RNA 干扰现象的发现

2001 级博：潘 皎 导 师：张义正教授 2003 年 4月 24 日

RNA 干扰

一些小的双链 RNA 可以高效、特异地阻断体内特定基因表达 , 促使ｍ RNA 降解 , 诱使细胞表现出特定基因缺失的表型 , 称为 RNA 干扰 (RNA interference, RNAi, 也译作 RNA 干预或者干涉 ) 。

RNAi －一种新的遗传工具 RNAi 是植物、果蝇、线虫和很可能包括哺乳动物在内的许多生物

抵抗病毒感染和限制转座子运动的一种自然存在的防御机制。

RNAi 可以作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具，来制备特定基因缺失表型的个体 , 从而研究该基因的功能 .它正在功能基因组学领域掀起一场真正的革命 ,并将彻底改变这个领域的研究步伐 ,为此被 SCIENCE 评为 2002 年最重要的科研成果之一。

在哺乳动物细胞中用 siRNA (21 － 23 核苷酸长的小分子干扰ＲＮＡ片段 (small interfering RNAs,siRNAs, 又被称为引导 RNAs) 。能高效阻断某个特定基因的表达 ,这项技术在疾病的基因治疗上也有光明的应用前景。特别可以用于阻断某些突变基因的表达 ,或者由蛋白过量表达引起的疾病。

共抑制现象的发现 ＲＮＡｉ研究的早期线索早在 20 年前 ,来自于美国和

荷兰的两个转基因植物实验组 Richjorgensen 和同事 ,在对矮牵牛 (petunias) 进行的研究中有个奇怪的发现 :将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后 , 导入矮脚牵牛中 , 试图加深花朵的紫颜色 , 结果没看到期待中的深紫色花朵 ,多数花成了花斑的甚至白的。 jorgensen 将这种现象命名为共抑制 (cosuppression), 因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制。开始这被认为是矮牵牛特有的怪现象 , 后来发现在其他许多植物中 ,甚至在真菌中也有类似的现象。

随后几年 ,另外几个植物学家也发现了类似的现象。如 Santa等 , 将番茄病毒Ｘ复制所需的复制酶基因导入烟草中 , 以阻断病毒的生活周期而控制病毒的生长 ,但有些烟草表现出抗病毒的特性 , 而另外一些则相反。随后 , 在植物病毒实验中也观察到共抑制现象 , 并发现共抑制具有抗病毒功能。

Quelling 现象 并非只有植物学家才注意到了这种意外的现象。意大利的 Cogoni 等 , 将外源类胡萝卜素基因导入链孢霉 (Neurosporacrassa), 结果转化细胞中内源性的类胡萝卜素基因也受到了抑制。而在真菌转基因实验中这种共抑制现象被称为“ quelling”。

基因沉默 转录阶段基因沉默 (transcriptional gene silencing

,or TGS)：对于部分植物来说 , 转基因引发的基因沉默可能是因为基因特异的甲基化而导致 , 这被称为转录阶段基因沉默 .

转录后发生的基因沉默 (post transcriptional gene silencing ,or PTGS)

Ｈａｍｉｌｔｏｎ等 , 率先在发生ＰＴＧＳ的西红柿中检测出与被沉默基因同源的约 25ｎｔ的短片段ＲＮＡ , 而未发生ＰＴＧＳ的西红柿则不能检出 25ｎｔ的ＲＮＡ

ＨａｍｉｌｔｏｎＡＪｅｔａｌ . Ｓｃｉｅｎｃｅ ,1999,286(5441):950—952

RNA 干扰现象的发现 线虫中首次发现了 RNAi ： 首次发现 dsRNA 能够导致基因沉默的线索来源于秀丽新小杆线虫 (Caenorhabditis.elegans) 的研究。 1995年康乃尔大学的研究人员 Guo 和 Kemphues尝试用反义RNA (antisense RNA)去阻断 par1 基因的表达以探讨该基因的功能 , 结果反义 RNA 的确能够阻断基因的表达 ,但是奇怪的是 ,注入正义链 RNA(sense RNA) 作为对照 , 也同样阻断了基因的表达。

ＧｕｏＳ ,ＫｅｍｐｈｕｅｓＫＪ .ＰａｒＬ .[ Ｊ ].Ｃｅｌｌ , 1995,81:611-620.

这个奇怪的现象直到 3年后 1998 才被解开———华盛顿卡耐基研究院的 Andrew Fire 和马萨诸塞大学癌症中心的 Craig Mello首次将双链 dsRNA———正义链和反义链的混合物注入线虫 , 结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默。将体外转录得到的单链ＲＮＡ纯化后注射线虫时 , 基因抑制效应变得十分微弱 , 而经过纯化的双链ＲＮＡ能够高效地特异性阻断同源基因的表达。实际上每个细胞只要很少几个分子的双链ＲＮＡ已经足够完全阻断同源基因的表达。后来的实验表明在线虫中注入双链ＲＮＡ不单可以阻断整个线虫的同源基因表达 ,还会导致其第一代子代的同源基因沉默。他们将这种现象称为ＲＮＡ干扰。

ＦｉｒｅＡ , ＸｕＳ , ＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙＭＫ , ｅｔａｌ [ Ｊ ]. Ｎａｔｕｒｅ ,1998,391:806 ～ 811.

ＲＮＡｉ潜在的作用促使 Fｉｒｅ和Ｔｉｍｍｏｎｓ继续实验 ,将一种能够表达与ｕｎｃ 22 基因同源的双链ＲＮＡ的基因工程细菌喂食线虫 ,结果线虫表现出类似ｕｎｃ 22 缺陷的表型。

ＴｉｍｍｏｎｓＬ，ＦｉｒｅＡ， 1998Ｎａｔｕｒｅ， 395：854

后继的实验表明将线虫浸入双链ＲＮＡ中同样可以诱导基因沉默———这种技术使得大规模筛选线虫ＲＮＡｉ诱导的功能缺失突变体成为可能 ,并引发后继的大量针对这种模式生物基因敲除的研究ＴａｂａｒａＨ，ＧｒｉｓｈｏｋＡ，ＭｅｌｌｏＣＣ 1998．Ｓｃｉｅｎｃｅ， 282 ： 430 ～ 431

涡虫 ( Ｐｌａｎａｒｉａｎ ) Ｓａｎｃｈｅｚ＿ＡｌｖａｒａｄｏＡ，ＮｅｗｍａｒｋＰＡ， 1999 ．Ｐ

ｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， 96 ： 504 ～ 5054

水螅 ( ｈｙｄｒａ ) ＬｏｈｍａｎｎＪＵ，ＥｎｄｌＩ，ＢｏｓｃｈＴＣ，1999 ．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ， 214 ： 211 ～ 214

锥虫 ( ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅｓ ) ＮｇｏＨ，ＴｓｃｈｕｄｉＣ，ＧｕｌｌＫ，ＵｌｌｕＥ， 1998 ．Ｐｒｏ

ｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， 95 ： 14687 ～ 14692 、

真菌 ( ｆｕｎｇｉ）（ neurospora crassa) ＣｏｇｏｎｉＧ，ＭａｃｉｎｏＧ， 1999 ．Ｎａｔｕｒｅ， 339 ： 166 ～

169

在果蝇 (Drosophila) 中发现ＲＮＡ i Berstein E et al Nature 2001,409(6818):363-366

在拟南芥中发现ＲＮＡ i Wassnengger M et al plant Mol Biol 1998,37(2):349-362

在小鼠中发现ＲＮＡ i Wianny F et al Nat cell Biol 2000 ,2 (2):70-75

果蝇中的ＲＮＡｉ 在果蝇的研究中同样发现ＲＮＡｉ。尽管采用能生产ｄｓＲＮＡ的酵母喂食果蝇的实验以失败告终 ,但是通过显微注射或者通过基因枪将ｄｓＲＮＡ注入果蝇胚胎中、或者将带有反向重复序列的ＤＮＡ导入果蝇中能够引发基因沉默。

来自于冷泉港Ｈａｎｎｏｎ研究组和麻省医学院的Ｂａｒｔｅｌ研究组分别利用果蝇培养细胞和果蝇胚胎 , 将外源ｄｓＲＮＡ转染果蝇细胞Ｓ 2 或将之直接加入胚胎提取物 , 同样发现与西红柿非常相似的结果 : 加入的ｄｓＲＮＡ被特异地切割成 21 － 23ｎｔ的ｄｓＲ ＮＡ , 而且这些具有核酸酶活性的 21 － 23ｎｔ的ｄｓＲＮＡ能够特异地降解与之同源的ｍＲ ＮＡ ,从而抑制相应基因的表达。

ＨａｎｎｏｎｄＳＭｅｔａｌ . Ｎａｔｕｒｅ ,2000,404(6775):293—296ＺａｍｏｒｅＰＤｅｔａｌ .Ｃｅｌｌ ,2000,101(1):25—33

核酸酶 (Ｄｉｃｅｒ ) 最近 ,Ｈａｎｎｏｎ研究组从果蝇中成功地分离出能特异切割ｄｓＲＮＡ的ＲＮａｓｅⅢ家族核酸酶 (Ｄｉｃｅｒ )。　ＢｅｒｓｔｅｉｎＥｅｔａｌ . Ｎａｔｕｒｅ， 2001,409(6818):363—366

ＲＮＡｉ在哺乳动物细胞中的研究 最近 ,Ｔｕｓｃｈｌ等在实验中发现哺乳动物细胞中同样存在ＲＮＡｉ

效应。他们将一种特殊构建的ｓｉＲＮＡ（对称性 3′突出 2nt约 21nt）双链复合物通过阳离子脂质体转入不同的哺乳动物细胞中 ,包括Ｈｅｌａ细胞和人胚肾 293 细胞等 ,观察到了可重复的 ,序列特异性的ＲＮＡｉ。ｓｉＲＮＡ的序列专一性要求非常严谨 ,与靶ｍＲＮＡ之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。他们还发现： >30ｂｐ的ｄｓＲＮＡ引起的阻抑效应是广泛的 ,非特异性的。原因是： >30ｂｐ的ｄｓＲＮＡ可诱发哺乳动物细胞内的干扰素系统 , 它能激活两种酶 , 一种为蛋白激酶ＰＫＲ ,激活的ＰＫＲ通过一系列的磷酸化使翻译起始因子ｅＩＦ 2ａ失活 , 导致翻译抑制。在另外一个途径中 ,长ｄｓＲＮＡｓ激活ＲＮａｓｅＬ ,致非特异的ＲＮＡ降解。

ＴｕｓｃｈｌＴ , ＺａｍｏｒｅＰＤ , ＬｅｈｍａｎｎＲ , ｅｔａｌ [Ｊ ]. ＧｅｎｅｓＤｅｖ ,1999,13:3191 ～ 3197

2002 年 5月 , 美国科学家Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ等报道 ,采用 21个核苷酸双链ＤＮＡ形成双链ＲＮＡ ,加入到感染艾滋病病毒的细胞中 ,24 ｈ后 ,可减少艾滋病病毒基因表达 90%以上 ,这种双链ＲＮＡ可阻断艾滋病病毒感染培养的细胞。 7月 , Ｎｏｖｉｎａ等用ＲＮＡｉ技术实现了ＨＩＶ 1 病毒的阻抑。

2002 年 7月 4日 ,《自然》杂志又介绍了美国科学家ＭｃＣａｆｆｒｅｙ等人将合成的双链ＲＮＡ和通过载体将双链ＤＮＡ形成小发夹状的双链ＲＮＡ直接注入鼠的肝脏 , 并将肝炎Ｃ病毒与标志基因相连后感染鼠肝脏 , 这种双链ＲＮＡ或双链发夹状ＲＮＡ对标志基因的表达抑制分别达到 81%和 92 8%, 表明这两种双链ＲＮＡ均可明显地抑制成体鼠肝脏内导入的肝炎Ｃ病毒基因的表达。许多实验都证明利用ＲＮＡｉ可以直接和有效地起到抗病毒的作用。

21ｎｔｓｉＲＮＡ的双链复合物在哺乳动物细胞中干预成功为基因作用的研究提供了一种新的工具 ,原来要花费 6个月至一年的时间才能明确一个哺乳动物细胞基因如何关闭 , 现在只需一个星期就能明确 10 个基因的关闭 , 使工作进程大大加快。可以预见 , ＲＮＡｉ作为一种快速关闭基因的途径 , 将会越来越多地用于哺乳动物基因研究。

遗传学通过基因突变筛选技术在基因水平肯定线虫中共抑制、ＰＴＧＳ和ＲＮＡｉ分享共同的基因 , 具有相同的作用形式 ,即ｄｓＲＮＡ介导的靶基因沉默。ｄｓＲＮＡ导入不仅使线虫、果蝇、小鼠和人细胞中相应基因表达抑制 , 也在植物中表现出同样效果 ,甚至把ｄｓＲＮＡ注射到线虫、锥体虫的体腔中 ,远距离组织及Ｆ 1 代也可以产生同源基因抑制 , 同样在植物韧皮部注射ｄｓＲＮＡ可遍及扩散到整个植株体产生ＲＮＡｉ ;,把线虫浸润到含有ｄｓＲＮＡ液体中或喂养表达ｄｓＲＮＡ的工程菌也可以诱发ＲＮＡｉ , 而在植物中把吸附在表面 500ｂｐ基因片段的金属片插入到植物中 , 在侵入点周围组织发生了基因沉默。因此 , ＲＮＡｉ普遍存在于各种生物 , 具有抗病毒、稳定转座子及监控异常表达ｍＲＮＡ的生物学功能 。

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