resultats - xtecjdomen44/tesi/pdfs/purpuratustesijdomenech.pdffotomètric de flama), tal com es...
TRANSCRIPT
Resultats
Article 3‐ Aprofundiment en el coneixement de les característiques coordinants de la metal∙lotioneïna SpMTA de l’equinoderm S.purpuratus. (Article en redacció)
Presentació Les MT d’equinoderm són homòlogues, tant a nivell d’estructura primària com terciària a les MT de mamífer. Les MT d’equinoderm presenten els dos dominis alfa i beta en disposició invertida respecte les MT de vertebrats. La determinació per NMR de l’estructura 3D de Cd‐SpMTA de S.purpuratus mostrà que la Phe, un aminoàcid aromàtic que no està present en les MT de mamífer, queda exposada a solvent, i per tant, pot condicionar les propietats d’aquesta MT. S’ha proposat que aquesta Phe mediatitza l’interacció amb altres proteïnes, però no s’ha explorat el seu paper en la formació de dímers MT, observats en Cd‐SpMTA. El sistema MT de S.purpuratus inclou dues MT, SpMTA i SpMTB, amb patrons d’expressió regulats molt estrictament, tant tissularment com per la seva resposta a metalls. Donada la seva inducció per baixos nivells de Zn, SpMTA sembla ésser una MT candidata a participar en la homeòstasi de metalls, però el seu comportament coordinant ha estat estudiat només davant de metalls xenobiòtics, com el Cd. L’estudi de les propietats coordinants ha estat clau en altres sistemes MT que presenten patrons d’expressió molt definits (Drosophila) per a confirmar una possible especificitat funcional, i la seva base molecular. En els equinoderms aquesta relació està encara per determinar. Resum: En aquest article es presenta la caracterització del comportament coordinant de la SpMTA de S.purpuratus. El cDNA de SpMTA fou cedit amablement pel Prof. J.H.R. Kägi, de la Universitat de Zurich (Suïssa). En aquesta tesi s’ha obtingut el plasmidi recombinant i s’han fet les síntesis heteròlogues i purificacions dels agregats Zn‐, Cd‐ i Cu‐SpMTA, i s’ha caracteritzat el comportament coordinant in vivo enfront d’aquests tres metalls. S’ha estudiat també el comportament in vitro de Zn‐SpMTA en estudis de valoracions amb Zn o Cu, duts a terme pel Dr. Roger Bofill, del grup de recerca dirigit per la Dra. Mercè Capdevila, a la Universitat Autònoma de Barcelona.
51
Resultats
52
S.purpuratus SpMTA
Aprofundiment en el coneixement de les característiques coordinants de la metal∙lotioneïna SpMTA de l’equinoderm S.purpuratus.
ABSTRACT Les metal∙lotioneïnes (MT) d’equinoderm presenten homologia estructural amb les MT de vertebrat, amb què s’ha proposat que tindrien una relació evolutiva consistent en un fenomen d’exon‐shuffling entre les regions codificants pels dominis alfa i beta. En les MT de vertebrat s’ha descrit un certa especialització funcional depenent d’isoforma en la unió a metalls, però no es coneix si aquesta especialització existeix també en equinoderms. Les diferències entre els patrons d’expressió de les dues MT de l’equinoderm Strongylocentrotus purpuratus, SpMTA i SpMTB, suggereixen que aquestes isoformes presenten especificitat funcional. En aquest estudi s’ha dut a terme la caracterització de les propietats coordinants de SpMTA mitjançant la seva síntesi heteròloga en E.coli en medis rics en Zn, Cd o Cu i la caracterització dels agregats metall‐SpMTA resultants per tècniques analítiques (ICP‐AES, GC‐FPD), espectromètriques (TOF‐ESI‐MS) i espectroscòpiques (CD, UV‐vis). En ésser sintetitzada en medi ric en Zn, SpMTA dóna lloc a una mescla atípica d’agregats: Zn7SpMTA, Zn3SpMTA, Zn4SpMTA. La valoració in vitro de Zn‐SpMTA amb Cd(II) o Cu(I) dóna lloc a agregats Cd‐SpMTA i Cu‐SpMTA diferents als obtinguts in vivo. La presència i participació d’ions sulfur en els agregats metall‐SpMTA ha estat detectada per als complexos amb Zn, Cd i Cu.
Keywords: Strongylocentrotus purpuratus, metallothionein, SpMTA, sulfide, metal coordination, Zn(II) binding, Cu(I) binding, Cd(II) binding, alpha domain, beta domain.
- 1 -
Resultats
INTRODUCCIÓ Les metal∙lotioneïnes (MT) són proteïnes de baix pes molecular riques en cisteïna, a través de les quals coordinen metalls pesants (Kägi, 1993). Membres d’aquesta família de proteïnes són presents a animals, plantes, protozous i procariotes, però presenten seqüències molt heterogènies. Les MT estan classificades en 15 famílies en funció de criteris taxonòmics de i la seva estructura primària (Binz & Kägi, 2001). Les MT de vertebrat constitueixen la família 1, i són considerades les MT paradigmàtiques. Presenten homologia entre elles, però no amb la resta de MT. La seva seqüència proteica (60‐68 aminoàcids) dóna lloc a 2 dominis rics en Cys separats per un espaiador de 2‐3 aminoàcids. El domini alfa, situat a l’extrem C‐term, conté 11 Cys i uneix 4 ions divalents, formant un cluster metàl∙lic anomenat cluster A. El domini beta, situat a l’extrem N‐term, conté 9 Cys i uneix 3 ions divalents, formant un cluster metàl∙lic anomenat cluster B (Furey et al., 1987). Aquesta distribució en els dos dominis beta‐alfa és exclusiva de vertebrats, però en determinar l’estructura 3D d’una MT d’equinoderm (SpMTA) per NMR, es va concloure que aquesta donava lloc a dos dominis equivalents, però en posició invertida en la cadena polipeptídica respecte les MT de vertebrat: el domini alfa es situa com a N‐terminal i el domini beta com a C‐terminal (Wang et al., 1995; Riek et al., 1999). Aquesta disposició de dominis podria implicar connexions evolutives importants entre les MT de vertebrats i d’equinoderm, suggerint un fenomen d’exon‐shuffling (Harlow et al., 1989).
Les MT presenten preferències d’unió a metalls que han estat relacionades amb una especialització funcional depenent d’isoforma. Mitjançant l’estudi dels agregats que formen amb diversos metalls (Zn, Cd, Cu,...) s’ha atribuït a les de MT llevat (Bertini et al., 2000; Cobine et al., 2004), i les MT de Drosophila MtnA (Valls et al., 2000), MtnB (Domenech et al., 2003), MtnC i MtnD (Egli et al., 2006) una preferència d’enllaç per al Cu(I) (Cu‐tioneïnes), mentre la MT de crustaci MTH (Valls et al., 2001), mostra preferència per al Zn(II) i el Cd(II) (Zn‐tioneïnes). En mamífers, s’han descrit quatre isoformes homòlogues MT1, MT2, MT3 i MT4, que presenten diferències en les seves seqüències i patrons d’expressió. Estudis de les propietats coordinants de MT1, MT4 i la MT de pollastre indiquen que aquestes MT presenten també un cert grau d’especialització funcional cap a Zn‐tioneïna (MT1 o MT de pollastre) o Cu‐tioneïna (MT4) (Bofill et al., 2001; Tio et al., 2004; Villarreal et al., 2006).
Les dades referents a especificitat funcional de les MT d’equinoderm es centren principalment en els seus patrons d’inducció i l’estudi dels promotors dels seus gens. L’equinoderm Strongylocentrotus purpuratus presenta dues isoformes de MT, SpMTA i SpMTB, que mostren comportaments diferents, tant d’expressió tissular com de resposta a metalls, (Nemer et al., 1984; Wilkinson & Nemer, 1987; Nemer et al., 1991; Nemer et al., 1995), fet que suggereix la possibilitat que duguin a terme tasques específiques. Aquest estudi té per objectiu la caracterització del comportament coordinant de SpMTA de l’equinoderm S. purpuratus, mitjançant la síntesi heteròloga en E.coli d’agregats Zn‐SpMTA, Cd‐SpMTA i Cu‐SpMTA i la caracterització de les seves propietats coordinants.
MATERIAL I MÈTODES Clonatge del cDNA SpMTA en el vector d’expressió pGEX4T2 El cDNA codificant per a SpMTA ha estat amablement cedit pel Prof. J.H.R.Kägi, del Departament de Bioquímica de la Universitat de Zurich. Ha estat amplificat per PCR mitjançant els oligonucleòtids 5SUMTA (5’‐CCCGGATCCATGCCTGATGTCAAG 3’) i 3SUMTA (5’GCGCCCGTCGACCTAGCATGCACA 3’), que introdueixen una diana de restricció BamHI immediatament a 5’ del codó ATG, i una diana de restricció SalI immediatament a 3’ del codó STOP. La reacció de PCR s’ha dut a terme en 30 cicles
- 2 -
S.purpuratus SpMTA
d’amplificació en les condicions següents: 45 s a 95 °C (desnaturalització), 30 s a 59 °C (anellament) i 45 s a 72 °C (elongació). La mida del producte de PCR resultant ha estat confirmada per electroforesi en gel d’agarosa tenyit amb bromur d’etidi, i el fragment purificat ha estat clonat direccionalment al MCS del vector d’expressió pGEX4T2 (Amersham Pharmacia). El plasmidi pGEX‐SpMTA resultant ha estat transformat en cèl∙lules E.coli BL21. La integritat i identitat de l’insert s’ha confirmat mitjançant seqüenciació (ABIPRISM Dye Terminator‐Cycle Sequencing Ready reaction kit (Perkin Elmer)). Síntesi in vivo i purificació dels agregats metall‐SpMTA recombinant El pèptid recombinant SpMTA ha estat sintetitzat en cultius de LB de 3 l, inoculats amb 300 ml de pre‐cultiu de cèl∙lules d’E.coli portadores del plasmidi pGEX‐SpMTA crescuts a 37 °C durant 12 h. La síntesi s’ha induït amb IPTG quan el cultiu ha assolit una OD600 de 0.8 i els cultius han continuat en creixement durant 3 h més, amb un suplement de metalls a una concentració final de 300 µM CdCl2 , 500 µM CuSO4 o 300 µM ZnCl2. Per centrifugació (Sorvall RC5C, 15 min a 9600 x g) s’han recuperat les cèl∙lules bacterianes, que han estat ressuspeses en PBSx1, 0.5% β‐mercaptoetanol. A partir d’aquest pas, tots els processos s’han dut a terme utilitzant solucions saturades amb argó i minimitzant el contacte amb l’aire, per a evitar l’oxidació dels pèptids. La solució obtinguda ha estat sonicada (Branson sonifier 250) a 0.6 Hz durant 12 min, i s’han separat les restes cel∙lulars per centrifugació (20 min a 20000 x g). Els pèptids de fusió GST‐SpMTA han estat purificats del sobrenedant mitjançant cromatografia d’afinitat amb Glutathione‐Sepharose 4B (Amersham Pharmacia). Els agregats metall‐SpMTA han estat separats de la fracció GST mitjançant digestió amb trombina i una nova ronda de cromatografia d’afinitat. La solució obtinguda s’ha concentrat amb Centriprep Microcon 3 (Amicon) i els agregats metall‐SpMTA han estat finalment purificats per FPLC en una columna Superdex75 (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada amb Tris‐HCl 50 mM a pH 7.0. S’han recollit les fraccions que presentaven absorbància a 254 nm. En tots els casos, les fraccions seleccionades s’han conservat a ‐80 °C fins al moment de la determinació de les seves propietats. Anàlisi i caracterització dels agregats metall‐SpMTA Per a cada preparació de SpMTA obtinguda en medis rics en Zn, Cd o Cu, s’ha analitzat el contingut de S, Zn, Cu i Cd per ICP‐AES (Espectroscòpia d’Emissió Atòmica de Plasma Acoblat per Inducció). S’ha usat un espectropolarímetre Polyscan 61E (Thermo Jarrell Ash), detectant el S a 182.040 nm, el Zn a 213.856 nm, el Cu a 324.803 nm i el Cd a 228.802 nm. Les mostres han estat preparades seguint el mètode descrit per Bongers et al. (1988). Alternativament, s’ha aplicat una modificació del mètode, consistent en la incubació de les mostres en 1M HCl durant 5 min a 65 °C, tal com es descriu a Capdevila et al. (2005). Aquesta modificació té per objectiu l’alliberament dels possibles ions de sulfur (S2‐) presents a la mostra, i és anomenada ICPàcid en aquest article. La concentració de proteïna s’ha calculat a partir del contingut de S en la mostra mesurat per ICPàcid, assumint que tots els àtoms de S provenien de les metionines i cisteïnes contingudes en el pèptid recombinant SpMTA, per tant, 21 àtoms de S per molècula (20 residus Cys i 1 residu Met). El contingut mitjà d’ions sulfur per pèptid s’ha mesurat per GC‐FPD (Cromatografia de Gasos acoblada a un Detector Fotomètric de Flama), tal com es descriu a Capdevila et al. (2005). Anàlisi espectroscòpica i espectromètrica dels agregats metall‐SpMTA Les mesures de CD (Dicroisme Circular) dels agregats metall‐MT recombinants de Zn, Cd i Cu i dels obtinguts en les valoracions amb Cd i Cu han estat obtingudes tal com es descriu a Bofill et al. (1999). S’ha usat un espectropolarímetre Jasco J715, controlat pel software J700. Les mesures d’absorció UV‐vis s’han dut a terme en un espectrofotòmetre HP‐8453. Tots els
- 3 -
Resultats
espectres han estat mesurats en cubetes de quars (1 cm) i processats mitjançant el programa GRAMS32. La temperatura s’ha mantingut a 25 °C mitjançant un aparell Peltier PTC‐351S. La massa molecular dels agregats de Zn, Cu i Cd ha estat determinada per TOF‐ESI‐MS (Espectrometria de Masses amb Ionització per ElectroSprai i un detector de Temps de Vol), en un aparell Ultima Micromass Instrument, controlat pel programari Masslynx Software i calibrat amb NaI (0.2 g de NaI dissolts en 100 ml de mescla 50:50 H2O:isopropanol). S’han injectat 5 µl de mostra a 40 µl/min en les següents condicions d’anàlisi: temperatura de la sonda: 150 °C; Voltatge del capil∙lar: 3.0 kV; 1.5 kV; Potencial del con: 30 V. S’han registrat els espectres en un rang m/z entre 950 i 2150 a 2 s/espectre, amb un interval de 0.1s. L’eluent utilitzat ha estat una mescla 10:90 d’acetonitril amb acetat d’amoni 5 mM a pH 7. Per a l’anàlisi de les formes apo, els metalopèptids han estat demetalats per acidificació amb HCl a pH 1.5 i s’ha usat com a eluent una mescla 10:90 de metanol i formiat d’amoni a pH 1.5. Per a les mesures per TOF‐ESI‐MS a pH 2.5 (anomenat acidTOF‐ESI‐MS en aquest article), s’han usat les condicions corresponents a la forma apo, però amb el pH ajustat a 2.5. En tots els casos, les masses moleculars han estat calculades com es descriu a Fabris et al. (1996). Estudis d’unió a metalls in vitro Els estudis de desplaçament metàl∙lic Zn/Cd i Zn/Cu del Zn enllaçat a Zn‐SpMTA s’han dut a terme seguint les metodologies prèviament descrites per aquest grup (Tío et al., 2004) i han estat monitorizats Per CD, UV‐vis i TOF‐ESI‐MS. Tots els assajos s’han dut a terme en atmosfera saturada d’argó.
- 4 -
S.purpuratus SpMTA
RESULTATS I DISCUSSIÓ La seqüència de pGEX‐SpMTA ha estat confirmada per seqüenciació de DNA i el plasmidi ha estat transformat en cèl∙lules d’E.coli per a l’expressió de la proteïna recombinant. A partir dels agregats Zn‐MT obtinguts s’ha obtingut la forma apo mitjançant la seva acidificació fins a pH 1.5, i se n’ha mesurat la seva massa molecular per TOF‐ESI‐MS. Els resultats obtinguts (6532.4±2.5 Da) es corresponen amb els esperats (6532.5 Da) per al pèptid recombinant SpMTA (que inclou la seqüència de SpMTA més dos residus addicionals ‐Gly i Ser‐ afegits a l’extrem N‐term per l’estratègia d’expressió). Aquest resultat ha confirmat la integritat i identitat de SpMTA recombinant, i la puresa de la mostra.
Caracterització dels agregats Zn‐SpMTA sintetitzats in vivo
El procés de síntesi i purificació de Zn‐SpMTA es repetí diverses vegades, aconseguint resultats equivalents que indiquen que la proteïna s’elueix de la columna de Superdex75 en forma de dos pics àmpliament solapats. Els resultats obtinguts per ICP‐AES i TOF‐ESI‐MS (Taula 1) en l’anàlisi d’aquests dos pics indiquen que en sintetitzar SpMTA en medi ric en Zn poden purificar‐se dos tipus de mostres que a partir d’aquest moment anomenarem Zn‐SpMTAc (completa) i Zn‐SpMTAp (parcial). La mostra corresponent al primer pic (Zn‐SpMTAp) conté majoritàriament Zn7‐SpMTA, acompanyada d’espècies minoritàries, i no conté les espècies Zn3‐SpMTA i Zn4‐SpMTA, que s’elueixen, juntament amb Zn7‐SpMTA, exclusivament en el segon pic de menor absorbància a 254 nm. En tots dos casos es detecten altres espècies minoritàries que contenen lligands sulfurs com és el cas de Zn7S1‐SpMTA.
Els espectres de dicroisme circular (CD) (Fig. 1) de Zn‐SpMTAp i Zn‐SpMTAc, que són molt propers entre sí i característics de les Zn‐MT, presenten absorcions en forma d’exciton coupling a ca. 240 nm –associats als cromòfors Zn(Cys)4– amb petites contribucions per longituds d’ona superiors a 260 nm, i més visibles en Zn‐SpMTAp, relacionades amb la presencia de lligands sulfurs en aquests agregats (Capdevila et al., 2005).
-80
-60
-40
-20
0
20
40
220 240 260 280 300 320 nm
∆ε Cd-SpMTA 2a síntesiZn-SpMTA 5a síntesiZn-SpMTA 4a síntesiCd-SpMTA 1a síntesi
Fig. 1‐ Espectres de CD de les diferents mostres Zn‐ i Cd‐SpMTA obtingudes per síntesi recombinant de SpMTA en medis rics en Zn i Cd. Zn‐SpMTAc (línia vermella), Zn‐SpMTAp (línia negra) i Cd‐SpMTA (línia verda).
La presència de Zn3‐SpMTA i Zn4‐SpMTA en les mostres Zn‐SpMTAc es correlaciona amb una menor intensitat dels seus espectres de CD (menor quiralitat dels seus agregats) respecte a les preparacions Zn‐SpMTAp, suggerint que Zn3‐SpMTA i Zn4‐SpMTA serien espècies menys estructurades que Zn7‐SpMTA. Aquesta observació estaria d’acord amb un cert grau d’oxidació dels complexos Zn7‐SpMTA que podria conduir a l’existència d’espècies de menor contingut metàl∙lic, Zn3‐SpMTA i Zn4‐SpMTA. Així mateix, la major intensitat d’absorció al
- 5 -
Resultats
CD que mostren les preparacions Zn‐SpMTAp a longituds d’ona superiors a 260 nm també es correlaciona amb el major contingut en lligands sulfur d’aquestes respecte a Zn‐SpMTAc.
ICP-AESa ICP-AESacidb GC-FPDc ESI-TOFd ESI-TOFacid
e
Concentració del pèptid Metalls/pèptid
Ions S2
/Pèptid Espècies majoritàries Espècies minoritàries
Espècies majoritàries Espècies minoritàries
Zn-SpMTAp --- 0.33 x 10-4
7.8 Zn 1.7
Zn7-SpMTA Zn6S1-SpMTA Zn7S1-SpMTA Zn8-SpMTA
---
Zn-SpMTAc 4.2 x 10-4
5.1 Zn 3.2 x 10-4
6.1 Zn 0.45
Zn7-SpMTA Zn4-SpMTA Zn3-SpMTA
Zn7S1-SpMTA
---
Cd-SpMTA 1.5 x 10-4
4.4 Cd 0.7 x 10-4
7.7 Cd 2.0
Cd7-SpMTA Cd7S1-SpMTA Cd6S2-SpMTA Cd8-SpMTA
---
Cu-SpMTA
Tipus 1
0.4 x 10-4
2.2 Zn 5.0 Cu
0.4 x 10-4
2.2 Zn 5.0 Cu
--- M8-SpMTA M9-SpMTA M4-SpMTA M6-SpMTA
Cu8-SpMTA Cu4-SpMTA
Cu-SpMTA
Tipus 2
0.6 x 10-4
1.5 Zn 8.7 Cu
0.5 x 10-4
1.6 Zn 9.5 Cu
0.6
M8-SpMTA M9-SpMTA M10-SpMTA M11-SpMTA
Cu8-SpMTA Cu9-SpMTA Cu10-SpMTA Cu4-SpMTA
Cu-SpMTA
Tipus 3
0.5 x 10-4
7.2 Cu 0.4 x 10-4
8.7 Cu 1.0
Cu8-SpMTA Cu4-SpMTA
Cu4S1-SpMTA Cu8S1-SpMTA
---
Taula 1‐ Concentració del pèptid recombinant SpMTA i estequiometries metall/pèptid i sulfur/pèptid per als agregats obtinguts en medis rics en Zn, Cu i Cd. a Concentració de SpMTA i estequiometria metàl∙lica calculada a partir de les mesures per ICP. b Concentració de SpMTA i estequiometria metall/MT calculada a partir de les mesures de S, Zn, Cd i Cu per ICP‐AESacid . c Contingut d’ions sulfur (S2‐) a la mostra, mesurat per GC‐FPD. d Espècies principals presents a la mostra, mesurat per TOF‐ESI‐MS. Per a les mostres que contenen ambdós Zn i Cu, “M” indica el nombre total de ions metàl∙lics units a SpMTA, ja que degut a la similitud dels seus pesos atòmics, la discriminació entre el Zn i el Cu en un agregat no és possible per espectrometria de masses. e Contingut de metalls dels agregats a pH 2.5 (pH a què el Zn, però no el Cu, és alliberat de l’agregat) mesurat per ESI‐TOF com en el punt (d). ‐‐‐ No es disposa d’aquestes dades.
Caracterització dels agregats Cd‐SpMTA
La caracterització per ICP‐AES i TOF‐ESI‐MS dels agregats Cd‐SpMTA sintetitzats in vivo suggereix una espècie majoritària Cd7‐SpMTA acompanyada d’altres espècies minoritàries, amb contingut metàl∙lic equiparable al de Zn‐SpMTAp (Taula 1). L’espectre de CD de Cd‐SpMTA és molt intens (Fig. 1), i presenta un exciton coupling centrat a 250 nm, l’absorció característica dels cromòfors Cd(Cys)4. Les mesures per GC‐FPD de Cd‐SpMTA indiquen la presencia mitjana de 2 ions sulfur per MT. La participació dels sulfurs en la coordinació a Cd no es detecta clarament en el CD (espectre de tipus A, segons la classificació de Capdevila et al. (2005), però la diferència d’intensitat entre la banda positiva a 260 nm i la negativa a 240 nm podria estar‐hi relacionada.
La valoració de Zn7‐SpMTA (Zn‐SpMTAp) amb Cd(II) ha permès obtenir més informació sobre els agregats Cd7‐SpMTA obtinguts in vivo. Per una part, aquest tractament in vitro de Zn7‐SpMTA amb Cd(II) ha posat de manifest la resistència que oposen els Zn inicialment coordinats a ser substituïts per Cd. Tal com es mostra a la Fig. 2, les variacions dels espectres de CD amb el temps, es necessiten temps d’estabilització elevats per tal d’aconseguir que els tres primers equivalents de Cd afegits entrin realment a coordinar‐se a la proteïna.
- 6 -
S.purpuratus SpMTA
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 nm
∆ε0 Cd
-5
0
5
10
15
20
25
30
220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 nm
∆ε2 Cd 7 min
1 Cd 5 min 2 Cd 11 min1 Cd 9 min1 Cd 19 min1 Cd 31 min1 Cd 44 min1 Cd 63 min1 Cd 92 min
2 Cd 33 min2 Cd 53 min2 Cd 1h10min2 Cd 1h38min
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 nm
∆ε3 Cd 5 min3 Cd 9 min3 Cd 20 min3 Cd 1h22min
Fig. 2‐ Variació amb el temps dels espectres de CD enregistrats per a l’addició de 1, 2 i 3 equivalents de Cd(II) a Zn7‐SpMTA
Per altra banda, i amb independència del temps requerit per aconseguir‐ho, les dades enregistrades in vitro mostren que els ions Cd2+ desplacen successivament els ions Zn2+ inicialment coordinats donant lloc a una variació monòtona dels espectres de CD i UV‐vis fins a 6 equivalents de Cd(II) afegits (Fig. 3). Aquesta evolució dels espectres de CD és la habitual en les valoracions de Zn‐MT amb Cd(II) i les dades de ESI‐MS (Taula 2) mostren que paulatinament els Cd(II) van substituint els Zn(II) en el cluster metàl∙lic de SpMTA de tal manera que el nombre d’ions Cd(II) coordinats per la MT equival al nombre d’ions afegit. Curiosament, l’addició del 7e equivalent de Cd(II) comporta una lleuger desplaçament cap el vermell del màxim d’absorció al CD i les dades de masses mostren només lleugeres modificacions en l’especiació de la mostra de manera que Cd6Zn1‐SpMTA continua essent l’espècie majoritària en la mostra. A partir de 7 eq de Cd(II) afegits s’observa una lleugera disminució en la intensitat dels espectres de CD fins que el senyal es satura per a 11 equivalents de Cd(II) afegits. Paradòjicament, tot i que l’espècie Cd7‐SpMTA és present en tot moment a la mostra, es passa d’una espècie Cd6Zn1‐SpMTA majoritària tant per a 7 com 8 eq de Cd(II) afegits a Cd8‐ i Cd9‐SpMTA com a les espècies més abundants per a 10 i 11 equivalents de Cd(II) afegits. Aquesta discordança estequiomètrica entre els complexos Cd‐SpMTA obtinguts in vivo i in vitro es veu corroborada per les dades espectroscòpiques ja que cap dels espectres CD obtinguts al llarg de la valoració reprodueix el de l’agregat Cd7‐SpMTA obtingut in vivo, tal com es veu a la Fig. 4 on s’ha superposat l’espectre de CD obtingut per a 11 eq de Cd(II) afegits amb l’espectre dels agregats recombinats Cd7‐SpMTA.
- 7 -
Resultats
CD UV-vis
0
10
20
30
40
50
60
220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 nm
∆ε0 Cd1 Cd2 Cd3 Cd4 Cd5 Cd6 Cd
0
5
10
15
20
25
210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 nm
ε4
/10 0 Cd
1 Cd2 Cd3 Cd4 Cd5 Cd6 Cd7 Cd8 Cd9 Cd
0
10
20
30
40
50
60
70
220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 nm
∆ε6 Cd 7 Cd
0
10
20
30
40
50
60
70
220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 nm
∆ε7 Cd 8 Cd9 Cd10 Cd11 Cd11 Cd + 1 S2-
Diff. UV-vis
0
.2
.4
.6
.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 nm
∆ε4
/10 1-0 Cd
A
2-1 Cd3-2 Cd4-3 Cd5-4 Cd6-5 Cd7-6 Cd8-7 Cd9-8 Cd10-9 Cd11-10 Cd
(11Cd+1S) - 11Cd
Fig. 3‐ Espectres CD, UV‐vis, i diferència d’UV‐vis obtinguts al llarg de la valoració de Zn7‐SpMTA (Zn‐SpMTAp) amb Cd(II).
-50
65
0
50
220 300240 260 280
CD[
mde
g]
Wavelength [nm] Fig. 4‐ Comparació de l’espectre de CD obtingut en la valoració de Zn‐SpMTA amb Cd(II) per a 11 eq de Cd(II) afegits (línia discontínua) amb l’espectre de Cd7‐SpMTA sintetitzada in vivo. (línia contínua).
0
6
7
6
6
0
0
5
10
15
20
25
210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 nm
ε4
/10 9 Cd
10 Cd11 Cd1 2-1 Cd + 1 S
7 eq 8 eq 9 eq
10 eq 11 eq
11
7
- 8 -
S.purpuratus SpMTA
Eq Cd(II) 0 2 4 6 7 8 10 11 Eq S2- 1
Zn7-SpMTA Zn6S1-SpMTA Zn7S1-SpMTA Zn8-SpMTA
Cd1Zn6-SpMTA X Cd2Zn5-SpMTA Cd3Zn4-SpMTA X X Cd4Zn3-SpMTA X Cd5Zn2-SpMTA X X Cd6Zn1-SpMTA
Cd7-SpMTA X X X X Cd7S1-SpMTA X X
Cd7S2/Cd7Zn1-SpMTA X X Cd7S3/Cd7Zn1S1-SpMTA
Cd8-SpMTA Cd8S1-SpMTA X
Cd8S2/Cd8Zn1-SpMTA X Cd9-SpMTA X
Cd9S1-SpMTA X Taula 2‐ Espècies principals detectades per TOF‐ESI‐MS durant la valoració de Zn‐SpMTAp amb Cd(II). =Clarament predominant; =majoritari; X= intermèdia; = minoritària. Per provar la possibilitat que els lligands sulfur presents en els agregats Zn‐SpMTA (1.7 S2‐/MT) fossin insuficients per reproduir l’estructuració de Cd‐SpMTA (2.0 S2‐/MT), s’ha dut a terme l’addició de ions sulfur després d’haver afegit 11 eq de Cd(II) en la valoració de Zn‐SpMTA. Tant les dades espectroscòpiques, (Fig. 3), com espectromètriques (Taula 2), suggereixen que l’addició d’un equivalent de sulfur de sodi pràcticament no té cap repercussió ni en l’especiació ni en les característiques espectroscòpiques de la mescla, cosa que tampoc condueix a l’obtenció de l’empremta de CD característica dels agregats Cd7‐SpMTA sintetitzats in vivo. Aquests resultats indiquen que la possible manca d’ions sulfur no és responsable de les diferències observades en SpMTA en la coordinació del Cd in vivo i in vitro.
Caracterització dels agregats Cu‐SpMTA
En les síntesis de SpMTA en medis rics en Cu s’han obtingut resultats variables, que s’han catalogat en tres tipus diferents (Taula 1). Les preparacions de tipus 1 i de tipus 2 són heterometàl∙liques (Zn i Cu).però difereixen en el seu contingut metàl∙lic (7 metalls/MT en les de tipus 1 enfront els 11 de les de tipus 2) essent molt més alt el contingut en Cu en les de tipus 2 (2.2 Zn : 5.0 Cu envers 1.6 Zn : 9.5 Cu). Independent d’aquesta divergència en contingut metàl∙lic les dades de TOF‐ESI‐MS mostres que tant les de tipus 1 com les de tipus 2 contenen espècies M8‐SpMTA com a espècies majoritàries. Les mostres de tipus 3 són homometàl∙liques de Cu, i contenen Cu8‐SpMTA i Cu4‐SpMTA com a espècies més abundants seguides les mateixes espècies amb un lligand sulfurs addicional, Cu8S1‐SpMTA i Cu4 S1‐SpMTA. El contingut d’ions sulfur també varia entre els diferents tipus de mostra.
És conegut que l’acidificació fins a pH 2.5 dels agregats heterometàl∙lics Zn,Cu‐MT provoca l’alliberament del Zn, mentre el Cu resta enllaçat a la proteïna donada la major afinitat d’aquest metall pels tiolats cisteínics. Les preparacions Cu‐SpMTA de tipus 1 i 2 s’han acidificat fins a aquest pH observant‐se en tots dos casos una espècie majoritària d’estequiometria Cu8‐SpMTA que suggereix que aquesta espècie homometàl∙lica es sintetitza en els tres tipus de produccions.
- 9 -
Resultats
Els espectres de CD dels tres tipus de mostra (Fig. 5), es corresponen amb el seu contingut metàl∙lic en quant que les dues heterometàl∙liques (Tipus 1 i 2) presenten unes absorcions en la zona dels 240 nm ‐corresponent als cromòfors Zn(SCys)4‐ que són absents en la homometàl∙lica (Tipus 3). Per sobre d’aquesta longitud d’ona les absorcions són les característiques de les MT que contenen Cu.
-50 -40 -30 -20 -10
0 10 20 30 40 50
220 240 260 280 300 320 340 360 nm
∆ε SpMTA exp.Cu 1a síntesi Fig. 5‐ Espectres CD de les mostres de Cu‐SpMTA obtingudes en l’expressió de SpMTA en medis rics en Cu: Cu‐SpMTA de tipus 1 (línia negra), de tipus 2 (línia verda), i de tipus 3 (línia vermella).
SpMTA exp.Cu 2a síntesiSpMTA exp.Cu 4a síntesi
L’obtenció d’agregats homometàl∙lics i heterometàl∙lics per a una mateixa MT sintetitzada en medis rics en Cu ja ha estat observat prèviament (Tio et al., 2004), i, més recentment, aquest grup de recerca ha proposat la seva relació amb els nivell d’oxigenació del cultiu (Pagani et al., 2006). Tot i això, cal destacar que en aquest treball les condicions d’agitació i oxigenació del cultiu s’han mantingut idèntiques en totes les síntesis, i els resultats de TOF‐ESI‐MSàcid indiquen que en una mateixa mostra existeixen al mateix temps espècies homo‐ i heterometàl∙liques, per la qual cosa, la diversitat de comportament davant el Cu es pot considerar una característica pròpia de SpMTA, que es definiria com una Cu‐tioneïna gràcies a la seva capacitat de donar lloc a agregats que continguin únicament Cu en ésser sintetitzada en medis rics en Cu (Bofill et al., 2001).
Un cop més els treball realitzats in vitro han permès aprofundir en el coneixement dels complexos Cu‐SpMTA. S’han fet dos tipus d’assajos: a) addició de Cu(I) a les mostres heterometàl∙liques de tipus 1 i 2 per veure si les de tipus 1 esdevenien de tipus 2 o qualsevol d’elles dues acabaven donant mostres del tipus 3, i b) addició de Cu(I) a la Zn‐SpMTA per tal d’estudiar les reaccions de desplaçament de Zn per Cu i analitzar si era possible obtenir in vitro mostres de composició i característiques espectroscòpiques comparables a les obtingudes in vivo. Per motius d’extensió, només es mostren aquí les dades de CD, UV‐vis (Fig. 6) i ESI‐MS (Taula 3) de la valoració de Zn‐SpMTA amb Cu(I). Els resultats obtinguts en tots dos tipus d’assajos permeten afirmar de manera genèrica que el desplaçament in vitro del Zn pel Cu en preparacions del tipus Zn‐SpMTA o Zn,Cu‐SpMTA no permet generar mostres que reprodueixin les característiques de les mostres Cu‐SpMTA sintetitzades in vivo, ja que tant els espectres de CD com l’especiació de les mostres són diferents.
- 10 -
S.purpuratus SpMTA
Fig. 6‐ Espectres CD (A) i UV‐vis (B) de la valoració de Zn‐SpMTA amb Cu(I). Al llarg de la valoració es van afegir fins a 24 eq de Cu(I) però les dades de CD només mostren l’addició fins a 19 ja que a partir d’aquest punt no es varen registrar variacions de l’empremta de CD.
A B
0
5
10
15
20
25
220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 nm
∆ε0 Cu1 Cu2 Cu3 Cu4 Cu5 Cu6 Cu
0
5
10
15
20
25
220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 nm
∆ε6 Cu7 Cu8 Cu9 Cu
0
5
10
15
20
25
220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 nm
ε4
/10 7 Cu
1 Cu2 Cu3 Cu4 Cu5 Cu6 Cu
0 Cu8 Cu9 Cu10 Cu11 Cu12 Cu19 min
-5
0
5
10
15
20
220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 nm
∆ε9 Cu10 Cu11 Cu12 Cu 8 min
-5
0
5
10
15
20
220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 nm
∆ε12 Cu 8 min12 Cu 15h 37 min13 Cu
0
5
10
15
20
220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 nm
∆ε13 Cu 14 Cu 15 Cu16 Cu
0
5
10
15
20
25
220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 nm
ε4
/10
12 Cu 16h13 Cu14 Cu15 Cu16 Cu17 Cu
12 Cu 19 min
18 Cu19 Cu20 Cu
0
11
7
0
7
14
11
14
15
14
24
14
15
19
- 11 -
Resultats
Eq de Cu 4 5 6 8 14 18
M5-SpMTA M6-SpMTA M7-SpMTA M8-SpMTA X X
M8S1-SpMTA M9-SpMTA X M10-SpMTA X
M10S1-SpMTA X X X X M11-SpMTA X X M12-SpMTA X X
M12S1-SpMTA M13-SpMTA X X
M13S1-SpMTA X X X M14-SpMTA
M14S1-SpMTA M15-SpMTA X X
M15S1-SpMTA X M16-SpMTA X M17-SpMTA M18-SpMTA X M19-SpMTA
Taula 3.‐ Espècies detectades per TOF‐ESI‐MS durant la valoració de Zn7‐SpMTA amb Cu(I). =Clarament predominant; =majoritari; X= intermèdia; = minoritària.
CONCLUSIONS SpMTA en ésser sintetitzada en medis rics en Zn i Cd dóna lloc majoritàriament a agregats amb 7 metalls divalents. En Zn‐SpMTA, la presència de formes inframetalades (Zn3‐SpMTA, Zn4‐SpMTA) s’ha associat a l’oxidació parcial de la mostra cosa que sembla suggerir una certa inestabilitat d’aquesta MT quan es troba enllaçada a Zn.
SpMTA enllaça 7 ions Cd(II) i 2 ions sulfur. El contingut metàl∙lic i l’espectre de CD mesurats reprodueixen les dades obtingudes per altres autors (Wang et al., 1994; Wang et al., 1995). Cd‐SpMTA mostra un contingut metàl∙lic similar al descrit per a Cd‐MT1, Cd‐MT2 i Cd‐MT3 (Bogumil et al., 1996) de mamífer i peix (Vergani et al., 2005), però divergent del de Cd‐MT4 de mamífer (Tio et al., 2004) i la MT de pollastre (Villarreal et al., 2006).
En canvi, en ésser sintetitzada en medi ric en Cu, SpMTA mostra un caràcter de Cu‐tioneïna similar a l’observat per a MT4, ja que MT4 és la única MT de vertebrat en què s’ha descrit la capacitat de generar dos tipus d’agregats, heterometàl∙lics i homometàl∙lics de Cu, en ésser sintetitzada en medis rics en Cu (Tio et al., 2004).
El complexos metall‐MT aconseguits amb les valoracions de Zn‐SpMTA, ja sigui amb Cd(II) o amb Cu(I), difereix en tots els casos dels obtingut en les produccions in vivo. Aquestes diferències no poden ser atribuïdes a la manca de lligands sulfur en l’agregat Zn‐SpMTA inicial.
La síntesi de SpMTA en els eriçons de mar s’indueix com a resposta a baixes concentracions de Zn (Wilkinson & Nemer, 1987), suggerint un rol homeostàtic. En canvi, l’altra MT de S.purpuratus, SpMTB, s’indueix a altes concentracions de Zn (Wilkinson & Nemer, 1987), suggerint un rol detoxificador. Els nostres resultats indiquen que SpMTA demostra una baixa eficàcia en la unió de metalls divalents (Zn i/o Cd). Altres autors han descrit que el domini
- 12 -
S.purpuratus SpMTA
beta de SpMTA cedeix fàcilment els ions de Cd coordinats (Wang et al., 1995; Wang et al., 1996).
El fet que en la síntesi de tipus 3 de Cu‐SpMTA s’obtinguin dos conjunts d’espècies, les d’estequiometria 4 i les d’estequiometria 8, relaciona SpMTA amb MT3 de mamífer ja que l’existència de complexos formats per coordinació de 4 i 8 Cu(I) a un pèptid MT ha estat extensament descrita per a la isoforma MT3 de mamífer.
L’existència de complexos formats per la coordinació de 4 Cu(I) i 8 Cu(I) a un pèptid MT ha estat extensament descrita per a l’isoforma MT3 de mamífer (Bogumil et al., 1996; Bogumil et al., 1996; Roschitzi & Vasak, 2002), i Cu4‐β‐MT4 ha estat demostrat que és un intermediari estable en la constitució dels clusters canònics contenint 6 Cu(I) enMT1 (Tío et al., 2004). És de destacar que, en absència d’estudi paral∙lels amb MT3, el cas de SpMTA és el primer on hem determinat que la síntesi recombinant d’una MT en medis rics en Cu resulta en agregats de 4 o 8 Cu(I), fet que indica un comportament comparable, al menys amb MT3 de mamífer. Aquest fet, conjuntament amb la classificació de SpMTA com a Cu‐tioneïna, comportament que comparteix amb MT4 de mamífer, fa que hi hagi una semblança de SpMTA amb les formes més primitives de mamífer, la qual cosa estaria en concordança amb la posició filogenètica d’ambdós grups d’animals.
REFERÈNCIES Bertini, I., Hartmann, H. J., Klein, T., Liu, G., Luchinat, C. & Weser, U. (2000). High resolution solution
structure of the protein part of Cu7 metallothionein. Eur J Biochem 267(4), 1008‐18. Binz, P. A., Kägi, J.H.R. (2001). http://www.biochem.unizh.ch/mtpage/MT.html. Bofill, R., Capdevila, M., Cols, N., Atrian, S. & Gonzalez‐Duarte, P. (2001). Zinc(II) is required for the in
vivo and in vitro folding of mouse copper metallothionein in two domains. J Biol Inorg Chem 6(4), 405‐17.
Bofill, R., Palacios, O., Capdevila, M., Cols, N., Gonzalez‐Duarte, R., Atrian, S. & Gonzalez‐Duarte, P. (1999). A new insight into the Ag+ and Cu+ binding sites in the metallothionein beta domain. J Inorg Biochem 73(1‐2), 57‐64.
Bogumil, R., Faller, P., Binz, P. A., Vasak, M., Charnock, J. M. & Garner, C. D. (1998). Structural characterization of Cu(I) and Zn(II) sites in neuronal‐growth‐inhibitory factor by extended X‐ray absorption fine structure (EXAFS). Eur J Biochem 255(1), 172‐7.
Bogumil, R., Faller, P., Pountney, D. L. & Vasak, M. (1996). Evidence for Cu(I) clusters and Zn(II) clusters in neuronal growth‐inhibitory factor isolated from bovine brain. Eur J Biochem 238(3), 698‐705.
Bongers, J., Walton, C. D., Richardson, D. E. & Bell, J. U. (1988). Micromolar protein concentrations and metalloprotein stoichiometries obtained by inductively coupled plasma atomic emission spectrometric determination of sulfur. Anal Chem 60(24), 2683‐6.
Capdevila, M., Cols, N., Romero‐Isart, N., Gonzalez‐Duarte, R., Atrian, S. & Gonzalez‐Duarte, P. (1997). Recombinant synthesis of mouse Zn3‐beta and Zn4‐alpha metallothionein 1 domains and characterization of their cadmium(II) binding capacity. Cell Mol Life Sci 53(8), 681‐8.
Capdevila, M., Domenech, J., Pagani, A., Tio, L., Villarreal, L. & Atrian, S. (2005). Zn‐ and Cd‐metallothionein recombinant species from the most diverse phyla may contain sulfide (S2‐) ligands. Angew Chem Int Ed Engl 44(29), 4618‐22.
Cobine, P. A., McKay, R. T., Zangger, K., Dameron, C. T. & Armitage, I. M. (2004). Solution structure of Cu6 metallothionein from the fungus Neurospora crassa. Eur J Biochem 271(21), 4213‐21.
Cols, N., Romero‐Isart, N., Capdevila, M., Oliva, B., Gonzalez‐Duarte, P., Gonzalez‐Duarte, R. & Atrian, S. (1997). Binding of excess cadmium(II) to Cd7‐metallothionein from recombinant mouse Zn7‐metallothionein 1. UV‐VIS absorption and circular dichroism studies and theoretical location approach by surface accessibility analysis. J Inorg Biochem 68(3), 157‐66.
- 13 -
Resultats
Domenech, J., Mir, G., Huguet, G., Capdevila, M., Molinas, M. & Atrian, S. (2006). Plant metallothionein domains: functional insight into physiological metal binding and protein folding. Biochimie 88(6), 583‐93.
Domenech, J., Palacios, O., Villarreal, L., Gonzalez‐Duarte, P., Capdevila, M. & Atrian, S. (2003). MTO: the second member of a Drosophila dual copper‐thionein system. FEBS Lett 533(1‐3), 72‐8.
Egli, D., Domenech, J., Selvaraj, A., Balamurugan, K., Hua, H., Capdevila, M., Georgiev, O., Schaffer, W. & Atrian, S. (2006). The four members of the Drosophila Metallothionein family exhibit distinct yet overlapping in heavy metal homeostasis and detoxification. Genes to Cells 11(6), 647‐58.
Fabris, D., Zaia, J., Hathout, Y., Fenselau,C. (1996). Retention of thiol protons in two classes of protein zinc coordination centers. J Am Chem Soc 118, 12242‐3.
Faller, P., Hasler, D. W., Zerbe, O., Klauser, S., Winge, D. R. & Vasak, M. (1999). Evidence for a dynamic structure of human neuronal growth inhibitory factor and for major rearrangements of its metal‐thiolate clusters. Biochemistry 38(31), 10158‐67.
Furey, W. F., Robbins, A. H., Clancy, L. L., Winge, D. R., Wang, B. C. & Stout, C. D. (1987). Crystal structure of Cd,Zn metallothionein. Experientia Suppl 52, 139‐48.
Harlow, P., Watkins, E., Thornton, R. D. & Nemer, M. (1989). Structure of an ectodermally expressed sea urchin metallothionein gene and characterization of its metal‐responsive region. Mol Cell Biol 9(12), 5445‐55.
Hasler, D. W., Faller, P. & Vasak, M. (1998). Metal‐thiolate clusters in the C‐terminal domain of human neuronal growth inhibitory factor (GIF). Biochemistry 37(42), 14966‐73.
Kägi, J. H. R. (1993). Evolution, structure and chemical activity of class I metallothioneins: An overview. In Suzuki KT, I.N.a.K.M. (Ed.) Metallothionein III, Biological Roles and Implications. pp. 29‐55). Birkhauser Verlag, Basel.
Nemer, M., Stuebing, E. W., Bai, G. & Parker, H. R. (1995). Spatial regulation of SpMTA metallothionein gene expression in sea urchin embryos by a regulatory cassette in intron 1. Mech Dev 50(2‐3), 131‐7.
Nemer, M., Thornton, R. D., Stuebing, E. W. & Harlow, P. (1991). Structure, spatial, and temporal expression of two sea urchin metallothionein genes, SpMTB1 and SpMTA. J Biol Chem 266(10), 6586‐93.
Nemer, M., Travaglini, E. C., Rondinelli, E. & DʹAlonzo, J. (1984). Developmental regulation, induction, and embryonic tissue specificity of sea urchin metallothionein gene expression. Dev Biol 102(2), 471‐82.
Pagani, A., Villarreal, L., Capdevila, M. & Atrian, S. (2006). Manuscript in preparation. Pountney, D. L., Fundel, S. M., Faller, P., Birchler, N. E., Hunziker, P. & Vasak, M. (1994). Isolation,
primary structures and metal binding properties of neuronal growth inhibitory factor (GIF) from bovine and equine brain. FEBS Lett 345(2‐3), 193‐7.
Riek, R., Precheur, B., Wang, Y., Mackay, E. A., Wider, G., Guntert, P., Liu, A., Kagi, J. H. & Wuthrich, K. (1999). NMR structure of the sea urchin (Strongylocentrotus purpuratus) metallothionein MTA. J Mol Biol 291(2), 417‐28.
Roschitzki B., Vasak M. (2002). A distinct Cu(4)‐thiolate cluster of human metallothionein‐3 is located in the N‐terminal domain. J Biol Inorg Chem. 7(6):611‐6.
Tio, L., Villarreal, L., Atrian, S. & Capdevila, M. (2004). Functional differentiation in the mammalian metallothionein gene family: metal binding features of mouse MT4 and comparison with its paralog MT1. J Biol Chem 279(23), 24403‐13.
Uchida, Y., Takio, K., Titani, K., Ihara, Y. & Tomonaga, M. (1991). The growth inhibitory factor that is deficient in the Alzheimerʹs disease brain is a 68 amino acid metallothionein‐like protein. Neuron 7(2), 337‐47.
Valls, M., Bofill, R., Gonzalez‐Duarte, R., Gonzalez‐Duarte, P., Capdevila, M. & Atrian, S. (2001). A new insight into metallothionein (MT) classification and evolution. The in vivo and in vitro metal binding features of Homarus americanus recombinant MT. J Biol Chem 276(35), 32835‐43.
Valls, M., Bofill, R., Romero‐Isart, N., Gonzalez‐Duarte, R., Abian, J., Carrascal, M., Gonzalez‐Duarte, P., Capdevila, M. & Atrian, S. (2000). Drosophila MTN: a metazoan copper‐thionein related to fungal forms. FEBS Lett 467(2‐3), 189‐94.
Vasak, M., Hasler, D. W. & Faller, P. (2000). Metal‐thiolate clusters in neuronal growth inhibitory factor (GIF). J Inorg Biochem 79(1‐4), 7‐10.
Vergani, L., Grattarola, M., Borghi, C., Dondero, F. & Viarengo, A. (2005). Fish and molluscan metallothioneins. FEBS J 272(23), 6014‐23.
- 14 -
S.purpuratus SpMTA
Villarreal, L., Tio, L., Capdevila, M. & Atrian, S. (2006). Comparative metal binding and genomic analysis of the avian (chicken) and mammalian metallothionein. FEBS J 273(3), 523‐35.
Wang, Y., Hess, D., Hunziker, P. E. & Kagi, J. H. (1996). Separation and characterization of the metal‐thiolate‐cluster domains of recombinant sea urchin metallothionein. Eur J Biochem 241(3), 835‐9.
Wang, Y., Mackay, E. A., Kurasaki, M. & Kagi, J. H. (1994). Purification and characterisation of recombinant sea urchin metallothionein expressed in Escherichia coli. Eur J Biochem 225(1), 449‐57.
Wang, Y., Mackay, E. A., Zerbe, O., Hess, D., Hunziker, P. E., Vasak, M. & Kagi, J. H. (1995). Characterization and sequential localization of the metal clusters in sea urchin metallothionein. Biochemistry 34(22), 7460‐7.
Wilkinson, D. G. & Nemer, M. (1987). Metallothionein genes MTa and MTb expressed under distinct quantitative and tissue‐specific regulation in sea urchin embryos. Mol Cell Biol 7(1), 48‐58.
- 15 -
Resultats
- 16 -