Richard Prù�aRichard Prù�a

Ústav klinické biochemie a patobiochemie2. lékaøské fakulty UK

.

Základy analytických

metod v klinické molekulární biologii

Richard Prù�a

Praha 1997

Základy analytických metod v klinické molekulární biologii

Autor: © Doc. MUDr. Richard Průša, CSc.

Vydala 2. lékařská fakulta UK a LAMBDA BIO−MED spol. s r. o., Praha 1997

Sazba a layout: Radovan Šupej, SupRa Design

Tato publikace vznikla za podpory grantu IGA MZ ČR č. 2897−3.

První vydání.

ISBN 80−238−0940−7

5

Obsah

Úvod . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

Izolace a purifikace nukleových kyselin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

RFLP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

Hybridizační metody . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

Reverzní transkripce. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

Amplifikační metody . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

Elektroforetické metody . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

Metody detekce . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

Sekvenování nukleových kyselin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

PTT test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

Nové metody . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

Použitá literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

Doporučená literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

6

7

Úvod

Vyšetřování iontů a substrátů v biologickém materiálu bylo následováno

velkým rozvojem proteinové a enzymové diagnostiky. V současnosti jsme

svědky expanze DNA a RNA diagnostiky a rozsáhlých možností její aplika−

ce v humánní a veterinární medicíně. Nejen lepší porozumění podstatě one−

mocnění, ale také převratné diagnostické a terapeutické důsledky jsou

výsledkem aplikace technik molekulární biologie v diagnostice infekčních

virových, bakteriálních, mykotických a parazitárních onemocnění, v prena−

tální a postnatální diagnostice dědičných chorob s mendelovskou i nemen−

delovskou dědičností, v diagnostice nádorových chorob a v identifikaci

(DNA typizaci) osob pro účely transplantační nebo forenzní. DNA a RNA

diagnostika vyžaduje nový způsob myšlení i práce. Schopnost detekovat

několik málo molekul sledované látky patřila vždy ke snům a cílům chemi−

ků analytiků. Dnes je možné měřit několik kopií některé DNA sekvence lid−

ského genomu amplifikací například pomocí PCR. I pro ty, kteří pracovali

s velmi citlivými metodami a měřili množství v pikomolech a attomolech

(10−18 mol, tj. 602 252 molekul), jsou chemické testy pro nukleové kyseliny

skokem v analytickém myšlení ve smyslu množství. Jedná se o překlenutí

propasti mezi attomoly a dvěma molekulami. Pro tyto účely byly zavedeny

dvě nové jednotky pojmenované zeptomol (10−21 mol) a yoctomol

(10−24 mol). Samozřejmě, že neexistuje 1 yoctomol, protože sama

Avogadrova konstanta je 6,023 x 1023

, takže 1 molekula má hodnotu

1,7 yoctomol. Právě tyto jednotky jsou potřebné pro rozsah měření používa−

ný při PCR. Byl také vytvořen termín PCR mentalita popisující nutnou

změnu ve stylu myšlení při práci v oblasti analytiky nukleových kyselin.

PCR je proces, kdy z několika málo kopií jedné molekuly (sekvence

nukleotidů) získáme milion i více násobek. Příprava vzorku je kritickým

bodem. Je nutno zajistit, aby amplifikovaná molekula byla právě jen ta sle−

8

dovaná a nikoliv jiná, zavlečená do reakce náhodně. Opakovatelnost a kon−

trola kvality (positivní a negativní kontroly) jsou základními podmínkami

DNA a RNA analýzy.

Od roku 1869, kdy Miescher poprvé izoloval nukleovou kyselinu z bí−

lých krvinek obsažených v hnisu, dosáhla biochemie supramolekulárních lá−

tek mimořádného pokroku. Nukleové kyseliny představují molekuly, které

se stávají důležitým cílem laboratorní analýzy. Z tohoto důvodu klinické

(servisní a výzkumné) laboratoře potřebují jednoduché a spolehlivé analy−

tické metody.

Analytické postupy v molekulární biologii obecně používají metody

centrifugační, metody extrakce a purifikace DNA (RNA), elektroforetické,

hybridizační a amplifikační metody. Tyto metody se v praxi vzájemně

překrývají. Nástrojem těchto metod jsou enzymy, jejichž biologické funkce

jsou použity pro specifické reakce in vitro (orientačně viz tabulka na násle−

dující straně). Základní zvláštní přístrojové vybavení klinické molekulárně

biologické laboratoře tvoří např. chlazená centrifuga, termocyklery, termo−

stat, vany pro horizontální agarosovou a vertikální polyakrylamidovou elek−

troforézu, zdroj napětí, UV transiluminátor, fotografická kamera, hybridi−

zační pece, sušička gelů, izotopové pracoviště.

9

Enzymy běžně používané v molekulárně biologické laboratoři

10

Izolace a purifikace nukleových kyselin

Principy izolace DNA vycházejí z chemických vlastností deoxyribo−

nukleové kyseliny: 1. fosfátové estery jsou silné kyseliny a chovají se jako

anionty při neutrálním pH, 2. DNA se snadno precipituje alkoholem, 3. base

jsou jen slabě basické a bez náboje, 4. vodíkové vazby mezi skupinami −NH2

a −OH jsou stabilní od pH 4 do pH 9, 5. nukleové kyseliny mají maximum

absorpce UV světla při 260 nm, jednovláknová DNA dává o 20 − 30% větší

absorbanci než dvouvláknová, 6. DNA je mimořádně stabilní molekula

a zaujímá obvykle konformace A, B, C nebo Z.

K extrakci a purifikaci DNA z leukocytů (0.5 − 20 ml plné krve

s 5 mmol/l K2−EDTA), amniových buněk a choriových klků se používá směs

chloroform−fenol s proteinasou K, guanidinhydrochlorid s proteinasou K,

chloroform s chloristanem sodným v silikonové suspenzi a mnoho dalších.

Odběr choriových klků se považuje za bezpečný od 10. týdne gravidity dále

(časnější odběry nesou riziko amputací končetin plodu).

Pro rutinní praxi klinické laboratoře (pro univerzální potřeby analytické

a pro archivní potřeby − uchovávání vzorků v DNA bance) je vhodnou me−

todou k izolaci DNA metoda s guanidinhydrochloridem (Sambrook et al.,

1989; Shibata et al., 1994). Pro účely polymerázové řetězové reakce je mož−

no použít následující alternativní zdroje DNA pro její extrakci: a) izolace

DNA z krevního odběru na novorozenecký screening fenylketonurie,

b) izolace DNA ze vzorku buněk bukální sliznice získaných výplachem úst,

c) izolace DNA z buněk vlasových kořínků. Vzorky žilní krve odebrané do

zkumavek s K2−EDTA uzavřeného systému by měly být zmraženy nejpo−

zději do 3 hodin po odběru a skladovány při teplotě −70 °C.

Metoda izolace DNA s guanidinhydrochloridem je založena na následu−

jícím postupu (Průša et al., 1996): hemolýza vodou, centrifugace k získání

11

leukocytů, cytolýza pomocí detergentu, centrifugace k získání jader, homo−

genizace peletu s guanidinhydrochloridem vychlazeným na 4 až 6 °C a

s octanem amonným na třepačce, lýza jader pomocí dodecylsulfátu sodného

a deproteinace proteinasou K, inkubace při 37 °C nebo 57 °C, precipitace

ethanolem, solubilizace v 1 ml TE pufru, reprecipitace, kontrola koncentra−

ce a čistoty. Iminomočovinové (guanidinové) soli jsou velmi silné chaotrop−

ní látky a působí jako denaturační činidla mimořádně účinně (Zolfaghari et

al., 1993). Chemicky se jedná o aminomethanamidinhydrochlorid, o relativ−

ní molekulové hmotnosti 95.53, [HN=C=(NH2).HCl].

Izolace RNA se provádí ultracentrifugací v prostředí CsCl po destrukci

buněčných membrán guanidin thiokyanátem. RNA vytvoří pelet, DNA

a proteiny zůstanou nad vrstvou CsCl. Jinou metodou je extrakce guanidin

thiokyanátem s fenolem v prostředí nízkého pH. Existuje řada komerčních

kitů, některé jsou založeny na využití polyadeninového řetězce mRNA.

Etanolový precipitát RNA se uchovává při −20 °C, vodný roztok při −70 °C.

Izolovaná neporušená celková RNA dává při kontrole elektroforetickou

separací v agarosovém gelu dva pruhy: 28S rRNA a 18S rRNA.

Měření koncentrace a čistoty získaného vzorku DNA a RNA.

V běžné praxi se používají dvě metody. Jestliže je vzorek čistý, tj. neob−

sahuje významné množství nečistot jako jsou bílkoviny, fenol, agarosa, pak

spektrofotometrické měření v UV světle je jednoduché a přesné. Jestliže je

množství DNA nebo RNA velmi malé (<25 mg/l) nebo vzorek obsahuje vý−

znamné množství nečistot, pak koncentrace nukleových kyselin může být

zjištěna z intenzity fluorescence emitované ethidiumbromidem srovnáním se

vzestupnou řadou standardních vzorků DNA o koncentraci od 0,5 − 50 mg/l.

Touto metodou je možno zjistit tak malé množství jako je 1 − 5 ng DNA. Při

spektrofotometrickém měření se vzorek nejprve naředí destilovanou vodou.

Měří se při vlnových délkách 260 a 280 nm. To umožní hodnocení čistoty

vzorku, očekávané poměry jsou 1.8 pro DNA a 2.0 pro RNA. Poměr

12

absorbancí 260/280 menší než 1,75 svědčí pro obsah kontaminujících bílko−

vin. V případě vyššího obsahu nečistot se provede reprecipitace vzorku.

Optická hustota 1 odpovídá přibližně 50 mg/l pro ds−DNA, 40 mg/l pro

ss−DNA a RNA, 20 mg/l pro oligonukleotidy. Dále by měla následovat kon−

trola celistvosti získané DNA elektroforézou a fotografií gelu na UV trans−

iluminátoru (0,8% agaróza, 100 V, asi 1 hodinu) po obarvení ethidiumbro−

midem. Výtěžek DNA z 5 ml krve činí obvykle 150 − 600 mg/l.

K automatizaci provozu klinické molekulárně genetické laboratoře byly

vyvinuty komerční kity pro izolaci DNA (RNA) a jednoduché UV spektro−

fotometry pro kvantifikaci oligonukleotidů, RNA a DNA s automatickou

kalkulací. Od roku 1987 je možno provádět izolaci DNA pomocí automatic−

kého extraktoru nukleových kyselin. Jsou to například přístroje jedné ame−

rické firmy, jejichž automaty používají metodu chloroform−fenolové extrak−

ce s proteinasou K.

RFLP (délkový polymorfismus restrikčních fragmentů)

Restrikční analýza DNA je metodou charakterizace DNA pomocí jejího

štěpení restrikčními endonukleasami na fragmenty. Identifikace a analýza

produktů štěpení se provádí elektroforetickým dělením. Je známo velké

množství bakteriálních restrikčních endonukleas (asi 1500), které se liší od

sebe tím, že rozpoznávají různé krátké sekvence nukleotidů − 4, 6, 8 a že

štěpí DNA na různě dlouhé fragmenty podle individuálního pořadí bazí

a podle rozpoznané sekvence. Za daných podmínek vzniká reprodukovatel−

ný počet restrikčních fragmentů o určité opět reprodukovatelné délce

(= počtu bazí). Počet i délka fragmentů je pro daného jedince specifická.

Některé restrikční endonukleasy jsou citlivé na methylaci DNA. V některých

případech methylace adeninu a methylace cytosinu inhibují štěpení, v jiných

je methylace pro štěpení nezbytná. Odlišení různých DNA se provádí na

13

základě polymorfismu délky štěpných úseků. Tento polymorfismus vzniká

na základě přítomnosti nebo nepřítomnosti rozpoznávacích a štěpných míst.

Obecně restrikční endonukleasy, které rozpoznávají kratší sekvenci, štěpí

DNA častěji na menší úseky, zatímco restrikční endonukleasy rozpoznávají−

cí delší sekvenci štěpí méně často a na delší fragmenty. Při neúplném (par−

ciálním) štěpení DNA vlivem nevhodných reakčních podmínek vznikají del−

ší úseky (například velký obsah bílkovin, nevhodná teplota, nedostatečná

doba). Hvězdičkové štěpení (tzv. „star“ aktivita enzymu) je způsobeno

nespecifickým štěpením mimo rozpoznávací místa. Vzniká tak mnoho krát−

kých úseků. Tento analyticky nepříznivý stav může být způsoben například

nadbytkem glycerolu v reakci. Proto nelze zvyšovat koncentraci restrikční−

ho enzymu v reakci zvyšováním použitého objemu, ale použitím stejného

objemu enzymu ze zásoby o vyšší koncentraci.

Příklady restrikčních endonukleas a jejich specifických restrikčních míst:

MwoI (Methanobacterium wolfei), inkubační teplota = 60 °C:

↓5´....GCNNNNN.NNGC....3´

3´....CGNN.NNNNNCG....5´

↑

DdeI (Desulfovibrio desulfuricans), inkubační teplota = 37 °C:

↓5´....C.TNAG...3´

3´....GANT.C...5´

↑

HaeIII (Haemophilus aegyptius), inkubační teplota = 37 °C:

↓5´....GG.CC...3´

3´....CC.GG....5´

↑

14

Znalost restrikčních endonukleas citlivých na methylaci (např. enzymy

HpaII a EagI štěpí pouze nemethylovanou DNA) má široké uplatnění napří−

klad v X−inaktivačních studiích pro diagnostiku aktivního a neaktivního

chromozomu X u řady onemocnění (např. Wiskottův − Aldrichův syndrom,

mukopolysacharidosa typu II). Klinický význam má studium náhodné a

nenáhodné inaktivace v různých buněčných populacích. Test se provádí ve

dvou reakcích.

Kromě RFLP se pro DNA diagnostiku a pro studium příbuzenských

vztahů (například průkaz otcovství) hojně využívá polymorfismu repetitiv−

ních úseků DNA − VNTR (variabilní počet tandemových opakování). Tak

například pro chromozom X se používá sondy M27 beta (EcoRI, MspI, PstI),

pro chromozom 15 sondy CMS620 (HinfI), CMW−1 (TaqI), pro chromozom

7 sondy MS31 (HinfI).

Zatímco při RFLP jsou jednotlivé alely charakterizovány velikostí získa−

ných fragmentů v závislosti na přítomnosti variabilního restrikčního místa,

při VNTR jsou jednotlivé alely charakterizovány buď velikostí fragmentu

v závislosti na počtu repetic nebo intenzitou (množstvím) při štěpení, které

oddělí jednotlivé repetice.

Princip RFLP (Cílová DNA obou chromosomů 1 a 2 je štěpena

restrikční endonukleasou v pravidelném restrikčním místě aa variabilním místě á.)

Obraz na gelu po elektroforetické separaci:

15

Princip VNTR (Cílová DNA je štěpena podle počtu opakování dané

sekvence restrikční endonukleasou v místě a za vniku dvou různě dlou−

hých fragmentů nebo jinou restrikční endonukleasou v místě b za vzni−

ku odlišné intensity proužku.)

Obraz na gelu po elektroforetické separaci:

Hybridizaèní metody

Významnou metodou je hybridizace získaných fragmentů DNA s jinou

molekulou DNA − komplementární a značenou sondou. Hybridizace se

provádí na pevných nosičích, na kterých je polynukleotid vázán a je součas−

ně schopen hybridizace, přestože kinetika této reakce je pomalá a relativně

málo efektivní. Mezi varianty hybridizace na pevném nosiči patří dot, blot

a slot hybridizace, Southernův přenos, hybridizace RNA (northern blotting)

a hybridizace in situ. Imobilizace vzorků se provádí nejčastěji na membrány

z nitrátu celulosy nebo nylonu. Přenosu DNA na pevný nosič předchází

depurinace, alkalická denaturace a neutralizace. Přenos se uskuteční buď

prostou difuzí na podkladě kapilárních sil nebo za pomoci vakua nebo půso−

bením elektrického proudu (electroblotting). Malé fragmenty (do 1500 bp)

se přenesou na membránu při použití difuze kapilární silou do 2 hodin,

větší fragmenty (nad 15 kb) vyžadují i více než 15 hodin. Permanentní fixa−

16

ce na membránu se docílí např. působením UV světla. Vlastní hybridizace

znamená reasociaci příslušných dvojic bazí podle specifického pořadí nuk−

leotidů se sondou značenou radioaktivním nebo neradioaktivním markerem.

Jde buď o úseky DNA (dvou nebo jednovláknové) klonované pomocí bakte−

riálního vektoru nebo syntetické oligonukleotidy. Méně často se používají

tzv. ribosondy (cRNA). Senzitivita hybridizace závisí na čtyřech hlavních

faktorech: délce (počtu bazí) a komplementaritě sondy, koncentraci sondy

(a potlačení nespecifických vazeb), specifické aktivitě sondy dané aktivitou

(koncentrací) navázaného markeru, koncentraci testované DNA přenesené

a fixované na membráně. Potlačení nespecifických vazeb (např. prehybridi−

zací se sonifikovanou lososí spermatickou DNA nebo prehybridizací sondy

se sonifikovanou lidskou DNA) dovoluje vyšší koncentraci sondy při dodr−

žení hybridizačních podmínek − teploty, koncentrace solí aj. Reakční směs a

kinetika hybridizační reakce jsou stanoveny obvykle empiricky. Po hybridi−

zační reakci ve speciálním inkubátoru s termostatem následuje vymývání

pufrem SSC o různé koncentraci (1 x SSC: 0.15 mol/l NaCl, 0.015 mol/l

citrát trojsodný).

Dot, blot a slot hybridizace. Názvy jsou odvozeny od tvaru jednotlivých

vzorků nanesených na membránu: dot − velmi pravidelný okrouhlý tvar, slot

− velmi pravidelný protáhlý tvar, blot − ručně nanesený vzorek více méně ná−

hodného tvaru. Reverzní blotting spočívá v tom, že na membránu je naopak

nejprve fixována sonda a potom teprve hybridozována s DNA z vlastního

zkoumaného vzorku.

Southernův přenos a hybridizace RNA (northern blotting). Tyto me−

tody jsou zvláštní tím, že přenosu fragmentů DNA nebo RNA na membránu

a následné hybridizaci předchází elektroforetické rozdělení. Elektroforetické

separaci obvykle ještě předchází štěpení restrikční endonukleasou. Tato

metoda dává dvojí informaci: interpretuje po vizualizaci proužků např. auto−

radiograficky nebo kolorimetricky jednak přítomnost a jednak velikost

nukleové kyseliny, která hybridizovala s aplikovanou specifickou sondou.

Northern blotting a hybridizace se používají nejčastěji k hodnocení úrovně

genové exprese konkrétních mRNA, a proto kvantifikace nebo semikvanti−

17

fikace se provádí k referenční kontrolní hybridizační sondě (např. aktin).

In situ hybridizace. Tato metoda je založena na tom, že hybridizace pro−

bíhá v morfologicky intaktní tkáni, v buňkách nebo na chromozomech, kte−

ré jsou fixovány na mikroskopickém sklíčku. Demonstruje se genetická

informace v morfologickém kontextu a metoda sdružuje standardní světel−

nou mikroskopii s detekcí hybridizace. Hybridizaci se značenou sondou mů−

že předcházet amplifikační reakce (nepřímá in situ PCR). Přímá in situ PCR

inkorporuje marker vázaný na oligonukleotidový primer nebo na dNTP

přímo. Následuje obvykle detekce protilátkou a vizualizace. Celý proces

může být automatizován. Příkladem je metoda FISH (fluorescenční in situ

hybridizace). Velmi speciální metodou je analogicky přímá a nepřímá

in situ RT−PCR (reverzní transkripce a amplifikace cDNA), která využívá

vlastností rekombinantní rTth DNA polymerasy.

Reverzní transkripce

Detekce a analýza molekul RNA patří k důležitým molekulárně biolo−

gickým postupům. Molekuly mRNA se podílejí pouze 1 − 2% na celkovém

množství izolované RNA (převážnou část tvoří rRNA). Adaptace amplifi−

kačních technik umožňují relativně snadnou analýzu mRNA tím, že po re−

verzní transkripci následuje amplifikace cDNA např. pomocí PCR. RT−PCRje velmi hodnotná metoda k analýze genové exprese, k detekci infekčních

agens, k detekci genetických nemocí (eliminují se introny, poskytuje infor−

mace o alternativním sestřihu). Mezi používané reversní transkriptasy patří

MLV, AMV, Tth. Reversní transkriptasy M−MuLV (z Moloneyho myšího

leukemického viru) a AMV (z ptačího myeloblastického viru) jsou schopny

syntetizovat cDNA až do 10 kb, zatímco bakteriální termostabilní Tth DNA

polymerasa jen do 2 kb. Reversní transkriptasa Tth na rozdíl od dvou před−

chozích nemá aktivitu RNasy H a vyžaduje navíc Mn+2 kationty v reakci.

18

Optimální reakční teploty se liší: M−MuLV = 37 °C, AMV = 42 °C,

Tth = 65 °C. Používají se tři typy primerů: specifické oligonukleotidy pro

syntézu vybrané určité mRNA, směs náhodných hexanukleotidů

a oligo(dT)12−18. Schopnost uskutečnit reversní transkripci a PCR v jedné re−

akci a v jedné zkumavce je jedinečnou výhodou enzymu Tth, protože se pod−

statně snižuje riziko kontaminace a celá procedura se zjednodušuje.

Amplifikaèní metody

1) Polymerázová řetězová reakce (PCR)

PCR byla vyvinuta v Cetus Corporation v Emeryville v Kalifornii. Jedná

se o enzymatickou amplifikaci DNA in vitro syntézou mnoha kopií vybrané

sekvence DNA v cyklické reakci o třech teplotních fázích (Saiki et al., 1988;

Schutzbank et al., 1993; White et al., 1992). Dvouvláknová DNA je nejprve

denaturována na dvě jednovláknové templátové (matricové) molekuly DNA.

Nukleotidová sekvence cílové DNA nemusí být známa, ale musí být známé

alespoň sekvence krátkých úseků na obou koncích cílové amplifikované

DNA. Oligonukleotidové sondy (primery), které hybridizují na obou stra−

nách cílové DNA, řídí syntézu nových vláken. Jejich syntézu katalyzuje ter−

mostabilní DNA polymeráza (například Taq z bakterie Thermus aquaticus)

od 5’ konce ke 3’ konci vždy začínající od primerů. Během prvního cyklu

syntéza nového vlákna pokračuje dále až za sledovanou sekvenci, ale

následné cykly již amplifikují převážně pouze úsek mezi dvěma vybranými

sondami (primery). Některé termostabilní DNA polymerasy (případně jejich

kombinace v reakci) umožňují amplifikaci fragmentů až 5000 bp, jiné

uměle upravené se aktivují až při působení teploty 95 °C po dobu 10 minut.

19

Přehled termostabilních DNA polymeras a jejich charakteristika

podle exonukleasové aktivity:

Reakční podmínky:

l Reakční objem je obvykle mezi 20 a 100 ul.

l Množství templátové DNA potřebné pro PCR je mezi 1.0 a 500.0 ng.

l Oligonukleotidové primery jsou syntetizovány tak, aby hybridizovaly

s komplementární sekvencí na obou vláknech dubletu DNA; jsou obvykle

20 − 30 nukleotidů dlouhé. Potřebné množství každého pro jednu reakci je

25 − 50 pmol. Jejich optimální koncentrace v reakci je mezi 0.1 až 1.0

µmol/l. GC:AT poměr byl měl být 1:1. Primer by neměl obsahovat oblasti

bohaté na AT a GC. Primery by neměly být mezi sebou komplementární, ze−

jména ne na 3’ konci, kde překrytí dvou nebo tří basí může způsobit vznik

20

dimeru primerů, zejména při nadbytku primeru. Může tak vzniknout nežá−

doucí produkt PCR, např. z 2x20 bp primerů se amplifikuje 40 bp fragment.

Někdy vznikají problémy se sekundární strukturou, zejména u primerů bo−

hatých na GC. V tom případě jsou vhodné primery delší, např. 25 − 30 bp.

Výpočet 50 pmol oligoprimeru se provádí podle vzorce:

Y µl primeru = 50 pmol/Z,

kde Z (x10−6

mol/l) = 1/X x Abs(260nm) x Dil.f.,

kde X = Axn + Cxn + Txn + Gxn, kde koeficienty nukleotidů jsou:

A=15200, C=7050, T=8400, G=12010, n je počet příslušného nukleotidu

v sekvenci primeru, Abs je optická hustota oligonukleotidového primeru

v UV světle při 260 nm a Dil.f. je diluční faktor.

l dNTP, deoxynukleotidtrifosfáty, optimálně 200 µmol/l každý, toleranční

rozpětí 20 až 400 µmol/l.

l Mg+2, optimálně 4 mmol/l, toleranční rozpětí 0.5 − 8 mmol/l, vyšší kon−

centrace snižují specificitu, ale u primerů bohatých na GC je vyšší

koncentrace lepší. Závisí také na použité metodě izolace DNA.

l Taq DNA polymerasa, optimálně 1 − 2 U pro každou reakci, toleranční

rozpětí 0.5 − 5 U, vyšší koncentrace zvyšuje pravděpodobnost amplifikace

chybně hybridizovaných primerů (pozadí). Porfyriny, heparin, methanol

a detergenty inhibují její aktivitu.

l PCR pufr obsahuje 10 − 50 µmol/l Tris−HCl, maximálně 50 µmol/l KCl,

případně acetamid, albumin, želatinu nebo Tween−20.

Teplotní fáze reakčního cyklu:

a) denaturace optimálně při 95 °C, toleranční rozpětí 92 − 98 °C,

pro fragmenty do 1 kb 15 sekund, pro větší fragmenty 0.5 − 1.0 minutu,

b) hybridizace optimálně podle denaturační teploty duplexu templátové

DNA s primerem minus 12, obvykle mezi 50°C a 55°C, nízká teplota

podstatně snižuje specifitu, vysoká teplota zamezí amplifikaci,

c) syntéza obvykle mezi 70°C a 74°C, pro fragmenty do 1 kb 0.5 − 1.0

21

minuta, pro úseky 6 − 10 kb je potřebná doba až 15 minut, pro primery

bohaté na obsah GC je někdy vhodná teplota 80°C.

Počet cyklů se obvykle pohybuje v rozmezí 15 − 30. Každá reakce s tes−

tovaným vzorkem musí mít positivní kontrolu, slepou (negativní kontrolu)

a interní kontrolu probíhající amplifikace.

Významnou inhibici PCR způsobují erytrocyty (například primárně

hemolyzovaná krev). Takový vzorek vyžaduje odstranění inhibitorů nebo

jejich neutralizaci. Jednoduchá metoda je založena na využití iontoměničo−

vé pryskyřice (např. kopolymer styren−divinylbenzenu) Chelex 100, která

váže dvojmocné ionty (Miffin et al., 1994; Shibata et al., 1994).

Princip polymerázové řetězové reakce (tři fáze 1. cyklu)

22

Zkušenosti s PCR poukázaly na nutnost zavedení technik, které minima−

lizují kontaminaci amplikonem (produktem PCR). V praxi je běžné použí−

vat negativní kontrolu a slepou (reakční směs bez cílové DNA). Jedna pre−

ventivní metoda k zabránění kontaminace je založena na využití dUTP mís−

to dTTP v reakční směsi PCR. Bakteriální enzym uracil−N−glykosylasa de−

graduje DNA obsahující uracil. Jenom fragmenty DNA pocházející z PCR

budou degradovány, protože normální DNA uracil neobsahuje. Uracil−N−

glykosylasa je přidána do reakční směsi před zahájením amplifikační reak−

ce, aby všechny případné amplikony byly včas degradovány. Samotný en−

zym je pak inaktivován při prvním denaturačním cyklu, takže nové produk−

ty PCR se již mohou akumulovat v reakční směsi. Jiná metoda je založena

na přidání derivátu psoralenu do směsi na začátku reakce. Psoralen neinter−

feruje s amplifikací a je stabilní během teplotních cyklů. Zkumavky jsou po

ukončení reakce ještě před otevřením vystaveny UV světlu. Interakce mezi

formami isopsoralenu a pyrimidiny neovlivňuje hybridizaci, ale zabraňuje

následné amplifikaci DNA polymerasou. Další běžnou metodou je používá−

ní speciálních pipet a pipetovacích špiček s filtrem.

Rozsáhlé diagnostické využití repetitivních sekvencí DNA je umožněno

aplikacemi PCR metod, např. AFLP (délkový polymorfismus amplifikova−

ných fragmentů). Repetitivní sekvence jsou označované podle svých speci−

fik jako VNTR (variable number of tandem repeats), STR (short tandem

repeats), (CA)n, mikrosatelity (Epplen, 1992). V lidském genomu je přibliž−

ně 50000 − 100000 (dC−dA)n.(dG−dT)n. Jedná se o podskupinu STR, běžně

označovanou (CA)n. Využívají se např. v diagnostice příbuzenských vztahů,

delecí genů nebo ztráty heterozygocie.

„Nested“ PCR. Amplifikuje se nejprve úsek, kde templátem je

genomická DNA. Následuje další PCR zv. „nested“ reakce, kde templátem

je produkt reakce předcházející. Pro první reakci se použije první sada

oligonukleotidů, v druhé, „nested“ reakci se použijí oligonukleotidy, které

jsou navrženy pro fragment získaný jako produkt první PCR. Tato oblíbená

modifikace má řadu aplikací, některé vystačí se sadou pouhých tří primerů.

23

Analýza heteroduplexů se používá k detekci mutací genetických

onemocnění stále častěji. Metoda je jednoduchá a citlivá. Principem metody

je skutečnost, že heteroduplexy, které se tvoří po amplifikaci u heterozygo−

tů, migrují v agarosovém gelu pomaleji než homoduplexy. Když amplifiko−

vané fragmenty ze dvou odlišných alel (mutace, polymorfismus) spolu hyb−

ridizují, vytvářejí dva homoduplexy a dva typy heteroduplexů. Za vhodných

hybridizačních podmínek vznikají všechny čtyři druhy duplexů v ekvimo−

lárním poměru. Detekce separovaných fragmentů v gelu se provádí barve−

ním ethidiumbromidem nebo stříbrem. V některých případech se využívá

tzv. generátoru heteroduplexů, tj. molekuly DNA upravené mutagenesou.

Asymetrická PCR je modifikace PCR, která umožňuje preferenční

syntézu jenom jednoho vlákna z duplexu DNA tím, že jeden z primerů je

v nadbytku. Jako produkt PCR tak vzniká jednovláknová DNA vhodná

např. pro sekvenování. Jinou modifikací je SSPR (single strand producing

reaction), která je ještě specifičtější. Tato metoda se také vhodně kombinuje

s „nested“ PCR.

Multiplexová reakce je velmi výkonná metoda PCR k testování mnoha

delecí a bodových mutací v jedné amplifikační reakci, v jednom elektrofo−

retickém dělení v agarose a obvykle s detekcí značením ethidiumbromidem.

Nejsložitější je fáze přípravná, kdy je nutno vypracovat takové reakční pod−

mínky (sekvence nukleotidů, koncentrace primerů, optimální teploty jedno−

tlivých kroků cyklu atd.), aby amplifikační reakce pro každý testovaný úsek

genomické DNA neprobíhala pouze v případě, že se jedná o mutaci v tom

kterém příslušném místě. Pro každou reakci je zařazena pozitivní a negativ−

ní kontrola. Například v DNA diagnostice delecí v oblasti genu pro dystro−

fin multiplexová reakce pro oblast 3’ konce testuje 11 různých exonů a pro

oblast 5’ konce 7 exonů najednou. Prakticky to znamená, že místo dříve pro−

váděných 18 samostaných amplifikací, se provedou reakce pouze dvě

(Abbs et al., 1991).

24

Pro přímou detekci známých bodových mutací je vhodná metoda hybri−

dizace s ASO (s alelově specifickými oligonukleotidy). Produkty polymerá−

zové řetězové reakce se rozdělí elektroforeticky např. v 1% agarosovém

gelu. Pak následuje denaturace a dvojité blotování z gelu, který je umístěn

mezi dvě nylonové membrány. Denaturační roztok slouží jako přenosový

pufr. Fixace DNA k membránám se provede v UV světle expozicí 1 minutu

na transiluminátoru. Následuje hybridizace s alelově specifickými oligo−

nukleotidy (normální a mutantní), které jsou označeny vhodným detekčním

systémem, například na 5’ konci α32P (ATP) pomocí T4 polynukleotidkina−

sy. Za určitých hybridizačních podmínek se dosáhne situace, kdy jediný

chybný pár bazí mezi sondou a analyzovanou DNA zabrání hybridizaci.

Bezchybně komplementární úseky spolu naopak hybridizují výborně.

Po hybridizaci se provede vymývání a detekce proužků například autoradio−

graficky.

CMC (chemical mismatch cleavage) je metoda štěpení heteroduplexů

piperidinem v místě mutace − chybně spárovaných bazí, které jsou che−

micky modifikované hydroxylaminem a OsO4. Následuje separace fragmen−

tů, která se obvykle provádí pomocí denaturační PAGE. Jinou příbuznou

modifikací je EMC (enzymatic mismatch cleavage).

AS−PCR (alelově specifická PCR). Pro detekci bodových mutací a ma−

lých delecí se často používají metody PCR, které využívají tzv. alelově spe−

cifické oligonukleotidy jako primery. Tyto metody prodělaly v posledních

letech vývoj od hybridizačních technik, přes dot blot analýzu, nested PCR až

po metody, které vystačí s detekcí fragmentů v agarosovém gelu s ethidium−

bromidem po elektroforetickém dělení. Alelově specifická dot blot hybridi−

zace je časově náročná a vyžaduje hybridizaci s radioaktivně značenou son−

dou. Využití alelově specifické PCR ukázal poprvé Olerup et al. (1991) na

detekci subtypů HLA.

25

Princip reakce AS−PCR a ARMS

Princip hodnocení AS−PCR a ARMS (s = společný, n = normální, m = mutantní primer)

26

Amplifikační refrakční mutační systém (ARMS) je metoda detekce

jakékoliv mutace v rozsahu záměny jednoho nukleotidu nebo malé delece.

Jedná se o variantu AS−PCR (alelově specifické PCR). Metoda je jednodu−

chá, spolehlivá, neizotopová a jasně rozliší heterozygota ve sledovaném

lokusu od homozygotů pro jednu nebo druhou alelu (Ferrie et al., 1992).

Systém je založen na pozorování, že DNA/DNA hybridy pospojované „mis−

matched“ (nedokonalé spárování) na jejich 3’ konci nejsou vhodnými

substráty pro působení Taq DNA polymerasy. Toto důležité pozorování

bylo využito a byl vyvinut systém diferenciální amplifikace. ARMS test se

skládá ze dvou samostatných reakcí, z nichž jedna je specifická pro normál−

ní DNA sekvenci a druhá pro sekvenci s mutací. Do jednoduchého ARMS

testu musí být zařazena vnitřní PCR kontrola, aby byla jistota, že amplifi−

kační reakce probíhá správně. Také je možné kombinovat několik ARMS

reakcí do jednoho multiplexového (několikanásobného) ARMS testu.

Pozitivní kontroly není třeba, smísí−li se 4 nebo více testů a jsou−li současně

ARMS reakce kombinovány tak, aby musel vždy vzniknout alespoň jeden

reakční produkt v obou reakčních mixech. Vlastní polymerázová řetězová

reakce probíhá na termocykleru v běžném provedení.

ARMS metoda byla úspěšně aplikována například k detekci mutací

v oblasti genu pro cystickou fibrosu. Byla vyvinuta multiplexová varianta,

která simultánně analyzuje DNA vzorek pro čtyři nejběžnější mutace CFTR

genu. Reakce A identifikuje CFTR geny, které nemají mutaci F508

a G21+1G>T nebo které mají mutaci G551D a G542X, zatímco

u reakce B je tomu právě naopak: identifikuje mutantní sekvenci F508

G21+1G>T a normální sekvenci v oblastech G551D a G542X.

PSM (PCR − mediated site directed mutagenesis) je metodou, která

umožňuje identifikaci specifických alel umělou změnou sekvence během

PCR tak, že dojde k vytvoření nového nebo k zániku původního restrikční−

ho místa pro restrikční endonukleasu. Metoda je založena na nepřesné hyb−

ridizaci sondy s genomickou DNA. Sekvence je modifikována tak, že jeden

27

z primerů se v jednom nukleotidu liší a hybridizuje s templátem v blízkosti

zkoumané mutace. Amplifikace oblasti s takto uměle vytvořenou mutací

vede k inkorporaci záměny nukleotidu do výsledného produktu PCR. Po

štěpení příslušným restrikčním enzymem a elektroforetické separaci se iden−

tifikují jednotlivé alely. Metoda byla úspěšně aplikována např. v detekci

mutací CFTR genu, genu pro LDL receptor, genu pro fenylalaninhydroxyla−

su. Jako příklad je uveden princip detekce mutace R1443X v tumor supre−

sorovém genu BRCA1. Tato mutace je výsledkem tranzice C→T v 4446.

nukleotidu a způsobuje záměnu argininu ve stop kodon. Zavedení restrikč−

ního místa AlfIII do produktu PCR mutantní alely vede ke vzniku fragmen−

tů 180 a 17 bp. Nemutovaná alela se neštěpí a produkt PCR zůstává 197 bp

dlouhý.

Příklad zavedení nového restrikčního místa pro AlfIII do produktu PCR:

RACE je metoda rychlé amplifikace cDNA konců pomocí PCR (Innis et

al., 1990). Nejprve se syntetizuje cDNA reverzní transkripcí z mRNA. Je to

metoda amplifikace cDNA, kdy syntéza probíhá směrem k 5´ nebo 3´ kon−

ci. Musí být známa část sekvence některého exonu. Amplifikace 5´ konců

vyžaduje purifikaci prvotní cDNA a ukončení řetězce terminální transfera−

sou za vzniku druhého poly(A) konce. Kombinací se pak získá celá plno−

hodnotná cDNA.

28

2) Ligázová řetězová reakce (LCR, LAR)

LCR je metoda amplifikace DNA určená k detekci stopových množství

DNA o známé sekvenci. LCR je dvoufázová cyklická reakce (Barany, 1991;

Wu et al., 1989). V první fázi se za vysoké teploty (95 °C) cílové molekuly

dvouvláknové DNA rozvinou na jednovláknové. V druhé fázi (70 °C) se dvě

sady (2x2) komplementárních oligonukleotidů přiloží (hybridizují) k cílo−

vým jednovláknovým molekulám a termostabilní ligasou jsou spolu spoje−

ny. Produkty ligázové reakce z jednoho cyklu slouží jako templát (podklad)

pro následující reakci cyklu. Používají se Tth DNA ligasa izolovaná

z Thermus thermophilus a Pfu DNA ligasa z Pyrococcus furiosus.

LCR je alternativní amplifikační technika, která může mít některé přímé

výhody oproti PCR. Při PCR často vznikají nespecifické amplifikační pro−

dukty, které znesnadňují interpretaci výsledků. Toto „pozadí“ (amplifikační

artefakty) vzniká tím způsobem, že se oligonukleotidové sondy přikládají

(hybridizují) k oblastem jak úplné, tak částečné sekvenční homologie

s původní templátovou DNA. Rozlišení PCR produktů vyžaduje separaci

pomocí elektroforézy, někdy izolaci z gelu a následné určení sekvence

amplifikovaných úseků. Naopak molekuly amplifikované pomocí LCR jsou

pouze ty, kde se zcela přesně a správně přiložily oligonukleotidové sondy

k homologním úsekům templátové DNA. V případě, že se jedna oligonuk−

leotidová sonda pro LCR označí například biotinem kovalentní vazbou

a druhá například alkalickou fosfatasou, pak se amplifikace i detekce obje−

vují současně. Elektroforéza nebo sekvenování nejsou nutné. Z těchto důvo−

dů je LCR také vhodnější k automatizaci než PCR a má větší specificitu.

Některé metody kombinují PCR s LCR, takže polymerasa a ligasa jsou pří−

tomny v jedné reakci současně.

29

3) Qß replikasová reakce (Kramer et al., 1992)

RNA bakteriofág Qß využívá RNA polymerasu k replikaci svého geno−

mu. Qß replikasa nepotřebuje oligonukleotidový primer k iniciaci syntézy

RNA, ale rozpoznává vysoce organizovanou oblast RNA genomu jako

iniciátoru. Jednovláknová molekula RNA je vhodným templátem pro Qß

replikasu. To umožňuje in vitro exponenciální vzestup počtu kopií RNA.

Denaturace není potřeba k iniciaci další replikační reakce. Enzym Qß

replikasa je velmi rychlý a výkonný: jedna molekula templátu je amplifiko−

vána na 1012

kopií za 10 − 15 minut při 37 °C. V praxi je nejprve sonda hyb−

ridizací navázána na Qß templát. Po hybridizaci se provede amplifikace.

Aplikace metody jsou limitovány požadavkem na absolutní specificitu hyb−

ridizace sondy. Jakékoliv hybridizační pozadí vede k snadné amplifikaci ja−

kéhokoliv produktu.

4) 3SR amplifikační reakce (self−sustained sequence replication;

Fahy et al., 1991; Gingeras et al., 1990)

3SR reakce využívá kolektivního účinku reverzní transkriptasy

(např. z ptačího myeloblastového viru), RNasy H (z Escherichia coli) a

T7 RNA polymerasy. K syntéze cDNA se používá hybridní primer, který

obsahuje cílovou specifickou oblast a nehybridizující konec s promotorem

pro T7 RNA polymerasu. Výsledná kopie cDNA má na jednom konci tento

promotor. RNasa H degraduje RNA v RNA/DNA hybridu. T7 RNA poly−

merasa syntetizuje podle DNA mnoho kopiií RNA, které jsou následně opět

cílem pro reversní transkriptasu, která syntetizuje další cDNA. Všechny

reakce probíhají při stejné teplotě. Reakční činidla jsou v koncentracích tak,

aby umožnily akumulaci produktu.

K dalším amplifikačním reakcím patří reakce cyklující sondy (cycling

probe reaction; Duck et al., 1990) nebo modifikace jako např. transkripční

30

amplifikační reakce (TAS, isothermal transcription−based amplification

reaction; Guatelli et al.,1990), NASBA (nucleic acid sequence based

amplification).

Elektroforetické metody

Produkty restrikčních nebo amplifikačních reakcí (fragmenty DNA) se

dělí podle své relativní molekulové hmotnosti a velikosti náboje elektrofo−

rézou DNA fragmentů v gelu (Sambrook et al. 1989). Sacharido−fosfátová

páteř nukleových kyselin je příčinou rovnoměrného rozložení negativních

nábojů v mokelulách DNA a RNA. Pohyb těchto vysoce elekronegativních

molekul v elektrickém poli vede k jejich separaci podle molekulové hmot−

nosti. Větší dělící mohutnosti pro rozdělení velkých fragmentů (až 5000 kb)

lze docílit použitím elektroforézy v pulzujícím poli (PFGE). Právě analýza

velikosti fragmentů je podstatou interpretace řady molekulárně biologických

metod. Nejčastěji se používá jako elektroforetické medium agarosa

(0.8 − 3.0 %), jejíž koncentrace se volí podle velikosti fragmentů, které

mají být separovány (orientačně viz tabulka).

Mnoho aplikací používá horizontální elektroforézu (např. U= 80−200 V,

I = 20−60 mA) a gel je uložen ve svém lůžku ponořen do pufru (TE, TBE,

TAE). Nejběžnější aplikace používají dvě velikosti gelů, např. 12 x 20 cm

31

a 5 x 9 cm, což představuje přibližně 4.5, resp. 9 V/cm. Nanášení vzorku

(0.1 − 5.0 µg DNA) na start do jamek předchází smíšení s nanášecím pufrem

obvykle v poměru 1:4 nebo 1:5, který obsahuje barvu viditelného spektra (na−

př. bromfenolová modř 0.5 g/l, 400 g/l sacharosa, 20 mmol/l EDTA).

Rozdělené frakce je možné buď přenést na speciální membrány (fólie)

tzv. blotováním a podrobit hybridizaci nebo pomocí fluorescenčních

barviv např. ethidiumbromidem interkalací mezi nukleotidy (50 µg/100 ml ge−

lu) vizualizovat na transiluminátoru v UV světle s následnou fotodokumenta−

cí. Krokový žebříček po 50 nebo 100 bp (Step ladder) nebo jiné PCR markery

se používají jako kalibrační škály molekulové hmotnosti (velikosti fragmentů).

PAGE (polyakrylamidová gelová elektroforéza). Druhým nejčastěji

používaným elektroforetickým médiem v molekulární biologii je poly−

akrylamidový gel (denaturační, obvykle s ureou, nebo nedenaturační). Jedná

se o vertikální elektroforézu. Směs akrylamidu a bisakrylamidu polymerizu−

je při pokojové teplotě v pufru (TAE) pomocí volných radikálů poskytova−

ných persulfátem amonným (APS), který způsobuje homolytické štěpení

vazeb O−O. K urychlení polymerizace se používá volná zásada TEMED

(tetrametylendiamin), který katalyzuje tvorbu volných radikálů persulfátu

amonného. Jiným užívaným iniciátorem polymerizace je riboflavin, který je

účinný již ve velmi nízkých koncentracích 5 −10 ng/l. Polymerizace se

neuskuteční při nízkém pH nebo za přístupu O2. Konečné koncentrace

TEMEDu a APS v polymerizačním roztoku by měly být 0,05 %. Použitá

koncentrace akrylamidu se liší podle velikosti separovaných fragmentů

DNA od 3.5% (fragmenty 1 − 2 kbp) až po 20% gely pro separaci malých

fragmentů 10 − 100 bp.

Metoda analýzy SSCP (jednovláknového konformačního polymorfismu,

zvaná též SSCA) je jednoduchou, velice senzitivní a efektivní technikou

k detekci mutací typu záměny jedné baze (Hayashi et al., 1991). Metoda je

založena na principu různé migrace jednovláknových molekul DNA, které

se liší svou sekundární strukturou (konformací) v nativním (nedenaturač−

32

ním) polyakrylamidovém gelu (obvykle 6%, typicky 0.4 mm silný, v TBE

pufru). Unikátní konformace jednovláknového fragmentu DNA je dána

intramolekulárními interakcemi uvnitř DNA sekvence. Tato konformace je

závislá na teplotě a iontové síle. Teplota při elektroforéze je klíčovým para−

metrem, který ovlivňuje kvalitu rozlišení DNA proužků. Již tak malý rozdíl

jako je záměna jedné baze způsobí změnu konformace a rozdílnou pohybli−

vost při elektroforéze za dodržení podmínky nedenaturace. Rozdíl v konfor−

maci může tedy být způsoben odlišností pouze jediné baze v sekvenci DNA.

Tato vysoce citlivá technika zachycuje 100% mutací v DNA fragmentech

menších než 200 bazí a 80% mutací v DNA fragmentech menších než 400

bazí. Optimální velikost PCR produktu je 150 bazí pro detekci mutací, větší

PCR produkty jsou vhodné ke sledování polymorfismů. Potřebné zařízení:

vhodný zdroj napětí, zařízení pro sekvenační gelovou elektoforézu (20 mA,

pokojová teplota) a případně chlazení (45 mA, 4 °C).

Princip SSCP (SSCA) ds DNA (stejná velikost, odlišná sekvence)

33

DGGE (denaturační gradientová gelová elektroforéza) je metoda, která

umožňuje separaci DNA molekul v polyakrylamidovém gelu na základě od−

lišné sekvence (liší se v jednom nukleotidu). Gel obsahuje lineární gradient

formamidu a močoviny. Dvouvláknová DNA putuje rychlostí určenou její

molekulovou hmotností až do doby, než vstoupí do té části gelu, kde je ta−

ková koncentrace denaturačních látek, že způsobí denaturaci dsDNA na jed−

novláknové molekuly. Tím se výrazně změní její pohyblivost. Konečná po−

zice fragmentu DNA v gelu závisí tedy na denaturačním bodu (melting).

Fragmenty identické velikosti mohou být takto separovány na základě

odlišné sekvence v gelech s gradientem denaturačního činidla. Gely mají

fixní koncentraci akrylamidu (akrylamid : bisakrylamid = 37,5 : 1) v TAE

pufru s lineárním gradientem denaturačního činidla (100% = 40% formamid

a 7 mol/l urea). Používají se dva typy DGGE: paralelní gely, v kterých se

zvyšuje koncentrace denaturačních činidel lineárně od shora dolů ve dvou

samostatných paralelních gelech (první 10 − 50%, druhý 40 − 80%);

perpendikulární gely, v kterých se zvyšuje koncentrace denaturačních čini−

del lineárně zleva doprava napříč gelem. Paralelní gely jsou vhodné k vyšet−

ření několika vzorků, perpendikulární gely mají na startu jednu jamku přes

celý gel pro jeden vzorek. Nejčastěji používaná strategie je vyšetření klíčo−

vého vzorku v perpendikulárním gelu a potom ostatní vzorky z rodokmenu

v gelu paralelním. Obvykle používaná koncentrace akrylamidu v této apli−

kaci je 6 − 8%, separuje se při konstantní teplotě 60 °C, při 150 V

po dobu 6 − 10 hodin. Detekce se provádí barvením stříbrem nebo

ethidiumbromidem. Denaturačního gradientu lze docílit také gradientem

teplotním (metoda TGGE).

Kapilární elektroforéza. Jedná se o alternativní metodu separace frag−

mentů DNA, která má tyto výhody: minimální spotřeba vzorku (1 − 2 nl

o koncentraci 5 − 50 mg/l), rychlost, snadná vizualizace. Separace probíhá

v lineárním hydrofilním polymeru v kapiláře (vnitřní průměr 25 − 50 µm,

délka několik cm až 1 m) a elektroforetickém pufru podle molekulové hmot−

nosti. Elektroendosmosa se využívá k zavedení vzorku a dále je eliminová−

34

na použitím kapilár se speciální úpravou vnitřního povrchu. K zařízení je

připojena přímá detekce měřením absorbance při 260 nm. Typická analýza

trvá méně než 20 minut. Pro separaci jednovláknové DNA se používá pufr

obsahující ureu (7 mol/l). Systém umožňuje jednoduché změny ve složení

pufru.

Metody detekce

Po označení nukleových kyselin následuje fáze detekce a případně kvan−

tifikace. Značení DNA se provádí metodami enzymatickými nebo přímou

chemickou vazbou. V obou skupinách rozlišujeme značení radioaktivní

a značení neizotopové. Enzymatické metody umožňují značení homogenní

nebo značení pouze 3’ nebo 5’ konců.

K radioaktivní detekci se používají nukleotidy značené těmito izotopy:

Neizotopové enzymatické systémy značení dosahují stejné citlivosti jako

radioaktivní a jsou vhodné pro automatizaci. Nejpoužívanější systémy

detekce jsou např.:

a) biotin − protilátka − enzym − substrát

b) biotin − streptavidin − enzym − substrát

c) sulfonová skupina − protilátka − enzym − substrát

d) digoxigenin − protilátka − enzym − substrát

e) fluorescenční detekční systém (např. rhodamin).

35

Ve všech těchto systémech se používá některý z chromogenních, chemi−

luminiscenčních nebo fluorescenčních substrátů a enzym je konjugován

s protilátkou nebo s avidinem. Používají se alkalická fosfatasa, peroxidasa,

glukosidasa, beta−galaktosidasa.

Velmi citlivý způsob detekce je bionylace nukleových kyselin a

následná specifická reakce s modifikovaným avidinem (konstanta afinity

K = 10−15

mol). Bionylace se provádí arylazidovým derivátem biotinu s ná−

slednou fotoaktivací. Vzniká vysoce reaktivní skupina, která umožní kova−

lentní vazbu biotinu s nukleovou kyselinou. Hybridizace in situ vyžaduje

někdy navíc inaktivaci endogenního biotinu (např. v hepatocytech).

Také některé metody přímého značení založené na fyzikálních a chemic−

kých principech vazby s nukleovou kyselinou jsou hojně používány. Mezi

tyto systémy patří značení ethidiumbromidem, radioaktivním jodem nebo

barvení stříbrem. Možná je také kovalentní vazba enzymů na nukleovou

kyselinu. Příkladem je zesílený chemiluminiscenční detekční systém. DNA

se značí přímo peroxidasou, která působí za přítomnosti H2O2 na luminol,

zesílení signálu se provádí pomocí derivátů fenolu (například 4−iodofenol).

Emitované světlo se detekuje na fotografickém filmu nebo se měří na lumi−

nometru.

Řada detekčních systémů umožňuje různé sestavy a ve spojení s ampli−

fikační reakcí jsou tyto metody vhodné pro automatizaci.

Porovnání vybraných metod vhodných pro detekci neznámé mutace:

36

Sekvenování nukleových kyselin

Určení sekvence (pořadí) nukleotidů úseků DNA a RNA o několika stech

bazí se provádí nejčastěji na principu konvenční Sangerovy metody (dideo−

xynukleotidová, ddNTP reakce) nebo nověji pomocí cyklického sekvenová−

ní na termocykleru bez nutnosti alkalické denaturace. Označené produkty

sekvenační reakce se rozdělí a detekují na sekvenačním gelu pomocí

elektroforézy. Původní metoda vyžadovala 4 samostatné sekvenační reakce

a také samostatné dělení při elektroforéze pro každý jednotlivý nukleotid.

Metoda má čtyři fáze: přiložení primeru k analyzovanému fragmentu DNA,

označení primeru, prodlužování primeru o další komplementární baze synté−

zou pomocí T7 DNA polymerasy, ukončení reakce inkorporací dideoxynuk−

leotidu. Značení primerů se provádělo pomocí radioizotopů. Sekvenační 5%

polyakrylamidový gel je denaturační (např. 7 mol/l urea), obvykle 0.3 mm

silný, separační vzdálenost 50 cm, TBE pufr. Parametry zdroje pro separač−

ní rychlost asi 100 bazí za hodinu jsou 60 W (1900 V, 45 mA). Moderní se−

kvenování je plně automatizováno. Místo radioaktivního značení se používá

značení fluoresceinem, místo značení primerů se používá značení termináto−

rů reakce (ddNTP), reakce se provádí na termocykleru pomocí Taq DNA

polymerasy, všechny čtyři reakce je možno provést v jedné zkumavce a

elektroforetické dělení je také z jednoho vzorku. Laserová detekce emise

čtyř různých fluorescenčních barev se provádí pomocí fotonásobiče a velmi

citlivého detektoru přímo z gelu. Počítačem je řízený posuv, fokusace, opti−

mální laserový paprsek a vyhodnocení získaných dat. K dispozici je specia−

lizovaný software.

37

PTT test (protein truncation test)

PTT je moderní metoda (popsána poprvé v roce 1993) k detekci mutací,

které vedou ke vzniku předčasného stop kodonu a tím k předčasnému ukon−

čení translace. Od ostaních metod se liší tím, že detekce mutací se provádí

na úrovni proteinů. Metoda umožňuje analýzu relativně velkých fragmentů

genů (2 − 3 kb) a detekuje výlučně patologické mutace, které vedou k neúpl−

ným bílkovinám, přičemž ignoruje např. polymorfismy. Některá onemocně−

ní jsou způsobena v 86 − 98 % mutacemi, které vedou výlučně ke zkrácené−

mu produktu translace (např. gen pro dystrofin, tumor supresorové

geny BRCA1 a HNPCC). Obvyklé provedení tohoto testu spočívá nejprve

v amplifikaci příslušné části genomické DNA (případně mRNA) pomocí

PCR (případně RT−PCR), přičemž jeden primer obsahuje startovací ATG

kodon, T7 promotor a Kozakovu sekvenci. Následuje transkripce PCR pro−

duktu do RNA pomocí T7 RNA polymerasy a potom konečně translace

např. pomocí lyzátu retikulocytů. Zkrácené proteiny jsou separovány

elektroforeticky v SDS polyakrylamidovém gelu podle své molekulové

hmotnosti a detekovány např. barvením stříbrem. Jiné snadné a citlivé de−

tekce se docílí, když se při translaci použijí tRNA, které nesou lysin znače−

ný biotinem. Po SDS−PAGE produktů translace označených biotinem se pro−

vede western blotting na membránu např. z nitrátu celulosy. Použitím systé−

mu strepravidin−peroxidasa a luminol−iodophenol se chemiluminiscence de−

tekuje expozicí na film. Kompletní PTT test z produktu PCR trvá přibližně

6 hodin. Místo T7 promotoru se někdy používá promotoru SP6 nebo T3

a příslušné fágové RNA polymerasy.

38

Nové metody

K nově vyvíjeným metodám patří minisekvenování, DNA (genové) chi−

py, strand displacement amplification, PCR−pouch, NASBA, TaqMan, bran−

ched DNA, CFLP (cleavase fragment length polymorphism) a jiné. Nejvíce

perspektivní se jeví metody, které integrují do jednoho homogenního systé−

mu amplifikaci a detekci s průběžným měřením (např. fluorescence) a vy−

hodnocováním již během PCR v termocykleru.

Jednou z nových perspektivních technik jsou prostorově adresné oligo−

nukleotidové matice − DNA čipy. Tyto matice jsou připraveny in situ pomo−

cí fotolitografie a chemické syntézy oligonukleotidů na pevném např. skle−

něném nosiči. Umožňují na principu alelově specifické oligonukleotidové

hybridizace opakované a rychlé testování buď prosté přítomnosti nebo

sekvenační analýzy fluoresceinem značených nukleových kyselin. Inku−

bační (hybridizační) fázi může podle potřeby předcházet amplifikace testo−

vané cílové DNA pomocí PCR. Hustota oligonukleotidové matice a její in−

formační kapacita je limitována prostorovým rozlišením v jakém mohou být

jednotlivé oligonukleotidové sekvence na čipu imobilizovány, syntetizovány

a hlavně nakonec detekovány po hybridizaci. Tak vysoce prostorově citlivé

detekce intenzity emitované fluorescence bylo dosaženo speciálním lasero−

vým scannerem (epifluorescence confocal scanning microscopy). V součas−

nosti dosahované rozlišení 20 µm umožňuje umístění 400 000 různých

oligonukleotidových sekvencí na plochu 1.6384 cm2. Toto rozlišení je dosta−

čující např. k úplnému sekvenování 16 kb mitochondriálního genomu.

Metoda využívající bDNA je amplifikační metodou zvláštní v tom, že

po reakci s cílovou detekovanou DNA (RNA) probíhá amplifikace signálu

a nikoliv templátu. Amplifikace se docílí použitím syntetických větvených

oligonukleotidů. Tato metoda se používá např. k detekci a kvantifikaci virové

39

RNA nebo DNA. Systém využívá alkalickou fosfatasu a substrát pro chemi−

luminiscenci (dioxetan). Signál je přímo úměrný množství kopií (molekul)

detekované nukleové kyseliny (počet kopií/ml) a měří se na luminometru.

Samostatnou pozornost si zaslouží ještě další separační a detekční systém

− MS (hmotnostní spektrometrie). Zavedení šetrných ionizačních technik,

např. elektrosprej nebo MALDI (matrix assisted laser desorption ioniza−

tion), umožnilo aplikovat MS k analýze větších biomolekul (DNA). Jako no−

vá metoda k detekci mutací byla nedávno popsána kombinace PROBE (pri−

mer oligo base extension) s MALDI−TOF (time of flight) −MS (Braun, A.

et al., 1997). PROBE je metoda podobná minisekvenování.

40

Pou�itá literatura

Abbs, S., Yau, S. C., Clark, S. et al.: A convenient multiplex PCR system for

the detection of dystrophin gene deletions: a comparative analysis with

cDNA hybridisation shows mistypings by both methods. J. Med. Genet., 28,

1991, s. 304−311

Braun, A., Little, D. P., Koster, H.: Detecting CFTR gene mutations by using

primer oligo base extension and mass spectrometry, Clin. Chem., 43, 1997,

7, s. 1151−1158

Barany, F.: The ligase chain reaction in a PCR world. PCR Methods and

Applications, 1, 1991, s. 5−16

Duck, P., Alvarado−Urbina, G., Burdick, B., Collier, B.: Probe amplifier sys−

tem based on chimeric cycling oligonucleotides. BioTechniques, 9, 1990,

s. 142−147

Epplen, J. T.: Diagnostic applications of repetitive DNA sequences, JIFCC,

4, 1992, 5, s. 228−234

Fahy, E., Kwoh, D. Y., Gingeras, T. R.: Self−sustained sequence replication

(3SR): an isothermal transcription−based amplification system alternative to

PCR. PCR Methods and Applications, 1, 1991, s. 25−33

Ferrie, R. M., Schwarz, M. J., Robertson, N. H. et al.: Development, multi−

plexing, and application of ARMS tests for common mutations in the CFTR

gene. Am. J. Hum. Genet., 51, 1992, s. 251−262

41

Gibbs, R. A.: DNA amplification by polymerase chain reaction. Anal.

Chem., 62, 1990, s. 1202−1214

Gingeras, T. R., Whitfield, K. M., Kwoh, D. Y.: Unique features of the self−

sustained sequence replication (3SR) reaction in the in vitro amplification of

nucleic acids. Ann. Biol. Clin., 48, 1990, s. 498−501

Guatelli, J. C., Whitfield, K. M., Kwoh, D. Y. et al.: Isothermal, in vitro am−

plification of nucleic acids by a mutienzyme reaction modeled after retrovi−

ral replication. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 1990, s. 1874−1878

Hayashi, K.: PCR−SSCP: a simple and sensitive method for detection of muta−

tions in the genomic DNA. PCR Methods and Applications, 1, 1991, s. 34−38

Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J.: PCR Protocols:

A Guide to Methods and Applications. Academic Press, San Diego,

California, 1990

Kramer, F .R., Lizardi, P. M., Tyagi, S.: Qbeta amplification assays, Clin.

Chem., 38, 1992, s. 456−457

Miffin, T. E., Sansieri, C. A., Kapp, D. W., Casciato, J.: Characterisation of

a rapid method for isolation of genomic DNA suitable for amplification,

Clin. Chem., 40, 1994, 6, s. 1091−1092

Olerup, O., Zetterquist, H.: HLA−DRB1´01 subtyping by allele specific PCR

amplification: a sensitive, specific, and rapid technique, Tissue Antigens, 37,

1991, s. 197−204

Průša, R., Vošmik, M.: Extrakce DNA metodou s guanidinhydrochloridem

a uchovávání vzorků v DNA bance, Klin. Biochem. Metab., 4(25), 1996, 4,

s. 233−236

42

Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S. et al.: Primer directed enzymatic

amplification of DNA with thermostable DNA polymerase. Science, 239,

1988, s. 487−491

Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T.: Molecular Cloning: A Laboratory

Manual, 2nd ed., Vols. 1, 2 and 3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold

Spring Harbor, New York, 1989

Schutzbank, T. E., Stern, H. J.: Principles and applications of the polymera−

se chain reaction. JIFCC, 5, 1993, 3, s. 96−104

Shibata, D.: Preparation of Nucleic Acids for Archival Material, In: Mullis,

K.B. (Ed.): The Polymerase Chain Reaction, Birkhauser, Boston, 1994,

s. 47−51

White, T. J., Madej, R., Persing, D. H.: The polymerase chain reaction:

clinical applications. Adv. Clin. Chem., 29, 1992, s. 161−196

Wu, D. Y., Wallace, R. B.: The ligation amplification reaction (LAR) −

amplification of specific DNA sequences using sequential rounds of templa−

te−dependent ligation. Genomics, 4, 1989, s. 560−569

Zolfaghari, R., Chen, X., Fisher, E. A.: Simple method for extracting RNA

from cultured cells and tissue with guanidine salts, Clin. Chem., 39, 1993,

7, s. 1408−1411

43

44

Doporuèená literatura

Mullis, K. B., Ferré, F., Gibbs, R. A.: The Polymerase Chain Reaction,

Birkhauser, Boston, 1994

Nollau, P., Wagener, Ch.: Methods for detection of point mutations:

performance and quality assessment, Clin. Chem., 43, 1997, 7,

s. 1114−1128

White, T. J., Madej, R., Persing, D. H.: The polymerase chain reaction:

clinical applications, Adv. Clin. Chem., 29, 1992, s. 161−196

45

.

kknniihhyy,, bbrroožžuurryy,, sskkrriippttaa,, kkaattaallooggyy,,pprroossppeekkttyy,, ttiisskkooppiissyy,, lleettáákkyy,, vviizziittkkyy,,

ppoozzvváánnkkyy,, hhllaavviiččkkoovvéé ppaappíírryy,,ppoosstteerryy mmaallýýcchh ii vveellkkýýcchh ffoorrmmááttůů ......

...... vvššee ddllee vvaaššiicchh ppřřeeddssttaavv

od návrhu až po tisk

9 788023 809404

ISBN 80-238-0940-7