rna-seqデータから知識データベース（lskb）を …rna-seq fdr±2 400 annotation filter...

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World Fusion Co., LTD

RNA-seqデータから知識データベース（LSKB）をフル活用した

創薬ターゲット探索

1

第12回 Class Aデータ解析セミナー～これからのＮＧＳデータ解析技術～

2015年9月8日（火）


この講演の内容

• LSKBとは

• Expressionアノテーターの紹介

• LSKB機能を用いた解析例

2


LSKBとは

3


Comprehensive Network in LSKB

Benefits of using LSKB:

- Relevant information from multiple data sources simultaneously

- Effortless extraction of highly specific data

- Significant time-savings

4

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LSKB Text-mining DB overview

DB construction

LSKB Database

Dictionary

Reference

Keyword

Annotation

Public database

FDA

ChEMBL

UniProt

NCBI

・・・

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LSKB Text-mining DB overview

DB construction

LSKB Database

Dictionary

Analyzed data

Text-mining

Gene

Protein

Chemical

Disease

Tissue

Literature DB

MEDLINE

Text-mining

Engine

Text-mining

※MEDLINE data for 20years

※Category in Medline

・Title

・Abstract

・MeSH Heading List

・Gene Symbol List

・Keyword List

Taxonomy


Chemicals in

Dictionary

Drugbank

Chemical database

FDA

PDB

ZINC

ChEMBL

PubChem

Public Data source

Dictionary

Literature

Keywords

Annotation

Non-Redundant

Structures

Structure Search Keyword Search

PDB Ligand

ZINC

ChEMBL

Chem in

Literature

PubChem

Import by customer

Mol. Framework

7


Chemical detail

Compound

Structure

Activity Info. Assay Info.

IUPAC Name

Patent Info.

Target Protein/Gene

Another active compounds

information

Drug

Classification

8


Pharmacological

Action

Structure Info.

PDB

Binding Protein

Active conformation

Chemical detail

9


Unique Structure Search in LSKB

• Exact Match

• Similarity Search

• Substructure Search

• Molecular Framework Search

-> Target Prediction

10


Molecular Framework Search

Query

PDE4 Inhibitor

APEX Nuclease Inhibitor

Lysyl-tRNA synthetase inhibitor

Tyrosine-protein kinase ITK/TSK Inhibitor

PTP1B Inhibitor

framework

11


Target Prediction

Ligand-based Target Prediction Methods in LSKB: – Compound similarity - known as active to targets

– Select with molecular framework filters

– Weighed average (by similarity) as predicted activity

– The data is built from “binding” assays with defined values, based on:

• 1.4 M compounds

• 5500 protein targets

• 5M interactions

• Regular updates continually enhance predictive accuracy

– Increasing # of compounds/proteins/interactions

12


Ex1) Antifungal Active Compound: Arasertaconazole

Predicted Value

The Evidence

Predicted ADME-related target

13


Disease

Known/unknown

therapeutic target

Gene/Protein

14


“New” Disease information

Go to Clinicaltrials.gov 当該疾患の臨床開発状況が調べられます。

リストされた疾患関連タンパク質情報は、LSKBのバッチ検索に

送ることができ、まとめて活性化合物を探すことが可能です。 15


Disease related Gene

MedGen/OMIM

は当該疾患関連のみ表示され、Filter操作可能です。

MedGene/OMIMで

の関連遺伝子および、Referenceの共

起をもとにリストされます。

16


Disease related Protein

MedGen/OMIM

は当該疾患関連のみ表示され、Filter操作可能です。

TTD, Reference,

MedGene/OMIMでの関

連タンパク質をもとにリストされ、関連PDB および

アッセイ情報が得られます。

17


Disease related Drug ATCから紐づく疾患およびTTDの記

載をもとにリストされます。

18


Disease related SNP

SNPから他の全

ての関連疾患（OMIM）が表示されます。

dbSNP の文献記載および OMIM をもとにリストされます。

19


Related Disease in Gene information - Rare Disease tag-

20


Target Prioritization

Valuable information by easy Operation

21



Pathway & GO

New interest Gene list ABCB1 ABCB11 ABCG2 SLC22A8 …


22


Annotated Transporters by Target Prioritization

https://lskb.w-fusion.com/lskbdemo/WfGate?key=20150710-08-10-19-987 23


Getting Related Information in an Intuitive Manner

• Filter by:

– Human Proteins

– PDB Information (3D structure)

– Activities

– SNP Information

– Related Diseases

• Links to Proteins/Genes/Activities/Chemicals

24


Expressionアノテーター

Microarray, RNA-seq解析結果から

疾患・表現型関連・薬物標的等の遺伝子を絞り込み

25


Human Transcript

RNA-Seq

FDR<0.05, Fold change>±2

400

Annotation filter

?

Microarray, RNA-seq解析で

有意差検定やアノテーション情報により絞り込んだ遺伝子からさらに着目する遺伝子を絞り込む“新しい”方法を提供

Expressionアノテーターとは

Mouse, Rat, Zebrafish etc

Transcript

RNA-Seq


500

400

Human Ortholog Gene

Annotation filter

? 26


この過程でタンパク質と活性

化合物の情報を付与する

遺伝子と関係がある活性化合物を取得 ⇒化合物による活性制御が可能な遺伝子(タンパク)を特定

1, 実測されたアッセイ情報を用いて遺伝子の化合物標的としての評価を迅速化 2, in vitro assayに用いる化合物の探索を通じてGene-Phenotype間の相関解析 3,情報の少ない遺伝子・タンパクの機能を結合化合物の作用から推定 Human Transcript

RNA-Seq


400

Annotation filter

?

RNA-Seq


500

400

Human Ortholog Gene

Annotation filter

?


Mouse, Rat, Zebrafish etc

Transcript

27


Pathway & GO

アノテーション情報付与

28

RNA-seq Microarry 解析データ



GENEID(Human)

ENTRY_NAME(HUMAN)

GO term; biological_process

GO term; cellular_component

GO term; molecular_function

OMIM Disease;#hits

OMIM Disease;ID_and_description

Pathway;#hits

Pathway;ID_and_description

UNIPROT_PRIMARY_ACC(HUMAN)

UNIPROT_ACC(HUMAN)

PubChem BioAssay;#Assays

PubChem BioAssay;#Compounds

ChEMBL Assay;Target_ID_and_Name

ChEMBL Assay;#Activities

ChEMBL Assay;#Inhibitors(pAct>5)

ChEMBL Assay;#Binders(pAct>5)

PDB associated with Entry Name;#PDBIDs

PDB associated with Entry Name;#Ligands

#References

Clinvar(hg19);#hits

Clinvar(hg19);IDs

Clinvar(hg38);#hits

Clinvar(hg38);IDs

Basic annotation

Additional annotation +

統計解析後元データ

Expressionアノテーター付与アノテーション

Feature ID Transcript ID

Control- 1

Control- 2

Control- 3

Control- 4

SSC- 1

SSC- 2

SSC- 3

SSC- 4

ControlMeans

SSCMeans

Foldchange FDR

ADAMDEC1_2 ENST00000256412 0 1 0 2 257 291 300 251 0.75 274.75 272.79 2.34E-28IGLV3-1_1 ENST00000390319 5 0 2 0 843 969 628 601 1.75 760.25 307.57 1.67E-27CXCL10_1 ENST00000306602 1 2 0 5 652 386 638 895 2 642.75 266.40 2.04E-27IGHG1_1 ENST00000390542 4 7 4 1 685 602 538 353 4 544.5 108.33 1.52E-26ADCYAP1_1 ENST00000579794 0 6 0 4 335 407 281 231 2.5 313.5 104.33 6.28E-24MS4A7_5 ENST00000358246 0 3 2 4 249 251 196 308 2.25 251 93.23 1.52E-23SFRP4_1 ENST00000436072 14 40 74 76 5720 3891 2041 3810 51 3865.5 66.72 3.36E-23IGHG1_2 ENST00000390548 2 8 3 3 1442 782 253 703 4 795 164.84 2.05E-22CD163_10 ENST00000537626 5 17 10 14 435 471 362 444 11.5 428 31.86 9.77E-22IGHG1_3 ENST00000390549 7 4 0 5 780 630 566 1043 4 754.75 143.65 1.24E-21EPYC_2 ENST00000261172 1 1 2 5 863 360 205 671 2.25 524.75 190.66 3.24E-21IGHGP_1 ENST00000390555 1 7 2 3 719 411 180 542 3.25 463 120.74 3.74E-21IGHG3_1 ENST00000390551 3 9 1 3 2030 664 428 1655 4 1194.3 251.08 5.33E-21AC093850.2_1 ENST00000415479 0 1 0 0 248 114 98 211 0.25 167.75 400.48 4.65E-20FDCSP_1 ENST00000317987 0 6 1 2 154 174 213 198 2.25 184.75 69.62 5.47E-20MSR1_1 ENST00000381998 30 104 54 148 5322 4169 2022 3392 84 3726.3 38.93 6.09E-20LBP_1 ENST00000217407 0 11 10 8 398 331 405 458 7.25 398 49.42 1.48E-19SERPINE1_2 ENST00000223095 9 87 10 55 3950 3271 3143 3699 40.25 3515.8 81.77 3.15E-19IGKV3-11_1 ENST00000483158 2 3 9 4 296 287 164 203 4.5 237.5 43.09 3.51E-19TNC_14 ENST00000341037 74 170 103 189 2577 3624 3420 2510 134 3032.8 19.12 5.38E-19CXCL13_1 ENST00000286758 0 1 0 2 200 131 82 145 0.75 139.5 138.83 5.85E-19S100A8_3 ENST00000368733 653 1681 750 1022 22876 55552 48343 18164 1026.5 36234 28.98 4.25E-18IGHV3-23_1 ENST00000390609 1 0 0 0 96 85 83 101 0.25 91.25 210.05 4.31E-18MMP1_1 ENST00000315274 0 0 0 2 990 169 167 870 0.5 549 790.73 1.28E-17COMP_4 ENST00000222271 6 43 15 32 804 672 613 584 24 668.25 25.03 2.08E-17COL8A1_7 ENST00000261037 103 203 144 281 5770 3616 3181 5038 182.75 4401.3 20.53 2.09E-17IGHG2_1 ENST00000390545 5 0 4 3 780 627 167 340 3 478.5 114.86 6.04E-17LUM_2 ENST00000266718 2066 6771 4757 7592 140119 99226 72521 111993 5296.5 105965 17.72 6.95E-17KRT6C_1 ENST00000252250 294 1741 397 1712 56646 201387 171021 38213 1036 116817 100.30 8.72E-17TNFSF4_3 ENST00000281834 26 76 12 41 3414 1767 1178 2822 38.75 2295.3 50.49 1.53E-16THBS1_1 ENST00000260356 759 2103 1163 2721 68203 30753 32420 64881 1686.5 49064 25.87 2.06E-16C1QB_3 ENST00000509305 21 110 104 94 3834 1948 1330 2898 82.25 2502.5 27.74 2.37E-16OAS2_2 ENST00000392583 14 32 45 59 668 1065 1077 608 37.5 854.5 19.55 3.64E-16

29


Additional annotation = Protein-Ligand function

UNIPROTPubChem

BioAssay

PubChem

BioAssay

ChEMBL

Assay

ChEMBL

Assay;#Acti

vities

ChEMBL

Assay;#Inhibit

ors(pAct>5)

ChEMBL

Assay;#Binde

rs(pAct>5)

PDBIDsPDB#Li

gands

PFAM

Domains

#Referen

ces

Clinvar(hg

19);IDs

Clinvar(hg

38);IDs

K9JA46;P

07900;Q8

6SX1

11 3539

CHEMBL3

880 Heat

shock

protein

570 259 82 166 153 PF00183 Hsp90 protein;PF02518 Histidine kinase-, DNA gyrase B-, and HSP90-like ATPase;PF00183 Hsp90 protein;PF02518 Histidine kinase-, DNA gyrase B-, and HSP90-like ATPase;PF02518 Histidine kinase-, DNA gyrase B-, and HSP90-like ATPase1898rs2676040

09

rs2676040

09

Inhibitors

実験上このタンパク質へ阻害

活性を持つ化合物の数

Binders=

実験上このタンパク質へ結合

活性を持つ化合物の数

タンパク質の働きを制御できる化合物を知る

Additional annotationの構成要素

1, 化合物-タンパク間の実測されたアッセイ情報を参照

2,活性値に基づいたフィルタリングを挟むことも可能

Expressionアノテーター使用方法

30


解析例

31


早期のびまん型強皮症（diffuse SSc） RNA-Seq

サンプルレイノー症状を伴わない早期のびまん型強皮症（diffuse SSc）発症患者4名の病変前腕皮膚および健常人4名の正常皮膚からRNA シーケンサー Illumina HiSeq 2000 リード 50 bp paired-end

レイノー症状：冷たいものに触れると手指が蒼白～紫色になる症状

出典：難病情報センター：http://www.nanbyou.or.jp/entry/75

強皮症（ scleroderma ）全身の皮膚が硬くなる他、内臓にも病変を発症する原因不明の慢性疾患である。古典的五大膠原病のひとつ。病因全身性強皮症では3つの異常が病因と深く関連していると考えられている。 (1)線維芽細胞の活性化（その結果、膠原線維が多量に産生され、皮膚や内臓の硬化が生じる）、 (2)血管障害（その結果、レイノー症状や指尖部の潰瘍などが生じる）、 (3)免疫異常（その結果、自己抗体が産生される）。

解析例

32


有意差検定（EdgeR）

発現解析発現解析

解析ステップ

マッピング

Fastq

マッピング

Fastq

Expression アノテーター


1693

Annotation filter

?

Diffuse SSc (n=4） Control (n=4）

UP:918

Down:478

CLC Genomics

Workbench

解析例

GO

pathway

33


解析結果1 Top 10 Gene ontology (GO) enrichment analysis

Accession GO Term Count P-value

5515 protein binding 327 1.06E-74

8201 heparin binding 34 4.44E-28

5509 calcium ion binding 62 2.83E-25

4872 receptor activity 36 8.25E-24

5201 extracellular matrix structural constituent 21 8.56E-22

5102 receptor binding 38 2.64E-20

5178 integrin binding 22 1.41E-17

8009 chemokine activity 16 1.05E-16

5518 collagen binding 16 4.65E-15


6954 inflammatory response 71 3.65E-55 30198 extracellular matrix organization 68 2.10E-52

6955 immune response 70 3.33E-52 45087 innate immune response 88 1.24E-46

7165 signal transduction 103 1.26E-46 7155 cell adhesion 68 3.70E-42

22617 extracellular matrix disassembly 35 5.56E-33 6935 chemotaxis 31 3.62E-27

30574 collagen catabolic process 26 1.04E-26 7267 cell-cell signaling 39 1.75E-25


5576 extracellular region 195 4.30E-112 5615 extracellular space 167 6.71E-99 5886 plasma membrane 257 2.39E-82

70062 extracellular vesicular exosome 195 3.56E-62

5887 integral component of plasma membrane

107 1.67E-45

31012 extracellular matrix 48 2.35E-42

16021 integral component of membrane 190 6.90E-37

5578 proteinaceous extracellular matrix 45 4.93E-33

9986 cell surface 60 4.62E-32

5829 cytosol 140 9.31E-30

●Cellular Component

● Biological Process

● Molecular Function

解析例

34


解析結果2 Reactome Pathway

BSID Name Count No of

Genes in Pathway

730306 Assembly of collagen fibrils and other multimeric structures 21 55

730309 Collagen degradation 12 39

771578 FCGR activation 11 36

645288 Collagen formation 26 88

645289 Collagen biosynthesis and modifying enzymes 19 65

106359 Chemokine receptors bind chemokines 16 60

106406 Initial triggering of complement 11 42

119557 PD-1 signaling 8 31

106110 Integrin cell surface interactions 17 66

106405 Complement cascade 15 60

187104 Interferon alpha/beta signaling 17 69

730310 Elastic fibre formation 10 41

105697 NCAM1 interactions 9 37

576262 Extracellular matrix organization 63 266

106407 Creation of C4 and C2 activators 8 35

解析例

35


GO解析ならびにPathway解析の結果、コ

ラーゲン合成系と分解系に関連する遺伝子

群が変動しているとことが推測された。

それに着目して、化合物による活性制御が

可能な遺伝子(タンパク)を特定をおこなった。

解析例

36


コラーゲン合成系と分解系に関連している変動遺伝子遺伝子リスト

ChEMBL AssayでpAct >= 5のInhibtor

遺伝子ごとに活性値を伴った化合物情報が表示される

pAct=活性値の-log

解析例

37


コラーゲン合成系と分解系に関連する発現変動遺伝子

ChEMBL Assay

Entrez GeneID Gene Symbol UniProt Entry

Name Target ID and Name #Activities

#Inhibitors (pAct>5)

#Binders (pAct>5)

4312 MMP1 MMP1_HUMAN CHEMBL332 Matrix metalloproteinase-1

6350 2102 18

1514 CTSL CATL1_HUMAN CHEMBL3837 Cathepsin L

2185 1009 0

4319 MMP10 MMP10_HUMAN CHEMBL4270 Matrix metalloproteinase 10

48 12 0

4067 LYN LYN_HUMAN CHEMBL3905 Tyrosine-protein kinase Lyn

2868 175 42


1357 870 0

1508 CTSB CATB_HUMAN CHEMBL4072 Cathepsin B

2010 726 2

8754 ADAM9 ADAM9_HUMAN CHEMBL5982 ADAM9

49 33 0

1520 CTSS CATS_HUMAN CHEMBL2954 Cathepsin S

2202 1478 48


2815 1574 3


9 5 0

1513 CTSK CATK_HUMAN CHEMBL268 Cathepsin K

2202 1464 0

解析例

化合物アッセイ情報がある遺伝子：11

MMP Family：5

38


Gene ID Symbol Gene Name Fold

change FDR

4312 MMP1 matrix metallopeptidase 1 (interstitial collagenase) 790.73 1.28E-17

4314 MMP3 matrix metallopeptidase 3 (stromelysin 1, progelatinase) 14.32 8.01E-03

4317 MMP8 matrix metallopeptidase 8 (neutrophil collagenase) 9.09 4.47E-03

4319 MMP10 matrix metallopeptidase 10 (stromelysin 2) 12.79 3.97E-04

4320 MMP11 matrix metallopeptidase 11 (stromelysin 3) 7.53 1.79E-02

MMP (マトリックスメタロプロテアーゼ)

diffuse SScで発現↑していたMMP

変動が大いMMP1 をターゲット化合物と

MMPマルチターゲット化合物の

探索を行った

解析例

39


MMP1は、interstitial collagenase とも呼ばれる各種癌や変形性関節症の標的にもなりうるタンパク質

解析例

40


MMP1は、interstitial collagenase とも呼ばれる各種癌や変形性関節症の標的にもなりうるタンパク質

MMP1 (diffuse SScで発現↑)の活性

を阻害する化合物のリスト

購入可能な化合物：40

Drug：13

解析例

41


MMPをターゲットとする化合物

SSCにおいて発現が上昇したMMPを

マルチターゲットとシングルターゲッ

トの阻害活性化合物を探索可能

解析例

42

遺伝子ごとに活性値が表示される


Cell based assay

-Inhibitor Compound

-Activator Compound

Significant Gene 1, 実測されたアッセイ情報を用いて遺伝子の化合物標的としての評価を迅速化

2, in vitro assayに用いる化合物の探索を通じてGene-Phenotype間の相関解析

3,情報の少ない遺伝子・タンパクの機能を結合化合物の作用から推定

遺伝子(protein)-活性化合物の関係を参照可能とすることで

Active chemical

related gene

Annotation filter

まとめ

43


今回ご紹介した製品

44

・LSKB 多様な情報を連携した知識データベースで、疾患、遺伝子、タンパク質やこれらのリストからの検索あるいは構造検索を出発に、短いステップで有用な情報を提示することを可能にしたシステム

・Disease Explorer 調べたい疾患の概要、関連遺伝子や変異情報、治療標的タンパク質や化合物情報まで一覧表示。

・Expressionアノテーター遺伝子のアノテーションのみでなく、タンパク質、疾患、Pathway、GO、ドメイン、PDB化合物、阻害、結合化合物と活性値などの情報を一度に閲覧できることが特徴。

・CLC Genomics Workbench CLCbio社のGenomics Workbenchは初歩的な遺伝子解析ツールから次世代シーケンスデータ解析ツールまでを網羅したデスクトップ型解析ソフトウェア。

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