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新一代测序平台文库制备技术简介
Roche 454 GS
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Roche 454 GS简介
Roche 454 GS
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454 GS 技术特点
• 测序通量:每次实验可产生450Mb的数据;
• 运行时间:每次实验运行10h;
• 序列读长:单条序列读长平均为450bp;
• 序列质量:单碱基准确率为99.995% ;
• 序列产量:平均每次实验可产生100万条序列。
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454 GS应用特点
• 454 GS也许是目前所有的二代测序仪中读长最长的测序仪,最高可达1000bp,平均在400bp以上,可用于基因组框架的搭建。因此454 GS在全基因组测序、转录组测序、扩增子测序和宏基因组测序领域都有着良好的应用。
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454 GS 技术原理
• Roche 454 GS是一种基于焦磷酸测序原理而建立起来的高通量基因组测序系统,依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术;
• 将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。通过检测荧光信号释放的有无和强度,就可以达到实时测定DNA序列的目的。
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焦磷酸酶级联化学反应
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454 GS 技术流程
1.文库制备
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2.乳滴PCR扩增(Emulsion PCR)
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Emulsion PCR(油包水)乳滴PCR
将PCR反应物包被于“油包水”的乳化剂中,PCR扩增过程就可以在每一滴乳化剂内独立进行。
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3. Bead Deposition
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4.焦磷酸测序
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5.图像获取、处理和数据分析
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454 GS文库制备
• 454 GS的文库要求片段长度较长,一般在300~800bp左右,起始样品有gDNA, cDNA, or amplicons;
• 基因组de novo测序:DNA文库构建的方法;
• 转录组de novo测序:具有方向性的RNA文库构建方法。
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Gnomegen DNA建库在454 GS平台上的应用特点
• 应用实例:-全基因学研究;-比较基因组学研究
• 特点:- 酶切打断;- 末端修复、加A尾和连接在同一试管内完成;- 再现性优化;- 更窄的片段长度范围且可重复性好。
• 优势:- 无需大量资本投入;- 可节约大量建库时间;- 产量高且可自动化操作;- 构建高质量文库。
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Gnomegen DNA建库流程
Forward PrimerReverse Primer
AA
AA
AA
TA
AT
End Repair and dA Tailing
Ligase Adaptors
PCR
Fragmented DNA
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Gnomegen RNA文库构建在454 GS上的应用特点
• 特点和优势:- 获得mRNA转录方向的信息—具有方向性的全转录组测序,有助于de novo拼接;- 简化的实验流程—单管反应,一天实验流程;- 初始量需求少—仅需10ng mRNA。
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Gnomegen RNA文库构建流程(全转录组)
5’ Adaptor ligation
Reverse
Transcription
PCR
AAA
Fragmented RNA
5’ Adaptor
NNNNNN RT Primer
Forward Primer
Reverse Primer with barcode
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454 GS应用领域
• Gnomegen系列文库制备试剂盒配合GS 454新一代测序仪可以为用户提供完整的文库构建解决方案。
基因组测序
转录组测序
扩增子测序
甲基化测序
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454 GS应用举例
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