ria osnovi
DESCRIPTION
osnoviTRANSCRIPT
-
Radioimunoloke analizeprincipiProf.dr sc.med. Boris Ajdinovi
-
UvodRazvoj radioimunolokih metoda (RIA) vezano je za ime Jalou i Bersena (Yalow i Berson) 1960. godine, ije se metode baziraju na principu takmienja neobeleenog i radioizotopom obeleenog insulina na vezivna mesta antitela. Iste godine Ikins (Ekins) je postavio osnove radiosaturacionih metoda baziranog na principu kompeticije neobeleenog i obeleenog tiroksina na fizioloki transportni protein ovog hormona.
-
Dr. Rosalyn Yalow - prva ena dobitnica Nobelove nagrade- 1959
RIA- pretea modernih imunoeseja
-
Uvod
Radioimunoloke analize su mikroanalitike tehnike bazirane na principu reakcije (antigen-antitelo) izmeu bioloki aktivnih supstancija u telesnim tenostima i specifinih vezujuih proteina uz primenu radioaktivnih izotopa.
-
Prednosti radioimunolokih analiza:OSETLJIVOST- veoma male koliine ( koncentracije) mogu biti kvantifikovane
SPECIFINOST meri se koncentracija samo jedne supstance od mnogih koje se nalaze u uzorku
UPOTREBLJIVOST- veliki broj uzoraka moe biti obraen za kratko vreme
-
OSETLJIVOST Kocka eera u olimpijskom bazenuKoncentracija eera u vodi 5g/ 1 milion l vode ( 5 g / l )
Koncentracija T3 u serumu 1g / l
-
SPECIFINOST ANTIGEN-ANTITELO IMUNOLOKA REAKCIJAPrincip kljua
Vezivanje antigena i antitelaantiteloantigen
-
Zahtevi RIAProdukcija i karakterizacija antigena (analita koji treba da se odreuje) Obeleavanje antigena radioaktivnom substancomProdukcija specifinog antitelaRazvijanje RIA kompleta (eseja)
-
Principi kompetitivnih vezujuih radioimunoanaliza- radioimunoeseja
-
Kompetitivno vezivanjeDodavanje poznatog obeleenog AgDodavanje nepoznatog AgKompeticija jednog i drugog za vezujua mesta na molekulu AbSubpstanca koja nije reagovala se mora odvojitiNain obeleavanja poznatog Ag odrejuje i metod detekcije.
-
Kompetitivno vezivanje
-
Radioimmunoassay Competitive
-
Measurement of Circulating Hormone: RIA MethodExcess Labeled + No Unlabeled HormoneAntibodies saturated by excess labeled hormone; Equilibrium: unbound labeled + antibody bound labeled AFigure 2. Example of a radioimmunoassay
-
Measurement of Circulating Hormone: RIA MethodLabeled Hormone + Some Unlabeled Hormone BSmall amount of unlabeled displaces some labeled = labeled antibodyEquilibrium: unbound unlabeled + saturated labeled antibody some unlabeled boundFigure 2. Example of a radioimmunoassay
-
Measurement of Circulating Hormone: RIA MethodLabeled Hormone + Large Quantity of Unlabeled Hormone CLarge amount of unlabeled displaces most labeled = labeled antibodyEquilibrium: unbound unlabeled + saturated labeled antibody mostly unlabeled boundFigure 2. Example of a radioimmunoassay
-
Measurement of Circulating Hormone: RIA Displacement CurveNo unlabeled hormoneSmall amount unlabeled hormoneLarge amount unlabeled hormoneFigure 2. Example of a radioimmunoassay
-
Measurement of Circulating Hormone: RIA Standard CurvePercent labeled hormone (*H) bound to antibodyConcentration of total unlabeled hormoneStandard curve: *H-antibodyknown unlabeled [hormone] vs measured labeled boundXX = measured for patient sampleFigure 3. Standard curve for evaluation of blood [hormone] by RIA
-
Produkcija i obeleavanje Antigena- analita-substance koja se odreuje Produkcija AntigenaSinteza molekula Izolovanje iz prirodnih izvora
Obeleavanje antigena 3 H 14 C 125 I kao obeleivai
NE SME se naruiti specifinost antigena kao ni aktivnost antigena!
-
Pripremanje specifinog antitelaintradermalno injektovanje antigena zeevima ili zamorcima produkcija antitelaAntitela izdvojena iz seruma Neki analiti su slabo antigeni- te se konjugiraju sa haptenima Hormoni , Steroidi, lekovi HAPTENI : Gastrin, Morphine, Hapteni conjugovani za albumin antigeni
-
Radioimunoloka- RIA -metodaSadraj kompleta:boica sa radioaktivno obeleenim Ag (I-125-Tg);boica sa Ab (oviji anti - Tg antiserum);standardi (tano odreene koncentracije Tg);3% rastvor PEG;kontrolni serum.
-
Pregled postupaka radioimunolokih analizapriprema analitikih uzoraka (ukoliko je potrebna) - deproteinizacija, izdvajanje proteinskih analoga, preiavanjepravljenje standardnih rastvora za kalibracionu mernu krivuformiranje saturacionog sistema (inkubacija i uspostavljanje ekvilibrijuma)izdvajanje slobodne /F/ od za proteine vezane /B/ frakcijemerenje aktivnosi reakcije /B ili F/
-
Principi i postupci u toku RIA analize;inkubacija (duina trajanja i uslovi predloeni od strane proizvoaa)
dodavanje sredstva za taloenje (PEG)
centrifugiranje
Aspiriranje
merenje radioaktivnosti u vezanom kompleksu u gamascintilacionom brojau;
koliina izmerene radioaktivnosti obrnuto je proporcionalna koncentraciji hormona u serumu.
-
Radioimmunassay
-
Princip testa
-
Princip testa/ RIA
-
RIA- standardna kriva
-
Tanost rezultata radioimunolokih analiza
-
Tanost rezultata radioimunolokih analiza
-
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent AssayPrincip: Bazira na imunoj reakciji kao RIAOd RIA se razlikuje po metodi detekcijeDetekcija se bazira naEnzim katalizatorskoj reakcijiFluorescentnoj probiNEMA RADIOAKTIVNOSTI (PREDNOST)
-
ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)
PRINCIP: Detekcija antigena ili antitela antitelima koja su obeleena razliitim enzimima.
ENZIMI: Alkalna fosfataza Peroksidaza -galaktozidazaHromogeni supstrat - bezbojni supstrat kojiregauje sa enzimom
STOP reagens zaustavlja enzimsku reakciju(najee neka kiselina)ELISA reader
-
ELISA
Klasifikacija Heterogena potrebno odvajanje reaktanataHomogena nema odvajanja
Dva tipa: Kompetitivna kompeticija poznatog I nepoznatogNekompetitivna reaguje samo nepoznato
-
ELISA nekompetitivni Sandwich Assay Antigen merni sistemEpruvete obloene odgovarajuim antitelom Dodavanje uzorka krvi sa AgInkubacija do zavretka reakcije Ag-AbIspiranje odvajanje nevezanog antigenaDodavanje Antitela obeleenog EnzimomIncubacija dok se l antigen ne vee za obeleeno antiteloIspiranje odvajanje nevezanog antitelaDodavanje substrata ; inkubacijaEnzyme + Substrate Produkt merenje boje Boja proporcionalna antigenu u uzorku seruma pacijenta
-
Sandwich Technique ELISA
-
ELISA- kompetitivni esej Kompeticija nepoznatog Ag sa obeleenim poznatim AgEnzimi izazivaju kolor reakciju
-
PRIMENA IMUNOESEJA [RIA & ELISA] Analiza hormona, vitamina, metabolita, tumorskih markera ACTH, FSH, T3, T4, Glucagon, Insulin, Testosteron, vitamin B12, prostaglandini, glukokortikoidi, Praenje koncentracije uneenih lekova: Barbiturati, morfin , digoxin, Diagnostika procedura za otkrivanje infekcije HIV, Hepatitis A, B, itd.
-
IRMA Imunoradiometrijski esej) _ Princip testakvantitativno odreivanje hormona ili neke druge supstance;sendvi metoda reakcija vezivanja supstance iz seruma sa Mo-At vezanim za dno epruvete i sa Mo-At koja su obeleena radioaktivnim izotopom I-125;inkubacija (vreme trajanja i uslovi predloeni od strane proizvoaa);aspiriranje i ispiranje (broj aspiririranja predloen od strane proizvoaa);merenje radioaktivnosti u gamascintilacionom brojau;koliina izmerene radioaktivnosti direktno je proporcionalna koncentraciji hormona u serumu.
-
IRMA Imunoradiometric assay ) Nekompetitivna ili Sendvi analiza
-
ImunoradiometrijskaIRMA - metodaSadraj kompleta:boica sa radioaktivno obeleenim Mo-Ab I-125;epruvete sa vezanim Mo-Ab;standardi (tano odreene koncentracije);rastvor za ispiranje;kontrolni serum.
-
Princip testa
-
IRMA- standardna kriva
-
Imunoloki radioimunieseji
-
Fluorescence Immunoassay
-
Markeri Fluoroforni ili fluorohromniSposobnost apsorpcije energije i emitovanja svetlostiNajee u upotrebi :Fluorescein zelenaTetramethylrhodamine crvena
-
Fluorescencija
-
Fluorescent Immunoassay
Direktna imunofluorescencijaMarkirano antitelo dodaje se nepoznatom antigenu fiksiranom na stripIndirektna imunofluorescencijaPacientov plus poznati fiksirani antigenDodavanje markiranog anti-antitelaFluorescencija
-
DELFIA METODA (Dissociation Enhanced Lanthanide Fluoroimmuno Assay)Sadraj kompletaboica sa hormon- Eu-tracer;antiserum za hormon koji se odreuje;stripovi sa Po-At;standardi (tano odreene koncentracije);rastvor za ispiranje;boica sa rastvorom za izdvajanje Europijuma.
-
Princip testakvantitativno odreivanje;kompetitivno vezivanje serumskog hormona i Europijumom obeleenog hormona za poliklonalana anti-hormonska At koja su vezana za dno epruvete;inkubacija;ispiranje;dodavanje rastvora za izdvajanje Europijuma;merenje jaine fluorescentnog signala;jaina fluorescentnog signala je obrnuto proporcionalna koncentraciji hormona u serumu.
-
Princip testa/ DELFIA
-
Radioligandni eseji
metodaVezujui proteinAfinitet (l/ mol)Klinika primenaRIA
CPBA(competitivni protein vezujuci esej)
RRARadioreceptorski esejAntitelo
Plazma ili tkivno vezujuci proteini
elijski receptori hormona 109- 1011
108- 109
108-109Hormoni
Vit B12, folna kiselina stariT4
autoantitela
*****