restrikce a modifikace fÁgovÉdna...kmeny e. colik a k(p1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou...
TRANSCRIPT
![Page 1: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/1.jpg)
RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉ DNA
Kmeny E. coli K a K(P1) + mají vzájemně odlišnou hostitelskouspecifitu (K a P1) = obsahují odlišné RM-systémy
po jednom cyklu
![Page 2: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/2.jpg)
Experimentální d ůkaz přítomnosti a p ůsobení RM systém ů
Kmen E. coliobsahující RM systém EcoB
Kmen E. coliobsahující RM systém EcoK
![Page 3: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/3.jpg)
RESTRIKČNĚ-MODIFIKAČNÍ (RM) SYSTÉMY
� Složkami standardního restrikčně-modifikačního (RM) systému jsou sekvenčně specifickéenzymy:� A. modifikační metyláza (metyltransferáza)� B. restrikční endonukleáza� Restrikci a modifikaci podléhá jen dsDNA:
1. Při infekci fágem2. Při přenosech DNA transdukcí a konjugací, omezeně transformací (při umělé tr.)
![Page 4: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/4.jpg)
N6mA
C5mC
![Page 5: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/5.jpg)
N6mA
Donor metylovéskupiny: SAM
(AdoMet)
![Page 6: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/6.jpg)
SYSTÉMY RESTRIKCE A METYLACE1. Hsd systémy (host specificity of DNA)
� třídy (typy) I, II, III, IVrestrikční a metylační aktivita
2. Systémy restrikce modifikované DNA� Mar, Mrr (methylated-adenine), DpnI� Mcr (methylated-cytosine)
3. Systémy metylující specifické sekvence DNA� Dam (adenine-methylation)� Dcm (cytosine-methylation)
![Page 7: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/7.jpg)
95%
1-2 geny,
30
protein štěpíjen modifiko-vanou DNA
![Page 8: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/8.jpg)
![Page 9: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/9.jpg)
GENY KÓDUJÍCÍ RM-SYSTÉMY JSOU NESENY NA RŮZNÝCH REPLIKONECH
lokalizace genů na chromozomu, plazmidech, nebo profágách
![Page 10: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/10.jpg)
xbaI Xanthomonas campestrisM.Vch0211 Vibrio cholerahphI Vibrio metschnikoviiCAA68 Lactococcus lactis
Integron
Rle39BI Transpozon
Sth368I Streptocvoccus thermophilushsdMS S. aureus
Integrační komulativníelement/genomický ostrov
hindIII H. influenzaesau42I S. aureusecoO1091 E. colibsuMI B. subtilis
Bakteriofág/profág
paeR71 P. aeruginosaecoRI E. colissoII Shigella sonneibsp6I Bacillus sp.
Plazmid
Příklad RM systémuMobilní element
Přítomnost gen ů RM systém ů na mobilních elementech
![Page 11: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/11.jpg)
Klasifikace RM-systém ů
![Page 12: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/12.jpg)
PODJEDNOTKOVÉ SLOŽENÍENZYMOVÉHO KOMPLEXU TYPU I
Multifunkční komplex
S = rozpoznání cílové sekvence
M = vazebné místo pro SAM a aktivnímísto pro metylaci
R = aktivní místo pro hydrolýzu ATP, pro translokaci DNA a pro št ěpení
![Page 13: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/13.jpg)
Alosterický efektorumožňující rozpoznánícílové sekvence
SAM se uvolňuje před štěpením
INTERAKCE ENZYMŮ RM SYSTÉMU TYPU IS CÍLOVOU SEKVENCÍ NA DNA
![Page 14: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/14.jpg)
1. Vyhledání rozpoznávacísekvence
2. Podle stavu sekvence (M, NM, H-M) dochází k
a) uvolnění enzymub) restrikcic) metylaci
Interakce enzymového komplexu s rozpoznáva-cím místem
![Page 15: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/15.jpg)
ATP-dependentní translokace DNA - ke štěpení docházípo kolizi DNA řetězců v místě navázaného enzymu
štěpení
MODELY TRANSLOKACE DNA ZPROSTŘEDKOVANÉ ENZYMY RM SYSTÉMŮTYPU ISmyčky pozorované v EM
![Page 16: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/16.jpg)
Navázaný restrikčníenzym
smyčka
![Page 17: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/17.jpg)
TRD = target recognition domain
![Page 18: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/18.jpg)
Pro RM systém typu I je nezbytná funkční hsdS -její mutace vede k fenotypu r- m-.S- M-R-
MUTACE V GENECH RM SYSTÉMU
r+/-/m-
![Page 19: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/19.jpg)
RM SYSTÉMY, U NICHŽ JE ŠTĚPENA MODIFI-KOVANÁ DNA (KMEN NETVOŘÍ METYLÁZU)� E. coli K12� Mar = methyladenine restriction (GmeAC, GmeAG)� Mrr = methyladenine recognition and restriction� Mcr = methylcytosine restriction - modifiedcytosine restriction (GmeCG - C5, N4, HM-C5) -štěpení sekvence v několika místech (štěpí téžneglukozylovanou fágovou DNA)� Diplocooccus (Streptococcus) pneumoniae:
RM systém DpnI - štěpí GmACT� (Caulobacter, Neisseria, Acholeplasma, Streptomyces)
![Page 20: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/20.jpg)
Kóduje místněspecifickou metylázu
![Page 21: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/21.jpg)
Na úrovni populace
StandardníRM systém
![Page 22: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/22.jpg)
![Page 23: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/23.jpg)
� Fág MU - konverze adeninu na A-(1-acetamido)adenin� Plazmidy: Ard (alleviation of restriction) - antirestrikčníprotein
� Fág lambda: Ral (restriction alleviation) - antirestrikčníprotein - zvýšení modifikační aktivity enzymů typuAI na NM DNA
� Fágy T3 a T7: (proteiny Ocr = overcoming restriction) inaktivace enzymů typu I (zábrana jejich vazby na DNA)
� Fág P1: Dar-proteiny (defense against restriction) ? -rozklad SAM
Příklady antirestrik čních mechanism ů
![Page 24: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/24.jpg)
Ocr 0,3
Promotor genu ard
Lokalizace genu ocr/0,3 na fágovém genomu
Lokalizace genu ard na plazmidu
Antirestrik čníprotein
![Page 25: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/25.jpg)
![Page 26: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/26.jpg)
Evoluce interakcí mezi T-sudými fágy a hostiteli
5-hydroxymetyl-cytosin
The prr locus was originally described as coding a ribonuclease that is activatedafter phage T4 infection to cut within theanticodon of a specific tRNA, inactivatingprotein synthesis and thus blocking phagedevelopment.
glykozylace hmC
![Page 27: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/27.jpg)
SYSTÉMY METYLACE DNA (E. COLI K12)� 1. Systém Dam (dam-metyláza)
� metylace A v GATC (donor met = SAM)� GATC - regulační funkce : počátek replikace,
promotory, reparace� (sekvence GATC je rozpoznávána 15% RE typu
II, je přítomna u 50% všech 4N-RE, není však cílovou sekvencí pro restriktázy v žádném z druhů enterobaktérií.� 2. DNA cytozin metylační - Dcm (E. coli K12)
� metylace cytozinu na C5 v sekvenci CC(A/T)GG(?funkce při reparaci na velmi krátké vzdálenosti)
![Page 28: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/28.jpg)
VÝSKYT RM SYSTÉMUU ENTEROBAKTERIÍ (3 DRUHY)� 30% kmenů (z 1000 studovaných) obsahuje RM
systém� u 170 RM systémů bylo zjištěno jen 33 různých
cílových sekvencí� nebyly zjištěny RM systémy rozpoznávající 4 bp-
místa (včetně GATC)
![Page 29: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/29.jpg)
VÝZNAM RESTRIKCE� Ochrana integrity vlastní DNA
� obrana před bakteriofágy (typ II) …dočasné působení, nutná obměna� Systém napomáhající rekombinaci cizorodé DNA (typ I)
� štěpení DNA (náhodně) mimo rozpoznávací sekvenci umožní rekombinaci mnoha genů - analýza přenosu genů transdukcí a konjugací podporuje vliv RM systémů při vzniku mozaikových genomů (E. coli)� ? „Selfish DNA“
� molekulární paraziti bakterií. RM systému typu II se udržují prostřednictvím plazmidů, které je kódují(usmrcení bezplazmidových buněk)
![Page 30: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/30.jpg)
RM systémy jako mechanismus postsegrega čního zabíjení
restriktáza metyláza
![Page 31: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/31.jpg)
"immigration control region"
Gen hsdS m ůže být nahrazen genem hsdS z jiného RM systému stejné t řídy, nebo geny mohou vzájemn ěrekombinovat
Odlišný obsah GC – indicie p řenosu HGT
![Page 32: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/32.jpg)
VYUŽITÍ RM SYSTÉMŮV EUKARYOTICKÝCH BUŇKÁCHTransgenní linie myších buněk exprimující geny RM systémů1. přenos a exprese genu M.PaeR7 (Pseudomonas
aeruginosa) - metyláza CTCGmeAG2. přenos a exprese genu R.PaeR7 - endonukleáza(restriktáza)3. infekce buněk HSV1 adenoviry - očekávanárezistence buněk - vytvoření organizmu rezistentního k virům (nebo jen určitých tkání)
Další možnost: studium vlivu metylace na genovou expresi
![Page 33: RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉDNA...Kmeny E. coliK a K(P1) + majívzájemněodlišnou hostitelskou specifitu(K a P1) = obsahujíodlišnéRM-systémy po jednom cyklu Experimentální](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041517/5e2c0b782ac77d5f8a5374d1/html5/thumbnails/33.jpg)
Geny pro R a M bývají blízko sebe, ale ne v transkripčních jednotkách
Konzervativní motiv