbiolgicas (segue em anexo
laudos de 2 avicultores).
As fotos 09 e 10 mostra o resultado da anlise molecular de Salmonella enteritidis de 3
avicultores, mostrando a ausncia de Salmonela nas amostras analisadas (ovos e
swabs). O nmero 1 o controle positivo de Salmonella enteritidis do Instituto Adolfo
Lutz, mostrando uma curva de amplificao do material gentico alvo, e o nmero 2 as
amostras de ovos (gema, clara e casca), swab de cloaca e controle negativo, onde no
houve curva de amplificao, ou seja, no houve deteco de Salmonella enteritidis.
Dezembro/2008 Janeiro/2009 Fevereiro/2009 Maro/2009 Abril/2009 Maio/2009 1 Quinzena
10/12/2008 OK
15/01/2009 OK
05/02/2009 OK
05/03/2009 OK
08/04/2009 OK
06/04/2009 OK
2 Quinzena
22/12/2008 OK
22/01/2009 OK
19/02/2009 OK
18/03/2009 OK
22/04/2009 OK
20/04/2009 OK
Junho/2009 Julho/2009 Agosto/2009 Setembro/2009 Outubro/2009 1 Quinzena
04/06/2009 OK
14/07/2009 OK
13/08/2009 OK
10/09/2009 OK
09/10/2009 OK
2 Quinzena
25/06/2009 OK
30/07/2009 OK
27/08/2009 OK
24/09/2009 OK
29/10/2009 OK
Foto 09: 1) Controle positivo de Salmonela enteritidis (Adolfo Lutz). 2) Amostras de
swab de cloaca do Avicultor Elimar Schwambach e controle negativo indetectvel para
Salmonela.
Foto 10: 1) Controle positivo de Salmonela enteritidis (Adolfo Lutz). 2) Amostras de
swab de cloaca do Avicultor Manfredo Kruger, ovos do Avicultor Edgar Agner e controle
negativo indetectvel para Salmonela.
Para verificarmos a eficincia de deteco molecular no ovo, foi realizado uma corrida
de amplificao (foto 11) atravs de uma amostra de ovo contaminado pelo controle
positivo de Salmonella