republica de colombia guia tecnica para identificaciÓn de

Republica de Colombia

Gobernación de Santander

GUIA TECNICA PARA IDENTIFICACIÓN DE

HAEMOPHILUS INFLUENZAE EN

MICROBIOLOGIA CLINICA

Laboratorio de Salud Pública

CÓDIGO MI-GS-GI-119

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FECHA DE APROBACIÓN 23/12/2020

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INTRODUCCIÓN

Haemophilus influenzae se encuentra exclusivamente en el tracto respiratorio humano y

forma parte dela flora normal. Es un cocobacilo Gram-negativo no móviles poseen o no un

polisacárido serológicamente específico, que permite clasificarlos en 6 serotipos,

denominados a, b, c, d, e y f (clasificación de Pittman) y se correlacionan con la virulencia

de la bacteria (3).

H. influenzae serotipo b (Hib) causa enfermedad invasiva como meningitis, neumonía,

sepsis, bacteriemia y enfermedad localizada como otitis, conjuntivitis o sinusitis,

especialmente en los niños.

H. influenzae serotipo a (Hia) es reconocido como un importante patógeno emergente

que puede ser considerado el segundo tipo clínicamente más virulento entre los 6

serotipos. Este serotipo afecta especialmente a los menores de 2 años y se ha

demostrado la relación de algunos clones de Hia con enfermedades graves con alta

tasa de letalidad.

Otros serotipos como el Hif y el Hie afectan principalmente a los adultos con alguna

enfermedad predisponente y, en menor frecuencia, a la poblaciónpediátrica

Algunos aislamientos no poseen cápsula, por lo que no pueden serotipificarse y se los

denomina H. influenzae notipificables (HiNT), y es responsable del 20-30% de todos

los episodios de otitismedia aguda.

Modo de transmisión:

El único reservorio conocido de la bacteria está en los humanos, quienes la pueden portar

sin estar enfermos, se propaga a través de las mucosidades y/o de la saliva.

Afortunadamente, se considera que en la mayoría de los casos su capacidad de contagio

es limitada.

Prevención:

En Colombia, la vacuna contra H. influezae serotipo hace parte del plan ampliado de

inmunizaciones (PAI), desde 1998.








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Aspectos clínicos:

El cuadro clínico es variable y depende de la edad del paciente, en niños mayores de un

año y adultos se puede presentar fiebre, cefalea, fotofobia, nauseas, vómito y rigidez en la

nuca, purpura petequial o equimotica, en las formas graves se puede presentar coma,

convulsiones signo de focalidad neurológica. En niños menores de un año mayoría de los

casos cursa con ausencia de signos meníngeos, se puede presentar irritabilidad, fiebre o

hipotermia, alteración del estado general, rechazo de alimentos, vomito. Los otros signos

posibles incluyen apnea, convulsiones, alteraciones de la conciencia, fontanela

abombada, ocasionalmente rigidez en la nuca y erupción purpurica.

Tabla 1. Agentes etiológicos de MBA (Protocolo INS. 2014)

1. OBJETIVO.

Describir la metodología para el desarrollo del programa de vigilancia de meningitis

bacterianas producida por Haemophilus influenzae enfocado en su identificación y

determinación a partir de muestras biológicas.

Establecer los procesos de obtención, conservación y transporte de las muestras

para la detección de Haemophilus influenzae

2. ALCANCE

Este documento se tomará como referencia única para el programa de vigilancia de

meningitis bacteriana por Haemophilus influenzae, enfocado en la identificación y

GRUPO ETAREO AGENTES BACTERIANOS

Recién nacido ( 0 a 4 semanas)

Enterobacterias: Escherichia coli, Klebsiella. pneumoniae, Proteus sp. Streptococcus del grupo B. Listeria Monocytogenes Enterococcus spp

De 1 a 3 meses

Todos los a entes citados re ia ente s: Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae tipo b Neisseria meningitidis

De 2 a 5 años

Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae tipo b, Neisseria meningitidis

Mayores de 5 años

Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis








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determinación a través de métodos fenotípicos, en el Laboratorio de Microbiología del

Laboratorio Departamental de Salud Pública como parte del control de calidad

indirecto.

3. RESPONSABILIDADES

Coordinador(a) grupo de laboratorio de salud pública: aprobar el presente

documento, supervisar el estricto cumplimiento de lo establecido en el mismo y

avalar los resultados que se generen de éste.

Profesional universitario o contratista responsable del área de microbiología clínica

del Laboratorio Departamental de Salud Pública: aplicar lo anterior con calidad,

oportunidad y avalar los resultados que se generen del mismo.

4. DEFINICIONES Y ABREVIATURAS.

Meningitis: Es la inflamación de las membranas que rodean al cerebro y la medula

espinal secundario a la presencia de una bacteria y que se caracteriza por un número

anormal de células (leucocitos) en el líquido cefalorraquídeo (LCR).

ACH: Agar chocolate

CIM: Concentración Inhibitoria Mínima

LCR: Líquido Cefalorraquídeo

LSP: Laboratorio de Salud pública

LSPD: Laboratorio de Salud pública Departamental

INS: Instituto Nacional de Salud

MBA: Meningitis Bacteriana Aguda

ATCC: American Type Culture Collection

5. CONDICIONES GENERALES

Las cepas aisladas de hemocultivos y LCR deben ser enviadas al Laboratorio

Departamental de Salud Pública por diferentes instituciones del departamento.








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Muestra ideal para realizar el diagnóstico de la MBA es el LCR recolectado por

punción lumbar, el cual debe recolectarse antes de instaurar cualquier terapéutica

antibiótica.

Todo liquido estéril que presente algún microorganismo se debe enviar el

aislamiento sin importar el microorganismo al LDSP, para líquido cefalorraquídeo

en el formato LCR, para hemocultivo en el formato Bacteriología general.

Seguir las medidas básicas de bioseguridad a través uso de los elementos de

protección individual como guantes, bata, tapaboca N95 y gafas durante la

recolección y procesamiento de las muestras. El nivel de contención recomendado

para los laboratorios que realizar el procesamiento de las muestras un nivel de

bioseguridad 2 (BSL-2).

6. FUNDAMENTO DEL METODO DE ENSAYO.

Agar chocolate o agar sangre: El objetivo es realizar el aislamiento del agente

bacteriano inicial para preceder a su identificación y caracterización. (Ver Anexo

No. 1)

Coloración de Gram: Este método permite diferenciar los agentes infecciosos

bacterianos en dos grandes grupos (Gram negativas y Gram positivas) basados en

las propiedades químicas y físicas de la pared celular, permitiendo orientar sobre

cuál es el posible agente bacteriano de acuerdo a la morfología y coloración

observada. Cuando se realiza a partir del LCR se debe hacer del sedimento luego

de centrifugar la muestra. (Ver Anexo No. 2)

Prueba oxidasa: La prueba de oxidasa determina la presencia de citocromo

oxidasa. El reactivo de oxidasa de Kovac (1% tetrametil-ρ-

hidroclorofenilendiamina) se torna en un compuesto purpúreo por la presencia de

microorganismos que contienen citocromo c como parte de su cadena respiratoria;

por lo tanto, una prueba de oxidasa dará una reacción púrpura. (Ver Anexo No. 3)

VITEK II (Ver Anexo No. 4)

7. LIMITACIONES O INTERFERENCIAS.

Falta de disponibilidad, accesibilidad y conocimiento de los protocolos de

procedimientos por parte del personal.








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Reactivos insuficientes, de mala calidad o vencidos.

Ausencia de recurso humano que cumpla con los requisitos de capacitación,

entrenamiento y experiencia para los procedimientos realizados en el área de

microbiología clínica.

8. RECOLECCION E IDENTIFICACION DE LA MUESTRA.

Figura 1. Mapa de proceso de identificación de H. influenzae

9. CONSERVACION DE LA MUESTRA

Colonias grandes, mucoides no

hemolíticas, redondas, entre

incoloras y color gris opaco en

agar chocolate suplementado

Coloración de Gram

Cocobacilos Gram negativos

Negativo

OXIDASA

Positivo

Haemophilus No Haemophilus

Vitek 2.0

Haemophilus influenzae








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Las muestras no deben ir refrigeradas y tampoco incubadas en el medio de

transporte amies con carbón activado (temperatura de envío: temperatura

ambiente entre 18 y 25°C)

Todas las muestras deben ser transportadas en triple embalaje correctamente

marcada y etiquetada con el nombre del paciente, historia clínica y fecha de

recogida del aislamiento cumpliendo con los protocolos de bioseguridad.

La muestra de LCR debe ser almacenada un envase plástico estéril o en un

criovial tapa rosca estéril y conservar a una temperatura de 2-8°C.

10. EQUIPOS

Materiales

Guantes

Caretas

Asa Bacteriológica

Escobillones estériles

Bombonera de anaerobiosis (Jarra con vela)

Encendedor

Láminas Portaobjetos

Cajas de petri

Tubos de ensayo

Pipetas Pasteur

Gradillas

Medios de Transporte Amies con carbón activado

Mechero

Equipos.

Microscopio

Incubadora

Balanza

Autoclave

pHmetro








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Nevera

Equipo automatizado (Vitek 2)

11. REACTIVOS CONTROLES Y MATERIALES DE REFERENCIA

Reactivo.

Agua Destilada

Solución salina

Hipoclorito

Medios de Cultivo

Tarjetas de Identificación para equipo automatizado

Controles:

Se realizará control de calidad con cepas ATCC microorganismos certificados para el

control de calidad en microbiología. Sus características genotípicas y fenotípicas

garantizan la identidad del microorganismo.

Material de referencia:

Laboratorio Departamental de Salud Pública. Protocolo de Procedimiento

Meningitis Bacteriana. Sección Microbiología. Bucaramanga, Santander. Marzo de

2004

Procedimiento para la Aplicación de las Normas de Bioseguridad en el Laboratorio

Departamental de Salud Pública (LDSP).

Guía para la vigilancia por laboratorio de Meningitis Bacteriana aguda (MBA)

Dirección de Redes en Salud Pública. Grupo de Microbiología - INS. 2014

Procedimientos para el diagnóstico de Neumonías y Meningitis Bacterianas y la

caracterización de cepas de Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae,

SIREVA II. Grupo Microbiologia, Instituto Nacional de Salud Bogotá – Colombia,

Organización Panamericana dela Salud- INS 2012








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12. DESCRIPCION DEL PROCEDIMIENTO

1. Cultivo a partir de la muestra enviada por la IPS al LDSP, Realizar el aislamiento del agente bacteriano inicial para preceder a su identificación y caracterización. 2. Una vez obtenido el crecimiento, se realizan las pruebas de identificación. (Ensayos que permiten identificar las características del metabolismo celular bacteriano y son específicas para cada agente. Estas pruebas se realizan a partir del cultivo puro. 3. El Laboratorio Departamental de salud Pública envía Las cepas una vez se hagan las pruebas necesarias al INS 4. En el INS funciona el Laboratorio de Referencia en Microbiología. El objetivo de enviar las cepas causantes de meningitis bacteriana es poder centralizar la información y tener datos actualizados y permanentes de los agentes causales que traen beneficios paraclínicos y epidemiológicos para la toma de decisiones en beneficio de la comunidad. 5. En caso de tener que remitir la muestra de LCR para otros ensayos bacteriológicos

adicionales como PCR remitir la muestra a temperatura de refrigeración (4-8°C). Para el

estudio de virus si el envío se demora más de 24 horas, la muestra debe congelarse de -

20 a -70°C, en todas las ocasiones utilizar el triple empaque indispensable para el

transporte de muestras y biológicos

13. CONTROL DE CALIDAD ANALITICO.

Programa de Evaluación Externa del Desempeño Directa (PEEDD)

El Grupo de Microbiología Clínica del LDSP realiza la Evaluación Externa del Desempeño

en Bacteriología y Resistencia a los Antimicrobianos (EEDB-RA) dirigida a la Red

Nacional de Laboratorios, como una herramienta para evaluar la competencia técnica de

los laboratorios en la identificación y realización de pruebas de sensibilidad antimicrobiana

de agentes bacterianos de importancia en salud publica entre los que se encuentran

microorganismos causantes de MBA.








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Programa de Evaluación Externa del Desempeño Indirecta (PEEDI)

Este PEEDI, se realiza mediante la caracterización fenotípica del 100% de los agentes

bacterianos de importancia en salud pública causantes de meningitis y neumonías

bacterianas.

14. ANALISIS Y EXPRESION DE RESULTADOS.

Morfología Cocobacilos

Tinción Gram negativos

Agar Chocolate

suplementado

colonias grandes, mucoides no hemolíticas,

redondas, entre incoloras y de color gris opaco.

Oxidasa Positiva.

Requerimiento

de factores

Hemina (X) y NAD (V) requiere de ambos factores

para su crecimiento

Porfirinas: Negativa

15. EMISION DEL INFORME DE RESULTADOS.

El documento que debe ser remitido al INS para solicitud de los ensayos es: FOR-

R01.5030-002 Envío de aislamientos invasores de Haemophilus influenzae

Los resultados realizados por INS se enviarán a las instituciones en su formato original en

archivo PDF, a través de correo institucional.

Los resultados que no cumplan con los criterios establecidos por el INS serán enviados a

las instituciones en formato de rechazo (establecido por el LDSP). Además, llevara anexo

el resultado del mismo

16. EXAMENES COMPLEMENTARIOS.

Determinación del requerimiento de factores X y V (Ver Anexo No.5)








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Prueba de aglutinación en látex Se realiza para la identificación de los serogrupos o

serotipos de H. influenzae a través de aglutinación en los cuales se utilizan antisueros

específicos que reaccionan con las capsulas bacteriana de estos. (Ver Anexo No. 6)

Prueba de síntesis de porfirinas (Ver Anexo No.7)

17. ANEXOS

Numero de Anexo Nombre del Análisis

Anexo No.1 Agar chocolate suplementado

Anexo No.2 Coloración de Gram

Anexo No.3 Prueba de oxidasa

Anexo No.4 VITEK

Anexo No.5 Prueba para requerimientos de factores de crecimiento

Anexo No.6 Serotipificación en láminas

Anexo No.7 Prueba de la síntesis de las porfirinas

Anexo No.1

AGAR CHOCOLATE SUPLEMENTADO

Este medio permite el crecimiento de microorganismo exigentes en sus requerimientos

nutricionales, por ejemplo: especies de Streptococcus, Haemophilus y Neisserias

patógenas.

Es un medio de cultivo ampliamente nutritivo por la presencia de peptonas, tripteína,

extracto de levadura, extracto de corazón y almidón. El agregado de sangre y suplemento

IsoVitalex con solvente aporta nutrientes, vitaminas y minerales adicionales. El cloruro de

sodio mantiene el balance osmótico y el agar es el agente solidificante

Preparación.

La composición química de la base de la tripticasa soya con extracto de levadura, de la

casa comercial DIFCO (Ref. 0662-17-0) es la siguiente:

Extracto de carne bovina 2,0 g








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• Suspenda 40g en un litro de agua destilada y lleve hasta ebullición para disolver el polvo

• Esterilice en autoclave a 121°C por 15 minutos

• Enfríe a 50°C (baño de María)

Procedimiento

Sembrar por superficie directamente el material de estudio

Control de calidad.

Incubar una caja de agar chocolate sin inocular de 24-48 h a 35 ± 2 °C. El medio debe

permanecer marrón chocolate, opaco, posiblemente poco homogéneo y no debe

observarse crecimiento.

Crecimiento.

El estudio del control de calidad de la sangre asegura que este medio mantenga el

crecimiento de microorganismos no fastidiosos y demostrará la alfa y beta hemólisis,

reacciones típicas de S. pyogenes y S. pneumoniae.

Cepas control

Inocular muestras representativas con las cepas siguientes. Incubar las placas a una

temperatura de 35 ± 2 °C en una atmósfera aerobia con dióxido de carbono. Efectuar

lectura de las placas después de 18 – 24 h y 42 – 48 h de incubación

Haemophilus influenzae ATCC 10211 Crecimiento de bueno a excelente

Hidrolizado ácido de caseína 17,5 g

Almidón 1,5 g

Hemoglobina 10,0 g

IsoVitaleX 10,0 g

Agar 16,0 g

Agua destilada 1000 mL

pH final 7.3 ± 0.2








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Neisseria gonorrhoeae ATCC 43069 Crecimiento de aceptable a excelente

Neisseria meningitidis ATCC 13090 Crecimiento de bueno a excelente

Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 Crecimiento bueno a excelente

Anexo No. 2

COLORACIÓN DE GRAM

Fundamento.

Según la reacción al Gram las bacterias se dividen en Gram positivas, se tiñen de color

violeta y en Gram negativas, se tiñen de color rojo. La división de las bacterias en Gram

positivas y en Gram negativas está dada por las diferencias físicas y químicas en la

composición de la pared celular.

La pared celular de las bacterias Gram positivas, está compuesta en un 50-60% por

peptidoglicano y en un 40-50% por ácidos teicoicos y polisacáridos. El peptidoglicano

(llamado también mureína, capa de glicopéptido o mucopéptido) está compuesto de N-

acetilglucosamina y N-acetil murámico. En las bacterias Gram positivas el cristal violeta se

fija a la pared celular y con la adición del lugol (mordiente), se produce el complejo cristal

violeta-iodo el cual es resistente a la decoloración. La pared celular de las bacterias Gram

negativas está compuesta por una delgada capa de peptidoglicano que constituye del 5-

10% del peso de la pared celular, recubriendo esta capa se encuentra una membrana

externa compleja, constituida por: fosfolípidos (20-30%), lipopolisacáridos (30%) y

proteínas (40-50%). El decolorante en las bacterias Gram negativas actúa como un

solvente de los lípidos presentes, permitiendo que el complejo cristal violeta-iodo se

libere, tomando la bacteria el colorante secundario o de contraste (safranina). Es

importante estandarizar los métodos de coloración para obtener resultados constantes y

fidedignos, para esto es necesario valorar los resultados con microorganismos control, en

los que se conozca la reacción al Gram.








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La coloración de Gram es una prueba critica para el diagnostico presuntivo y rápido de

agentes infecciosos, también sirve para valorar la calidad de la muestra clínica.

Estas características pueden estar influenciadas por muchos factores tales como:

• Edad del cultivo

• Medio de cultivo

• Atmósfera de incubación

• Método de coloración

• Presencia de sustancias inhibitorias.

Reactivos

Cristal violeta

Solución A de reserva

Solución B de reserva

La solución de trabajo se prepara mezclando una parte de solución A, con cuatro partes

de solución B.

Solución de yoduro de potasio

Colocar el yodo y el yoduro de potasio

dentro de un mortero, agregar 20 ml de agua destilada y mezclar hasta que los reactivos

Cristal violeta 2 g

Alcohol etílico absoluto 20 mL

Oxalato de amonio 0,8 g

Agua destilada 80 mL

Yodo 1 g

Yoduro de potasio 2 g

Agua destilada 300 ml








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estén en solución. Colocar la solución en un frasco ámbar, lavar el mortero con la

cantidad de agua necesaria para completar los 300 ml.

Decolorantes

• Lento: alcohol etílico (95%).

• Intermedio: alcohol etílico 95% + acetona (grado reactivo) 1:1

• Rápido: acetona (grado reactivo)

Safranina (Solución de contraste)

La solución de trabajo se prepara

mezclando 10 ml de la solución anterior con 90 ml de agua destilada

Procedimiento

• Fije la preparación con calor

• Cubra la preparación con cristal violeta por 1 minuto.

• Lave con agua

• Cubra la preparación con lugol por 1 minuto.

• Lave con agua.

• Cubra con el alcohol etílico sin tiempo lave rápidamente

• Lave con agua

• Cubra con safranina por 30 segundos.

• Lave con agua, dejar secar.

Control de calidad

• Observar la apariencia de los reactivos diariamente. Si el cristal violeta presenta un

precipitado o cristales sedimentados, refiltrar antes de usarlo. La evaporación puede

Safranina O 2,5 g

Alcohol etílico (95%) 100 mL








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alterar la efectividad de los reactivos, por lo tanto las soluciones de trabajo deben ser

cambiadas regularmente.

• Realizar con cepas conocidas un control diario, igualmente cuando se prepara un nuevo

lote de reactivos. Preparar dos extendidos, uno con Escherichia coli y otro con

Staphylococcus aureus a partir de un cultivo en caldo (estas cepas son las de control de

antibiograma).

Anexo No. 3

PRUEBA OXIDASA

Fundamento

Esta prueba determina la presencia de la enzima citocromo oxidasa. Para esta prueba se

puede usar el reactivo de Kovac (tetrametil-ρ-hidroclorofenilendiamina) o el reactivo de

dimetil (1% dimetil-ρ- hidroclorofenilendiamina dihydroclorido). En ambos casos, el

reactivo se torna azulpúrpura en presencia de la enzima.

Material y equipos

• Cultivo bacteriano fresco (24h)

• Papel de filtro

• Cultivo

• Pipeta

• Puntas de pipeta

• Reactivo de Kovac ( o dimetil)

• Cabina de bioseguridad II

Procedimiento

Nota: se debe evitar el uso de asas de cultivo de níquel a fin de evitar falsos positivos

• Preparar la cabina de bioseguridad II para el trabajo según lo estipulado en los

procedimientos estándar de trabajo (POE) del laboratorio








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• Introducir en la cabina la placa a testar, el papel de filtro y una alícuota del reactivo de

Kovac -Colocar una gota de reactivo en una pequeña tira de papel de filtro

• Con el asa de cultivo, tomar una pequeña cantidad de crecimiento bacteriano

(aproximadamente una colonia) con cuidado de no tocar el agar, y mezclar con la gota de

reactivo

•Esperar unos 10 segundos (10-30 minutos si se usa reactivo dimetil). Si el organismo es

oxidasa

Interpretación de resultados

• Positivo: la reacción tomará un color azul-púrpura

• Negativo: permanecerá incoloro

Anexo No.4

VITEK II

Fundamento:

El sistema automático VITEK usado en el ámbito de la microbiología clínica, e industrial.

VITEK automatiza todas las etapas necesarias para la realización de las pruebas de

identificación y antibiograma con las tarjetas VITEK. Está constituido por un

inoculador/sellador, un incubador/lector, un ordenador y una impresora. El

inoculador/sellador permite la inoculación de las tarjetas en pocos minutos. El

incubador/lector asegura simultáneamente la incubación y la lectura de las tarjetas para

una capacidad que varía de 32 a 480 tarjetas según el modelo. El ordenador equipado

con los programas de VITEK efectúa un control permanente de las operaciones en curso,

memoriza los valores, trata e interpreta los resultados. Este modelo reagrupa el inoculador

y el incubador/lector en el mismo módulo. Su capacidad es de 30 tarjetas.

Materiales:

Densichek

Pipetas automáticas

Vortex








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Tarjetas de ID y AST

Tubo plástico

Hisopos

Procedimiento:

Repicar:

• Con ayuda del hisopo contenido en el medio de transporte repicar la cepa en agar

solido según corresponda:

• Mueller Hinton para enterobacterias y Gram positivos.

• Agar Sangre para Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae

• Agar Chocolate para Neisseria meningitidis, Neisseria gonohrroeae, Haemophilus

influenzae.

• Agar sabouraud para hongos y levaduras.

Incubación.

Incubar las placas en posición invertida a 35+/- 2°C durante 18-24 horas.

Las placas de Haemophilus spp y Streptococcus spp, deben ser incubadas en

atmósfera del 5% de CO2.

Identificación y antibiograma,

Preparar los reactivos e insumos: tarjetas de identificación, solución salina, tubos,

pipetas y puntas.

Realizar prueba de catalasa, oxidasa y Gram para cada microorganismo aislado.

Preparación de la muestra:

TUBO 1: Tubo para identificación

adicionar 3ml de solución salina en tubo, adicionar de una a tres colonias y

disolverla, agitar con vortex y con ayuda del densicheck evaluar la densidad del

inoculo según criterios de Mac Farlan así:

Intervalo aceptable: McFarland. Microrganismos

0,50- 0,63 Gram negativos y positivos

1,80- 2,20 Levaduras








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2,70- 3,30 Neisseria/ Haemophillus

Tomar una tarjeta de identificación y colocarla en el cassette.

TARJETA VITEK2 UTILIDAD

VITEK GN Identificación de enterobacterias y Gram

negativos no fermentadores.

VITEK GP Identificación de enterococcus,

estreptococcus, estafilococos y

organismos Gram positivos.

VITEK NH Identificación de Neisseria spp,

Haemophilus spp

VITEK YST Identificación de levaduras y organismos

similares.

TUBO 2: Tubo para antibiograma

Inocular según corresponda:

Gram negativos: 3.0 ml de solución salina + 145ul de suspensión 0.45- 0.63en la

escala de Mac Farlan.

Gram Positivos: 3.0 ml de solución salina + 280ul de suspensión 0.5-0.63 en la

escala de Mac Farlan.

Levaduras: 3.0 ml de solución salina + 280ul de suspensión 0.5-0.63 en la escala de

Mac Farlan.

Tomar una tarjeta de antibiograma según corresponda.

TARJETA UTILIDAD

AST-N272 Pruebas de sensibilidad para bacilos

aerobios Gram negativos clínicamente

significativos frente a determinados

antimicrobianos.








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AST-P612 Pruebas de sensibilidad para

Staphylococcos spp, Enterococcus spp, y

S. agalactiae frente a determinados

antimicrobianos.

AST YST 08 Pruebas de sensibilidad para hongos.

Anexo No.5

DETERMINACIÓN DEL REQUERIMIENTO DE FACTORES X Y V

En el comercio hay tiras o discos de papel filtro impregnado de factores X o V. Los

factores X y V, ambos hidrosolubles, difunden fácilmente en agar. Los discos o tiras de

papel de filtro con estos factores se colocan sobre la superficie de un medio deficiente en

dichos factores como el agar tripticasa soya, previamente inoculado en forma masiva con

el organismo en estudio. La dependencia de la bacteria por los factores X y V se

determina observando el patrón de crecimiento de las colonias alrededor de las tiras de

papel.

Procedimiento

• A partir de un aislamiento puro, realice una siembra masiva sobre el agar o realice una

suspensión bacteriana en escala 0,5 de MacFarland y siembre el inóculo con el escobillón

sobre la superficie del agar en tres direcciones con el fin de asegurar la uniformidad de

este. Evite el contacto del asa con el agar chocolate, para evitar arrastrar los factores

contenidos en el medio.

• Coloque los discos o tiras X y V (BBL, Difco), sobre la superficie del agar en el área de

inoculación, a una distancia de 1 a 2 cm entre ellos.

• Incube la caja a 35ºC en 3 - 5% de CO2 durante 18 a 24 h.

Lectura

Examine visualmente la superficie del agar para comprobar la presencia del crecimiento

visible alrededor de los discos/tiras. Los aislamientos que dependen únicamente del factor








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X crecerán alrededor del disco/tira X y los que dependen solamente del factor V, crecerán

alrededor del factor V. Los aislamientos que requieren de los dos factores (X y V),

crecerán en medio de ambos discos

Control de calidad

Realice la prueba con las cepas control:

Requiere sólo factor V: H. parainfluenzae

Requiere factores X y V: H. influenzae

Anexo No.6

AGLUTINACIÓN EN LÁMINA

Las bacterias en suspensión se aglutinan cuando se mezclan con anticuerpos dirigidos

contra los componentes de la superficie. Esta técnica es un método simple y rápido para

identificar y serotipificar H. influenzae.

Procedimiento:

• Haga una suspensión densa (tubo #5 de la escala de McFarland) de la bacteria a

identificar, en solución salina a 0,85%.








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Suavemente mezcle la lámina repetidamente para las reacciones de aglutinación en la mina

Fuente: Manual de Laboratorio para la Identificación y Prueba de Susceptibilidad a los

Antimicrobianos de Patógenos Bacterianos de Importancia para la Salud Pública en el Mundo en Desarrollo Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Neisseria

gonorrhoeae, Salmonella serotipo Typhi, Shigella y Vibrio cholerae.

• Coloque por separado dos gotas de 5 ó 10 µl de la suspensión, en una lámina

portaobjetos limpia y agregue a una de ellas 5 ó 10 µl del antisuero polivalente y a la otra,

5µl de solución salina (control negativo).

• Observe la formación de grumos bacterianos antes de 1 minuto. Sólo una aglutinación

gruesa se debe considerar positiva.

• Sí la reacción con el polivalente es positiva, continúe con el anti-b y después con los

otros antisueros (anti-a,c-f).

El orden de los antisueros se basa en la prevalencia de los serotipos en una región.

Algunos aislamientos presentan una aglutinación pequeña con varios antisueros; en ese

caso debe resembrarse el aislamiento y estudiarse nuevamente frente a todos los

antisueros. Pueden ocurrir reacciones cruzadas especialmente en serotipos poco

frecuentes por ejemplo c y d. También pueden presentarse reacciones cruzadas de b, e y

f








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Interpretación

1. Aglutinación con el antisuero polivalente y no hay aglutinación con la solución salina

(control negativo).

• Es un H. influenzae capsulado

• Continúe la serotipificación con los antisueros monovalentes colocando primero el más

frecuente de los serotipos (b). Utilice la misma metodología empleada con el antisuero

polivalente.

• Continúe con el antisuero monovalente, que corresponda al segundo serotipo en

frecuencia para comprobar que no existe reacción cruzada con el antisuero monovalente.

• Sí hay aglutinación con el antisuero b y no se observa con el otro antisuero

monovalente, corresponde a H. influenzae serotipo b

• Sí no se observa aglutinación con el antisuero b, continúe la serotipificación con el

antisuero correspondiente al serotipo que sea segundo en frecuencia. Generalmente para

Latinoamérica es el a.

2. Aglutinación con el antisuero polivalente y hay aglutinación con la solución salina.

• El aislamiento esta autoaglutinando y el serotipo debe determinarse por la técnica de

reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

3. No hay aglutinación con el antisuero polivalente ni con la solución salina (control

negativo) El aislamiento no es capsular y se informa como H. influenzae NC.

(Comunicación personal, Mary Slack, PHLS de Oxford).

• Recuerde que si se demora mucho la lectura, la placa puede secarse y dar falsos

positivos.

• Un exceso de uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) puede dar un resultado

falso negativo.








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CONTROL DE CAMBIOS

CONTROL DE CAMBIOS

VERSIÓN FECHA DESCRIPCIÓN DEL CAMBIO

ELABORO REVISO APROBO

0 06/12/2020 Emisión inicial del documento

ROBINSON GALAN TORRES.

Profesional universitario

VIANEY EMILCE PORTILLA R.

Profesional universitario

FREDY BLANCO RIOS

Coordinador Grupo LSP

GERMAN MARIN

Director de Salud Integral

JAVIER VILLAMIZAR

SUAREZ

Secretario de Salud de

Santander

republica de colombia guia tecnica para identificaciÓn de

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