SEPSİS SONRASI ERDOSTEİN VE ASETİLSİSTEİN

TEDAVİSİNİN PULMONER EPİTEL HÜCRELERDE APOPİTOTİK VE ANTİAPOPİTOTİK

GÖSTERGELER ÜZERİNE ETKİLERİ

Rezan DEMİRALAY

Sepsis, multipl organ disfonksiyonu ve yüksek mortaliteye neden olabilen

bir hastalıktır. Sepsisli hastaların lenfoid organlarında önemli apopitozisin

(programlı hücre ölümü) geliştiği ve bu organlardaki apopitozis

inhibisyonunun yaşam süresi ile ilişkili olduğu tespit edilmiştir. Sepsiste

başlıca hasar gören organ akciğerdir ve akut solunum sıkıntısı sendromu

(ARDS)’a öncülük eden akut akciğer hasarı (ALI) sıklıkla sepsisin bir

komplikasyonu olarak ortaya çıkmaktadır.

GİRİŞ

Apopitozis sinyal yolları; Ölüm reseptörü (dış) veya mitokondrial ve/veya endoplazmik retikulum (iç) yolları ile oluşan apopitotik cevabın bazı ana noktaları.

Ölüm reseptör aracılıklı kaspaz aktivasyonu

AIF

AIF

AIF

AIF

AIF

AIFAIF

AIF

Mitokondri (iç) yolu; sitokrom c ve apopitozis indükleyici faktör gibi apoptojenik faktörlerin mitokondriden salınımını içerir.

AIF

AIFAIF

AIF

AIFAIF

AIF

AIF

Cytchrome c

Cytchrome c

Cytchrome c

Cytchrome c

Cytchrome c

Cytchrome c

Cytchrome c

Cytchrome c

Cytchrome c

Cytchrome c

Cytchrome c

Cytchrome c

mitokondri

Bcl-2 ailesi

Anti-apoptotik(Bcl-2)

Pro-apoptotik (Bax)

Mitokondri

Bcl-2

Dış mitokondri membranında bulunurMitokondri dış zarının geçirgenliğini ↓ Sitokrom c ve AFI’ün salgılanmasını engeller

Bax

Sitoplazmada bulunur.Dış mitokondri zarının geçirgenliğini ↑Sitokrom c ve AIF’ün sitoplazmayageçişini sağlar

Apoptozom kompleksi oluşumu ve aktivasyonu

Apopitozis sinyal yollarında kaspaz aktivasyonu

Sepsisteki akciğer hasarında serbest oksijen radikalleri

önemli bir rol oynamaktadır.

Mitokondri

ROS

Bax

Sitokrom c salınımı

Hücre ölümü

Mitokondride bax aktivasyonu, sitokrom c salınımı ve hücre ölümü için serbest radikal oluşumu gereklidir.

Bu nedenle, hücresel antioksidan savunma sistemini artıran ve

serbest oksijen radikal oluşumunu nötralize eden tedavi ajanları ile

apopitozis regülasyonu, sepsis gidişatını ve akut akciğer hasarı (ALI)

gelişimini kontrol altına alabilir gibi görünmektedir.

AMAÇ

• İntraperitoneal LPS uygulanmasından sonra

pulmoner epitel hücrelerdeki apopitozis

sıklığını,

• Akciğer hasarında apopitotik ve antiapopitotik

göstergeler (bax, kaspaz-3 ve bcl-2) üzerine LPS’in

etkilerini,

• Erdostein ve asetilsisteinin koruyucu

etkilerini araştırmak

MATERYAL VE METOD

DENEYSEL PROTOKOL

Sıçanlar, her biri 9 hayvandan oluşan 6 gruba ayrıldı. Bunlar:

■ Negatif kontrol grubu; intraperitoneal salin ve oral distile su verilen grup■ Negatif kontrol grubu; intraperitoneal salin ve oral sodyum bikarbonat verilen grup■ Pozitif kontrol grubu; intraperitoneal LPS ve oral distile su verilen grup■ Pozitif kontrol grubu; intraperitoneal LPS ve oral sodyum bikarbonat verilen grup■ İntraperitoneal LPS ve erdostein (150mg/kg) verilen grup■ İntraperitoneal LPS ve asetilsistein (150mg/kg) verilen grup

İLAÇLAR

Erdostein, eş molar miktarda sodyum bikarbonat içeren distile suda çözülerek ve asetilsistein ise distile suda çözülerek oral olarak günde tek doz verildi.

DENEYSEL PROTOKOL

LPS (E.coli 055:B5; Sigma) 20 mg/kg vücut ağırlığı dozunda 1 ml salin içerisinde seyreltilerek intraperitoneal olarak uygulandı. Sıçanlar, LPS enjeksiyonundan 24 saat sonra öldürüldü ve torakotomi yapılıp akciğerler çıkarıldı. Akciğer dokusu, apopitozis, bcl-2, bax ve kaspaz 3 analizi için hazırlandı.

KONTROL GRUBU

İzotonik salin solüsyonu (LPS ile aynı hacimde) intraperitoneal olarak enjekte edildi. Ayrıca sodyum bikarbonat (erdostein dozu ile aynı molar miktarda) içeren distile su veya distile su (asetilsistein ile aynı miktarda) oral olarak tek doz verildi.

APOPİTOZİS ANALİZİ

Bronşiol ve alveol epitelindeki apopitozis düzeyi, In Situ Cell Death Detection kiti (Roche, Germany) kullanılarak TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick endlabelling) yöntemi ile belirlendi. Aynı kesitte sayılan 1000 hücre içerisindeki TUNEL-pozitif boyanan hücrelerin yüzdesi apopitozis indeksi (AI) olarak ifade edildi.

İMMÜNHİSTOKİMYASAL ANALİZ

Bronşiol ve alveol epitel hücrelerindeki lokal bcl-2 oluşum seviyesi anti-bcl-2 kiti (SantaCruz, USA), lokal bax oluşum seviyesi anti-bax kiti (Abcam, USA) ve endotel hücrelerindeki lokal kaspaz 3 oluşum seviyesi anti-kaspaz 3 kiti (Neomarkers, USA) kullanılarak immünhistokimyasal olarak değerlendirildi. Sonuçlar, aynı kesitte sayılan 1000 hücre içerisindeki pozitif sitoplazmik boyanma gösteren hücrelerinin yüzdesi olarak ifade edildi.

(A). APOPİTOZİS ANALİZİ BULGULARI

______________________________________Tedavi grubu Apopitozis indeksi (%) ortalamaSD_________________________________________________________Negatif kontrol 10.6 8.5 Pozitif kontrol 85.6 6.2

______________________________________İstatistiksel analiz: Negatif kontrol grubundan istatistiksel olarak farklı (p=0.000)

LPS’İN AKCİĞER EPİTEL HÜCRE APOPİTOZİSİ ÜZERİNE ETKİSİ

BULGULAR

TUNEL yöntemi ile apopitozis analizi (X200)

Negatif kontrol grubu Pozitif kontrol grubu

TEDAVİ GRUPLARININ AKCİĞER EPİTEL HÜCRE APOPİTOZİSİ ÜZERİNE ETKİSİ

________________________________________________________Tedavi grubu Apopitozis indeksi (%) ortalamaSD________________________________________________________Negatif kontrol 10.6 8.5 Pozitif kontrol 84.1 7.0Erdostein (150mg/kg) 19.4 9.8Asetilsistein (150mg/kg) 36.1 4.2¶________________________________________________________İstatistiksel analiz: negatif kontrol grubundan istatistiksel olarak farklı (¶ p<0.05) pozitif kontrol grubundan istatistiksel olarak farklı (p=0.000)

(B). BCL-2 ANALİZİ BULGULARI

LPS’İN LOKAL BCL-2 OLUŞUM SEVİYESİ ÜZERİNE ETKİSİ

______________________________________________Tedavi grubu Lokal bcl-2 oluşum seviyesi (%) OrtalamaSD__________________________________________________________Negatif kontrol 21.1 3.3 Pozitif kontrol 8.8 3.5

______________________________________________İstatistiksel analiz: Negatif kontrol grubundan istatistiksel olarak farklı( p=0.000)

LPS’in lokal bcl-2 oluşum seviyesi üzerine etkisi (x400)

Negatif kontrol grubu Pozitif kontrol grubu

TEDAVİ GRUPLARININ LOKAL BCL-2 OLUŞUM SEVİYESİ ÜZERİNE ETKİSİ

________________________________________________________

Tedavi grubu Lokal bcl-2 oluşum seviyesi (%)

ortalamaSD

________________________________________________________

Pozitif kontrol 8.8 3.5

Erdostein (150mg/kg) 43.8 12.2Asetilsistein (150mg/kg) 45.6 5.3

________________________________________________________İstatistiksel analiz: pozitif kontrol grubundan istatistiksel olarak farklı ( p=0.000)

(D). BAX ANALİZİ BULGULARI

LPS’İN LOKAL BAX OLUŞUM SEVİYESİ ÜZERİNE ETKİSİ

__________________________________________________Tedavi grubu Lokal bax oluşum seviyesi (%) ortalamaSD________________________________________________________Negatif kontrol 10.8 5.3 Pozitif kontrol 77.5 5.5

_____________________________________________İstatistiksel analiz: Negatif kontrol grubundan istatistiksel olarak farklı(p=0.000)

Lps’in lokal bax oluşum seviyesi üzerine etkisi (x400)

Negatif kontrol grubu Pozitif kontrol grubu

TEDAVİ GRUPLARININ LOKAL BAX OLUŞUM SEVİYESİ ÜZERİNE ETKİSİ

______________________________Tedavi grubu Lokal bax oluşum seviyesi (%)

ortalamaSD

_____________________________________________________

Pozitif kontrol 77.5 5.5

Erdostein (150mg/kg) 48.8 7.9 Asetilsistein (150mg/kg) 42.8 2.6

_________________________________İstatistiksel analiz: pozitif kontrol grubundan istatistiksel olarak farklı ( p=0.000)

(D). KASPAZ 3 ANALİZİ BULGULARI

LPS’İN LOKAL KASPAZ 3 OLUŞUM SEVİYESİ ÜZERİNE ETKİSİ

________________________________________________________Tedavi grubu Lokal kaspaz 3 oluşum seviyesi (%) ortalamaSD_______________________________________________________________Negatif kontrol 10.8 5.3 Pozitif kontrol 80.0 8.01 ________________________________________________________İstatistiksel analiz: Negatif kontrol grubundan istatistiksel olarak farklı(p=0.000)

Lps’in lokal kaspaz 3 oluşum seviyesi üzerine etkisi (x400)

Negatif kontrol grubu Pozitif kontrol grubu

TEDAVİ GRUPLARININ LOKAL KASPAZ 3 OLUŞUM SEVİYESİ ÜZERİNE ETKİSİ

__________________________________________________Tedavi grubu Lokal kaspaz 3 oluşum seviyesi (%) ortalamaSD________________________________________________________Pozitif kontrol 80.0 8.01 Erdostein (150mg/kg) 51.3 6.9 Asetilsistein (150mg/kg) 43.9 3.3 ________________________________________________________

İstatistiksel analiz: pozitif kontrol grubundan istatistiksel olarak farklı ( p=0.000)

SONUÇ Sonuç olarak,

Erdostein ve asetilsistein tedavisi, sepsisin neden olduğu

akciğer epitel hücre apopitozisi oranını önemli ölçüde azalttı.

Asetilsisteinin apopitozis regülasyonu üzerine etkisinin

erdosteinden daha zayıf olduğu bulundu.

Erdostein ve asetilsistein, lokal bax ve kaspaz-3 oluşum

seviyelerindeki artışı istatistiksel olarak önemli ölçüde azalttı

ve lokal bcl-2 seviyesindeki azalışı önemli ölçüde artırdı.