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RESUMENES DEL SIMPOSIO DE VERANO 2007
¿Qué podemos aprender desde una perspectiva de genómica comparativa sobre laevolución de la función enzimática?Francisco (Paco) Barona Gómez
Recientemente, y a consecuencia de los avances en genómica y bioinformática, una nueva visiónsobre las leyes que regulan la aparición de una nueva función enzimática ha comenzado a delinearse.Más allá de la fijación de mutaciones posteriores a un evento de duplicación génica que impactannotoriamente sobre la estructura y función de una proteína, como lo dicta el modelo original, parecieraque varias funciones pueden residir en una misma proteína. En particular, se ha postulado que lapromiscuidad catalítica, definida ésta como la capacidad de una enzima de aceptar un sustrato distinto al“natural” y convertirlo, aunque de forma ineficiente pero normalmente siguiendo el mismo mecanismode reacción, es un rasgo que se ha seleccionado durante el curso de la evolución. Esto ha dado lugar a laaceptación de un nuevo corolario en la forma de función precede duplicación. Sin embargo, sedesconoce que tan representado se encuentra dicho fenómeno en la naturaleza (la mayoría de laevidencia proviene de experimentos de evolución dirigida in vitro), y más importante aún, cuales son laspresiones selectivas que pudieran dictar su evolución y la subsiguiente aparición divergente de ladiversidad funcional de las enzimas. De hecho, modelos de evolución natural de enzimas que confirmeneste corolario resultan, en el mejor de los casos, escasos y poco fundamentados. En esta plática, unejemplo de evolución natural de la función enzimática identificado usando genómica comparativa, elcual hemos validado experimentalmente, será presentado. La caracterización funcional y estructural dehomólogos selectos miembros de la familia de enzimas en cuestión es consistente con un modeloevolutivo que procede vía intermediarios promiscuos pero que rápidamente vuelven a especializarse sinnecesidad de un evento de duplicación génica. Más aún, pareciera que las constricciones funcionales quedictan las distintas historias evolutivas descritas, es decir, la evolución de la promiscuidad catalítica,operan a nivel de sistema como lo son la estructura y función de toda la red metabólica, así como elcontenido y dinámica de los genomas comparados.
Ambos tipos de adenilil ciclasas las transmembranales y la soluble participan en la fisiología delespermatozoide de erizo de mar.C. Beltrán, A. Loza, P. Sánchez y A. Darszon.
El AMPc, segundo mensajero sintetizado por la adenilil ciclasa (AC) importante en latransducción de señales de las células, es fundamental en la fisiología del espermatozoide. Elespermatozoide debe nadar, encontrar el óvulo y llevar a cabo la reacción acrosomal (RA) parafecundarlo. Los niveles de AMPc influencian los flujos iónicos del espermatozoide, la movilidad y laRA.
Dos tipos de ACs se expresan en mamíferos, las transmembranales (ACtms) y la soluble (sAC),identificada molecularmente en el testículo de rata y en el espermatozoide.
Las ACtms localizadas en la membrana plasmática, se regulan por proteínas G heterotriméricas y seestimulan por forskolina. Por el contrario la sAC se estimula por Ca2+ y por bicarbonato. Además de lasAC el espermatozoide de ratón y de humano aparentemente también contiene ACtms.
En este trabajo utilizando ensayos funcionales y técnicas de inmunofluorescencia y de westernblot, demostramos que además de la sAC, en el espermatozoide de erizo de mar también están presentesmúltiple isoformas de ACtms. Nuestros resultados utilizando inhibidores selectivos para los dos tipos deACs, indican que ambas, la sAC y las ACtms participan tanto en la RA como en la movilidad delespermatozoide de erizo de mar. Además el uso del RpAMPc, inhibidor especifico para la proteínacinasa dependiente de AMPc (PKA), mostró que dicha enzima participa en los diferentes tipos demovimiento del espermatozoide.
Nuevos enfoques para la visualización de calcio y ERO en pelos radicales de leguminosas ysu respuesta a los factores de nodulación de Rhizobium etli.L. Cárdenas, L. Martínez Lara, y C. Quinto.
Nuestro modelo de trabajo consiste en estudiar la interacción simbiótica Rhizobium etliPhaseolus vulgaris, y estamos interesados en determinar los mecanismos celulares y molecularesinvolucrados en esta interacción. Los FNs de R. etli son moléculas señales de naturaleza lipoquitooligosacarídica. Los pelos radicales de frijol responden a los FNs deformándose y en presencia de labacteria se forman los hilos de infección por donde el rhizobium penetra hasta el cortex de la raíz.Utilizando técnicas de microinyección de células vivas demostramos que los FNs de R. etli purificados yaplicados a los pelos radicales inducen reorganización de los microfilamentos de actina y cambios enlos influjos de calcio, así también demostramos que las modificaciones químicas de los FNs juegan unpapel muy importante en esta respuesta. Recientemente utilizamos citocalasina derivatizada confluoresceína para visualizar los sitios de polimerización de actina en pelos radicales de frijol vivos y surespuesta en presencia de los FNs. Por otro lado también abordadamos el estudio de las especiesreactivas de oxigeno (ERO) en la vía de señalización inducida por los FNs, encontrando que hay unarespuesta temprana, transiente y distinta a la inducida por elicitores de patógenos (Cárdenas et al.,sometido). Ahora estamos interesados en determinar el papel del calcio y ERO durante la percepción delos FNs mediante enfoques menos invasivos y más integrativos. Para esto utilizaremos nuevasherramientas moleculares como la expresión de nuevas variantes mejoradas de proteínas verdesfluorescentes sensibles a calcio o a ERO utilizando plantas de Lotus japonicus transformadasestablemente. Esto nos permitirá determinar simultáneamente los niveles intracelulares de calcio o EROa lo largo del proceso de infección, así como sus fuentes intracelulares, dado que las sondas molecularespueden ser dirigidas a compartimentos celulares específicos, como el núcleo, el retículo endoplasmáticoy las mitocondrias.
Estudio de la muerte celular asociada al envejecimiento y enfermedades relacionadasJ. Bouzas, R. RodríguesValentín, G. Zárraga, X. Gracida, L. Covarrubias y S. Castro Obregón.
En los últimos 50 años la expectativa de vida de los humanos se ha duplicado, permitiendo
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observar el surgimiento de enfermedades asociadas a la vejez como el cáncer y las enfermedadesneurodegenerativas. Dado que la proporción de individuos viejos en la sociedad va en aumento, es deactual relevancia estudiar los mecanismos moleculares del envejecimiento, así como de las enfermedadesasociadas, procesos en los que la muerte celular juega un papel central. Es por eso que nuestra línea deinvestigación busca entender los mecanismos moleculares de las diferentes formas en que las célulaspueden morir. Inicialmente descubrimos que el neurotransmisor conocido como la sustancia P (SP), alactivar a su receptor (NK1R), induce una forma de muerte celular programada no apoptótica con unamorfología semejante al tipo de muerte 2 o autofágica, y recientemente demostramos que requiere de lamaquinaria molecular de la autofagia para ejecutarse. Las características morfológicas de la muerteinducida por SP/NK1R asemejan la muerte observada durante la neurodegeneración, resultando ser unmodelo para estudiar el mecanismo molecular por el cual se da la muerte neuronal. Aunque hay quedestacar que dicho programa de muerte se observa tanto en células neuronales como en células noneuronales, sugiriendo ser un proceso general. Identificamos la vía de transducción que se activa parainducir la muerte autofágica desde la membrana plasmática hasta el núcleo. Se encontró al receptornuclear Nur77 como esencial para la progresión de la muerte y recientemente encontramos que Nur77modula la muerte autofágica inducida por al menos otros dos estímulos; actualmente estamosinvestigando el mecanismo molecular. Considerando además que Nur77 es capaz de inducir otrosprocesos celulares, como proliferación, diferenciación o muerte apoptótica, esta molécula modula eldestino celular. Es nuestra meta entender el mecanismo molecular que determina el tipo de proceso quepromueve.
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Antibióticos provenientes del veneno de arácnidosCorzo, G., Belokoneva, O.S., Espino, P., Possani, L.D., Villegas, E.
El veneno de algunos arácnidos presentan péptidos con actividad antibacteriana, los cualesademás de tener un carácter anfipático, contienen una cantidad significativa de aminoácidos cargadospositivamente. Varios de estas moléculas con características anfipáticas y actividades antimicrobianashan sido extraídas del veneno de los alacranes Pandinus imperator y Centruroides suffusus suffusus, y dela araña Oxyopes kitabensis. Dos péptidos llamados Pin1 y Pin2 fueron obtenidos del alacrán P.imperator, y dos moléculas más: Oxki1 y Oxki2 fueron extraídos de la araña O. kitabensis. Algunasfracciones con actividad microbicida han sido identificadas en el alacrán C. s. suffusus (datos todavia nopublicados por nuestro grupo). Sinembargo aún no se tiene la estructura primaria de las moléculasresponsables de dicha actividad. Pin2 y Oxki1 tienen 24 y 48 aminoácidos, respectivamente. Ensayos dePin2 u Oxki1 en presencia de membranas artificiales sugieren que Pin2 forma polímeros, los cualesdependen de la concentración de esta molécula. Por otro lado, Oxki1 se inserta monoméricamente a lasmembranas y forma polímeros estables independientemente de su concentración.
Ambas moléculas Pin2 y Oxki1, por sus características químicas, pueden penetrar membranascelulares, lo que resulta en la formación de poros, los cuales permiten el libre paso de iones, de modoque provocan la despolarización de la membrana celular. Moléculas catiónicas y anfipáticas provenientesdel veneno de arácnidos, así como de otras fuentes, como de las glándulas de la epidermis de ranas, soninteresantes ya que podrían actuar como antibióticos contra microorganismos patógenos. Si bien muchasde estas moléculas tienen la desventaja de ser hemolíticas, su potencia microbicida podría ser unaventaja para considerarse como antibióticos alternativos de aplicación tópica en el tratamiento deinfecciones orales asociadas a la caries dental y en el tratamiento de infecciones de la piel.
Papel de múltiples receptores en el reconocimiento celular de toxinas bacterianasI. Gómez, I. Arenas, M. T. Martínez
El primer paso en el mecanismo de toxicidad de diversas toxinas bacterianas es el contacto deestas proteínas con receptores específicos localizados en las células blanco. Nuestro modelo de trabajopropone la participación secuencial de al menos 2 receptores para las toxinas Cry. Primero, lainteracción con el receptor BtR1 induce un corte proteolítico en la toxina y la formación de unoligómero de 4 subunidades, este cambio en la conformación de la toxina está acoplado a un incrementoen la afinidad hacia la APN, que está anclada a la membrana por un puente de glicosilfosfatidilinositolque lo localiza preferencialmente en regiones de la membrana llamadas “Raft´s” donde ocurre lainserción de la toxina. Dado el amplio uso de las toxinas Cry como agente de control biológico, esimportante entender el papel de cada receptor en el mecanismo de toxicidad, esto pudiera tener unimpacto en el diseño de toxinas modificadas con mayor actividad, o bien, para contender con la posiblegeneración de insectos resistentes. Mediante la metodología de Despliegue en fagos, construimosbibliotecas de anticuerpos que reconocen la toxina Cry1Ab y hemos diseñado estrategias de selecciónpara dirigir nuestra búsqueda hacia regiones de la toxina involucradas en la interacción con losreceptores. Logramos seleccionar anticuerpos contra el Dominio II y III, observando la interacción del
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DII con el receptor BtR1 y del Domino III con la APN, ambos grupos de anticuerpos son capaces deinhibir toxicidad “in vivo”. También tenemos anticuerpos antioligómero con capacidad de inhibir lainteracción con vesículas purificadas a partir del intestino medio del lepidóptero Manduca sexta. Por otrolado, estamos caracterizando péptidos que reconocen a los receptores APN y ALP. Estas moléculasconstituyen herramientas útiles para el estudio de la interacción de las toxinas Cry con los receptoresinvolucrados en su mecanismo de toxidad.
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Ingeniería Metabólica de Escherichia coli y Bacillus subtilis para la obtención de etanol ylactato a partir de residuos agroindustriales.Alfredo Martínez Jiménez.
El futuro de agotamiento de combustibles fósiles, entre otros factores, plantea la necesidad deobtención de combustibles alternos y productos químicos renovables, mediante tecnologías sustentablesy más amigables con el medio ambiente. En este contexto se circunscriben nuestras líneas deinvestigación. Los planteamientos parten de necesidades tecnológicas para generar ciencia básica yaplicada. La pregunta práctica a contestar es si podemos desarrollar biotecnologías competitivas para laobtención de combustibles alternos a los fósiles y materias primas para la síntesis de plásticosbiodegradables. Y la básica es generar conocimiento del metabolismo bacteriano, en condiciones defermentación, para la canalización eficiente del flujo de carbono a dos modelos de estudio: a) etanolcarburante; y b) L y D lactatos ópticamente puros. En este trabajo se presentará el diseño y construcción,mediante ingeniería de vías metabólicas, de E. coli y B. subtilis, para obtener, en ambos casos, cepashomoetanolgénicas y homolácticas. En los aspectos básicos se hará énfasis en estrategias metabólicasracionales y de evolución adaptativa para lograr una eficiente conversión de xilosa (segundomonosacárido más abundante en la lignocelulosa) y mezclas de glucosaxilosa en los productosmencionados. Se discutirán resultados de análisis de regulación metabólica, los cuales permitendeterminar los pasos que controlan la formación de productos en condiciones de fermentación.Finalmente, se analizará la aplicación de cepas construidas por ingeniería metabólica en cultivos a nivelfermentador, usando hidrolizados de bagazo de caña, para la obtención de etanol y Dlactato.
Procesamiento proteolítico de las proteínas de Astrovirus.E. Méndez, T. FernándezLuna, C. Muñoz, R. Baños, M.P.E. Salas, G. AguirreCrespo, G. Zavala, C.F.Arias.
Los astrovirus son la segunda causa de gastroenteritis viral en niños menores de cinco años. Sehan encontrado también asociados a gastroenteritis en otros mamíferos y, en aves, causan enfermedadesde alta mortalidad. Son virus no envueltos cuyo genoma esta formado por una sola cadena de RNA depolaridad positiva de 6.8 kb, lo cual significa que en ausencia de proteínas virales, éste es capaz deiniciar un ciclo de replicación productivo. El genoma contiene tres marcos de lectura, uno de los cuales(ORF2) codifica para la proteína estructural VP90. Esta proteína sufre cortes proteolíticos que sonimportantes en varios pasos del proceso infeccioso. Durante la morfogénesis, la proteína VP90 seensambla en partículas asociadas a membranas, en donde parece ocurrir la replicación del RNA viral.Una vez ensamblada y disociada de membranas, VP90 se procesa en su carboxilo terminal por lascaspasas, proteasas celulares asociadas a la muerte celular por apoptosis, cuya actividad es inducidadurante la infección. Los cortes sobre VP90 generan partículas formadas por la proteína VP70 y parecenser importantes para que éstas sean liberadas de la célula. Estos virus no son infecciosos por si mismossino que, a su vez, deben procesarse con tripsina (presente en el intestino delgado, donde infecta demanera natural), para iniciar un nuevo ciclo replicativo. El procesamiento con esta enzima provoca lageneración de partículas con alta infectividad, que contienen tres productos: VP34, VP27 y VP25.
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Aunque no se conoce el mecanismo por el que esto ocurre, se piensa que, en conjunto con el pH ácido delos endosomas (que es necesario para la infección), el tratamiento con tripsina podría inducir cambiosestructurales que provocan la entrada del virus. Ante una respuesta celular a la infección, los virusdesarrollan estrategias que les permite contrarrestar, y/o aprovechar esta respuesta. La utilización de lasenzimas celulares como las caspasas y la tripsina durante la infección por astrovirus es un ejemplo deesta situación.
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La THIbox, o de como los thi mRNAs unen pirofosfato de tiamina y autoregulan suexpresión.N. OntiverosPalacios, A.M. Smith1, F.J. Grundy1, M. Soberon, T. M. Henkin1 and J. MirandaRíos.1Department of Microbiology, The Ohio State University, Columbus, OH, USA
Los riboswitches son elementos de control genético localizados principalmente en la región 5´no traducida de algunos mRNAs. Estos dominios de RNA sufren cambios conformacionales quemodulan la expresión genética al unir señales regulatorias que pueden ser vitaminas, aminoácidos,nucleótidos y tRNA no cargado. El riboswitch que une al pirofosfato de tiamina (PFT), llamado THIbox, se encuentra en los tres reinos de la vida y regula la expresión génica a nivel de terminaciónprematura de la transcripción, inicio de la traducción y en el “splicing”(1). Se llevó a cabo una análisisde la expresión in vivo de mutantes con substituciones en las bases conservadas presentes en las asas dela THIbox presente en el operón thiMD de E. coli, obteniéndose dos clases fenotípicas (2). Una claseexhibe una alta expresión durante el crecimiento en presencia o ausencia de tiamina, mientras que lasegunda clase muestra una baja expresión en ambas condiciones. Se monitoreó la accesibilidad de lasecuencia ShineDalgarno después de añadir PFT por medio de ensayosde rompimiento por RNasa H yunión de subunidades ribosomales 30S. Estos estudios muestran que los RNAs mutantes de alta y bajaexpresión están bloqueados en las conformaciones norepresiva y represiva, respectivamente.
Imágenes de fluorescencia y compuestos fotoactivables – aplicación a la fisiología delespermatozoideTakuya Nishigaki Tomar imágenes fluorescentes en células vivas es un método muy importante para observar losprocesos biológicos. La demanda de esta técnica es cada vez mayor debido a la facilidad que se tienepara usar la proteína fluorescente (GFP) como marcador molecular en células sin fijar, también existenotros indicadores fluorescentes muy útiles para observar parámetros fisiológicos como son losindicadores de calcio (Ca2+) intracelular. Durante mucho tiempo hemos trabajado en la fisiología del espermatozoide y recientemente nosenfocamos a estudiar el papel de Ca2+ intracelular en el movimiento del espermatozoide. Para ello,desarrollamos un sistema para tomar imágenes fluorescentes usando luz estroboscópica con LED (lightemitting diode), lo cual nos permite tomar imágenes claras del flagelo del espermatozoide motil.También, desarrollamos compuestos fotoactivables para estimular las células sin causar ningunaperturbación del medio. Utilizando estos avances metodológicos, por primera vez, logramos tomarimágenes del Ca2+ intracelular en el espermatozoide de erizo de mar durante la quimiotaxis. El sistema de microscopia con iluminación estroboscópica tiene otras ventajas importantes como:reducir el tiempo total de la excitación a la muestra. Esto ayuda a reducir la fototoxicidad a las células yel blanqueo del fluoroforo. Además, la lámpara de LED requiere menos energía que una lámparaconvencional (mercurio o Xenón) y tiene un tiempo de la vida muy largo. Por estas razones, el sistemade iluminación que desarrollamos podría ser a futuro, el sistema principal para microscopia defluorescencia en el campo de las ciencias biológicas. En la presentación, explicaré nuestros avances metodológicos en detalle y mostraré resultados
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preliminares junto con los de publicados.
Mutaciones que resultan en una sobreproducción de alginato en Azotobacter vinelandii: Elpapel de la NADHUbiquinona oxidoreductasa translocadora de Na+.C. E. Núñez López y E. G. Espín Ocampo
Nuestro modelo de investigación comprende el estudio de las redes de regulación molecular dela producción del exopolisacárido alginato en Azotobacter vinelandii. Todos los genes estructurales, conexcepcion de algC, se localizan en una región del cromosoma y están encabezados por algD cuyatranscripción esta positivamente regulada por los factores sigma de estrés AlgU y RpoS, y el sistema dedos componentes GacA/GacS. En contraste, las proteínas AmpDE necesarias para la integridad de lapared celular y los factores antisigmaAlgU MucAB regulan negativamente la transcripción de algD.Con el objeto de identificar aún mas reguladores negativos de esta vía, realizamos una mutagénesis alazar de A. vinelandii e identificamos 12 mutantes que sobreproducen alginato. La función de los genesinterrumpidos es muy diversa e incluyen funciones de respiración, metabolismo de carbono, síntesis delsegundo mensajero cdiGMP etc. Los distintos niveles en la sobreproducción específica de alginato asícomo en la cinética de transcripción del gen algD en dichas mutantes sugiere la existencia demecanismos de señalización diversos para la activación de la síntesis de alginato. La mutante GG4exhibió los niveles más altos en la producción específica de alginato (60 veces) y dicha mutante llevainterrumpido el operón que codifica para el complejo de la NADHUbiquinona oxidoreductasatranslocadora de sodio (NQR) el cual es una bomba ligada a la respiración y que crea un gradiente deNa+. Un estudio mas profundo del complejo NQR nos permitió concluir que este constituye la principalbomba de sodio en A. vinelandii y tenemos evidencias que la producción de alginato responde a loscambios en el flujo membranal de este catión. En conjunto nuestros resultados revelan la existencia deuna compleja red de regulación que controla la síntesis de alginato en A. vinelandii; el objetivo defuturos proyectos es investigar los mecanismos moleculares que permiten activar esta ruta biosintética.
Siguiendo la producción y las cinéticas de ensamblaje y desensamblaje de pseudopartículas virales de rotavirus: Hacia la producción de nanomaterialesL.A. Palomares, J.A. Mena, G. PlascenciaVilla, y O.T. Ramírez
Las pseudopartículas virales y otras estructuras proteicas de dimensiones nanométricas hanrecibido creciente interés en bio y nanotecnología, debido a su capacidad para el transporte dirigido yentrega de proteínas, sustancias o ácidos nucléicos, o por sus propiedades como materiales. Lasproteínas del rotavirus son especialmente interesantes para estas aplicaciones, dada su capacidad deensamblaje en estructuras con propiedades distintas. Primero, la partícula de una sola capa (slRLP),formada por VP2, es hidrofóbica. Segundo, la partícula de doble capa (dlRLP) formada por P2 y VP6, eshidrofílica y puede desensamblarse en slRLP por cambios en la concentración de calcio. Finalmente,VP6 es capaz de ensamblarse en tubos de varios micrómetros de largo con diámetros de 45 o 70 nm. Eneste trabajo, presentaremos las cinéticas in vitro de ensamblaje y desensamblaje de tubos de VP6 ydlRLP seguidas por dispersión de luz dinámica y estática y por cromatografía de pereación en gel. Las
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cinéticas de desensamblaje y ensamblaje de VP6 en tubos o en dlRLP fueron diferentes. Estos procesosfueron de dos etapas, con los trímeros de VP6 como intermediario. Las condiciones óptimas deensamblaje de dlRLP y tubos de VP6 serán presentadas. Además, las cinéticas de producción in vivo deambas estructuras serán discutidas. Esta información es importante para el diseño de procesos para laproducción de nanomateriales, vacunas, o moléculas transportadoras, basados en dlRLP o nanotubos condiámetros de 70 o 45 nm. Para incrementar la utilidad de los nanotubos de VP6, estos fueronfuncionarizados con plata, paladio y platino. Se mostrarán las características de la funcionalización.
La regulación de los umbrales de activación del receptor para el antígeno de linfocitos T y
la respuesta inmune.Gustavo Pedraza Alva
La respuesta inmune adaptativa comienza con la activación de los linfocitos T (LT). Esto ocurrecuando el receptor para el antígeno (TCR) reconoce al antígeno unido a las moléculas del complejomayor de histocompatibilidad en la superficie de la célula presentadora de antígeno (APC). Sinembargo, para que el linfocito se active requiere no solo de la señales resultantes del reconocimiento delantígeno por el TCR, si no que también de las señales generadas por la interacción de moléculas coreceptoras con sus contra receptores presentes en la APC. Se ha propuesto que las señales coestimuladoras disminuyen el umbral de activación del TCR inhibiendo los efectos negativos que ejercenligasas de ubiquitina de la familia de Cbl sobre la vía de señalización del TCR. En este trabajomostramos que la preestimulación de LT a través de la molécula coreceptora CD43 inhibe lafosforilación de Cbl en tirosinas inducida por el TCR; así como, la interacción de Cbl con la moléculaadaptadora CrkL. Adicionalmente, la estimulación de CD43 previa a la activación del TCR tambiénindujo la ubiquitinación y degradación de Cblb y retrasó la degradación de la cinasa ZAP70 y de lacadena del complejo CD3, resultando en una mayor activación de la vía de ERK y proliferacióncelular. Estos resultados muestran que las señales generadas por CD43 regulan los umbrales deactivación de los LT previniendo el efecto inhibitorio de Cbl y Cblb sobre las señales del TCR. Loanterior sugiere que las señales de CD43 juegan un papel importante en la respuesta inmune mediada porLT.
Desarrollo del fenotipo TRHergico hipotalamico: papel del factor 4 similar a Kruppel(KFL4).Leonor Pérez Martínez
La homeostasis neuroendócrina es establecida principalmente por los neuronas hipotalámicasque regulan la secreción hormonal de la glándula hipófisis. Durante el desarrollo del sistema nerviosocentral (SNC) de murinos, los precursores neurales que originan a los fenotipos hipotalámicos surgenentre los días embrionarios 11 (E11) y E16. Se ha determinado que algunos factores de transcripción tipobHLH y de la familia POU son cruciales para el surgimiento de varios fenotipos neuronaleshipotalámicos. En nuestro laboratorio hemos analizado el transcriptoma de las neuronas que sintetizan al
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péptido hipotalámico “hormona liberadora de tirotropina” (TRH), durante etapas tempranas deldesarrollo. Entre los transcritos enriquecidos en éstas neuronas se encuentran algunos que codifican parafactores de transcripción no caracterizados previamente en el SNC. Específicamente, el factor detranscripción “4 similar a kruppel” (KLF4) y el factor KLF10. En el presente trabajo nos hemosenfocado a determinar el papel de KLF4 durante la diferenciación del fenotipo TRHérgico hipotalámico.La expresión de KLF4 durante el desarrollo del hipotálamo coincide con su unión a la región promotoradel gen de TRH (E14E15) y con el inicio de la expresión del RNAm de TRH. La unión de KLF4 alpromotor de TRH se da a través de sitios de respuesta a factores tipo KLF (KREs). Interesantemente, elfactor de transcripción Sp1 forma parte de un complejo KLF4/Sp1 que interactúa con uno de los KRE.De acuerdo con esto, la expresión exógena de KLF4 y Sp1 en cultivos primarios de hipotálamo fetalregula la actividad del promotor de TRH de manera sinérgica. En conjunto, nuestros datos indican queKLF4 y muy posiblemente Sp1 son capaces de regular directamente la actividad transcripcional del gende TRH en etapas tempranas del desarrollo hipotalámico de la rata.
Análisis funcional y estructural de los factores transcripcionales en procariotes: Unenfoque GenómicoErnesto PérezRueda
Diversos elementos han sido identificados como responsables de regular la expresión génica enprocariotes, tales como los factores sigma, o los factores de la transcripción (TFs). En bacterias yarqueas, la estructura de unión al DNA más abundante en los TFs es la denominada hélicevueltahélice(HTH). Basado en la comparación de secuencias, hemos clasificado y evaluado la plasticidad(abundancia, distribución) de los TFs en alrededor de 400 genomas de procariotes. Alternativamente,hemos predicho la función en alrededor el 75% de los reguladores transcripcionales de la familiaAraC/XylS. Este enfoque se basa en el análisis del Dominio de unión al DNA (DBD) utilizandoherramientas evolutivas. Actualmente, estamos evaluando la utilidad de este enfoque en la predicción dela función en las diferentes familias de reguladores que hemos identificado a la fecha. Paralelamente,estamos intentando responder la pregunta de cómo ha evolucionado el repertorio de TFs en las Arqueascomo preámbulo de una reconstrucción de la red regulatoria en Halobacterium NRC1. Estacaracterización permitirá comparar esta red regulatoria con las redes regulatorias descritas en E. coliK12 y B. subtilis y algunos eucariotes. El enfoque utilizado se basa en comparar las familias de TFs entérminos de su abundancia y distribución, así como en sus propiedades funcionales, tales como si losreguladores globales se encuentran en las mismas familias de reguladores. Finalmente, los TFs estánsiendo evaluados en términos evolutivas para determinar cual es el mecanismo de selección que estaactuando en ellos y asi tener un mayor entendimiento en este tipo de proteínas. Estos análisis permitiránplantear como ha evolucionado el repertorio de TFs en procariotes y tener sistemas de predicción tantopara la función de los reguladores como para la predicción de redes regulatorias en organismos con pocao nula información de regulación transcripcional, así como evaluar la diversidad en sus elementos.
microRNAs de frijol en respuesta a estresJosé Luis Reyes Taboada
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La falta de agua se encuentra dentro de los principales factores abióticos que pueden afectar elcrecimiento de las plantas. El estrés hídrico puede resultar como consecuencia de otras condicionesadversas como sequía, temperaturas extremas, niveles elevados de sales en el suelo, o una combinaciónde las anteriores. En respuesta a estas alteraciones, las plantas han desarrollado distintas estrategias anivel fisiológico, celular y molecular. Recientemente se han identificado pequeñas moléculas de RNA,denominadas microRNAs (miRNAs), como reguladores de la expresión genética en eucariotes. En laplanta modelo Arabidopsis thaliana, se ha mostrado que los miRNAs participan durante el desarrollo, enrespuesta a fitohormonas y por limitación de nutrientes. Sin embargo, en otras especies se conoce poco,en particular en respuesta a estrés por falta de agua.Estamos utilizando Frijol (Phaseolus vulgaris), como modelo para estudiar la función de los miRNAs enrespuesta a estrés hídrico. Los retos que este modelo impone son particularmente interesantes debido a lafalta de la secuencia completa de su genoma y a la vez atractivos por la importancia económica del frijolen nuestro país. Este análisis nos ayudará a entender las diferentes estrategias de adaptación al estréshídrico que las plantas han desarrollado.El estudio de miRNAs en frijol se está llevando a cabo mediante la identificación de RNAs pequeñospresentes en condiciones de estrés por limitación de agua ó por tratamiento con Acido Abscísico (ABA)y su posterior análisis tanto bioinformático como experimental. Asi mismo, hemos desarrolladodiferentes herramientas experimentales que nos permiten estudiar los miRNAs de frijol y su función. Porotra parte, la identificación de los RNA mensajeros regulados por miRNAs nos dará una idea de larelevancia biológica de este mecanismo de regulación genética para la respuesta a estrés, asi como de ladiversidad de procesos regulados por los microRNAs en plantas en general.
¿Cómo se unen ciertos péptidos bacterianos a la fibronectina humana?Enrique Rudiño Piñera
La fibronectina humana es una proteína multidominio, formada por tres tipos de módulosrepetidos, que se localiza en la matriz extracelular y el plasma. Se le involucra en varios procesoscelulares, incluyendo la adhesión celular y la migración durante la embriogénesis y la cicatrización.Adicionalmente, presenta la característica de unirse específicamente con moléculas provenientes dediversos patógenos. En el caso de Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes, la unión a lafibronectina se da mediante proteínas bacterianas llamadas FnBPs (por sus siglas en ingles), las cualeshan demostrado no solo tener un papel importante en la adhesión a células huésped, sino también en elproceso de absorción bacteriana en las células humanas. Las FnBPs interactúan específicamente con laregión aminoterminal de la fibronectina humana, en una región rica en módulos llamados F1. A pesar deque existen algunos estudios estructurales de esta región de la fibronectina humana, todas determinadaspor RMN, no existían estructuras determinadas por difracción de rayos X. Con esto en mente iniciamosun proyecto que a la fecha ha producido 4 artículos publicados, en los cuales el componente técnico y dedesarrollo de metodologías tanto para difracción de rayos X, como para RMN, ha sido fundamental. Enla plática se abundara sobre la determinación de 2 formas cristalinas de los dominios 2F13F1 de lafibronectina humana, otro más resultado de RMN, así como la segunda estructura de un complejofibronectina – FnBPs y sus posibles implicaciones biológicas.
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Ingeniería de Proteínas en amilasas como biocatalizadores en la producción de alquilglucósidos.J.Yazmín, D. Almazo, A. Chauvin, M.H. Rivera, E. Mancera, P. Fuentes, A. Ochoa, A. Carrillo, G. SaabRincón.
Los proyectos en los que he trabajado se dividen en dos líneas relativamente independientes. Laprimera, es el desarrollo de herramientas para la generación de variabilidad, las cuales han sidoimplementadas específicamente en proteínas con un plegamiento de barril TIM y entre las que se puedendestacar la recombinación in vivo de mitades del gene de fosforibosil antranilato isomerasa [1] y eldesarrollo de librerías intercambiando las asas catalíticas de barriles TIM, trabajo que se encuentra enproceso y cuyo avance discutiré brevemente. La segunda, en la cual abundaré mas se relaciona con el usode amilasas para la producción de alquil glucósidos, la cual ha englobado la exploración de diversasamilasas en búsqueda de aquellas que cumplan con las especificaciones que esta reacción requiere. Las alfaamilasas son enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces 1,4 en almidón. Sin embargo,algunas de ellas tienen la capacidad de realizar reacciones alternas como son la transglicosidación y laalcohólisis, en cuyos casos el glicósido unido a la enzima es transferido a un aceptor de naturalezaglicosídica en el primer caso, o a un alcohol, en el segundo caso. Nuestro interés se centra en lasreacciones de alcohólisis que generan alquilglicósidos como producto, ya que estos son utilizados comotensoactivos en las industrias alimenticia, farmacéutica y cosmética, y tienen un alto valor agregado. Eldesarrollo de biocatalizadores para la producción de este tipo de compuestos resulta muy atractivo parasustituir la síntesis química de estos compuestos que requiere de varios pasos de protección ydesprotección de los diversos grupos hidroxilo en las moléculas de sacárido bajo condiciones extremasde pH, que resultan muy laboriosas, costosas y de bajo rendimiento. La comparación de patrones de secuencias entre amilasas con y sin actividad transglicosídica nos hapermitido identificar residuos que son importantes en esta actividad y a través de mutagénesis sitiodirigida hemos podido introducir actividad transglciosídica y alcoholítica en amilasas que nopresentaban estas actividades [2], así como aumentarla en enzimas que ya las presentaban [3, 4]. El usode evolución dirigida como herramienta para alcanzar este objetivo se ha visto limitado al no contar conun método de selección que permita discriminar la actividad alcoholítica presente en un fondo dehidrólisis muy alto. Una de las estrategias propuestas requiere la síntesis de derivados de oligosacáridosque nos permita discriminar entre estas dos reacciones, para ello se están sintetizando compuestos quenos permitan hacer un monitoreo de reacciones de transferencia a metanol, de manera que se pueda hacerun análisis sistematizado de muchas muestras. No obstante, aun con el desarrollo de estos métodos dealta eficiencia, el análisis se limita a unos cuantos miles de variantes, que es una muestra infinitesimal delas variantes que se pueden generar por métodos de mutagénesis aleatoria. Es entonces indispensable,dirigir la mutagénesis hacia residuos que presumiblemente estén involucrados con el mecanismo de lareacción. La identificación de residuos a mutagenizar se ha basado en el modelamiento del sitio activo,así como en la identificación de patrones de estos residuos en enzimas homólogas con alta actividadtransglicosídica.
Caracterización molecular de los canales TRP que participan en la fisiología del
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espermatozoide de mamíferoClaudia Treviño
La comunicación entre los gametos es la base de la reproducción sexual. La regulación de lapermeabilidad iónica membranal de los gametos juega un papel crucial en el intercambio de señalesentre estas celulas. Los canales iónicos participan de manera importante en tres eventos básicos de lafecundación: la motilidad, la capacitación y la reacción acrosomal (RA). La evidencia hasta ahora esconsistente con la propuesta de que durante la RA hay una liberación de Ca2+ de pozas intracelularessensibles a IP3, lo cual activa canales operados por pozas (SOCs) produciendo una elevación sostenidade la [Ca2+]i y finalmente la RA. Sin embargo se sabe poco sobre la identidad molecular de la mayoría deestos canales y sobre su regulación durante estas funciones clave del espermatozoide. En mamíferos lafamilia de los canales TRP (candidatos moleculares para los SOCs) ha ido en aumento y actualmenteesta conformada por más de 30 genes diferentes subdivididos en 7 familias. Recientemente Jungnickel ycolaboradores demostraron la participación de TRPC2 durante los eventos que conducen a la RA.Nosotros, hemos explorado la expresión de la familia TRPC, TRPV y TRPM en célulasespermatogénicas de ratón y en espermatozoide de ratón y humano. Encontramos que estas proteínas sedistribuyen heterogéneamente en el espermatozoide tanto en cabeza como en el flagelo por lo quepodrían participar también en eventos como movilidad y/o capacitación. Así mismo hemos utilizadoherramientas farmacológicas y de medición de [Ca2+]i intracelular con colorantes fluorescentes paracaracterizar funcionalmente a los canales TRP que participan en la fisiología del espermatozoide.
Ingeniería de metaloenzimas redox.F. Gasteazoro, P. Gil, M. Loza, G. Paredes, D. Ruiz y B. Valderrama.
La mejor fuente de energía biológica es la reducción de O2 a agua mediante la incorporaciónsucesiva de cuatro electrones. Los intermediarios de este proceso se llaman especies de oxígeno reactivas(EORs) y su acumulación detona el daño oxidativo subyacente en padecimientos degenerativos yenvejecimiento. El éxito de la vida aeróbica esta ligada al desarrollo de mecanismos de control en laemisión de EORs por reclutamiento de metales de transición (principalmente cobre y fierro) comocofactores enzimáticos. A diferencia de los intermediarios abióticos de la reducción de O2, losbiocatalíticos no son difusibles sino que se asientan en los átomos metálicos, tienen vidas medias máslargas y menor reactividad. Esta táctica permite controlar la extensión del daño oxidativo de las EORs alconfinarlas. Sin embargo, este confinamiento dirige el daño oxidativo a las enzimas mismas, llegando adestruirlas. Las enzimas oxidativas están adquiriendo un papel protagónico en la biotecnología por sucapacidad de desarrollar oxigenaciones enantioselectivas, regioselectivas y estereoespecíficas.Desgraciadamente, y debido a su baja estabilidad intrínseca, su participación en el mercado es menor al10% a pesar de tener a la más cotizada, la glucosa oxidasa. Nuestra investigación se enfoca a elucidar losmecanismos moleculares involucrados en el daño oxidativo autoinfligido de metaloenzimas condiferentes sitios metálicos: fierro hémico, fierro nohémico o cobre. Las metaloenzimas provienen dediferentes fuentes naturales (plantas, hongos o bacterias), aunque también las producimosrecombinantes. La estrategia que usamos es la caracterización detallada de los mecanismos catalíticos yde desactivación mediante métodos biofísicos como espectroscopías (UVvis, EPR, DC, DCM, etc.) y la
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resolución de su estructura cristalográfica. Todo esto dirigido a generar las bases conceptuales quepermitan un diseño racional de variantes más estables mediante ingeniería de proteínas basada en redox.
Tub23C interactúa genéticamente con los complejos remodeladores de la cromatinaBrahma en Drosophila melanogaster.M. Vázquez, M. T. Cooper, M. Zurita y J. A. Kennison.
En Drosophila melanogaster los genes del grupo trithorax se requieren para mantener la expresión de losgenes homeóticos que determinan la identidad de los segmentos que conforman el cuerpo de la mosca.En este insecto existen por lo menos dos complejos remodeladores de la cromatina que contienen comosubunidad catalítica a la ATPasa Brahma (Brm). Estos complejos son llamados BAP y PBAP. Varias delas subunidades de estos complejos están codificadas por genes del grupo trithorax. La tubulina forma parte de los complejos T uSC y TuRC, que a su vez forman parte de loscomplejos organizadores de microtúbulos (MTOCs). La función de TuRC es iniciar la polimerizaciónde y tubulina para la formación de los microtúbulos, que sirven para el transporte de proteínas yorganelos, para el establecimiento de la polaridad celular y para la formación de los husos mitóticos ymeióticos. La tubulina parece tener también una función regulatoria, independiente de la de iniciar laformación de microtúbulos, pues interactúa con proteínas que regulan el ciclo celular.La tubulina es esencial para la célula, por tanto, sus funciones son difíciles de estudiar genéticamenteya que muchas de las mutaciones que afectan a la proteína causan letalidad y no permiten que uneucarionte multicelular alcance etapas de desarrollo avanzadas. En la búsqueda de genes que codifican para proteínas relacionadas con la función de Brahmaencontramos uno de los dos genes que codifican para la tubulina en Drosophila, T ub23C. Lasmoscas mutantes en T ub23C tienen las alas extendidas, con ampollas y con muescas en los márgenes,así como estructuras en forma de perlas en las venas de las alas. Algunos de estos fenotipos sondependientes de la presencia de mutaciones en los complejos BRM. Por otro lado, encontramos que lasmutaciones que afectan la proteína Grip91 que también es una subunidad de T uSC y T uRC,suprimen la letalidad recesiva y los fenotipos de ala causados por las mutaciones en T ub23C.
Tub23C también interactúa con los genes trithorax, osa (subunidad del complejo BAP) y tonalli(posible E3 ligasa de SUMO relacionada a la actividad de los complejos BRM).Las interacciones genéticas de Tub23C con algunas mutaciones que afectan la remodelación de lacromatina, sugieren que la tubulina pueda tener un papel en la regulación de la expresión genética.
Las acuaporinas como reguladoras del flujo de agua durante la adaptación de las plantas ala sequia y la salinidadRosario Vera Estrella.
El agua es el principal componente de células y tejidos de todos los organismos, y la manera decómo se regula la entrada y salida de esta en las células debe de ser uno de los aspectos más importanteen el estudio de la fisiología de los organismos en general. La comprobación de la existencia de lasacuaporinas (AQPs) o canales de agua ha creado un reto para definir su papel en la biología celular y
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fisiología de todos los organismos. Debido a que en las plantas, a diferencia de los demás organismos,las AQPs forman una gran familia génica, se podría inferir que las AQPs juegan un papel primordial enel uso eficiente del agua, como podría ser durante la sequía y la salinidad. En general, la expresión deAQPs en las plantas es muy compleja ya que se ha comprobado que intervienen diferentes factorestranscripcionales y postransduccionales, como la fosforilación y la glicosilación. Aunado a estosfactores con nuestro trabajo hemos agregando un componente más a la lista de mecanismos, laparticipación del tráfico vesicular. De estas evidencias surgen algunas preguntas, las cuales esimprescindible que tratemos de contestar: Si las AQPs se mueven entre los diferentes organelos, ¿cuál esla función de esta AQP en estos organelos celulares?, ¿cuál o cuáles son el(los) mecanismo(s) queinducen estos cambios en distribución? y ¿como es que estos mecanismos están siendo regulados?,existen otras AQPs que no se localizan en la membrana plasmática (PM) o TP, entonces ¿cual es laubicación subcelular de estas AQPs y ¿cual es la función de cada una de estas en sus respectivoscompartimentos subcelulares?. Para poder tratar de contestar estas preguntas hemos estudiado el papelde la compartimentación en las respuestas de Mesembryanthemum crystallinum al estrés, además deidentificar las moléculas reguladoras que participan en la activación del transporte de agua en general.Nuestros resultados han demostrado que las AQPs se mueven entre los diferentes compartimentoscelulares bajo ciertas condiciones ambientales, al mismo tiempo contamos con evidencias de que otrogrupo de AQPs se expresan en la mitocondria, el ER, el aparato de Golgi, y en compartimentosinvolucrados en la biogénesis de vacuolas y el tráfico vesicular. Otro de los aspectos que hemosestudiado en detalle es la función de cada una de las AQPs, utilizando el sistema de expresiónheteróloga, inyectando cRNA de las AQPs en ovocitos de Xenopus laevis. Los estudios que se hanrealizado en este proyecto han sido esenciales para poder asignar el papel fisiológico que las AQPsrealizan en la tolerancia de las plantas al estrés osmótico y salino.
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