replicação de dna - iq.usp.br · unidade do dna onde está ocorrendo um evento de ... cadeia...
TRANSCRIPT
Replicação de DNAReplicação de DNA
DuplaDupla--hélice composta hélice composta de de nucleotídeos ligados nucleotídeos ligados entre si entre si e e cujascujas bases bases nitrogenadas nitrogenadas de de uma uma
hélice fazemhélice fazem pontes de pontes de hidrogênio hidrogênio com bases com bases nitrogenadas nitrogenadas de de outra outra hélicehélice, , numa direção numa direção
antianti--paralelaparalela..
DNADNA
Replicação do DNAProcesso que precede a divisProcesso que precede a divisãão celular e atravo celular e atravéés do qual ss do qual sãão o geradas cgeradas cóópias pias ididêênticasnticas das moldas molééculas de DNA presentes culas de DNA presentes na cna céélulalula--mmããe, a seguir herdadas pelas duas ce, a seguir herdadas pelas duas céélulaslulas--filhasfilhas
Duplicação dos cromossomos
Divisão celular
Separação dos cromossomos
Cada vez que uma Cada vez que uma célula divide a célula divide a informação informação genética precisa genética precisa ser transmitida às ser transmitida às células filhascélulas filhas
formação de formação de gametas para gametas para transmissão da transmissão da informação informação para a próxima para a próxima geraçãogeração
Ciclo CelularCiclo Celular
Antes de iniciar a Antes de iniciar a condensação dos condensação dos
cromossomos o DNA cromossomos o DNA necessita ser duplicado : necessita ser duplicado :
é a fase S é a fase S
ExperimentoExperimento de de MeselsonMeselson & Stahl, 1958& Stahl, 1958
A perguntaA pergunta
Cultivo de bactérias Cultivo de bactérias em meio contendo em meio contendo 1515NHNH44Cl,Cl,IsótopoIsótopo pesado de Npesado de N
Transferência para Transferência para meio contendo meio contendo 1414NHNH44ClCl
Extração e purificação do DNA Extração e purificação do DNA seguida de centrifugação em seguida de centrifugação em gradiente de gradiente de CsClCsCl
Molécula parental
Primeira geração de moléculas “filhas”
Segunda geração de moléculas “filhas”
ExperimentoExperimento de de MeselsonMeselson & Stahl, 1958& Stahl, 1958
A respostaA resposta
Replicação Replicação do DNA do DNA -- característicascaracterísticas
•• Síntese de DNA é Síntese de DNA é semisemi--conservativaconservativa
Fita 1 parental
Fita 2 parental
Fita 1parental
Fita 2parental
Fita 2“filha”
Fita 1“filha”
ReplicaçãoReplicação do do cromossomocromossomo bacterianobacteriano
ExperimentoExperimento de J. Cairns, 1963de J. Cairns, 1963
Cultivo de bactérias Cultivo de bactérias em meio contendo em meio contendo Trítio (Trítio (33H),H), isótopoisótoporadioativo de Hradioativo de H
Isolamento do DNA, Isolamento do DNA, espalhamento em espalhamento em emulsão fotográficaemulsão fotográfica
Observação em Observação em microscópio eletrônicomicroscópio eletrônico
Replicação Replicação do DNA do DNA -- característicascaracterísticas
••Começa numa Começa numa origem de origem de replicação (replicação (OriOri) e é ) e é bidirecionalbidirecional
O genoma bacteriano circular constitui um O genoma bacteriano circular constitui um únicoúnico repliconreplicon
•• A velocidade da forquilha de replicação A velocidade da forquilha de replicação bacteriana é bacteriana é 50.00050.000 pb/minpb/min
•• Um única origem de replicação em Um única origem de replicação em E.E.colicoli((OriCOriC, 245 pb), 245 pb)
Forquilha de replicaçãoForquilha de replicaçãoRegião do DNA onde ocorre a transição do DNA parental fita duplaRegião do DNA onde ocorre a transição do DNA parental fita dupla para as para as novas fitas filhas duplasnovas fitas filhas duplas
O genoma eucariótico possui O genoma eucariótico possui váriosvários repliconsreplicons
•• A velocidade da forquilha de replicação eucariótica é A velocidade da forquilha de replicação eucariótica é 2.0002.000 pb/minpb/min•• Os Os repliconsreplicons eucarióticos tem 40eucarióticos tem 40--100 kb e são iniciados em tempos diferentes100 kb e são iniciados em tempos diferentes•• Fase S demora ~ 6hrs em uma célula somáticaFase S demora ~ 6hrs em uma célula somática
RepliconRepliconUnidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicaçãoUnidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicação
•• Origem + TérminoOrigem + Término
•• Ativados apenas uma única vez em cada ciclo celularAtivados apenas uma única vez em cada ciclo celular
•• O genoma de uma O genoma de uma célula procarióticacélula procariótica possui um possui um único único repliconreplicon
•• Cada Cada cromossomo eucarióticocromossomo eucariótico possui possui vários vários repliconsreplicons e todos são e todos são
ativados uma única vez no ciclo celular ainda que não ativados uma única vez no ciclo celular ainda que não
simultaneamentesimultaneamente
Primeiro passoPrimeiro passo: : abrir abrir o DNA (o DNA (forquilha forquilha de de replicaçãoreplicação) e ) e manter manter as as fitas separadasfitas separadas
O que dirige a escolha do nucleotídeo a ser adicionado à fita é a especificidade A-T/C-G e o alongamento ocorre somente no
sentido 5’ – 3’, devido à necessidade de um grupamento 3’OH livre para formação da ligação fosfodiéster
DNA ou iniciador RNA
DNA polimerase
Fita de DNAmolde
DesoxiribonucleosídeoDesoxiribonucleosídeo5´trifosfato 5´trifosfato (substrato)(substrato)
Fita sendo Fita sendo polimerizadapolimerizada
Fita moldeFita molde
Síntese da cadeia de DNA envolve a formação Síntese da cadeia de DNA envolve a formação das ligações das ligações fosfodiésterfosfodiéster
A ligação fosfodiéster se dá entre o grupamento 3’OH de um nucleotídeo já existentes na fita e o grupamento 5’P do
nucleotídeo livre
iniciador
trifosfatode guanosina
Fita de DNA molde
Fita de DNA molde
iniciador
Na formação da ligação fosfodiéster é liberado um grupo pirofosfato rico em energia
Fita de DNA molde
iniciadorLiberação de pirofosfato
DNA é sintetizado porDNA é sintetizado por DNA DNA polimerasespolimerases
•• DNA DNA polimerasepolimerase I foi isolada a I foi isolada a partir de E.partir de E.colicoli em 1955 por A. em 1955 por A. KornbergKornberg
•• As DNA As DNA polimerasespolimerases necessitam necessitam sempre de um sempre de um DNA moldeDNA molde e uma e uma sequênciasequência iniciadora.iniciadora.
•• O substrato da síntese é o O substrato da síntese é o desoxiribonucleosídeodesoxiribonucleosídeo 5´5´--trifosfato.trifosfato.
•• A síntese de DNA ocorre pela A síntese de DNA ocorre pela adição de nucleotídeos aadição de nucleotídeos aextremidade 3´OHextremidade 3´OH da cadeia em da cadeia em crescimento.crescimento.
••Sentido da síntese Sentido da síntese sempre sempre éé
5’ 5’ →→ 3’.3’.
Replicação Replicação do DNA do DNA -- característicascaracterísticas
•• Síntese de DNA procede Síntese de DNA procede na direção 5´na direção 5´--3´3´
A replicação se dá nas duas fitas ao mesmo tempo, porém A replicação se dá nas duas fitas ao mesmo tempo, porém em sentidos opostosem sentidos opostos
DNA parental
Fita contínua
Fita descontínua
No caso da síntese da fita descontínua, iniciadores de RNA No caso da síntese da fita descontínua, iniciadores de RNA são produzidos ao longo de todo o processo pela são produzidos ao longo de todo o processo pela primaseprimase
Fita contínua
Fita descontínuaIniciador Iniciador dede RNARNA
Observe o alongamento das duas fitas em sentidos opostosObserve o alongamento das duas fitas em sentidos opostos
Fita contínua
Fita descontínua
Os fragmentos sintetizados na fita descontínua são Os fragmentos sintetizados na fita descontínua são chamados de fragmentos de chamados de fragmentos de Okazaki Okazaki e são ligados e são ligados
enzimaticamente enzimaticamente para gerar uma fita contínuapara gerar uma fita contínua
Fita contínua
Fita descontínua
Fragmento deOkazaki
Fita com síntese contínua
Fita com síntese descontínua
Fragmentos de Fragmentos de OkazakiOkazaki::Bactéria: Bactéria: 1.000 a 2.0001.000 a 2.000 pbpb
EucariotosEucariotos: : 150 a 200150 a 200 pbpb
Síntese de DNA ocorreSíntese de DNA ocorre sempresempre na direçãona direção5’ 5’ →→ 33’’ e e éé semisemi--descontdescontíínuanua
As subAs sub--unidades Beta da DNAunidades Beta da DNA--polimerasepolimerase envolvem a envolvem a dupla hélice formada durante a replicaçãodupla hélice formada durante a replicação
Dupla - hélicenascente
Sub-unidades beta da Pol
PRINCIPAIS COMPONENTES ENVOLVIDOS NA REPLICAÇÃOPRINCIPAIS COMPONENTES ENVOLVIDOS NA REPLICAÇÃO
DNA polimerase
DNA polimerase
proteína ligante de DNA
Proteínas presentes na origem de Replicação de E.coli
DnaA Reconhece a origem oriC e abre a dupla fita em sítios específicos
DnaB (helicase) Desenrola o DNA
DnaC Auxilia a ligação de DnaB na origem
HU Proteína do tipo histona que estimula a iniciação
Primase (DnaG) Sintetiza os iniciadores de RNA
Single strand binding(SSB)
Liga a fita simples de DNA
RNA polimerase Facilita a ação da DnaA
DNA girase(topoisomerase)
Alivia a tensão torsional gerada pela abertura da dupla-fita
Dam Metilase Metila as sequências GATC na OriC
Propriedades das DNA-polimerases Bacterianas
Pol I Pol II Pol IIIPolimerização 5’ → 3’ + + +Exonuclease 3’ → 5’ + + +Exonuclease 5’ → 3’ + - -Número de subunidades 1 ≥4 ≥ 10Velocidade de Polimerização(nt/seg) 16-20 40 250-1.000
Processividade 3-200 1.500 ≥ 500.000(nt adicionados antesda dissociação da fita-molde)
Reparo (Pol IV e V) Principal enzima dereplicação em E.coli
Atividade exonuclease 5’ → 3’,responsável pelo processo de remoção dos iniciadores de RNA
A DNAA DNA--polimerasepolimerase III é III é multiméricamultimérica, formada por mais , formada por mais de 10 cadeias, com uma simetria de 10 cadeias, com uma simetria diméricadimérica
Fita na qual ocorreFita na qual ocorrea síntese contínuaa síntese contínua
Fita na qual ocorre aFita na qual ocorre asíntese descontínuasíntese descontínua
As subAs sub--unidades unidades ττ mantmantéém a m a estrutura estrutura dimdimééricarica
6 sub6 sub--unidadesunidades6 sub6 sub--unidadesunidades
IniciaIniciaçãção o -- 11ºº estestáágiogio dada replicareplicaçãçãoo emem E.E.colicoli
Estrutura da origem de replicação bacteriana Estrutura da origem de replicação bacteriana orioriCC
•• A origem de replicação A origem de replicação OriOriCC é é extremamente conservadaextremamente conservada..•• sequênciassequências repetidas com 9 e 13 bases, repetidas com 9 e 13 bases, ricas em Aricas em A--TT são são reconhecidas por > 9 enzimas diferentes.reconhecidas por > 9 enzimas diferentes.•• enriquecidaenriquecida na na sequênciasequência palindrômicapalindrômica GATC, alvo de GATC, alvo de metilaçãometilaçãoenzimática enzimática na adenina .na adenina .
Origem de Replicação em bactériasOrigem de Replicação em bactériasSomente origens completamente Somente origens completamente metiladasmetiladas podem iniciar a replicaçãopodem iniciar a replicação
Elongação Elongação -- 22º º estágioestágio dada replicaçãoreplicação
Replicação do DNA Replicação do DNA -- ResumoResumo
• Replicação do DNA é semi-conservativa
• Replicação é bi-direcional.
• Cromossomos bacterianos possuem apenas 1 replicon,
cromossomos eucariotos possuem vários amplicons.
• O DNA é sintetizado por DNA polimerase, uma enzima multimérica,
• A síntese ocorre sempre no sentido 5´ - 3’, com atividade revisora
3´- 5´.
• A síntese é contínua em uma das fitas e descontínua na fita oposta
• Um complexo de mais 9 enzimas está envolvido na iniciação,
elongação e terminação da replicação.
•• Replicação do DNA é semiReplicação do DNA é semi--conservativaconservativa
•• Replicação é biReplicação é bi--direcional.direcional.
•• Cromossomos bacterianos possuem apenas 1 Cromossomos bacterianos possuem apenas 1 repliconreplicon, ,
cromossomos cromossomos eucariotoseucariotos possuem vários possuem vários ampliconsamplicons..
•• O DNA é sintetizado por DNA O DNA é sintetizado por DNA polimerasepolimerase, uma enzima , uma enzima multiméricamultimérica, ,
•• A síntese ocorre sempre no sentido 5´ A síntese ocorre sempre no sentido 5´ -- 3’, com atividade revisora 3’, com atividade revisora
3´3´-- 5´.5´.
•• A síntese é contínua em uma das fitas e descontínua na fita opA síntese é contínua em uma das fitas e descontínua na fita opostaosta
•• Um complexo de mais 9 enzimas está envolvido na iniciação, Um complexo de mais 9 enzimas está envolvido na iniciação,
elongação e terminação da replicação.elongação e terminação da replicação.
Geometria do pareamento das Geometria do pareamento das bases contribui para a fidelidade bases contribui para a fidelidade da replicação do DNAda replicação do DNA
Pareamento correto
Pareamento incorreto
TT
AA
CC GG
TT
AA
AA
CC
GG
GG
Atividade revisora (atividade Atividade revisora (atividade exonucleaseexonuclease 3’ 3’ →→ 5’) 5’) garante a fidelidade da replicaçãogarante a fidelidade da replicação
ReparoReparo do DNAdo DNA
-- ““Mismatch repairMismatch repair””
-- Reparo por ExcisReparo por Excisãão de Baseso de Bases
-- Reparo por ExcisReparo por Excisãão de Nucleoto de Nucleotíídeosdeos
-- Reparo DiretoReparo Direto
-- Reparo por RecombinaReparo por Recombinaçãçãoo
““Mismatch repairMismatch repair”” ::Corrige erros de replicaCorrige erros de replicaçãçãoo
ReparoReparo do DNAdo DNA
Reparo por ExcisReparo por Excisãão o de Bases:de Bases:Remove a UracilaRemove a Uracila(citosina alterada)(citosina alterada)
ReparoReparo do DNAdo DNA
UracilaUracilaCitosinaCitosina
Reparo por Reparo por ExcisExcisãão de o de NucleotNucleotíídeos :deos :Remove o Remove o nucleotnucleotíídeodeo
ReparoReparo do DNAdo DNA
Reparo Direto :Reparo Direto :NNãão ho háá remoremoçãção de nucleoto de nucleotíídeosdeos
ReparoReparo do DNAdo DNA
Reparo por Reparo por RecombinaRecombinaçãção :o :UsaUsa--se uma outra se uma outra molmoléécula de DNA cula de DNA
ReparoReparo do DNAdo DNA
Célula Célula NormalNormal CâncerCâncer
estimaestima--se que 6se que 6--7 eventos devem ocorrer (em ~207 eventos devem ocorrer (em ~20--40 anos) para indução do câncer 40 anos) para indução do câncer
em certos casos a propensão ao câncer é hereditáriaem certos casos a propensão ao câncer é hereditária
Recombinaçãoconstitui na troca ou constitui na troca ou
incorporação de uma incorporação de uma seqüência de DNA com seqüência de DNA com (à) outra(à) outra
na meiose ocorre a na meiose ocorre a recombinação homóloga recombinação homóloga (troca de trechos)(troca de trechos)
a recombinação a recombinação somática é responsável somática é responsável pelo rearranjo de BCR e pelo rearranjo de BCR e TCRTCR
DNA de bactérias e DNA de bactérias e virus virus também sofrem também sofrem recombinaçãorecombinação
recombinase RecA recombinase RecA e e Rec Rec BCDBCD
recombinação homólogarecombinação homóloga
cadeia leve cadeia leve λλ
cadeia leve cadeia leve κκ
cadeia pesadacadeia pesada
Recombinação SomáticaRecombinação Somática
recombinase recombinase RAG1 e RAG2RAG1 e RAG2
RSS: a regra de recombinaçãoRSS: a regra de recombinação
há a formação há a formação de alças durante de alças durante o rearranjoo rearranjo
e parte do e parte do DNA DNA genômico genômico é é perdidoperdido
Repertório ImunológicoRepertório ImunológicoRepertório Imunológico
EventosEventos
VVDDJJinserções inserções
TOTALTOTAL
HH
515130305522
κκ + + λλ
69690055(1)(1)
10101616
ImunoglobulinasImunoglobulinasDNA germinativoDNA germinativo
DNA DNA rearranjadorearranjado
mRNAmRNA maduromaduro
proteínaproteína
A A hipermutaçãohipermutação somática ocorre após a somática ocorre após a ativação do linfócito B no centro ativação do linfócito B no centro germinativo e leva a maturação por germinativo e leva a maturação por afinidade. afinidade.
taxa de mutação neste processo : 1/1000 taxa de mutação neste processo : 1/1000 bpbp(normal : 1/ 10(normal : 1/ 106 6 ou menos)ou menos)
a cada divisão 1/2 linfócitos modificam suaa cada divisão 1/2 linfócitos modificam suaseqüênciaseqüência
mutação ocorre nas regiões V mutação ocorre nas regiões V rearranjadasrearranjadas
conseqüência da grande proliferação e conseqüência da grande proliferação e hipermutaçãohipermutação
na fase após infecção de uma bactéria pode ocorrer a recombinação (integração) do DNA do fago no DNA da bactéria
Ciclo de vida de um bacteriófago lambdaCiclo de vida de um bacteriófago lambda
na fase após infecção de uma bactéria ocorre a recombinação (integração) sítio-específica (att) do DNA do fago no DNA da
bactéria
Há replicação do DNA do fago, formação de novas partículas e o ciclo de fecha
os fagos permanecem dentro das bactérias e assim podem ser usados para formar bibliotecas de DNA