Exp. Path., Bd. 10, S. 115-121 (1975)

Aus der Medizinischen Klinik der Karl-Marx- Universität Leipzig (Direktor: Prof. Dr. sc. med. R. EMMRICH)

Renale Glutaminase I-Aktivitäten bei experimenteller und humaner chronischer Pyelonephritis

Von eHR. PHILIPPSON

Mit 3 Abbildungen

(Eingegangen am 30. Dezember 1973)

Renal glutaminase I activities in experimental and human chronic pyelonephritis

Key-words: pyelonephritis; glutaminase I activities; kidney; glomerulum; cortical tubules; men; rabbit

Abstract

Question: For more exact knowledge on the pathogenesis of pyelonephritis aseries of large scale histochemical and biochemical investigations were performed. In this study the author reports his observations on the renal glutaminase I activities in experimental and human pyelonephritis.

Materials a.nd methods: Details on materials and methods were given in arecent paper [PHILIPPSON, Exp. Path. 8, 182-193 (1973)]. Glutaminase I activities (L-glutamine amidohydro­lase, E C 3.5.1.2.) were quantitatively ana.lyzed according to MATTENHEIMER and DEBRUIN (7) in which the reaction was not only produced by cooling but also by simultaneous inhibition by means of 15 % trichloric acetic acid. Ammonia was released and determined by Berthelot's reaction as modified by WELLER (18).

Results: The results in rabbit kidneys are compiled in the tables 1-3, the observations on human kidneys are represented in table 4.

139 rabbits showed unilateral experimental pyelonephritis, in 19 rabbits pyelonephritis did not develop or "healed up spontaneously". 31 sampies of pyelonephritic nephrocirrhotic human kidneys (obtained by surgical operations) and 20 sampies of healthy human kidneys were investigated. After separation of renal cortex and medulla the cortex was separated into glomerula and renal tubules by differential centrifugation. Significance was tested by universal comparison of the group me an values by t-test (rabbit and human kidneys separately).

1. In the rabbit glomerula glutaminase I (glut I) activities were increased significantly from the beginning of the experiment up to 100 days. They decreased markedly in the subsequent nephro­cirrhotic stage (fig. 1).

2. The glut I activities in the rabbit cortical tubules decreased immediately, intensively and succe­sively up to the late-chronic nephrocirrhotic stage.

3. The rabbit medullary glut I showed likewise intensive decrease in the acute and subacute phase progressing to very low activities in the nephrocirrhotic stages.

4. In all sam pies from human pyelonephritic nephrocirrhoses (glomerula, cortical tubules and me­dulla) extremely decreased glut I activities were demonstrated.

5. The enzyme activities observed and the results of the semiquantitative histological analysis [SORGER and co-workers, Exp. Path. 9, 280-287 (1974)] are closely correlated.

6. In the glomerula of the "spontaneously healed up" tissue the glut I activities were markedly increased whereas they were moderately decreased in the cortical tubules and in the medulla.

7. The dry weights and values of pro tein content were equal to those earlier reported (PHILIPPSON 1973).

8. In the significance test (universally applied t-test) the overwhelming majority of the values showed high significance (p ::; 0.001).

The results are correlated with the observations of the se mi quantitative histological analysis (SORGER et al. 1974) and discussed on the basis of data reported in literature.

Zusammenfassung

Bei 139 Kaninchen mit unilateraler experimenteller Pyelonephritis (PN) unterschiedlicher Krank­heitsdalIer, bei 19 Tieren mit "nicht angegangener" bzw. "spontan ausgeheilter" PN sowie bei 37

115

gesunden Kaninchen, ferner bei 31 Proben von Operationsmaterial einer PN-l'Iephrocirrhose und bei 20 gesunden menschlichen Nieren werden die Glutaminase I-Aktivitäten (Glut I) gemessen. Nach Zerlegung in Rinde und Mark wird durch DifferentiaIzentrifugation die Nierenrinde in Glomerula und Rindentubuli aufgetrennt. Die Signifikanzprüfung erfolgt durch universellen Vergleich der Gruppenmittelwerte - für Mensch und Tier getrennt - mit Hilfe des t-Tests.

In den Glomerula der experimentellen PN zeigt die Glut I vom Beginn bis zur 100-Tage-Serie signifikant erhöhte Werte, die erst im Stadium der Schrumpfniere tief abfallen (Abb. 1).

Die Glut-I-Aktivitäten der Kaninchenrindentubuli sinken sofort stark und dann sukzessive bis zu den spätchronischen Nephrozirrhosen ab (Abb. 2).

Die medulläre Glut I zeigt einen starken Aktivitätsabfall, der bereits in der akuten-subakuten Phase einsetzt und bis zur Ausbildung einer Schrumpfniere fortschreitet.

In Proben von Opera.tionsma.terial aus menschlichen pyelonephritischen Schrumpfnieren sind die Glut-I-Aktivitäten in den Glomerula und den Tubuli der Rinde und des Markes stark reduziert (Abb.3).

Es besteht eine enge Korrelation zwischen den Enzymaktivitäten und den quantitativ-histologi­schen Ergebnissen (SORGER und Mitarb., Exp. Path. 9, 280-287 (1974)].

Die Ergebnisse werden im Zusammenhang mit den Beobachtungen anderer Autoren diskutiert.

Im Rahmen eines breiteren Spektrums von gleichzeitigen Enzym- und Phosphatid­analysen des pyelonephritisch erkrankten Nierengewebes zur Frage der Pathogenese der chronischen Pyelonephritis wurden auch die phosphataktivierten Glutaminase I-Aktivi­täten (Glut I) gemessen. Über die Resultate der sauren und alkalischen Phosphataseaktivi­täten (SP, AP) am selben Untersuchungsgut wurde schon berichtet [PHILIPPSON, Exp. Path. 8, 182-193 (1973)].

l'r1 aterial und l'r1 ethodik

Operations- und Tiermaterial ist dasselbe wie in den früheren Untersuchungen (10, 11). Tier­versuche, Organentnahme, MateriaI- und weitere Gewebeaufbereitung, Eiweißanalytik, Trocken­gewichtsbestimmungen und statistische Auswertung sind dort ausführlich beschrieben. Die quanti­tative Analyse der phosphataktivierten Glut-I-Aktivitäten (L-Glutamin-amidohydrolase, E C 3.5.1.2.) erfolgte nach MATTENHEIMER und DEBRUIN (7), wobei insbesondere die Reaktion nicht nur durch Abkühlen, sondern auch durch gleichzeitiges Abstoppen mit 15%iger Trichloressigsäure erfolgte und die Ammoniakfreisetzung und -bestimmung mit Hilfe der von WELLER (18) angegebe­nen Methode der Berthelotschen Reaktion durchgeführt wurde.

Ergebnisse

Die Tabellen 1-3 enthalten die Werte der Glut-I-Analysen bei Kaninchen, Tabelle 4 die Glut-I-Analysen an menschlichem Material. In den Abb. 1-3 sind die Ergebnisse für ein-

KrQnIrh.~ der eJCperim.,.,felle,., PN (~(m (Zlt) (Z3) (ZS) (251 (2ft) (,e)

Abb.1. L-Glutamin-Amidohydrolase (Gut I) 3.5.2.1. Gesunde und pyelonephritische Kaninchen, Glomerula.. - Healthy and pyelonephritic rabbits.

116

Tabelle 1. Glut I-Enzymaktivitäten - Kaninchen - Glomerula Table 1. Glut I-enzyme activities in rabbit glomerula

Stat. Param. Normal- 20- 31- 64- 100- 212- 261- H-Serie sene Tage- Tage- Tage- Tage- Tage- Tage-

Serie Serie Serie Serie Serie Serie

X max. 113,00 216,70 306,70 512,40 174,80 36,40 93,20 234,20 Xmin. 9,80 28,30 29,50 78,30 59,40 3,30 1,90 18,63 n 37 24 23 25 25 24 18 19 x 46,38 101,90 110,69 301,87 106,36 13,51 26,95 126,65 s 24,49 49,83 73,81 102,89 28,53 7,18 27,75 59,62 sx 4,03 1,23 15,39 20,58 5,71 1,47 6,54 13,68 V 52,82 48,90 66,68 34,08 26,82 53,16 102,96 47,07

Tabelle 2. Glut I-Enzymaktivitäten - Kaninchen - Rindentubuli Table 2 Glut I-enzyme activities in rabbit cortical tubules

Stat. Param. Normal- 20- 31- 64- 100- 212- 261- H-Serie serie Tage- Tage- Tage- Tage- Tage- Tage-

Serie Serie Serie Serie Serie Serie

X max. 3910,50 1382,60 371,90 426,40 506,30 387,40 226,30 3056,50 Xmin. 294,70 154,70 55,30 17,70 49,80 53,60 104,80 192,40 n 37 24 23 25 25 24 18 19 x 1515,78 674,74 179,88 172,25 259,73 179,54 157,74 1319,49

847,25 359,43 89,23 131,15 142,60 103,36 35,96 827,27 sx 139,29 74,95 18,60 26,23 28,52 20,67 8,48 189,79 V 55,89 53,27 49,60 76,14 54,90 57,57 22,80 62,69

Tabelle 3. Glut I-Enzymaktivitäten - Kaninchen - :Mark Table 3. Glut I-enzyme activities in rabbit renal medulla

Stat. Param. Normal- 20- 31- 64- 100- 212- 261 H-Serie sene Tage- Tage- Tage- Tage- Tage- Tage-

Serie Serie Serie Serie Serie Serie

Xmax. 502,40 264,90 116,30 129,40 85,90 82,80 41,90 485,90 Xmin. 131,60 11,50 8,60 2,90 6,20 1,80 2,10 113,80 n 37 24 23 25 25 24 18 19 x 277,91 109,07 45,50 40,88 43,42 33,24 21,96 223,44 s 97,22 63,75 27,82 38,03 22,88 22,78 14,55 93,97 sx 15,98 13,01 5,4G 7,61 4,58 4,65 3,43 21,56 V 34,98 58,45 61,15 93,04 52,69 68,55 66,27 42,05

Tabelle 4. Glut I-Enzymaktivitäten - Menschennieren Table 4. Glut I-enzyme activities in human kidneys

Stat. Pamm. Glomerula Rindentubuli Mark gesund chron. gesund chron. gesund chron.

P.N. P.N. P.N.

Xmax. 72,46 20,35 2365,60 233,40 542,00 66,80 Xmin. 9,48 2,99 1038,80 89,70 323,60 18,60 n 20 31 20 31 20 31 x 33,02 10,67 1776.06 164,30 417,49 43,79

19,18 4,82 393;91 40,30 62,65 12,84 Sx 4,29 0,78 88,08 G,54 14,01 2,08 V 58,09 45,17 22,17 24,53 15,00 29,31

117

~~~~~~~~~~ N 0 100 zrr

KrQnKhei/ftlauer der Mpenmenlellen PN v./m (llt) (l3) (ZS) (25) (2ft) (18)

Abb. 2. L-Glutamin-Amidohydrolase (Glut I) 3.5.1.2. Gesunde und pyelonephritische Kaninchen, Rindentubuli. - Healthy and pyelonephritic rab bits. Cortical tubules.

100

(nl (zo)

Abb.3. L-Glutamin-Amidohydrolase (Glut I) 3.5.1.2. Mark. - Renal medulla.

zeIne Gewebefraktionen graphisch dargestellt. Dabei fallen erneut - ähnlich wie bei der glomerulären SP - die bis zur lOO-Tage-Serie erhöhten Glut-I-Aktivitäten in den Kanin­chenglomerula auf (Abb. 1). Das Verhalten der cortico-tubulären Glut I ist dem der entspre­chenden SP weitgehend ähnlich (Abb. 2). Der sofort in der akut-sub akuten Phase einset­zende Aktivitätsabfall der medullären Glut I setzt sich sukzessive bis in die Schrumpfnieren. stadien fort und verhält sich analog zu der cortico-tubulären Glut I und der medullären SP­Das "spontan ausgeheilte" Gewebe [s. (10, 11)] zeigt an den Glomerula erhöhte, in den Rindentubuli und im Mark mäßig herabgesetzte Glut-I-Aktivitäten (s. Tabellen 1-3). Der Verlauf der Trockengewichte und der Eiweißgehalte ist bereits früher dargestellt worden (10, 11).

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Beim uni ver se 11 en Gruppenmittelwertsvergleich innerhalb der Signifikanzprüfung nach dem t-Test ergibt sich für

die Kaninchenglomerula in 20 Fällen p kleiner als 0,001; in 2 Fällen p kleiner als 0,05 und 6mal keine statistische Signifikanz; die corticalen Tubuli in 16 Fällen p kleiner als 0,001; in 2 Fällen kleiner als 0,01; in 3 Fällen kleiner als 0,05 und 7mal keine statistische Signifikanz; das Kaninchenmark in 17 Fällen p kleiner als 0,001 ; in 2 Fällen p kleiner als 0,01; Imal p kleiner als 0,05 und 8mal keine statistische Signifikanz.

In allen Proben des menschlichen Schrumpfnierenmaterials war eine deutliche bzw. sehr starke Aktivitätssenkung der Glut I nachweisbar (Abb. 3).

Diskussion

Die deutliche - in der 64-Tage-Serie sogar starke - Erhöhung der glomerulären Glut­I-Aktivitäten bis zur 100-Tage-Serie (schon manifeste Chronizität) der Kaninchenexperi­mente könnte möglicherweise durch toxinbedingte Enzyminduktion erklärt oder/und mit den bis dahin dominierenden Schlingenkollapsbildungen in Zusammenhang gebracht wer­den. Die noch stärker herabgesetzten glomerulären Glut-I-Aktivitäten der spätchronischen Phasen der experimentellen Pyelonephritis sind mühelos mit den dort festgestellten schwe­ren morphologischen Schäden zu erklären (10, 11, 16). Mögliche Störungen des Protein- und/ oder Nukleotid-Nukleinsäurestoffwechsels müßten ebenfalls diskutiert werden [so auch (10)]. Über rein glomeruläre Glut-I-Aktivitätsmessungen ist uns bisher nichts bekannt geworden.

Der sofort einsetzende Abfall der Glut-I-Aktivität in den Rindentubuli der subakuten Phase (20 Tage) bei der experimentellen Pyelonephritis, der bis in die spätchronischen Pha­sen bestehenbleibt, deutet in erster Linie auf die hinlänglich bekannte Vulnerabilität der Glutaminase hin. Die in den Rindentubuli gefundenen quantitativ-histologischen Ergeb­nisse sind bereits beschrieben worden (10).

In der Initialphase (20-Tage-Serie) verhält sich nach unseren Befunden die Glut I um­gekehrt zu der erhöhten AP. Das könnte durchaus mit der sehr hohen Vulnerabilität der Glutaminase zusammenhängen.

Die Glut-I-Aktivitäten im Nierenmark bei experimenteller Pyelonephritis verhielten sich analog zu der cortico-tubulären Glut I und der medullären SP-Aktivität: Ein sofort in der akut-subakuten Phase einsetzender Aktivitätsabfall ging sukzessive bis in die Schrumpf­nierenstadien weiter.

Die zunehmenden histologischen Läsionen des Markes erklären den Abfall der Glut-I­Aktivität.

Das bereits skizzierte Verhalten der Glut-I-Aktivitäten in den 3 Fraktionen des "spontan ausgeheilten" Gewebes (B-Serie) könnte erneut, insbesondere wegen der Erniedrigung in den Rindentubuli, auf die - gegenüber der AP - noch größere Empfindlichkeit der Glutaminase hindeuten.

In allen 3 Fraktionen (Glomerula, Rindentubuli, Mark) des Gewebes aus mens ch­lichen pyelogenen Schrumpfnieren ist die Aktivität der Glut I stark herabgesetzt. Das stimmt mit den histologischen Veränderungen überein.

VAN SLYKE (17), DAVIES und YUDKIN (1) und andere Autoren (3, 4) haben den Zusammenhang zwischen ~arnal!lmoniakbildung und Glutaminspaltung unter verschiedenen Bedingungen, ins­besondere m BezIehung zur jeweiligen Höhe der Glutaminaseaktivität, untersucht. Harnammoniak­produktion und -ausscheidung in Abhängigkeit vom jeweiligen Harn- respektive Nierengewebs-pH sind ebenfalls gemessen worden (2,9, 12, 14).

Von ROBERTS (13) wurden die beiden Nieren-Glutaminase-Isozyme (phosphat- und respektive ketosäuren-aktiviert) beschrieben. KATUNUMA (6) trennte diese beiden Isozyme aus Säugenieren voneinander, wobei er für die erstere eine Hitzelabilität von 55 oe, für die zweite eine solche erst o~erhal? von 70 oe fand. Ferner wurden noch Unterschiede in den plI-Optima und den verschiedenen l\bchaehs-Konstanten festgestellt. Hochproteinhaltige Nahrung steigerte das phosphat-aktivierte Enzym.

119

Die phosphataktivierte Glut I ist ein durch Einfrieren (respektive Lyophilisieren) fast völlig zu zerstörendes Enzym (7).

Nach PITTS (12) sind 2 Faktoren für die Ausscheidungsgeschwindigkeit des Ammoniaks maß­gebend:

1. das Harn-pH und 2. ein noch unbekanntes Element in den Tubuluszellen.

Nach MATTENHEIMER und POLLACK (8) entstammt der größere Teil, etwa 60 % des Harnammo­niaks beim Hund (und wahrscheinich auch beim Menschen), den Glutaminasereaktionen, bevorzugt denen der Nierenrinde. Dagegen ist in der Rattennierenrinde nur etwa die 2,5fache Menge der ent­sprechenden Mark + Papillen-Aktivität lokalisiert. SAYRE und ROBERTs (15) extrahierten die Nieren­glutaminase im gefrorenen (!) Zustand, wozu die Hundenieren einen Monat lang vor Gebrauch ein­gefroren worden waren. Diese Autoren fanden als pH-Optimum ihrer Hundenieren-Glutaminase­Präparation einen Wert von 8,1.

Dagegen geben MATTENHEIMER und DE BRUIN (7) für die Glut I als Bestimmungsoptimum für das menschliche Enzym 9,0, für die Ratte 8,6 und für den Hund pH 9,2 an. Für die Glutaminase II wird von denselben Autoren für den Menschen pH 9,2, die Ratte 9,2 und den Hund 8,8 angegeben - weiteres s. bei )1ATTENHEIMER und POLLAK (8).

HOLMGARD (5) fand bei 6 untersuchten normalen menschlichen Nierenbiopsieproben (vorwiegend Rindenmaterial ??) einen Mittelwert für die Glut I von 1566 ± 269p,Mol/g Feuchtgewicht/min. Bei Glomerulonephritis fand er oft - aber nicht regelmäßig - erniedrigte Glut-I-Aktivitäten, des­gleichen herabgesetzte Aktivitäten in einem Fall von Pyelonephritis, einem Fall von Phenacetin­Niere, bei je einem Fall von Periarteritis nodosa und von Myelom. Bei einem Fall von benigner Nephrosklerose und einem solchen von nekrotisierender Papillitis war die Glut I im Biopsiegewebe erhöht.

Zu Fragen der Spezifität unserer Befunde für die Pyelonephritis läßt sich einerseits wegen des Mangels an Vergleichen aus der Literatur (über andere Nephropathien) z. Z. keine Aus­sage machen. Bei zwar zahlenmäßig sehr geringen Probenanzahlen von menschlichem Biopsiematerial sind durch HOLMGARD (5) Glut-I-Aktivitätssteigerungen und auch -ernied­rigungen beobachtet worden.

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Anschrift des Verfassers: Dr. med. CHR. PHILIPPSON, Medizinische Klinik der Karl-Marx-Universität, DDR - 701 Leipzig,

Johannisallee 32.

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