İrritabl Bağırsak Sendromu ve Mikrobiyota: Türk Hastalardan Oluşan bir KohorttaDientamoeba fragilis, Blastocystis ve

Yeme Alışkanlıkları Ekseninde bir Ön Çalışma

Özgür Kurt1, Munkhtsetseg Banzragch2, Christen Rune Stensvold3,

Orhan Özcan4, Lee O’brien Andersen3, Sinem Öktem Okullu1,

Osman Uğur Sezerman4, Henrik Vedel Nielsen3, Ayşe Nurdan Tözün2

1Acıbadem Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İstanbul2Acıbadem Üniversitesi Tıp Fakültesi, İç Hastalıkları Anabilim Dalı Gastroenteroloji Bilim Dalı, İstanbul

3Statens Serum Institute, Dept of Microbiology and Infection Control, Parasitology Lab, Kopenhag-Danimarka4Acıbadem Üniversitesi Tıp Fakültesi, Biyoistatistik ve Tıp Bilişimi Ana Bilim Dalı, İstanbul

İrritabl Bağırsak Sendromu

• Genç, sağlıklı bireylerde, iş gücü kaybı, yaşam kalitesi

• Modern yaşam tarzı, yoğun iş, dengesiz beslenme

• Manning (1979) ve Rome (2000) Tanısal Kriterleri

• Etiyoloji? “Fonksiyonel Hastalık”

• Günümüzde NGS teknolojisi => “mikrobiyota İBS”

organik köken?

Horwitz BJ, Fisher RS. The irritable bowel syndrome. N Engl J Med 2001;344(24):1846–1850Drossman DA, Camilleri M, Mayer EA, Whitehead WE. AGA technical review on irritable bowel syndrome. Gastroenterology 2002;123(6):2108–2131

Manning AP, Thompson WG, Heaton KW, Morris AF. Towards positive diagnosis of the irritable bowel. BMJ 1978;2(6138): 653–654Drossman DA, Corazziari E, Talley NJ, et al. Rome II: The Functional Gastrointestinal Disorders: Diagnosis, Pathophysiology, and Treatment: A Multinational Consensus. 2nd ed. McLean, VA: Degnon Associates; 2000

Blastocystis & Dientamoeba fragilis:

Trichrome, x1000

CBU Parasitology

Dientamoeba fragilis

Blastocystis

Yıllarca non–patojen bağırsak ökaryotlarıolarak değerlendirildi.

90’ların sonunda D. fragilis ile Blastocystis’i gastrointestinal sistemdeve dermatolojik klinik olgulara yol açabilen parazitler olarak gösterençok sayıda çalışma yayınlandı..

Sonra, konuya bakış açımızda değişiklik olmaya başladı!

1. Özgün PCR protokollerinin geliştirilmesi

D. fragilis & Blastocystis => toplumlarda çok yaygın!

(Danimarka: 43% / Hollanda: 22% / Senegal: 100%)

Patojenler mi? Bağırsağın Doğal Sakinleri mi?

2. Yeni Nesil Sekanslama=> Bağırsak Mikrobiyotası”ndaki Bileşenlerin İyi Tanımlanması

Blastocystis & D. fragilis => Dost mu Düşman mı? İBS etiyopatogenezinde etkileri?

Amaçlar

Türkiye'den İBS kriteri karşılayan hasta ve sağlıklı insantopluluklarında bağırsak mikrobiotası içeriğinin,Blastocystis ve Dientamoeba fragilis dahil olmak üzere,yeni moleküler yöntemler ve ileri dizi analiziuygulamalarıyla saptanması,

Mikrobiyota içeriğindeki bakteriler ile adı geçen ikiprotozoonun (Blastocystis ve Dientamoeba fragilis)patojenite ya da sağlıklılık üzerindeki rollerinindeğerlendirilmesi,

Hastaların yaşam tarzı ile bu mikroorganizmalar arasıkorelasyonların araştırılması

Gereç ve Yöntem

Çalışma Grubu: ACU İç Hastalıkları Gastroenteroloji BilimDalı’na çeşitli gastrointestinal yakınmalarla başvurmuş,ayırıcı tanı için kolonoskopi uygulanmış, İBS tanı kriterlerinikarşılayan 14 hasta.

Kontrol Grubu: Kolorektal Ca taraması ya da klinik ya daradyolojik açıdan şüpheli bir lezyonun biyopsisi içinkolonoskopi uygulanan ve sonuç negatif çıkan, yaşı vecinsiyeti uyumlu 14 birey.

Gereç ve Yöntem

Gereç ve Yöntem

Dışkı örnekleri kolonoskopi sırasında alındı, +4°C'desaklandı!

DNA izolasyonu: Acıbadem Üniversitesi Ar-Gelaboratuvarlarında (Qiagen Stool Mini Kit®, Almanya)

Gereç ve Yöntem

• Mikrobiyota analizi: Kopenhag’dakiStatens Serum Enstitüsü’nde

=> “Genomik DNA’nın 16S ve 18S ribozomal DNA gen bölgeleri üzerinden yeni nesil sekanslama (Illumina MiSeq Platformu’nda) ile”…

Gereç ve Yöntem

Biyoinformatik Analiz => Acıbadem Üniversitesi Biyoistatistik ve Tıp Bilişimi A.D.’nda

Ham veriler İBS hastaları ve kontrol grubuna uygulanıp eşleştirildi ve yorumlandı

Gereç ve Yöntem

• Dientamoeba fragilis => Real Time PCR

(Verweij ve ark., 2007)

GEREÇ ve YÖNTEM (İstatistik)

Olgu sayısı az => Öngörü Modeli (Prediktif model) oluşturuldu=> “R programı”

Her bir bakteri türü kaç hastada / kaç kontrolde? Belirlendi

Hasta/Kontrol veya Kontrol/Hasta <2 bakteri türleri

değerlendirme dışı bırakıldı

Prediktif modelin çizimi => “RPart” programı (Olgu sayısı az)

Oluşturulan Model için “ki-kare analizi” yapıldı.

BULGULAR

BULGULAR

Geliştirilen öngörü modelinin ki-kare analiz değeri => 11.63 (Yüksek)Model %82’lik başarı oranı ile Hasta ve Kontrol’leri ayırmayı başardı.

BULGULARÖngörü modelinde analizler tür düzeyinde yapılıp

anlamlı sonuçlar elde edildi.

BULGULAR

Analizler Class düzeyinde

yapıldığında bakterilerin

dağılımında Hasta/Kontrol

ayrımı mümkün değil!

(Tür düzeyinde mümkün!)

BULGULAR – Anket bulguları

Özellik Hasta

Grubu

(n=14)

Kontrol

Grubu

(n=14)

Şehirde ikamet edenler (Kocaeli) 14 14

Hayvan besleme 4 1

Son 1 ay içinde antibiyotik kullananlar 3 0

Süt sonrası şişkinlik 7 3

Hiç et yemediğini bildiren (vejeteryan) 2 6

Yağlı öğünleri tüketen hastalarda => Erysipelotrichaceae türleri!

Erysipelotrichaceae, Escherichia/Shigella unclassified, Phascolarctobacterium faecium, Bacteriodes nordi

hasta grubunda anlamlı düzeyde daha sık (p<0,05)!

BULGULAR

BULGULAR

Bacteriodetes nordii basit karbonhidrat (simit,

bal, reçel, alkol) tüketenlerde İBS ile ilişkili

bulundu!

Hem Escherichia/Shigella unclassified ile

birlikte Bacteriodetes nordii’nin olduğu tüm

hastalarda Blastocystis de pozitif! İBS!

BULGULAR

Dientamoeba fragilis

=> Hasta Grubunda 2, Kontrol grubunda 4 kişide (+)

=> parazit mi, sağlıklı flora üyesi mi?

=> “Allisenolla histominofarmans” bakterisi saptanan iki hastada D. fragilis (+)

Histidin üreten bakteri! Vücut histidini almak için bağırsak hareketlerini yavaşlatır!

Tartışma

Geliştirilen prediktif model “Mikrobiota&İBS”

ilişkisini %82 düzeyinde gösterebilmekte!

Tür düzeyinde sonuç alınabilmekte!

İBS fonksiyonel + organik? Kökenli

Veriler yeni örneklerle değerlendirilmeli!

“Cross validation”

Sonraki Aşamalarda…

Aynı hastalar ve yeni hastaların kolon biyopsi, kan ve dışkı örnekleri ile:

- Mikrobiyota analizi

- İmmünolojik parametrelerin (örn. IL-17) analizi

- “Metabolomics” çalışmaları (bütçe???)

Teşekkürler…