replicaÇÃo de dna
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Universidade Federal de Pelotas Centro de Biotecnologia Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. REPLICAÇÃO DE DNA. Conteúdo. Replicação do DNA e ciclo celular; Origem de Replicação; Mecanismos básicos de replicação Fases da replicação *Início *Alongamento *Término. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Universidade Federal de PelotasCentro de Biotecnologia
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
Conteúdo...Conteúdo...
- Replicação do DNA e ciclo celular;
-Origem de Replicação;
-Mecanismos básicos de replicação
- Fases da replicação*Início*Alongamento*Término
GENÉTICA BACTERIANAGENÉTICA BACTERIANA
- O DNA bacteriano é circular;- O cromossomo de E. coli, por exemplo, contém cerca de 4 milhões de pares de bases e é aproximadamente 1000 vezes mais longo que a célula.
Estrutura da dupla hélice
1953: Watson and Crick
Estrutura espacial da dupla héliceEstrutura espacial da dupla hélice
Replicação do DNAReplicação do DNA
DNADNADNADNA
RNARNA
ProteínaProteína
Replicação
Transcrição
Tradução
Trasncrição Reversa
Escherichia coli
Escherichia coli
1
2
3
4
Replicação do DNA x Ciclo Celular
Replicação do DNA x Ciclo Celular
TEMPO DE GERAÇÃO: 20 MINUTOS
Replicação do DNA x Ciclo Celular
Replicação do DNA x Ciclo Celular
“O ciclo de replicação e início da formação do septo
ocorrem bem antes do processo de divisão”
Origem de Replicação em bactérias: Somente origens completamente metiladas podem iniciar a replicação
Origem de Replicação em bactérias: Somente origens completamente metiladas podem iniciar a replicação
- Metilação – DNA hemi-metilado- Ligação física com a membrana- Garante que a origem será ativada uma vez por ciclo
Replicação do DNA x Ciclo Celular
Replicação do DNA x Ciclo Celular
Replicação do DNA x Ciclo Celular
Replicação do DNA x Ciclo Celular
Eucariot
os
Região do DNA onde a replicação começa
Origens de procariotos e eucariotos – ricas em AT
Procariotos, plasmídeos e vírus - uma origem
Eucariotos – várias origens
E. coli – região de 245 pb essencial à replicação
4 seqüências de 9 pb - TTAT(C/A)CA(C/A)A
3 seqüências de 13 pb ricas em AT
INÍCIO DA REPLICAÇÃO - ORIGEMINÍCIO DA REPLICAÇÃO - ORIGEM
OriC d
o cr
omos
som
o de
E.col
i
OriC d
o cr
omos
som
o de
E.col
i
1- Complexo inicial
1- Complexo inicial
52 kDa52 kDa
autocooperaçãoautocooperação
2- Complexo aberto
2- Complexo aberto
3- Complexo pré-priming3- Complexo pré-priming
HU e HU e IHFIHF
DnaB - DnaB - helicasehelicase
Proteínas presentes na origem de replicação de E. coli
DnaA Reconhece a origem e abre a dupla fita em sítios específicos
DnaB (helicase) Desenrola o DNA
DnaC Auxilia a ligação de DnaB na origem
HU Proteína do tipo histona que estimula a iniciação
Primase (DnaG) Sintetiza os primers de RNA
Single strand binding (SSB)
Liga a fita simples de DNA
RNA polimerase Facilita a ação da DnaA
DNA girase Alivia a tensão torsional gerada pela abertura da dupla-fita
Dam Metilase Metila as sequências GATC na OriC
Processo semiconservativo
Início da replicação - Origem
Movimento da forquilha de replicação
Unidirecional ou bidirecional
Direção da replicação
5’ 3’
Semi-descontinuidade da replicação
O processo pode ser dividida em:
- Inicio da replicação- Forquilha de replicação- Terminação
Regras básicas do processo de replicação
Regras básicas do processo de replicação
A replicação do DNA é semi-conservativa?A replicação do DNA é semi-conservativa?
A replicação do DNA é semi-conservativa
A replicação do DNA é semi-conservativa
Experimento realizado por Meselson & Stahl em 1958
Experimento realizado por Meselson & Stahl em 1958
Cultivo em meio14NH4Cl
Cultivo em meio15NH4Cl
Purificação do DNA seguida de centrifugação em gradiente de CsCl
Replicação do DNAReplicação do DNA
Semi-conservativa
Replicon: Unidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicação
1. Origem + Término
2. Durante um ciclo celular, a origem de replicação pode ser ativada mais de uma vez em procariotos e uma vez em eucariotos
3. O cromossomo de uma célula procariótica constituem um único replicon
4. Cada cromossomo eucariótico constitue vários replicons
INÍCIO DA REPLICAÇÃOINÍCIO DA REPLICAÇÃO
A replicação é vista como um “olho” flanqueado por DNA não replicado
A replicação é vista como um “olho” flanqueado por DNA não replicado
O genoma bacteriano circular constitue um único replicon
O genoma bacteriano circular constitue um único replicon
A velocidade da forquillha de replicação bacteriana é 50000pb/min
Um única origem de replicação em E.coli (OriC, 245 pb)
O genoma eucariótico constitue vários repliconsO genoma eucariótico constitue vários replicons
A velocidade da forquillha de replicação eucariótica é 2000 pb/min
Os replicons eucarióticos tem 40-100 kb e são iniciados em tempos diferentes
Fase S demora ~ 6 h em uma célula somática
A replicação é bidirecional em
procariotos
A replicação é bidirecional em
procariotos
MOVIMENTO DA FORQUILHA DE
REPLICAÇÃO
Unidirecional ou bidirecional
MOVIMENTO DA FORQUILHA DE
REPLICAÇÃO
Unidirecional ou bidirecional
A replicação é unidirecional em
eucariotos
A replicação é unidirecional em
eucariotos
DIREÇÃO DA REPLICAÇÃODIREÇÃO DA REPLICAÇÃO
A adição dos nucleotídeos para o alongamento da cadeia é SEMPRE no sentido 5’-3’
SEMI-DESCONTINUIDADE DA
REPLICAÇÃO
SEMI-DESCONTINUIDADE DA
REPLICAÇÃOA replicação ocorre de maneira contínua em uma das fitas e descontínua na
outra fita
Replicação do DNAReplicação do DNA
Procariotos - Genes menores- Cromossomo circular- Bidirecional- UMA ORIGEM
Eucariotos- Genes e cromossomos
maiores- Unidirecional - VÁRIAS ORIGENS
ENZIMAS QUE PARTICIPAM DA REPLICAÇÃO DO DNA
ENZIMAS QUE PARTICIPAM DA REPLICAÇÃO DO DNA
Helicases (DnaB)
DNA Polimerase
Primase
SSB (Single Strand Binding Protein)
Topoisomerases
DNA ligase
PROTEÍNAS PRESENTES NA FORQUILHA DE REPLICAÇÃO DE E. COLI
PROTEÍNAS PRESENTES NA FORQUILHA DE REPLICAÇÃO DE E. COLI
SSB Liga a fita simples de DNA
DnaB (helicase) Desenrola o DNA
Primase (DnaG) Sintetiza os primers de RNA
DNA Polimerase III
Sintese da fita nova
DNA Polimerase I Preenche as lacunas e remove os primers
DNA Ligase Liga os fragmentos
DNA girase Superenrolamento
DNA POLIMERASES
E PRIMASES
DNA POLIMERASES
E PRIMASES
As DNA-polimerases sempre requerem um iniciador previamente pareado ao molde que será copiado
As DNA-polimerases sempre requerem um iniciador previamente pareado ao molde que será copiado
Atividade revisora 3’ 5’ garante a fidelidade da replicaçãoAtividade revisora 3’ 5’ garante a fidelidade da replicação
DNA POLIMERASESDNA POLIMERASES
E. coli - DNA
Polimerase I
# polipeptídeo de 928
aa, replicação e reparo
de DNA
E. coli - DNA
Polimerase I
# polipeptídeo de 928
aa, replicação e reparo
de DNA
Propriedades das DNA-polimerases Bacterianas
Propriedades das DNA-polimerases Bacterianas
Pol IPolII PolIIIPolimerização 5’ 3’ + + +Exonuclease 3’ 5’ + + +Exonuclease 5’ 3’ + - -
Número de subunidades 1 4 10Tamanho em kDa 103 90 ~900
Velocidade de Polimerização(nt/seg) 16-20 40 250-1000
Eucariotos - DNA polimerases
- primase
e - reparo do DNA
- replicação do genoma nuclear
- replicação do DNA mitocondrial
Bacteriófagos - T4 DNA Polimerase
Outras - Taq DNA polimerase (Thermus aquaticus)
Pfu DNA polimerase (Pyrococcus furiosus)
DNA POLIMERASESDNA POLIMERASES
Thermus aquaticus
-Estável a temperaturas de 177 graus;
-Estável a temperaturas de 177 graus;
Temperatura Ótima: 72 graus
Temperatura Ótima: 72 graus
TAQ DNA POLIMERASETAQ DNA POLIMERASE
Forquilha de ReplicaçãoForquilha de Replicação
A síntese do DNA é semi-descontínua e requer um iniciador (primer) de RNA
Fita contínua
Fita descontínua
Síntese da Fita descontínua
Síntese da Fita Contínua
REPLICAÇÃO DO DNAREPLICAÇÃO DO DNA
Fita contínua (líder)
Fita descontínua
Fragmentos de Okazaki:
1000 a 2000 nt (PROCARIOTOS) 100 a 200 nt (EUCARIOTOS)
REPLICAÇÃO DO DNAREPLICAÇÃO DO DNA
Fragmentos de Okasaki ocorrem na fita descontínua
A DNA polimerase III é responsável pela síntese da maior parte do DNA
A DNA polimerase I remove o primer de RNA e preenche as lacunas
A DNA ligase sela as quebras
Síntese das fitas contínua e descontínua é independenteSíntese das fitas contínua e descontínua é independente
A DNA ligase sela as quebrasA DNA ligase sela as quebras
REPLICAÇÃO DO DNAREPLICAÇÃO DO DNA
O complexo de replicaçãoO complexo de replicação
A proteína DNA B (helicase) é responsável pelo movimento para frente da forquilha
Cada core catalítico da DNA PolIII sintetiza uma das fitas-filhas
O primossomo afasta uma das fitas molde
Proteínas SSB mantem as fitas parentais separadas
REPLICAÇÃO DO DNAREPLICAÇÃO DO DNA
Da origem ao término da replicaçãoDa origem ao término da replicação
Problema!!!Problema!!!
Término da replicação- genomas lineares
Término da replicação- genomas lineares
REPLICAÇÃO DE DNA LINEAR: o modelo demonstra o surgimento de extremidades não pareadas após a remoção dos
primers no final da replicação
Término da Replicação
Formação de Concatâmeros
Término da replicação
Telômeros