rzeczpospolita tŁumaczenie patentu …public.sds.tiktalik.com/patenty/pdf/262075.pdf ·...

RZECZPOSPOLITA POLSKA

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej

Polskiej

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2236600

(96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 17.10.2005 10170532.5 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 19.09.2012 Europejski Biuletyn Patentowy 2012/38 EP 2236600 B1

(13) (51)

T3 Int.Cl. C12N 9/16 (2006.01) C12N 15/55 (2006.01) C12N 15/11 (2006.01) C12P 21/02 (2006.01) C12N 1/20 (2006.01) A23K 1/165 (2006.01)

(54) Tytuł wynalazku:

Fitazy

PL/E

P 22

3660

0 T3

(30) Pierwszeństwo:

18.10.2004 GB 0423139

(43) Zgłoszenie ogłoszono:

06.10.2010 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2010/40

(45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:

28.02.2013 Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/02

(73) Uprawniony z patentu:

DuPont Nutrition Biosciences ApS, Copenhagen, DK

(72) Twórca(y) wynalazku:

ANDREI MIASNIKOV, Mountain View, US VIJAY KUMAR, Casnate, IT OLIVER KENSCH, Cologne, DE KLAUS PELLENGAHR, Cologne, DE BIRGITTA LEUTHNER, Cologne, DE ULRICH KETTLING, Munich, DE ANDRE KOLTERMANN, Munich, DE

(74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Anna Grzelak

WTS RZECZNICY PATENTOWI WITEK, ŚNIEŻKO I PARTNERZY ul. R. Weigla 12 53-114 Wrocław

Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

EP 2 236 600 B1

Opis

[0001] Niniejszy wynalazek dotyczy fitaz, ich sekwencji nukleotydowych, sposobów wytwarzania fitaz i ich zastosowań.

DZIEDZINA WYNALAZKU

[0002] Niniejszy wynalazek dotyczy dziedziny enzymów stosowanych jako dodatki do pasz. W szczególności wynalazek dotyczy fitaz, które mogą być wykorzystane w celu poprawy trawienia fosforanów w żywności i paszach dla zwierząt.

INFORMACJE TECHNICZNE I STAN TECHNIKI

[0003] Fitynian jest główną formą magazynowania fosforu w zbożach i roślinach strączkowych. Jednakże zwierzęta monogastryczne, takie jak świnie, drób i ryby, nie są zdolne do metabolizowania lub pochłaniania fitynianu (lub kwasu fitynowego), a więc jest on wydalany, co prowadzi do zanieczyszczenia fosforem na obszarach intensywnej produkcji zwierzęcej. Ponadto kwas fitynowy działa również jako czynnik antyżywieniowy u zwierząt monogastrycznych poprzez chelatowanie metali, takich jak wapń, miedź i cynk.

[0004] W celu zapewnienia wystarczającej ilości fosforanów niezbędnych dla wzrostu i zdrowia tych zwierząt, do ich diety dodawany jest fosforan nieorganiczny. Taki dodatek może być kosztowny i w dalszym ciągu zwiększa problemy związane z zanieczyszczeniem.

[0005] Dzięki działaniu fitazy, fitynian jest zazwyczaj poddawany hydrolizie w celu otrzymania niższych fosforanów inozytolu i fosforanu nieorganicznego. Fitazy są przydatne jako dodatki do pasz dla zwierząt, w których zwiększają dostępność fosforu organicznego dla zwierząt i zmniejszają zanieczyszczenie środowiska fosforanami (Wodziński RJ, Ullah AH. Adv Appl Microbiol. 42, 263-302 (1996)).

[0006] W literaturze opisano wiele fitaz pochodzenia grzybiczego (Wyss M. et al. Appl. Environ. Microbiol. 65 (2), 367-373 (1999); Berka R.M. et al. Appl. Environ. Microbiol. 64 (11), 4423-4427 (1998); Lassen S. et al. Appl. Environ. Microbiol. 67 (10), 4701-4707 (2001)) oraz bakteryjnego (Greiner R. et al Arch. Biochem. Biophys. 303 (1), 107-113 (1993); Kerovuo et al. Appl. Environ. Microbiol. 64 (6), 2079-2085 (1998); Kim H.W. et al. Biotechnol. Lett. 25, 1231-1234 (2003); Greiner R. et al. Arch. Biochem. Biophys. 341 (2), 201-206 (1997); Yoon S.J. et al. Enzyme and microbial technol. 18, 449-454 (1996); Zinin N.V. et al. FEMS Microbiol. Lett. 236, 283-290 (2004)).

[007] Na przykład zmutowany enzym fitazy E. coli i ich naturalne warianty są znane z WO2004/015084, a fitazy produkowane z Citrobacter braakii są znane z WO2004/085638. Inne bakteryjne fitazy zostały przedstawione za pomocą pobierania próbek i metod przesiewowych (Zinn N. V. i wsp. Biotehnologia, Glavnoe Upravlenie Mikrobiologiceskoj Promy Lennosti Pri, 2, 3-10 (2003)).

[008] Jednak do tej pory żadna z tych fitaz nie wykazuje właściwości niezbędnych do skutecznego stosowania jako suplement do paszy zwierzęcej. W szczególności fitazy grzybicze bywają proteolitycznie niestabilne (Igbasan F.A. i wsp. Arch. Anim. Nutr. 53,353-373 (2000)) i w związku z tym są podatne na degradację, podczas gdy większość fitaz bakteryjnych ma wąską specyficzność substratową dla samego fitynianu i słabo degraduje fosforany inozytolu pośrednich stopni fosforylacji (Greiner R. i wsp., Arch. Biochem. Biophys. 303 (1), 107-113 (1993); Kerovuo J. i wsp. Biochem. J. 352, 623-628 (2000)). Uznaje się, że fitaza ze stabilnością termiczną i stabilnością kwasową oraz szeroką specyficznością substratu i wysoką aktywnością specyficzną jest wysoce wskazana w szczególności w żywieniu zwierząt (VatsP i wsp. Enzyme and Microbial Technology.35,3-14(2004)).

[009] W związku z powyższym, istnieje zapotrzebowanie na ulepszone fitazy.

1

EP 2 236 600 B1

STRESZCZENIE WYNALAZKU

[0010] W szerokim aspekcie niniejszy wynalazek odnosi się do wyizolowanych cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących fitazy uzyskane z bakterii i ich zmodyfikowanych postaci. W szczególności wynalazek dotyczy wyizolowanych cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących fitazy uzyskanych z bakterii, Buttiauxella sp. i ich wariantów/ zmodyfikowanych postaci wybranych i/lub zmodyfikowanych w celu poprawy właściwości w porównaniu z enzymem typu dzikiego (macierzystym).

[0011] Niniejszy wynalazek jest korzystny, ponieważ przedstawia wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące nowe fitazy, których właściwości są szczególnie użyteczne i skuteczne jako enzymy paszowe. W szczególności wynalazek dotyczy wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej wyizolowane i/lub oczyszczonych polipeptydów nowych fitaz, jak tu opisano, lub ich funkcjonalnego fragmentu, wariantów lub zmodyfikowanych postaci, lub ich zmodyfikowanych postaci.

[0012] Dla skuteczności jako dodatek enzymowy do żywności lub paszy, fitaza musi łączyć wiele różnych właściwości. Aby móc obniżyć poziom kwasu fitynowego w kwaśnym środowisku żołądka zwierzęcego, fitaza musi być aktywna w niskim pH, najlepiej w szerokim zakresie wartości pH. Ponadto musi odznaczać się wysoką specyficzną aktywnością i posiadać korzystnie wysoką termostabilność, aby uaktywnić białko, które wytrzyma wysokie temperatury zazwyczaj stosowane w przygotowywaniu pasz takich jak granulaty paszowe.

[0013] Ważne jest także, aby enzym posiadał szeroką specyficzność substratową, która pozwoli mu na

hydrolizę nie tylko fitynianu, ale również produktów pośrednich rozkładu fitynianu, takich jak pentafosforany,

trifosforany i tetrafosforany inozytolu. Badania dotyczące degradacji fitynianu u świń wykazują, że te

oligofosforany inozytolu pozostają w znacznym stopniu nierozpuszczalne w jelicie cienkim i grubym, i tym

samym są niedostępne dla fosfatazy alkalicznej wytwarzanej przez zwierzęta i mikroflorę jelit (Schlemmer U.

i wsp. Arch. Anim. Nutr. 55 255-280 (2001)). Stwierdzono występowanie różnic w profilach specyficzności

substratowej różnych enzymów. Na przykład trifosforany inozytolu generowane przez fitazy z B. subtilis są

zasadniczo odporne na dalszą hydrolizę przez ten enzym [Kerovuo J. i wsp. Biochem. J. 352,623-628

(2000)].

[0014] W innym aspekcie wynalazku opisany jest plazmid lub system wektora, lub przekształcony czy transgeniczny organizm zawierający wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą nową fitazę tu opisaną lub jej zmodyfikowaną postać.

[0015] W innym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy organizmów transgenicznych zmodyfikowanych w celu ekspresji nowej fitazy, jak tu opisano, lub ich zmodyfikowanych postaci, a więc zdolnych do wytwarzania fitazy. Niniejszy wynalazek dostarcza sposobów i metod produkcji biotechnologicznej fitaz i opisuje ich zastosowanie jako dodatków paszowych.

[0016] Aspekty niniejszego wynalazku przedstawione są w zastrzeżeniach patentowych i w następującym komentarzu.

[0017] Dla ułatwienia, te i inne aspekty niniejszego wynalazku są omówione w odpowiednich pozycjach sekcji. Jednakże wiedza przedstawiona w poszczególnych sekcjach, nie jest koniecznie ograniczona do danej sekcji.

[0018] Stosowane w odniesieniu do niniejszego wynalazku terminy „produkować”, „produkowanie”, „produkowane”, „możliwe do wyprodukowania”, „produkcja” są odpowiednio synonimami określeń:

2

EP 2 236 600 B1

„przygotować”, „przygotowanie”, „przygotowane”, „preparat”, „wytworzone”, „wytwarzanie” i „możliwe do wytworzenia”.

[0019] Stosowane w odniesieniu do niniejszego wynalazku określenia: „ekspresja”, „dokonuje ekspresji”, „eksprymowany” i „możliwe do ekspresji”, są odpowiednio synonimami określeń: „transkrypcja”, „transkrybuje”, „transkrybowane” i „dające się transkrybować”.

[0020] Stosowane w odniesieniu do niniejszego wynalazku określenia: „transformacja” i „transfekcja” dotyczą sposobu wprowadzenia sekwencji kwasu nukleinowego do gospodarzy, komórek gospodarza, tkanek lub narządów.

[0021] Inne aspekty dotyczące sekwencji nukleotydowych, które mogą być stosowane w niniejszym wynalazku obejmują: konstrukt zawierający sekwencje niniejszego wynalazku, wektor zawierający sekwencje do stosowania w niniejszym wynalazku, plazmid zawierający sekwencje do stosowania w niniejszym wynalazku, transformowaną komórkę zawierającą sekwencje do stosowania w niniejszym wynalazku, transformowaną tkankę zawierającą sekwencje do stosowania w niniejszym wynalazku, transformowany organ zawierający sekwencje do stosowania w niniejszym wynalazku, transformowanego gospodarza zawierającego sekwencje do stosowania w niniejszym wynalazku, transformowany organizm zawierający sekwencje do stosowania w niniejszym wynalazku. Niniejszy wynalazek obejmuje także sposoby ekspresji sekwencji nukleotydowej do stosowania w niniejszym wynalazku, za pomocą tej samej ekspresji co w komórce gospodarza; włączając sposoby jego przenoszenia. Niniejszy wynalazek obejmuje też sposoby izolowania sekwencji nukleotydów, takie jak izolowanie z komórki gospodarza.

[0022] Inne aspekty dotyczące sekwencji aminokwasowych do stosowania w sposobach niniejszego wynalazku obejmują: konstrukt kodujący sekwencje aminokwasowe do stosowania w niniejszym wynalazku, wektor kodujący sekwencje aminokwasowe do stosowania w niniejszym wynalazku, plazmid kodujący sekwencje aminokwasowe do stosowania w niniejszym wynalazku, transformowaną komórkę dokonującą ekspresji sekwencji aminokwasowej do stosowania w niniejszym wynalazku, transformowaną tkankę dokonującą ekspresji sekwencji aminokwasowej do stosowania w niniejszym wynalazku, transformowany organ dokonujący ekspresji sekwencji aminokwasowej do stosowania w niniejszym wynalazku, transformowanego gospodarza dokonującego ekspresji sekwencji aminokwasowej do stosowania w niniejszym wynalazku, transformowany organizm dokonujący ekspresji sekwencji aminokwasowej do stosowania w niniejszym wynalazku. Niniejszy wynalazek obejmuje również sposoby oczyszczania sekwencji aminokwasowej do stosowania w niniejszym wynalazku, za pomocą tej samej ekspresji co w komórce gospodarza, w tym sposobów przenoszenia, a następnie oczyszczania wspomnianej sekwencji.

KRÓTKI OPIS FIGUR

[0023]

Figura 1 przedstawia analizę SDS PAGE fitazy rekombinowanej z Buttiauxella P1-29 oczyszczonej metodą chromatografii z użyciem DEAE-Sefarozy. Figura przedstawia ślad skanowania cyfrowego obrazu fotograficznego ścieżki zawierającej próbkę fitazy Buttiauxella.

Figura 2 przedstawia profil pH fitazy z Buttiauxella P1-29.

Figura 3 przedstawia specyficzność substratową oczyszczonej fitazy rekombinowanej z Buttiauxella P1-29 z frakcjami fosforanu inozytolu o różnym stopniu fosforylacji i substratami modelowymi. Skróty: IP6 – kwas fitynowy, IP5, IP4 i IP3 – mieszaniny izomerów, odpowiednio penta-, tetra- i trifosforanów inozytolu. Fru P2 –1,6 –difosforan fruktozy, Fru P1 – 6-fosforan fruktozy.

3

EP 2 236 600 B1

[0024] SEQ ID NR: 1 przedstawia sekwencję uzyskaną do identyfikacji szczepu bakteryjnego.

[0025] SEQ ID NR: 2 przedstawia sekwencję polinukleotydową zawierającą gen fitazy z Buttiauxella P1-29.

[0026] SEQ ID NR: 3 przedstawia sekwencję aminokwasową genu fitazy z Buttiauxella P1-29.

SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU

[0027] Niniejszy wynalazek przedstawia wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej enzym zawierający sekwencję aminokwasową odpowiadającą fitazie Buttiauxella sp. lub zmodyfikowanej formie, homologowi, wariantowi, funkcjonalnemu ekwiwalentowi lub jej efektywnemu fragmentowi.

[0028] Termin "fitaza" oznacza białko lub polipeptyd, który jest zdolny do katalizowania hydrolizy estrów kwasu fosforowego, w tym fitynianu i uwalniania fosforanu nieorganicznego. Niektóre fitazy, tak jak fitynian, są zdolne do hydrolizy przynajmniej niektórych fosforanów inozytolu o pośrednich stopniach fosforylacji.

[0029] Termin "odpowiadający fitazie Buttiauxella sp." oznacza, że enzymy nie muszą być uzyskiwane ze źródła Buttiauxella sp. Zamiast tego, najlepiej gdyby enzym posiadał te same właściwości funkcjonalne lub sekwencję taką, jak w fitazie Buttiauxella sp. Na przykład fitaza Buttiauxella sp. może być wariantem pochodzącym z Buttiauxella sp., ale nieobecnym naturalnie w gatunkach Buttiauxella.

[0030] Gatunki Buttiauxella spp. obejmują: Buttiauxella agrestis, Buttiauxella brennerae, Buttiauxella ferragutiae, Buttiauxella gaviniae, Buttiauxella izardii, Buttiauxella noackiae, Buttiauxella warmboldiae. Szczepy gatunków Buttiauxella są dostępne w DSMZ, Niemieckim Narodowym Ośrodku Zasobów Materiałów Biologicznych. Fitazy są korzystnie zidentyfikowane z Buttiauxella spp. za pomocą metod opisanych w niniejszym dokumencie, np.: hybrydyzacji do SEQ ID NR 2. Szczepy Buttiauxella spp. korzystne do izolowania polipeptydów i/lub polinukleotydów wynalazku są przedstawione w przykładach.

[0031] Określenia „fitaza typu dzikiego” lub „typ dziki”, stosownie do wynalazku, opisują enzym fitazy z sekwencją aminokwasową występującą w przyrodzie.

[0032] Określenia „wariant enzymu fitazy”, „wariant fitazy” lub “wariant” stosownie do wynalazku, opisują enzym fitazy z sekwencją aminokwasową pochodzącą z sekwencji aminokwasowej fitazy macierzystej, ale różniący się jednym lub więcej niż jednym podstawieniem, insercjami i/lub delecjami aminokwasów, które razem określane są jako „mutacje”. Przewiduje się, że wariant enzymu fitazy może być również enzymem fitazy macierzystej w dalszych etapach sposobów przygotowywania wariantów fitaz, takich jak ewolucja molekularna.

[0033] Określenie „polipeptyd(y) homologiczny(e)”, stosownie do niniejszego wynalazku, opisane tu również jako „homologi”, opisuje polipeptydy, najlepiej enzymy fitaz (np. „homologiczne fitazy” lub „homologiczne enzymy”) z identycznością sekwencji powyżej 75% w porównaniu do pierwszej sekwencji aminokwasowej polipeptydów/fitaz/enzymów, korzystnie posiada przynajmniej 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% homologii sekwencji.

4

[0034] Określenie „jego funkcjonalny równoważnik“ oznacza, że enzym powinien posiadać prawie takie same właściwości funkcjonalne, jak fitaza Buttiauxella sp. Określenie „zmodyfikowana postać” lub „wariant” oznacza, że enzym został zmodyfikowany w pierwotnej postaci, ale zachowuje te same funkcjonalne właściwości enzymatyczne co fitaza Buttiauxella sp. W szczególności, określenia „wariant” lub „zmodyfikowana postać” obejmują enzymy fitaz z sekwencją aminokwasową pochodzącą od sekwencji aminokwasowej fitazy macierzystej/typu dzikiego i posiadającą jedną lub więcej podstawień, insercji i/lub delecji aminokwasów, które łącznie nazywa się mutacjami. Zmodyfikowane postaci lub warianty mogą wykazywać zmienione właściwości enzymu w porównaniu z enzymem macierzystym. Korzystnie zmodyfikowane postaci lub warianty mają jeden lub więcej z następujących fenotypów ulepszonych:

EP 2 236 600 B1

zwiększoną termostabilność; i/lub zwiększoną stabilność proteolityczną (np. pepsyna); i/lub zwiększoną aktywność specyficzną; i/lub szerszą specyfikację substratową; i/lub aktywność w szerszym zakresie pH. Określenie „funkcjonalny” lub „efektywny” fragment oznacza fragment lub część fitazy Buttiauxella sp., który(a) zachowuje prawie taką samą funkcję enzymatyczną lub działanie.

[0035] Korzystnie wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca enzym fitazy w tym aspekcie niniejszego wynalazku posiada taką samą sekwencję lub sekwencję, która jest co najmniej w 80% identyczna (homologiczna) z sekwencją fitazy Buttiauxella sp.

[0036] Odpowiednio, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca enzym zawiera sekwencję aminokwasową jak pokazano w SEQ ID NR: 3 lub sekwencję wykazującą co najmniej 80% identyczności (homologii). W korzystnej postaci wykonania, wynalazek przedstawia wyizolowaną i/lub oczyszczoną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd posiadający sekwencję aminokwasową określoną w SEQ ID NR: 3 lub sekwencję wykazującą co najmniej 80% identyczności (homologii). W odniesieniu do SEQ ID NR: 3 i polipeptydów zawierających SEQ ID NR: 3, przewiduje się, że to także odnosi się do polipeptydów, które są przetworzone współ- lub post-translacyjnie podczas ekspresji, na przykład przez rozszczepienie peptydu sygnałowego. Post-translacyjne rozszczepienie może również pojawić się przy końcówce C. Dlatego też, w korzystnym wykonaniu, jego fragment funkcjonalny jest dojrzałym polipeptydem wytwarzanym przez rodzimego gospodarza lub odpowiedniego gospodarza ekspresji.

[0037] W innym wykonaniu, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca fitazę charakteryzuje się tym, że pochodzi ze szczepu P1-29 Buttiauxella sp. zdeponowanego pod numerem dostępu NCIMB 41248.

[0038] W korzystnym wykonaniu wynalazek odnosi się do wyizolowanej cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującej fitazę zgodnie z jakimkolwiek wykonaniem pierwszego aspektu wynalazku, który zawiera jedną lub więcej mutacji w następujących pozycjach (numeracja według numeracji w SEQ ID NR 3):

59, 70, 122, 125, 167, 193, 197, 204, 209, 211, 221, 223, 225, 240, 242, 244, 268, 281, 289, 294, 303, 336, 351.

[0039] Pozycje te charakteryzują się tym, że mutageneza enzymu w tych pozycjach prowadzi do poprawy właściwości pożądanych enzymów.

[0040] Poniższe podstawienia mogą być korzystnymi wariantami:

K 59 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y T 70 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W lub Y A 122 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y D 125 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y T 167 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W lub Y H 193 A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y F 197 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y T 204 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W, lub Y T 209 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W lub Y A 211 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y G 221 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y 1223 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y S 225 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W lub Y K 240 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y A 242 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y D 244 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y

5

EP 2 236 600 B1

A 268 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y L 281 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y Q 289 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W lub Y A 294 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y N 303 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W lub Y I 336 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y N 351. A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W lub Y

[0041] Przez określenie „mutacje konserwatywne” rozumie się mutacje reszt aminokwasowych, które są konserwatywne pod względem właściwości aminokwasowych w porównaniu ze wskazaną resztą aminokwasową. Do właściwości aminokwasów należą: wielkość reszty, hydrofobowość, biegunowość, ładunek, wartość pK i inne znane właściwości aminokwasów w dziedzinie. Preferowane mutacje konserwatywne są wymienione poniżej jako podstawienia konserwatywne.

[0042] W szczególnie korzystnej postaci wykonania, mutacje występują w jednej lub więcej z następujących pozycji: K59; T167; K240; T167; K240; D244; Q289; T209 i F197.

[0043] Preferowane mutacje w tych określonych pozycjach są wymienione powyżej, korzystniejsze mutacje obejmują: K59E; T167V; K240T; T167I; K240E; D244C; Q289Y; T209K i F197S.

[0044] W dalszym korzystnym wykonaniu, przedstawiona jest wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca fitazę zawierającą kombinację mutacji wybranych z grupy składającej się z:

D125E/H193R; A294E/N303K; T167I/K240T; D223E/K240E/N351D; T167I/K240T/A294E/N303K; T167I/K240E/A242S/A294E/N303K; A122T/T167I/F1975/T209K/A211P/K240E/A294E/N303K; A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K; A122T/D125E/H193R/F197S/T209K/A211P/S221N/G225A/K240E/A294EJ N303K; D125E/T167I/H193R/F1975/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K; A122T/T167I/H193R/F1975/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K/I336F i N70Y/D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K.

[0045] W związku z powyższym, korzystna fitaza kodowana przez wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zgodnie z niniejszym wynalazkiem, jest wariantem obejmującym sekwencję aminokwasową wymienioną jako SEQ ID NR: 3 (lub jego homologiem, a najlepiej gdy fitaza charakteryzuje się tym, że pochodzi ze szczepu P1-29 Buttiauxella sp. zdeponowanego pod numerem dostępu NCIMB 41248, lub jest jego homologiem), z wyjątkiem posiadania jednej lub więcej mutacji aminokwasów wymienionych powyżej lub jednej z kombinacji wymienionych powyżej mutacji.

[0046] W tych przykładach wykonania, nomenklatura wskazuje fitazę zawierającą sekwencję aminokwasową określoną w SEKW. NR ID: 3 z mutacjami wskazanymi w odniesieniu do pozycji aminokwasów w SEQ ID NR: 3. Nomenklatura opisana jest bardziej szczegółowo poniżej.

[0047] Odpowiednio, warianty te wykazują polepszone właściwości w zakresie któregokolwiek z następujących: stabilność temperatury, zakres pH, stabilność pepsyny, specyficzna aktywność, specyficzność substratowa i szersza specyficzność substratowa. Ujawnione tu zostały odpowiednie sposoby określania tych właściwości.

6

EP 2 236 600 B1

[0048] W szczególności, poprawione właściwości fitazy dotyczą: stabilności enzymu w warunkach przetwarzania żywności i paszy, stabilności enzymu podczas transportu do żołądka, a także aktywności enzymatycznej i stabilności w żołądku ludzkim i zwierzęcym i/lub jelitach sprawiając, że ulepszone warianty są szczególnie odpowiednie do stosowania jako dodatki do pasz. Tak więc, takie ulepszenia obejmują, między innymi parametry wzrostu stabilności w podwyższonych temperaturach, najlepiej w temperaturze powyżej 65°C, wzrost stabilności wobec trawienia proteolitycznego, najlepiej proteazą przewodu pokarmowego, taką jak pepsyna, wzrost aktywności katalitycznej w niskim pH, najlepiej aktywność katalityczną poniżej pH 5,5 i ogólną efektywność uwalniania grup fosforanowych z fitynianu, a najlepiej dodatkowo w fosforanach inozytolu.

Nomenklatura

[0049] W niniejszym opisie i zastrzeżeniach stosuje się konwencjonalne jednoliterowe i trzyliterowe kody reszt aminokwasowych. Dla ułatwienia, mutacje w wariantach enzymów zostały opisane poprzez zastosowanie następującej nomenklatury: reszta aminokwasowa w enzymie macierzystym, pozycja, podstawiona(e) reszta(y) aminokwasowa(e). Zgodnie z tą nomenklaturą, podstawienie na przykład reszty alaniny resztą glicyny w pozycji 20, jest oznaczone jako Ala20Gly lub A20G. Delecja alaniny w tej samej pozycji jest pokazana jako Ala20* lub A20*. Insercja dodatkowej reszty aminokwasowej (np. glicyny) jest oznaczona jako Ala20AlaGly lub A20AG. Delecja kolejnego odcinka reszt aminokwasowych (np. pomiędzy alaniną w pozycji 20 a glicyną w pozycji 21) jest oznaczona jako Δ(Ala20-Gly21) lub Δ(A20-G21). Kiedy sekwencja enzymu macierzystego zawiera delecję w porównaniu do sekwencji enzymu stosowanego do numeracji insercji w takiej pozycji (np. alanina w usuniętej pozycji 20), jest to oznaczone jako *20Ala lub *20A. Mutacje wielokrotne są oddzielone znakiem plus lub ukośnikiem. Na przykład dwie mutacje w pozycjach 20 i 21, zastępujące alaninę i kwas glutaminowy glicyną i seryną, są odpowiednio określone jako A20G+E21 S lub A20G/E21 S. Gdy reszta aminokwasowa w danym położeniu jest zastąpiona dwoma lub więcej alternatywnymi resztami aminokwasowymi, wtedy reszty te są oddzielone przecinkiem lub ukośnikiem. Na przykład zastąpienie alaniny w pozycji 30 glicyną lub kwasem glutaminowym jest oznaczone jako A20G,E lub A20G/E lub A20G, A20E. Gdy odpowiednia do modyfikacji pozycja jest tu określona bez sugerowania specyficznej modyfikacji, powinno zostać to zrozumiane, że jakakolwiek reszta aminokwasowa może być podstawiona za resztę aminokwasową obecną w pozycji. Zatem, na przykład kiedy wspomniana jest modyfikacja alaniny w pozycji 20, ale nie jest ona określona, należy rozumieć, że alanina może być usunięta lub zastąpiona przez inną resztę aminokwasową (np. jedną z R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V).

[0050] Odpowiednio, fitaza lub wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca ekwiwalent funkcjonalny niniejszego wynalazku charakteryzuje się tym, że ma aktywność specyficzną co najmniej 300 U/mg, przy czym specyficzna aktywność jest określana przez inkubację wspomnianej fitazy w roztworze zawierającym 2mM fitynian i 0,8mM CaCl₂ w 200 mM buforze octanu sodu przy pH równym 3,5, jak określono w Przykładzie 1. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca fitazę niniejszego wynalazku, może także korzystnie charakteryzować się tym, że maksima aktywności osiąga przy pH wynoszącym ok. 4 - 4,5, przy czym wspomniana aktywność jest określona przez inkubację fitazy w roztworze zawierającym 2 mM fitynianu, 0,8mM CaCl₂ w 200mM buforu octanu sodu. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca fitazę niniejszego wynalazku, może również dogodnie charakteryzować się tym, że 40% lub więcej maksymalnej aktywności zaobserwowano przy pH 2,5 i 5,5, przy czym do określania aktywności przy pH 2,5 służy bufor chlorowodorku glicyny.

[0051] W jednym z wykonań, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca fitazę niniejszego wynalazku charakteryzuje się aktywnością specyficzną 330 U/mg lub wyższą, przy czym aktywność specyficzna jest określona przez inkubację wspomnianej fitazy w roztworze zawierającym 2mM fitynianu, 0,8mM CaCl₂ w 200mM buforu octanu sodu o pH równym 3,5. W innym wykonaniu, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca fitazę niniejszego wynalazku może dogodnie charakteryzować się tym, że

7

EP 2 236 600 B1

osiąga dwa maksima aktywności przy pH wynoszącym około 3 i pH 4 - 4,5, przy czym wspomniana aktywność określana jest przez inkubację wspomnianej fitazy w roztworze zawierającym 2mM fitynianu, 0,8mM CaCl ₂ w 200mM buforu octanu sodu.

[0052] W innym aspekcie, w niniejszym dokumencie opisano wyizolowaną i/lub oczyszczoną cząsteczkę kwasu nukleinowego, lub sekwencję nukleotydową kodującą enzym zawierający sekwencję aminokwasową odpowiadającą fitazie Buttiauxella sp. lub jej homologowi. Odpowiednio wyizolowana i/lub oczyszczona cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NR: 3 lub sekwencję o co najmniej 80% identyczności (homologii) lub jej fragment efektywny. W jednym wykonaniu cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd zawierający SEQ ID NR: 3 w tym zawierającą mutacje w preferowanych pozycjach wymienionych w niniejszym dokumencie lub dowolne specyficzne mutacje czy kombinacje mutacji wymienione w niniejszym dokumencie. W innym wykonaniu wynalazek przedstawia wyizolowaną i/lub oczyszczoną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową, która jest taka sama, lub jest komplementarna z, lub zawiera dowolne odpowiednie podstawienia kodonowe dla dowolnych z SEQ ID NR: 2 lub zawiera sekwencję, która posiada co najmniej 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% homologii z sekwencją SEQ ID NR: 2.

[0053] W jeszcze innym aspekcie, niniejszy dokument opisuje sekwencję nukleotydową i zastosowanie sekwencji nukleotydowej przedstawionej jako:

(a) sekwencja nukleotydowa przedstawiona jako SEQ ID NR 2, (b) sekwencja nukleotydowa, która jest wariantem, homologiem, pochodną lub fragmentem sekwencji nukleotydowej przedstawionej jako SEQ ID NR 2; (c) sekwencja nukleotydowa, która stanowi uzupełnienie sekwencji nukleotydowej określonej w SEQ ID NR 2; (d) sekwencja nukleotydowa, która jest uzupełnieniem wariantu, homologu, pochodnej lub fragmentu sekwencji nukleotydowej przedstawionej jako SEQ ID NR 2; (e) sekwencja nukleotydowa, która jest zdolna do hybrydyzacji do sekwencji nukleotydowej określonej w SEQ ID NR 2; (f) sekwencja nukleotydowa, która jest zdolna do hybrydyzacji z wariantem, homologiem, pochodną lub fragmentem sekwencji nukleotydowej przedstawionej jako SEQ ID NR 2; (g) sekwencja nukleotydowa, która jest uzupełnieniem sekwencji nukleotydowej, zdolnej do hybrydyzacji do sekwencji nukleotydowej określonej w SEQ ID NR 2; (h) sekwencja nukleotydowa, która jest uzupełnieniem sekwencji nukleotydowej, która jest zdolna do hybrydyzacji z wariantem, homologiem, pochodną lub fragmentem sekwencji nukleotydowej przedstawionej jako SEQ ID NR 2; (i) sekwencja nukleotydowa, która jest zdolna do hybrydyzacji z uzupełnieniem sekwencji nukleotydowej określonej w SEQ ID NR 2; (j) sekwencja nukleotydowa, która jest zdolna do hybrydyzacji z uzupełnieniem wariantu, homologu, pochodnej lub fragmentu sekwencji nukleotydowej przedstawionej jako SEQ ID NR 2.

[0054] Uznaje się, że nukleotyd hybrydyzuje z jednym z powyższych nukleotydów (e), (f), (g), (h), (i) lub (j), jeżeli jest zdolny do hybrydyzacji w warunkach średniej rygorystyczności, korzystniej wysokiej rygorystyczności, a najlepiej w warunkach bardzo wysokiej rygorystyczności.

[0055] W celu przygotowania próby hybrydyzacyjnej, można skorzystać ze standardowych protokołów biologii molekularnej, stosowanych w hybrydyzacji (np. metoda Southerna wykorzystywana do hybrydyzacji DNA). Ilość docelowego DNA zależy od względnej obfitości sekwencji docelowej. Jeżeli zostanie zastosowana czysta sekwencja docelowa, to najlepiej jest użyć od 1 do 5 pikogramów DNA na kilobazę polinukleotydów. Zazwyczaj granica wykrywalności wynosi około 0,5pg DNA dla sondy radioaktywnej ze specyficzną aktywnością 10⁹dpm/mg, co jest równoważne pojedynczej kopii genu o długości 500pb w 3,3mg genomowego DNA złożonego genomu (np. człowieka). W praktyce używa się ok. 10mg genomowego DNA - na przykład w celu zbadania organizmów, takich jak mikroorganizmy, które zawierają polinukleotyd kodujący fitazę tego wynalazku. Jeżeli docelowe DNA jest bakteryjne lub, na przykład, plazmidowe, wtedy należy

8

EP 2 236 600 B1

odpowiednio rozcieńczyć DNA , aby uniknąć narażenia na nadmierną ekspozycję. Docelowe DNA jest blotowane, np. metodą „dot blotting” lub przez transfer z żelu elektroforezowego. Preferowane warunki opisane są w „Membrane Transfer and Detection Methods”, Amersham International plc, UK.- PI/162/85/1). Korzystne jest zastosowanie membrany nylonowej dodatnio naładowanej Hybond N+ (Amersham Life Science). Aby przygotować sondę > 1X10⁹dpm/mikrogram, najlepiej ją wykonać zgodnie z zestawem do etykietowania firmy Pharmacia, ’Ready to Go DNA™. Sonda używana jest w buforze do hybrydyzacji, w stężeniu 1x10⁶dpm na milimetr buforu. Przeniesione próbki są prehybrydyzowane w buforze do hybrydyzacji (6 x SSC, 5 x roztwór Denhardta, 0,5% SDS i denaturowane DNA ze spermy łososia w 100mg/ml bufora) przez godzinę w temperaturze 65oC, a następnie hybrydyzowane w buforze do hybrydyzacji zawierającym denaturowaną, znakowaną sondę, z wytrząsaniem przez 12 godzin w temperaturze 65oC. Próbka(i) są następnie przemywane odpowiednią objętością buforu do przemywania (zwykle 50ml), w 2xSSC, 0,1% SDS przez 30 minut w 65oC, po czym są ponownie przemywane w odpowiedniej objętości buforu do przemywania (zwykle 50 ml) albo w tym samym buforze (2xSSC, 0,1% SDS) dla średniej rygorystyczności lub 0,1% x SSC, 0,1% SDS przez 10 minut w 65oC (wysoka rygorystyczność). Drugie mycie może być powtórzone w 70oC , dla osiągnięcia bardzo wysokiej rygorystyczności przemywania. [0056] Sekwencja nukleotydowa niniejszego wynalazku może zawierać sekwencje kodujące dla SEQ ID Nr 3 lub jej efektywnego fragment lub wariantu, zmodyfikowanej postaci, homologu lub jej pochodnej.

[0057] Wynalazek opisuje zwłaszcza plazmid lub system wektora zawierający opisaną tu fitazę lub jej homolog czy pochodną. Najlepiej, jeżeli plazmid lub system wektora zawiera sekwencję kwasu nukleinowego jak określono w SEQ ID NR: 2 lub sekwencję, która jest w co najmniej 80% homologiczna do niej lub jej efektywny fragment. Najlepiej, jeżeli plazmid lub system wektora jest wektorem ekspresyjnym dla ekspresji dowolnych enzymów kodowanych przez sekwencję kwasu nukleinowego, jak określono w którejkolwiek z SEQ ID NR: 2 lub sekwencję, która jest w mikroorganizmie co najmniej w 80% z nią homologiczna (identyczna). Właściwe wektory ekspresyjne są opisane w niniejszym dokumencie. Wynalazek dodatkowo opisuje plazmid lub system wektora ekspresji któregokolwiek ze zmodyfikowanych enzymów lub wariantów, lub fragmentów funkcjonalnych opisanych w niniejszym dokumencie. Właściwe wektory ekspresyjne zostały opisane w niniejszym dokumencie.

Warianty fitazy

[0058] Niniejszy wynalazek skupia się na ulepszeniu właściwości fitazy macierzystej poprzez modyfikację jednej lub więcej reszt aminokwasowych w sekwencji aminokwasowej fitazy macierzystej.

[0059] Enzymy fitazy zastosowane jako enzymy macierzyste zgodnie z niniejszym wynalazkiem obejmują, w szczególności, fitazy typu dzikiego pochodzące z bakterii, najlepiej fitazy, które są uzyskane lub pochodzą z Buttiauxella sp. o sekwencji aminokwasowej, jak podano w SEQ ID Nr 3, lub sekwencji aminokwasowej o podobieństwie z SEQ ID Nr 3 wynoszącym ponad 80%, lepiej ponad 90%, jeszcze lepiej ponad 95%, 96%, 97%, 98%, a najlepiej ponad 99% (czyli polipeptyd homologiczny).

[0060] Ulepszone warianty enzymu fitazy kodowanej przez wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego wynalazku, najlepiej, jeżeli są identyczne z SEQ ID Nr: 3 w ponad 80%, lepiej ponad 90%, jeszcze lepiej ponad 95%, 96%, 97%, 98%, a najlepiej ponad 99%. Jednakże, przewiduje się również, że warianty mogą być heterologiczne (tj. nie są homologiczne) z SEQ ID Nr 3. Dla przykładu warianty wytworzone przy użyciu technik rekombinacji, takich jak rekombinacja z egzopośrednictwem lub tasowanie rodziny, mogą skutkować wariantami, które chociaż zostały przygotowane z zastosowaniem fitazy macierzystej zgodnie z niniejszym wynalazkiem, mogą posiadać mniej niż 75% homologii.

9

[0061] Dopasowania sekwencji, jak również określenie identyczności sekwencji, może być odpowiednio wykonane za pomocą programów komputerowych znanych w dziedzinie, takich jak GAP dostarczany w pakiecie programowym GCG (Needleman, S. B. i Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, str. 443-453). GAP może być stosowany z następującymi ustawieniami dla porównywania sekwencji

EP 2 236 600 B1

polipeptydowej: GAP creation penalty 3,0 i GAP extension penalty 0,1. Dopasowania sekwencji są stosowane na przykład w celu określenia odpowiadających sobie pozycji w polipeptydach homologicznych.

[0062] Enzymy fitazy zostały scharakteryzowane po ekspresji heterologicznej w jednym lub więcej z następujących gospodarzy ekspresji: Escherichia coli K12; Bacillus subtilis; Saccharomyces cerevisiae. Można użyć innych gospodarzy ekspresji.

[0063] Ulepszenia właściwości fitazy zgodnie z niniejszym wynalazkiem, są przeznaczone do zastosowania w przetwórstwie żywności i paszy, jak również do stosowania jako dodatek do produktów spożywczych i pasz zwierzęcych. Ulepszenia są szczególnie ukierunkowane na stabilność podczas warunków przetwarzania żywności i paszy, stabilność podczas transportu do żołądka, a także aktywność i stabilność w ludzkim lub zwierzęcym żołądku i/lub jelitach. Te ulepszenia obejmują takie parametry jak: wzrost stabilności w podwyższonych temperaturach, najlepiej w temperaturach powyżej 65°C, wzrost stabilności w trawieniu proteolitycznym, najlepiej wobec proteazy przewodu pokarmowego, wzrost aktywności katalitycznej w niskim pH, najlepiej aktywność katalityczna poniżej pH 5,5 oraz ogólną wydajność grup uwalniających fosforan z fitynianu.

[0064] Zwiększenie stabilności w podwyższonej temperaturze jest określane za pomocą temperatury inaktywacji enzymu. Temperaturę inaktywacji definiuje się jako temperaturę, w której aktywność resztkowa enzymu fitazy po pewnym czasie inkubacji, a następnie chłodzenia do temperatury pokojowej wynosi 50% aktywności resztkowej tego samego enzymu fitazy inkubowanego przez taki sam okres, w tych samych warunkach, w temperaturze pokojowej. Różnice w termostabilności są różnicami w °C pomiędzy temperaturami inaktywacji dwóch enzymów.

[0065] Pozycje i/lub regiony, które mają zostać zmutowane w celu uzyskania ulepszonych właściwości, stwierdzono na podstawie analizy sekwencji i struktury fitaz typu dzikiego, jak i przez mutagenezę enzymów macierzystych, w szczególności przez wprowadzenie mutacji do sekwencji aminokwasowej typu dzikiego, jak podano w SEQ ID Nr 3 oraz przez zbadanie wariantów enzymu o ulepszonych właściwościach. Tym samym, niektóre regiony, jak i pozycje w enzymach macierzystych zostały uznane za istotne dla poprawy właściwości enzymów fitazy.

[0066] Dlatego też, wynalazek dotyczy wyizolowanych cząsteczek kwasu nukleinowego kodującego warianty fitazy o ulepszonych właściwościach, które w porównaniu z fitazą macierzystą, zawierają mutacje w jednej lub więcej następujących pozycji (numeracja według numeracji w SEQ ID Nr 3):

59, 70, 122, 125, 167, 193, 197, 204, 209, 211, 221, 223, 225, 240, 242, 244, 268, 281, 289, 294, 303, 336, 351;

i/lub w odpowiadających im pozycjach w fitazie homologicznej do fitazy, jak przedstawiono w sekwencji aminokwasowej SEQ ID Nr 3. Pozycje te charakteryzują się tym, że mutageneza tych pozycji prowadzi do poprawy właściwości enzymów.

K59E; T167V; K240T; T167I; K240E; D244C; Q289Y; T209K i F197S.

lub mutacje konserwatywne w każdej pozycji.

[0067] Poszczególne korzystne kombinacje mutacji obejmują:

D125E/H193R; A294E/N303K; T167I/K240T; D223E/K240E/N351D; T167I/K240T/A294E/N303K;

10

EP 2 236 600 B1

T167I/K240E/A242S/A294E/N303K; A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A294E/N303K; A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K; A122T/D125E/H193R/F197S/T209K/A211P/5221N/G225A/K240E/A294E/ N303K; D125E/T167I/H193R/F197S/T2041/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K; A122T/T167I/H193R/F1975/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K/I336F oraz N70Y/D125E/T167I/H193R/F197S/T204K/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K.

Sposoby przygotowania wariantów fitazy - tylko w celu ilustracyjnym

[0068] W szerokim wykonaniu wynalazek przedstawia sposoby wytwarzania wariantu(ów) enzymu fitazy.

[0069] W korzystnym wykonaniu sposób wytwarzania wariantu enzymu fitazy składa się z następujących po sobie etapów:

a) Wybór przynajmniej jednego macierzystego enzymu fitazy, przy czym co najmniej jeden macierzysty enzym fitazy jest wybrany z i) polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową odpowiadającą fitazie Buttiauxella sp. lub jej zmodyfikowanej postaci, polipeptydowi homologicznemu, wariantowi, ekwiwalentowi funkcjonalnemu lub efektywnemu fragmentowi, jak opisano w niniejszym dokumencie lub ii) co najmniej jednego wariantu fitazy jak opisano w niniejszym dokumencie;

b) Wytwarzanie przynajmniej jednego wariantu fitazy poprzez wprowadzenie co najmniej jednej zmiany w macierzystym enzymie fitazy, którą może być insercja, delecja lub substytucja reszty aminokwasowej albo ich kombinacja w macierzystym enzymie fitazy, w celu uzyskania co najmniej jednego wariantu enzymu fitazy;

c) Badania przesiewowe co najmniej jednego wspomnianego wariantu enzymu fitazy w celu identyfikacji ulepszonego wariantu enzymu fitazy, który w porównaniu do macierzystego enzymu fitazy ma ulepszoną(e) właściwość/właściwości wybraną(e) spośród:

i. wyższa stabilność termiczna i/lub ii. aktywność specyficzna i/lub iii. stabilność proteolityczna

d) Przygotowanie ulepszonego wariantu enzymu fitazy, najlepiej do produkcji wyizolowanego i/lub oczyszczonego wariantu enzymu fitazy.

[0070] W korzystnym wykonaniu, w etapie b) wytwarzana jest populacja wariantów enzymu fitazy, a w etapie c) co najmniej część tej populacji wariantów enzymu fitazy poddawana jest badaniom przesiewowym.

[0071] W korzystnym wykonaniu etap a) obejmuje poddanie sekwencji nukleotydowej według zastrzeżeń 11 do 13, kodującej macierzysty enzym fitazy, mutagenezie i etap b) zawiera ekspresję zmutowanej sekwencji nukleotydów otrzymanej w etapie (a) w komórce gospodarza, etap c ) obejmuje badania przesiewowe komórek gospodarza lub ich ekstraktu(ów) pod kątem ulepszonego wariantu enzymu fitazy posiadającego wspomnianą(e) ulepszoną(e) właściwość/właściwości.

[0072] W dalszym wykonaniu po etapie c) oraz opcjonalnie d), następuje co najmniej jedna kolejna runda powtórzenia etapów a)-c) i opcjonalnie d), przy czym najlepiej w kolejnej(ych) rundzie(ach), co najmniej jeden macierzysty enzym fitazy z etapu a) jest wybrany spośród co najmniej jednego wariantu enzymu fitazy i/lub ulepszonego wariantu fitazy przygotowanego zgodnie ze sposobem.

[0073] W kolejnym korzystnym wykonaniu etap c) zawiera badania przesiewowe wykonywane pod kątem komórek gospodarza dokonujących ekspresji ulepszonego wariantu enzymu fitazy, który w porównaniu do i)

11

EP 2 236 600 B1

macierzystego enzymu fitazy i/lub ii) polipeptydu zawierającego SEQ ID Nr 3 jego funkcjonalnego fragmentu, ma różnicę stabilności termicznej wynoszącą co najmniej 2,5.

[0074] W kolejnym wykonaniu etap c) zawiera badania przesiewowe wykonywane pod kątem komórek gospodarza dokonujących ekspresji ulepszonego wariantu enzymu fitazy, który w porównaniu do i) macierzystego enzymu fitazy i/lub ii) polipeptydu zawierającego SEQ ID Nr 3 jego funkcjonalnego fragmentu, ma stabilność wobec pepsyny wynoszącą co najmniej 30.

[0075] W kolejnym korzystnym wykonaniu etap c) zawiera badania przesiewowe wykonywane pod kątem komórek gospodarza dokonujących ekspresji ulepszonego wariantu enzymu fitazy, który w porównaniu do i) macierzystego enzymu fitazy i/lub ii) polipeptydu zawierającego SEQ ID Nr 3, ma współczynnik aktywności specyficznej, który w porównaniu z fitazą kodowaną przez SEQ ID Nr 3 wynosi co najmniej 110.

[0076] Wynalazek przedstawia także sposób wytwarzania wariantu enzymu fitazy, który to sposób obejmuje:

a) Wybór macierzystego enzymu fitazy, przy czym macierzysty enzym fitazy jest wybrany z:

i. macierzystego enzymu fitazy z co najmniej 75% homologią z SEQ ID Nr 3 jej funkcjonalnego fragmentu ii. macierzystego enzymu fitazy pochodzącego z Buttiauxella spp. iii. co najmniej jednego wariantu fitazy.

b) Dokonywanie przynajmniej jednej zmiany, którą jest insercja, delecja lub substytucja reszty aminokwasowej w macierzystym enzymie fitazy w celu uzyskania wariantu enzymu fitazy,

c) Badania przesiewowe pod kątem wariantu enzymu fitazy, który w porównaniu do macierzystego enzymu fitazy ma ulepszone właściwości, jak tu opisano, najlepiej wybranych spośród jednego lub więcej z następujących czynników:

i. wyższa stabilność termiczna i/lub ii. aktywność specyficzna i/lub iii. stabilność proteolityczna i/lub d) Przygotowanie wariantu enzymu fitazy.

[0077] Opcjonalnie, przynajmniej etapy a) do c) mogą być powtórzone w jednym lub kilku kolejnych (wielokrotnych) rundach. W związku z tym przewiduje się, że macierzysty enzym fitazy jest wariantem enzymu fitazy przygotowanym w poprzednich rundach powyższej metody a) do c).

[0078] W kolejnym wykonaniu wynalazek przedstawia sposób wytwarzania wariantu fitazy, obejmujący następujące etapy:

a) Dostarczenie macierzystego enzymu fitazy, wybranego z

(i) enzymu fitazy z co najmniej 75% homologią z SEQ ID Nr 3 lub jej funkcjonalnym fragmentem

(ii) enzymu fitazy pochodzącego z Buttiauxella spp.,

(iii) co najmniej jednego wariantu fitazy

b) Wytwarzanie populacji wariantów fitazy przez zmianę macierzystej fitazy. Wspomnianą zmianę(y) najlepiej uzyskuje się poprzez insercję, delecję lub podstawienie co najmniej jednej reszty aminokwasowej w macierzystej fitazie, albo ich kombinację.

12

EP 2 236 600 B1

(c) Badania przesiewowe pod kątem wariantu enzymu fitazy, który w porównaniu do macierzystego enzymu fitazy ma ulepszone właściwości, jak tu opisano, najlepiej wybierane spośród jednego lub więcej z następujących czynników:

(i) wyższa stabilność termiczna i/lub (ii) wyższa aktywność specyficzna i/lub (iii) wyższa stabilność proteolityczna, (d) Wybór jednego lub więcej wariantów fitazy z populacji fitaz. (e) Opcjonalnie powtarzanie etapów (a) do (c) cyklicznie, przy czym najlepiej, kiedy warianty fitazy wybrane w jednym cyklu są wykorzystywane jako pierwsze fitazy w kolejnym cyklu.


a) Poddanie sekwencji nukleotydowej kodującej macierzysty enzym fitazy mutagenezie, przy czym macierzysty enzym fitazy jest wybrany spośród

i. macierzystego enzymu fitazy z co najmniej 75% homologią z SEQ ID Nr 3 lub jej funkcjonalnym fragmentem ii. macierzystego enzymu fitazy pochodzącego z Buttiauxella spp. iv. co najmniej jednego wariantu fitazy.

b) Dokonywanie ekspresji (wyrażanie) zmutowanej sekwencji nukleotydów otrzymanej w etapie (a), w komórce gospodarza i

c) Badania przesiewowe pod kątem wariantu enzymu fitazy, który w porównaniu do macierzystego enzymu fitazy ma ulepszone właściwości, jak tu opisano, najlepiej wybierane spośród jednego lub więcej z następujących czynników:

i) wyższa stabilność termiczna i/lub ii) wyższa aktywność specyficzna i/lub iii) wyższa stabilność proteolityczna i/lub

d) Przygotowanie wariantu enzymu fitazy, którego ekspresja jest dokonywana przez komórkę gospodarza

[0080] Opcjonalnie etapy a) do c), ewentualnie d), mogą być powtórzone w jednym lub kilku kolejnych (wielokrotnych) rundach.


(a) Poddanie sekwencji nukleotydowej kodującej macierzysty enzym fitazy mutagenezie, w celu wytworzenia populacji zmienionych wariantów nukleotydów, przy czym najlepiej, kiedy zmiana(y) jest/są uzyskiwane poprzez insercję, delecję lub substytucję co najmniej jednej reszty aminokwasowej w macierzystej fitazie, lub jakąkolwiek ich kombinację, przy czym macierzysty enzym fitazy jest wybierany spośród

(i) enzymu fitazy z co najmniej 75% homologią z SEQ ID Nr 3 lub jej funkcjonalnym fragmentem (ii) enzymu fitazy pochodzącego z Buttiauxella spp,. (iii) co najmniej jednego wariantu fitazy

13

EP 2 236 600 B1

(b) Dokonywanie ekspresji populacji wariantów nukleotydów otrzymanych w etapie (a), w populacji odpowiednich komórek gospodarza i

(c) Badania przesiewowe populacji dla wariantu fitazy, który w porównaniu do macierzystego enzymu fitazy ma ulepszone właściwości, jak tu opisano, najlepiej wybierane spośród jednego lub więcej z następujących czynników:

(i) wyższa stabilność termiczna i/lub (ii) wyższa aktywność specyficzna i/lub (iii) wyższa stabilność proteolityczna,

(d) Wybór jednego lub więcej wariantów fitazy z populacji fitaz. (e) Opcjonalnie powtarzanie etapów (a) do (c) cyklicznie, przy czym najlepiej, kiedy warianty fitazy wybrane w jednym cyklu są wykorzystywane jako pierwsze fitazy w kolejnym cyklu.

[0082] W stosownych przypadkach, w powyższych sposobach wytwarzania wariantu enzymu fitazy, wspomniana sekwencja nukleotydowa jest najlepiej sekwencją DNA.

[0083] Najlepiej, jeżeli sekwencja nukleotydowa jest wyizolowaną i/lub oczyszczoną cząsteczką kwasu nukleinowego lub sekwencją nukleotydów kodującą enzym zawierający sekwencję aminokwasową odpowiadającą fitazie Buttiauxella sp. lub jej homologowi, jak opisano w niniejszym dokumencie.

[0084] Najlepiej, jeżeli macierzysta fitaza jest wybrana z SEQ ID Nr 3 lub jej funkcjonalnego fragmentu czy homologu fitazy Buttiauxella sp jak przedstawiono w SEQ ID Nr 3, opisanej w niniejszym dokumencie.

[0085] W powyższych przykładach wynalazku, które dotyczą sposobów wytwarzania wariantu enzymu fitazy, najlepiej, jeżeli macierzysty enzym fitazy/nukleotyd kodujący jest fitazą typu dzikiego.

[0086] Jednakże, w innym przypadku wariantem macierzystym może być wariant przygotowany w poprzednich rundach mutagenezy, np. w jednym z przykładów wykonania sposoby wytwarzania wariantów enzymu fitazy są wielokrotne, przy czym etapy a) do c) (opcjonalnie również etap d)) są powtarzane co najmniej po kilka razy. W takich wykonaniach, stosowaną metodą mutagenezy w pierwszej rundzie mutagenezy, najlepiej gdy jest podatna na błędy PCR, korzystniej PCR z progiem błędu. Kolejne rundy mogą być również wykonywane metodą podatnej na błędy PCR, korzystniej PCR z progiem błędu, ale mogą być również mutagenezą opartą na rekombinacji, w której grupy co najmniej dwóch niezależnych ulepszonych wariantów są określane w pierwszych rundach mutagenezy, a podczas drugiej lub kolejnej rundy mutagenezy rekombinowane, dając w wyniku co najmniej jeden wariant rekombinacyjny (np. za pomocą tasowania rodziny lub metody rekombinacyjnej reakcji łańcuchowej).

[0087] Dla wykwalifikowanego fachowca oczywistym będzie, że alternatywne metody mutagenezy również mogą być wykorzystywane, w tym racjonalne projektowanie, mutageneza site scanning lub mutageneza wywoływana chemicznie/radiacyjnie

[0088] W powyższych przykładach wykonania wynalazku, które dotyczą sposobów wytwarzania wariantu enzymu fitazy, wariant enzymu fitazy najlepiej, jeżeli jest przedmiotem badań przesiewowych pod kątem wyższej stabilności termicznej.

[0089] W powyższych przykładach wykonania wynalazku, które dotyczą sposobów wytwarzania wariantu enzymu fitazy, wariant enzymu fitazy najlepiej jeżeli jest przedmiotem badań przesiewowych pod kątem co najmniej jednego z wybranych parametrów: wyższej stabilności termicznej, wyższej stabilności proteolitycznej lub wyższej aktywności specyficznej, jednak najlepiej pod kątem wyższej stabilności termicznej.

14

EP 2 236 600 B1

[0090] Najlepiej, jeżeli badanie przesiewowe, wykonywane pod kątem tego pierwszego parametru, odbywało się co najmniej w pierwszej rundzie mutagenezy składającej się przynajmniej z etapów a) do c), przy czym c) zawiera co najmniej badania przesiewowe pod kątem wskazanego pierwszego parametru. Po pierwszej rundzie mutagenezy mogą następować kolejne (wielokrotne) rundy mutagenezy i selekcji, obejmujące etapy a) do c) (opcjonalnie również d)), przy czym selekcja w kolejnych rundach może być dokonywana z uwagi na ten sam parametr selekcji, jak w etapie c) wspomnianej pierwszej rundy, albo też z uwagi na inny parametr.

[0091] W czasie wielokrotnych rund powyższych sposobów wytworzenia wariantu enzymu fitazy najlepiej, gdy pierwszy parametr wybierany jest spośród wyższej stabilności termicznej, wyższej stabilności proteolitycznej lub wyższej aktywności specyficznej, a najlepiej z wyższej stabilności termicznej. Najlepiej, gdy pierwsza runda mutagenezy została przeprowadzona w celu wybrania wariantów z wyższą stabilnością termiczną, podczas kolejnej(ych) (wielokrotnej) rund(y) mutagenezy, obejmującej etapy a) do c), wspomniany parametr jest wybierany z następujących parametrów: wyższa stabilność termiczna, wyższa stabilność proteolityczna lub wyższa aktywność specyficzna, najlepiej wyższa stabilność proteolityczna lub wyższa aktywność specyficzna.

[0092] W powyższych przykładach wykonania wynalazku, które dotyczą sposobów wytwarzania wariantu enzymu fitazy, najlepiej gdy wariant enzymu fitazy jest przedmiotem badań przesiewowych pod kątem wyższej stabilności termicznej, wyższej stabilności proteolitycznej lub wyższej aktywności specyficznej, w co najmniej jednej rundzie mutagenezy (etapy a do c), najlepiej jednak w więcej niż jednej rundzie, tj. wielokrotnych rundach wyboru.

[0093] Macierzysty enzym fitazy najlepiej, gdy pochodzi z Buttiauxella P1-29.

[0094] W sposobach wytwarzania wariantu enzymu fitazy, który to sposób obejmuje poddanie sekwencji DNA kodującej macierzysty enzym fitazy mutagenezie, sekwencja DNA kodująca macierzysty enzym fitazy korzystnie poddawana jest losowej mutagenezie, korzystniej podatnej na błędy PCR, jeszcze korzystniej PCR z progiem błędu.

[0095] Preferowaną metodą mutagenezy sekwencji DNA kodującej macierzysty enzym fitazy jest podatna na błędy metoda PCR, korzystniej PCR z progiem błędu, inne metody mutagenezy można stosować w miejsce podatnej na błędy PCR/PCR z progiem lub w połączeniu z podatną na błędy PCR/PCR z progiem błędu. Patrz Przykład 12, który zawiera odniesienia do odpowiednich metod PCR: PCR podatnej na błędy i PCR z progiem błędu. Inna przydatna metoda mutagenicznej PCR została opisana przez Cadwell i Joyce (PCR Methods Appl. 3(1994), 136-140)"

[0096] Określenie „ekspresja w komórce gospodarza” użyte w kontekście wykonań, które odnoszą się do „sposobu wytwarzania wariantu enzymu fitazy” najlepiej jest definiowane jako produkcja wariantu enzymu fitazy w żywym organizmie, organie lub komórce, tu opisanych. Korzystnymi gospodarzami są Escherichia coli K12; Bacillus subtilis; Saccharomyces cerevisiae. Enzymy fitazy opisane dokładnie w niniejszym dokumencie, scharakteryzowano po ekspresji heterologicznej w jednym lub więcej z następujących gospodarzy ekspresji: Escherichia coli K12; Bacillus subtilis; Saccharomyces cerevisiae.

[0097] Jednakże uważa się, że w celu wyboru wariantów enzymu fitazy jak tu opisano, w takich sposobach można korzystać z metod in vitro ekspresji wariantów enzymu fitazy, korzystnie do stosowania w etapie (c) wyżej wymienionych sposobów, które wykorzystują mechanizmy transkrypcji i translacji wyizolowane z jednej lub więcej komórek, wyizolowanych z jednego lub więcej organizmów żywych lub wirusów. Taka produkcja in vitro wariantu fitazy według opisu może być również używana do wyboru korzystnych wariantów fitazy. Ekspresja in vitro może być dogodnie przeprowadzona przy użyciu standardowych technik. Dla odniesienia patrz “In vitro Expression Guide” (Podręcznik dot. ekspresji in vitro) dostępny z Promega Inc (Part# BR053).

15

EP 2 236 600 B1

Określanie Fenotypów Wariantów

[0098] Warianty z wyższą stabilnością termiczną (różnicą stabilności termicznej) kodowane przez wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego niniejszego wynalazku, najlepiej określa się przez zastosowanie sposobów przedstawionych w Przykładzie 12.

[0099] Najlepiej, gdy różnica stabilności termicznej (TD) wariantu enzymu fitazy, przygotowanego sposobem wytwarzania wariantów enzymów fitazy, wynosiła przynajmniej 1.5, korzystniej 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 , 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, a najkorzystniej co najmniej 20.

[0100] Warianty z wyższą stabilnością proteolityczną najlepiej określa się przez zastosowanie metod przedstawionych w Przykładzie 12.

[0101] Korzystnie jest, gdy wariant enzymu fitazy kodowany przez wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego niniejszego wynalazku ma stabilność proteolityczną (aktywność resztkową) co najmniej 45%, korzystnie 50%, 55%, korzystniej co najmniej 60% lub 65%, a najkorzystniej co najmniej 70%.

[0102] Korzystnie jest, gdy wariant fitazy kodowany przez wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego niniejszego wynalazku ma specyficzną aktywność większą niż 100% wagowej aktywności przy pH 4,0, korzystnie większą niż 105%, 110%, a najkorzystniej większą niż 114%.

Kolejne wykonania wariantów - tylko w celu ilustracyjnym

[0103] W kolejnym wykonaniu opisano sposoby przygotowania pasz zwierzęcych zawierających wariant enzymu fitazy, który to sposób obejmuje kolejne etapy: i) wykonywanie jednego lub więcej z powyższych sposobów wytwarzania wariantu enzymu fitazy oraz ii) dodawanie wytworzonego wariantu enzymu fitazy do paszy dla zwierząt.

[0104] W szczególnym wykonaniu wynalazek przedstawia sposób wytwarzania paszy dla zwierząt, obejmujący wariant enzymu fitazy, a wspomniany sposób obejmuje:

a) Wybór macierzystego enzymu fitazy, przy czym macierzysty enzym fitazy jest wybrany z

i. macierzystego enzymu fitazy z co najmniej 75% homologią z SEQ ID Nr 3 lub jego fragmentem funkcjonalnym, ii. macierzystego enzymu fitazy pochodzącego z Buttiauxella spp, najlepiej z Buttiauxella P1-29. i/lub iii. co najmniej jednego wariantu enzymu fitazy;

b) Dokonywanie przynajmniej jednej zmiany, którą jest insercja, delecja lub substytucja reszty aminokwasowej macierzystego enzymu fitazy w celu uzyskania wariantu enzymu fitazy.

c) Badania przesiewowe pod kątem wariantu enzymu fitazy, który w porównaniu do macierzystego enzymu fitazy ma ulepszone właściwości, jak tu opisano, najlepiej wybierane spośród jednego lub więcej z następujących czynników:

i. wyższa stabilność termiczna i/lub ii. aktywność specyficzna i/lub iii. stabilność proteolityczna i/lub

d) Przygotowanie wariantu enzymu fitazy.

e) Dodawanie wytworzonego wariantu enzymu fitazy do paszy zwierzęcej.

16

EP 2 236 600 B1

[0105] W kolejnym wykonaniu wynalazek przedstawia sposoby wytwarzania paszy dla zwierząt, zawierające wariant enzymu fitazy.

a) Poddanie sekwencji nukleotydów (najlepiej DNA) kodującej macierzysty enzym fitazy mutagenezie, przy czym nukleotyd jest wybrany z nukleotydu, który koduje

i. macierzysty enzym fitazy z co najmniej 75% homologią z SEQ ID Nr 3 lub jego fragmentem funkcjonalnym, i/lub ii. macierzysty enzym fitazy pochodzący z Buttiauxella spp, najlepiej z Buttiauxella P1-29.

b) Dokonywanie ekspresji zmutowanej sekwencji nukleotydów (najlepiej DNA) otrzymanej w etapie (a), w komórce gospodarza, i

c) Badania przesiewowe pod kątem komórek gospodarza dokonujących ekspresji wariantu enzymu fitazy, który w porównaniu do macierzystego enzymu fitazy ma ulepszone właściwości, jak tu opisano, najlepiej wybierane spośród jednego lub więcej z następujących czynników:

i. większa stabilność termiczna i/lub ii. wyższa aktywność specyficzna i/lub iii. wyższa stabilność proteolityczna i/lub

d) Przygotowanie wariantu enzymu fitazy, którego ekspresja jest dokonywana przez komórkę gospodarza

f) Dodawanie wytworzonego wariantu enzymu fitazy do paszy zwierzęcej.

[0106] Opisane przykłady wykonania i korzystne aspekty sposobu wytwarzania wariantu enzymu fitazy mają również zastosowanie do wyżej wymienionych sposobów wytwarzania pasz zwierzęcych zawierających wariant enzymu fitazy.

Najkorzystniejsze postaci wykonania wynalazku

[0107] W najkorzystniejszej postaci wykonania, niniejszy wynalazek dotyczy wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego, sposobów wytwarzania polipeptydu za pomocą wspomnianej cząsteczki kwasu nukleinowego i komórki gospodarza, plazmidu, systemu wektorowego zgodnie z kolejnymi ustępami:

1. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego wybrana z:

i) kodowania wyizolowanej cząsteczek kwasu nukleinowego dla polipeptydu wybrany z grupy składającej się z:

• polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NR: 3 lub sekwencję aminokwasową, która jest z nią co najmniej w 80% identyczna;

• polipeptydu otrzymywanego ze szczepu P1-29 Buttiauxella sp. zdeponowanego pod numerem dostępu NCIMB 41248;

• polipeptydu otrzymanego przez ekspresję SEQ ID Nr 2 lub sekwencji nukleotydowej uzyskanej ze szczepu P1-29 Buttiauxella sp. zdeponowanego pod numerem dostępu NCIMB 41248 lub sekwencji nukleotydowej, która jest z nią co najmniej w 80% identyczna; oraz

• polipeptydu otrzymywanego ze szczepu P1-29 Buttiauxella sp. zdeponowanego pod numerem dostępu NCIMB 41248, przy czym peptyd otrzymywany jest przez ekspresję SEQ ID Nr 2 lub sekwencji nukleotydowej otrzymanej ze szczepu P1-29 Buttiauxella sp. zdeponowanego pod numerem dostępu NCIMB 41248 lub sekwencji nukleotydowej, która jest z nią co najmniej w 80% identyczna,

17

EP 2 236 600 B1

gdzie wspomniany polipeptyd posiada aktywność fitazy, przy czym wspomniany polipeptyd posiada aktywność specyficzną przynajmniej 300 U/mg, przy czym aktywność specyficzna jest wyznaczana przez inkubację wspomnianego polipeptydu w roztworze zawierającym 2mM fitynian i 0,8mM CaCl₂ w 200mM buforze octanu sodu o pH równym 3,5, w temperaturze 37°C;

ii) wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego zawierającej sekwencję, jak przedstawiono w SEQ ID NR: 2 iii) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje do SEQ ID Nr 2 w warunkach rygorystycznych (ostrych) przy 50°C oraz 0,2 x SSC.

2. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zgodna z ustępem 1 kodująca polipeptyd wybrany z grupy składającej się z:





gdzie wspomniany polipeptyd posiada aktywność fitazy, przy czym wspomniany polipeptyd posiada aktywność specyficzną przynajmniej 300 U/mg, przy czym aktywność specyficzna jest wyznaczana przez inkubację wspomnianego polipeptydu w roztworze zawierającym 2mM fitynian i 0,8 mMCaCl₂ w 200mM buforze octanu sodu o pH równym 3,5, w temperaturze 37°C.

3. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zgodna z ustępem 1 lub ustępem 2 zawierająca sekwencję nukleotydową, która jest taka sama lub komplementarna z SEQ ID NR 2, lub zawiera sekwencję, która jest co najmniej w 80% identyczna z SEQ ID NR: 2.

4. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zgodna z którymkolwiek z ustępów 1 do 3, przy czym wspomniana cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd posiadający maksimum aktywności przy pH wynoszącym około 3 do 6, przy czym wspomniana aktywność jest wyznaczana przez inkubację wspomnianego polipeptydu w roztworze zawierającym 2mM fitynian 1 0,8mM CaCl₂ w 200mM buforze octanu sodu w temperaturze 37°C.

5. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zgodna z którymkolwiek z ustępów 1 do 3, przy czym wspomniana cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd posiadający maksimum aktywności przy pH wynoszącym około 4 do 5, przy czym wspomniana aktywność jest wyznaczana przez inkubację wspomnianego polipeptydu w roztworze zawierającym 2mM fitynian i 0,8mM CaCl₂ w 200mM buforze octanu sodu w temperaturze 37°C.

6.Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zgodna z którymkolwiek z ustępów 1 do 3, przy czym wspomniana cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd posiadający maksimum aktywności przy pH wynoszącym około 4,5, przy czym wspomniana aktywność jest wyznaczana przez inkubację wspomnianego polipeptydu w roztworze zawierającym 2mM fitynian i 0,8mM CaCl₂ w 200mM buforze octanu sodu w temperaturze 37°C.

18

EP 2 236 600 B1

7. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zgodna z którymkolwiek z ustępów 1 do 6, przy czym wspomniana cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera mutacje w co najmniej jednej z następujących pozycji, numerowanych zgodnie z numerowaniem w SEQ ID Nr 3: K 59, T 70, A 122, D 125, T 167, H 193, F 197, T 204, T 209, A 211, S 221, I 223, S225, K 240, A 242, D 244, A 268, S 281, Q 289, A 294, N 303, I 336 lub N 351. 8. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zgodna z którymkolwiek z ustępów 1 do 7, przy czym wspomniana cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd zawierający jedną lub więcej z następujących mutacji: K 59 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub T 70 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W lub Y; lub A 122 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub D 125 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub T 167 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W,\ lub Y; lub H 193 A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub F 197 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub T 204 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W lub Y; lub T 209 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W lub Y; lub A 211 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub G 221 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub D 223 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub G 225 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W lub Y; lub K 240 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub A 242 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub D 244 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub A 268 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub S 281 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; l lub Q 289 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W lub Y; lub A 294 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub N 303 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub I 336 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub N 351. A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, lub Y.

19

EP 2 236 600 B1

9. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zgodna z którymkolwiek z ustępów 1 do 8, przy czym wspomniana cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd zawierający co najmniej jedną mutację wybraną z grupy składającej się z: K59E; T167V; K240T;T167I; K240E; D244C; Q289Y; T209K lub F 197S. 10. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zgodna z którymkolwiek z ustępów 1 do 9, przy czym wspomniana cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd zawierający kombinację mutacji wyselekcjonowaną z grupy składającej się z:

D125E/H193R; lub A294E/N303K; lub T167I/K240T; lub D223E/K240E/N351D; lub T167I/K240T/A294E/N303K; lub T167I/K240E/A242S/A294E/N303K; lub A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A294E/N303K; lub A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K; lub A122T/D125E/H193R/F197S/T209K/A211P/S221N/G225A/K240E/A294E/N303K; lub D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K; lub A122T/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K/I336F lub N70Y/D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K.

11.Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zgodna z którymkolwiek z ustępów 1 do 10, przy czym wspomniana cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd zawierający kombinację mutacji:

A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K.

12. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zgodna z którymkolwiek z ustępów 7 do 10, przy czym wspomniana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd jest wariantem enzymu fitazy, który posiada wyższą stabilność termiczną i/ lub wyższą aktywność specyficzną i/ lub wyższą stabilność proteolityczną w porównaniu z enzymem fitazy kodowanym przez SEQ ID Nr 2.

13. Plazmid lub system wektora zawierający nukleotyd zgodny z którymkolwiek z ustępów 1 do 12.

14. Plazmid lub system wektora zgodny z ustępem 13, przy czym wspomniany plazmid lub system wektora jest wektorem ekspresji któregokolwiek z polipeptydów, jak zdefiniowano w którymkolwiek z ustępów 1 do 12 i/ lub zawiera polinukleotydy zgodne z którymkolwiek z ustępów 1 do 12 w mikroorganizmie.

15. Komórka gospodarza przekształcona lub transfekowana plazmidem lub systemem wektora opisanymi w ustępie 13 lub 14.

16. Komórka gospodarza opisana w ustępie 15, która wyraża polipeptyd określony w którymkolwiek z ustępów 1 do 12.

17. Komórka gospodarza opisana w zastrzeżeniu 15 lub 16, przy czym wspomniana komórka gospodarza pochodzi od mikroorganizmu.

18. Komórka gospodarza opisana w którymkolwiek z zastrzeżeń 15 do 17, przy czym wspomniana komórka gospodarza wybrana jest spośród bakterii i grzybów

19. Komórka gospodarza opisana w którymkolwiek z ustępów 15 do 18, przy czym wspomniana komórka gospodarza wybrana jest spośród bakterii, drożdży i grzybów nitkowatych.

20. Komórka gospodarza opisana w którymkolwiek z zastrzeżeń 15 do 19, przy czym wspomniana komórka gospodarza wybrana jest spośród B. subtilis, E.coli, H. polymorpha, S. pombe, S. cerevisiae, Trichoderma spp. i Aspergillus spp.

20

EP 2 236 600 B1

21. Komórka gospodarza opisana w zastrzeżeniu 20, przy czym wspomniany Aspergillus spp. to A. oryzae. 22. Komórka gospodarza opisana w którymkolwiek z zastrzeżeń 15 do 20, przy czym wspomniana komórka gospodarza jest prokariotyczną komórką bakteryjną, najlepiej E.coli. 23. Komórka gospodarza opisana w ustępie 22, przy czym wspomnianą komórką gospodarza jest E. coli.

24. Szczep komórkowy P1-29 bakterii Buttiauxella sp. zdeponowany pod numerem dostępu NCIMB 41248.

25. Sposób wytwarzania polipeptydu składający się z transformacji komórki gospodarza polinukleotydem określonym w którymkolwiek z ustępów 1 do 12, przy czym wspomniany polipeptyd jest wybrany z grupy składającej się z:

• polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NR.: 3 lub sekwencję aminokwasową, która jest z nią co najmniej w 80% identyczna;


• polipeptydu możliwego do uzyskania przez ekspresję SEQ ID Nr 2 lub sekwencji nukleotydowej możliwej do uzyskania ze szczepu P1-29 Buttiauxella sp. zdeponowanego pod numerem dostępu NCIMB 41248 lub sekwencji nukleotydowej, która jest z nią co najmniej w 80% identyczna; oraz

• polipeptydu możliwego do uzyskania ze szczepu P1-29 Buttiauxella sp., zdeponowanego pod numerem dostępu NCIMB 41248, przy czym peptyd ten jest możliwy do uzyskania przez ekspresję SEQ ID Nr 2 lub sekwencji nukleotydowej możliwej do uzyskania ze szczepu P1-29 Buttiauxella sp. zdeponowanego pod numerem dostępu NCIMB 41248 lub sekwencji nukleotydowej, która jest z nią co najmniej w 80% identyczna,

gdzie wspomniany polipeptyd posiada aktywność fitazy, przy czym wspomniany polipeptyd posiada aktywność specyficzną wynoszącą przynajmniej 300 U/mg, przy czym aktywność specyficzna jest wyznaczana przez inkubację wspomnianego polipeptydu w roztworze zawierającym 2mM fitynian i 0,8mM CaCl₂ w 200mM buforze octanu sodu o pH równym 3,5, w temperaturze 37°C.

26. Sposób wytwarzania polipeptydu zgodnego z zastrzeżeniem 25, obejmujący transformację komórki gospodarza polinukleotydem zgodnym z którymkolwiek z zastrzeżeń 1 do 12, plazmidem lub wektorem określonym w jednym z zastrzeżeń 13 lub 14. 27. Sposób wytwarzania polipeptydu zgodnie z zastrzeżeniem 25 lub zastrzeżeniem 26, przy czym wspomniana komórka gospodarza jest komórką gospodarza określoną w którymkolwiek z zastrzeżeń 1 do 24. 28. Sposób wytwarzania polipeptydu obejmujący ekspresję polinukleotydu zgodnego z którymkolwiek z zastrzeżeń 1 do 12, przy czym wspomniany polipeptyd jest wybrany z grupy składającej się z:




• polipeptydu możliwego do uzyskania ze szczepu P1-29 Buttiauxella sp., zdeponowanego pod numerem dostępu NCIMB 41248, przy czym peptyd ten otrzymywany jest przez ekspresję SEQ ID Nr 2 lub sekwencji nukleotydowej otrzymanej ze szczepu P1-29 Buttiauxella sp. zdeponowanego

21

EP 2 236 600 B1

pod numerem dostępu NCIMB 41248 lub sekwencji nukleotydowej, która jest z nią co najmniej w 80% identyczna,


29. Sposób wytwarzania polipeptydu zgodnego z ustępem 28 obejmujący ekspresję polinukleotydu, zgodnego z którymkolwiek z ustępów 1 do 12, w plazmidzie lub wektorze zgodnie z ustępem 13 lub 14. 30. Sposób wytwarzania polipeptydu obejmujący ekspresję polinukleotydu zgodnego z którymkolwiek z ustępów 1 do 12 w komórce gospodarza w pożywce oraz oddzielenie wspomnianego polipeptydu od pożywki komórki gospodarza, przy czym wspomniany polipeptyd jest wybrany z grupy składającej się z:





gdzie wspomniany polipeptyd posiada aktywność fitazy, przy czym wspomniany polipeptyd posiada aktywność specyficzną przynajmniej 300 U/mg, przy czym aktywność specyficzna jest wyznaczana przez inkubację wspomnianego polipeptydu w roztworze zawierającym 2mM fitynian i 0,8mM CaCl₂ w 200mMm buforze octanu sodu o pH równym 3,5, w temperaturze 37°C.

31. Sposób wytwarzania polipeptydu, zgodnego z ustępem 30, obejmujący ekspresję polinukleotydu zgodnego z którymkolwiek z ustępów 1 do 12 w plazmidzie lub wektorze, zgodnie z ustępem 13 lub 14, w komórce gospodarza.

[0108] W innym aspekcie wynalazku przedstawiona została komórka gospodarza transformowana (przekształcona) lub transfekowana kwasem nukleinowym kodującym fitazę, jak tu opisano.

[0109] Odpowiednio, komórka gospodarza zgodna z tym aspektem wynalazku zawiera fitazę, która zawiera sekwencję aminokwasową, jak przedstawiono w SEQ ID NR: 3 lub sekwencję, która jest z nią co najmniej w 80% homologiczna.

[0110] W korzystnym wykonaniu wspomniana komórka gospodarza wytwarza fitazę

[0111] W dalszym aspekcie wynalazku przedstawiono komórkę gospodarza przekształconą lub transfekowaną kwasem nukleinowym kodującym fitazę, zgodnie z niniejszym wynalazkiem. Najlepiej, gdy fitaza jest fitazą Buttiauxella sp., jak opisano w niniejszym wynalazku, lub jej homologiem czy pochodną. Korzystnie, enzym fitazy zawiera sekwencję aminokwasów, jak określono w SEKW. Nr ID.: 3 lub sekwencję, która jest w co najmniej w 80% do niej homologiczna (identyczna). Najlepiej, gdy wspomniana komórka gospodarza produkuje fitazę.

22

EP 2 236 600 B1

[0112] W jednym wykonaniu sekwencję nukleotydów, którą można stosować w niniejszym wynalazku, można uzyskać z (choć nie musi być faktycznie uzyskana z) Buttiauxella sp., należy jednak zauważyć, że enzymy wyizolowane i/lub oczyszczone z równoważnych szczepów również mogą zostać zastosowane.

[0113] Odpowiednio, komórka gospodarza pochodzi z mikroorganizmów, w tym bakterii i grzybów, w tym drożdży. W szczególnie korzystnym wykonaniu, komórka gospodarza jest prokariotyczną komórką bakteryjną. Odpowiednie bakteryjne komórki gospodarza obejmują bakterie z różnych prokariotycznych grup taksonomicznych, w tym proteobakterie, w tym poddziały alfa, beta, gamma, delta i epsilon, bakterie gram dodatnie, takie jak Actinomycetes, Firmicutes, Clostridium i pokrewne, flawobakterie, cyjanobakterie (sinice), zielone bakterie siarkowe, zielone bakterie niesiarkowe i archeowce. Szczególnie korzystne są Enterobacteriaceae, takie jak proteobakteria Escherichia coli należąca do poddziału gamma i bakterie gram dodatnie o niskiej zawartości GC, takie jak Bacillus.

[0114] Odpowiednie komórki grzybów gospodarza obejmują drożdże wybrane z grupy obejmującej workowce (Ascomycota), w tym drożdżaki (Saccharomycetes), takie jak Pichia, Hansenula i Saccharomyces, woreczniaki (Schizosaccharmycetes) takie jak Schizosaccharomyces pombe oraz anamorficzne workowce (anomorphic Ascomycota), w tym Aspergillus.

[0115] Inne odpowiednie eukariotyczne komórki gospodarza obejmują komórki owadów, takie jak komórki SF9, SF21,Trychplusiani i M121. Na przykład polipeptydy zgodnie z wynalazkiem mogą korzystnie ulegać ekspresji w systemach komórkowych owadów. Ekspresję genów fitazy można prowadzić zarówno w kulturach komórkowych komórek owadów, jak i w całych organizmach owadów. Wektory wirusowe, takie jak bakulowirus umożliwiają infekowanie całych owadów. Duże owady, takie jak ćmy jedwabnika, zapewniają wysoką wydajność produkcji białka heterologicznego. Białko można wydobywać z owadów, zgodnie z konwencjonalnymi technikami ekstrakcji. Wektory ekspresyjne nadające się do stosowania w wynalazku, obejmują wszystkie wektory, które są zdolne do ekspresji obcych białek w liniach komórkowych owadów.

[0116] Inne komórki gospodarza obejmują komórki roślin wybranych z grupy składającej się z protoplastów, komórek, calli, tkanek, organów, nasion, embrionów, zalążków, zygot itp. Wynalazek dotyczy także całych roślin, które zostały przetworzone i zawierają rekombinowane DNA wynalazku.

[0117] Określenie „roślina” zasadniczo obejmuje glony eukariotyczne, embriofity w tym mszaki (Bryophyta), paprotniki (Pteridophyta) i rośliny nasienne (Spermatophyta), takie jak nagozalążkowe (Gymnospermae) i okrytozalążkowe (Angiospermae).

[0118] Najlepiej, jeżeli wspomniana komórka gospodarza jest drobnoustrojem. Preferowane drobnoustroje obejmują prokariotyczne komórki bakteryjne, najlepiej E. Coli, B. Subtilis i inne gatunki z rodzaju Bacillus, drożdże, najlepiej Hansenula polymorpha i Schizosaccharomyces pombe.

[0119] W kolejnym aspekcie wynalazku przedstawiony jest szczep P1-29 komórek bakterii Buttiauxella sp zdeponowany przez Danisco Global Innovation, Sokeritehtaantie 20, FIN-02460 Kantvik, Finlandia 22 września 2004 r. pod numerem dostępu 41248 NCIMB. Taka komórka może być włączona bezpośrednio do paszy zwierzęcej.

[0120] W kolejnym aspekcie przedstawiono sposób produkcji fitaz składający się z transfekcji komórki gospodarza wektorem ekspresyjnym lub plazmidem zgodnie z wynalazkiem, hodowli wspomnianej komórki gospodarza w warunkach ekspresji fitazy oraz ekstrakcji fitazy z pożywki kultury komórki gospodarza.

[0121] Korzystnie jest, jeżeli wspomniany sposób służy produkcji sekwencji aminokwasowej dokonującej ekspresji fitazy, jak określono w SEQ ID Nr: 3 lub sekwencji o co najmniej 80% homologii do niej w komórce gospodarza i ekstrakcji wydzielanego białka z pożywki kultury komórki gospodarza.

23

EP 2 236 600 B1

Żywność lub pasza – tylko w celu ilustracyjnym

[0122] Innym aspektem wynalazku jest kompozycja pasz zwierzęcych zawierających fitazę zgodnie z wynalazkiem. Najlepiej, jeżeli kompozycja pasz zawiera fitazę w stężeniu 10-10000 U/kg paszy, korzystnie 200-2000U/kg paszy, a korzystniej 500-1000 U/kg paszy.

[0123] W jednym wykonaniu kompozycja pasz zawiera komórkę gospodarza zgodną z wynalazkiem.

[0124] W kolejnym aspekcie, zgodnie z wynalazkiem, przedstawiono zastosowanie fitazy w żywności lub paszy zwierzęcej.

KORZYSTNE ASPEKTY

[0125] Korzystne aspekty przedstawione są w załączonych zastrzeżeniach i w poniższym opisie oraz sekcji Przykłady.

DODATKOWE ZALETY

[0126] Niniejszy wynalazek posiada zalety, ponieważ przedstawia kodowanie wyizolowanych cząsteczek kwasu nukleinowego dla fitaz, które mają liczne właściwości, czyniące je szczególnie przydatnymi jako dodatki do pasz zwierzęcych.

[0127] W szczególności fitazy niniejszego wynalazku kodowane wyizolowaną cząsteczką kwasu nukleinowego są aktywne przy niskim pH, najlepiej w zakresie pH od 2 do 5,5 z maksimum aktywności przy pH około 4 – 4,5. Korzystnie fitazy są aktywne przy niskich wartościach pH środowiska żołądka (zachowując około 40% maksymalnej aktywności przy pH 2,5).

[0128] Ponadto fitazy niniejszego wynalazku kodowane przez wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego są efektywnie wydzielane zarówno w rodzimym gospodarzu, jak i podczas ekspresji heterologicznej, prowadząc tym samym do zwiększenia efektywności produkcji i izolacji w celu dodawania do pasz.

[0129] Ponadto fitazy niniejszego wynalazku kodowane przez wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego mają szeroką specyficzność wobec substratu, w tym substratów penta-, tetra-, tri- i difosforanowych, zwiększając tym samym całkowitą ilość fosforanów dostępnych dla absorpcji przez zwierzę (dostępny fosforan). Najkorzystniej jest, gdy fitazy posiadają również wysoką aktywność specyficzną w regionie 300 U/mg +/- około 10%, najlepiej co najmniej 300 U/mg.

[0130] Produkty niniejszego wynalazku mogą być stosowane jako dodatki/suplementy do żywności i pasz zwierzęcych. Produkty te mogą być również przydatne w komercyjnej produkcji różnych fosforanów inozytolu.

FITYNIAN/KWAS FITYNOWY/FITAZY

[0131] Kwas fitynowy (heksakisfosforan mio-inozytolu) jest ważnym składnikiem zbóż, roślin strączkowych i roślin oleistych. Fitynian w postaci soli jest główną formą magazynowania fosforu w tych roślinach.

[0132] Fitazy katalizują hydrolizę monoestru fosforanu kwasu fitynowego, co powoduje stopniowe tworzenie mio-inozytolu pentakis-, tetrakis-, tris-, bis- i monofosforanów, jak również wyzwolenie nieorganicznego fosforanu.

[0133] Określenia „fitaza typu dzikiego” lub „typ dziki”, stosownie do wynalazku, odnoszą się do enzymu fitazy z sekwencją aminokwasową występującą w przyrodzie.

[0134] Określenia „wariant fitazy” lub „wariant” lub „postać zmodyfikowana” odnoszą się do enzymu fitazy o sekwencji aminokwasów pochodzącej z sekwencji aminokwasów fitazy macierzystej posiadającej jedno lub

24

EP 2 236 600 B1

więcej podstawienie aminokwasowe, insercję i/lub delecję aminokwasów, które łącznie są określane jako „mutacje”.

[0135] Określenia „fitaza macierzysta” lub „enzym macierzysty” odnoszą się do enzymu fitazy, z którego pochodzi wariant fitazy. Fitaza macierzysta może być fitazą typu dzikiego lub innym wariantem fitazy. W szczególności, w niniejszym wynalazku, „fitaza macierzysta” może pochodzić z Buttiauxella sp. Korzystnie „fitaza macierzysta” pochodzi od szczepu P1-29 Buttiauxella, jak tu opisano, który najlepiej gdy ma sekwencję aminokwasową określoną w SEQ ID Nr: 3

WYIZOLOWANE

[0136] W jednym aspekcie, korzystnie jest, gdy sekwencja nukleotydowa lub sekwencja aminokwasowa jest w postaci izolowanej. Określenie „wyizolowane” oznacza, że sekwencja jest co najmniej zasadniczo wolna od co najmniej jednego innego składnika, z którym sekwencja jest naturalnie związana w naturze, jak i występuje w przyrodzie.

OCZYSZCZONE

[0137] W jednym aspekcie wynalazku, korzystnie jest, gdy sekwencja nukleotydowa lub sekwencja aminokwasowa występuje w postaci oczyszczonej. Określenie „oczyszczony” oznacza, że sekwencja jest w stanie stosunkowo czystym, jest co najmniej czysta w 1%, 5% lub w 10%, najlepiej gdy jest czysta w co najmniej 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%. W przypadku polipeptydu, w najlepszym wykonaniu czystość, jak określono powyżej, jest określana w znaczeniu oczyszczenia z innych polipeptydów za pomocą elektroforezy SDS-PAGE. W przypadku polinukleotydu, w najlepszym wykonaniu czystość, jak określono powyżej, jest określana w znaczeniu oczyszczenia z innych polinukleotydów.

SEKWENCJA NUKLEOTYDOWA

[0138] Zakres niniejszego wynalazku obejmuje sekwencje nukleotydów kodujące enzymy posiadające szczególne właściwości, określone w niniejszym dokumencie.

[0139] Stosowane tu określenie „sekwencja nukleotydowa” odnosi się do sekwencji oligonukleotydów, sekwencji kwasu nukleinowego lub polinukleotydów oraz wariantu, homologów, fragmentów i pochodnych (np. jej części). Sekwencja nukleotydowa może pochodzić z genomu, może być pochodzenia syntetycznego lub zostać otrzymana z rekombinacji, może być dwuniciowa lub jednoniciowa, zarówno sensowna jak i antysensowna.

[0140] Określenie „sekwencja nukleotydowa” lub „cząsteczka kwasu nukleinowego” w odniesieniu do niniejszego wynalazku, obejmuje genomowy DNA, cDNA, syntetyczny DNA i RNA. Korzystnie oznacza to DNA, korzystniej sekwencję cDNA kodującą według niniejszego wynalazku.

[0141] W najlepszym wykonaniu sekwencja nukleotydowa w odniesieniu do i objęta per se zakresem niniejszego wynalazku, nie obejmuje natywnej sekwencji nukleotydowej w jej naturalnym środowisku i sytuacji, gdy jest połączona ze swoimi naturalnie związanymi sekwencjami(ą) które(a) również znajdują(e) się w jej/ich środowisku naturalnym. Dla ułatwienia, to korzystne wykonanie będzie nazywane „nienatywną sekwencją nukleotydową”. W związku z tym, określenie „natywna sekwencja nukleotydowa” oznacza całą sekwencję nukleotydową, która znajduje się w swoim naturalnym środowisku i jest operacyjnie połączona z całym promotorem, z którym jest naturalnie powiązana, który to promotor także znajduje się w swoim naturalnym środowisku. Jednakże, sekwencja aminokwasowa objęta zakresem niniejszego wynalazku może zostać wyizolowana i/lub oczyszczona po ekspresji sekwencji nukleotydowej w jej rodzimym organizmie. Jednakże, najlepiej, gdy ekspresja sekwencji aminokwasowej objętej zakresem niniejszego wynalazku

25

EP 2 236 600 B1

dokonywana jest przez sekwencję nukleotydową w jej rodzimym organizmie, przy czym sekwencja nukleotydowa nie jest sterowana przez promotor, z którym jest naturalnie związana w tym organizmie.

PRZYGOTOWANIE SEKWENCJI NUKLEOTYDOWEJ

[0142] Zazwyczaj sekwencja nukleotydowa objęta zakresem wynalazku lub sekwencja nukleotydowa do zastosowania w niniejszym wynalazku jest wytwarzana za pomocą technik rekombinacji DNA (tj. Rekombinowany DNA). Jednakże, w alternatywnym wykonaniu wynalazku, sekwencja nukleotydowa może być syntetyzowana w całości lub w części, przy użyciu metod chemicznych, dobrze znanych w dziedzinie [patrz Caruthers MH i wsp., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 i Horn T i wsp., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232].

[0143] Sekwencja nukleotydowa kodująca enzym, który posiada szczególne właściwości, jak określono w niniejszym dokumencie, lub enzym, który nadaje się do modyfikacji, może zostać zidentyfikowana i/lub wyizolowana, i/lub oczyszczona z dowolnej komórki lub organizmu produkującego ten enzym. W dziedzinie znane są dobrze różne metody identyfikacji i/lub izolacji, i/lub oczyszczania sekwencji nukleotydowych. Przykładowo, po tym, gdy odpowiednia sekwencja zostanie zidentyfikowana i/lub wyizolowana i/lub oczyszczona, w celu wytworzenia większej ilości sekwencji stosowane mogą być techniki amplifikacji PCR.

[144] Jako dalszy przykład można wskazać tworzenie genomowego DNA i/lub biblioteki cDNA przy użyciu chromosomalnego DNA lub matrycowego RNA z organizmu produkującego enzym. Jeśli sekwencja aminokwasowa enzymu lub część sekwencji aminokwasowej enzymu jest znana, do identyfikacji klonów kodujących enzym z biblioteki genomowej przygotowanej z organizmu, można syntetyzować i zastosować znakowane sondy oligonukleotydowe. Alternatywnie, do identyfikacji klonów kodujących enzym można zastosować znakowaną sondę oligonukleotydową, która zawiera sekwencje homologiczne do innego znanego genu enzymu. W tym ostatnim przypadku stosuje się hybrydyzację i przemywanie w warunkach obniżonej rygorystyczności.

[0145] Alternatywnie klony kodujące enzym można zidentyfikować poprzez wprowadzenie fragmentów genomowego DNA do wektora ekspresji, takiego jak plazmid, przekształcając bakterie ujemne na enzymy otrzymaną biblioteką genomowego DNA, a następnie umieszczając przekształcone bakterie na płytkach agarowych zawierających pożywkę dla enzymu (np. maltozę dla enzymu wytwarzającego glukozydazę (maltazę)), umożliwiając klonom ekspresję enzymu, który ma zostać zidentyfikowany.

[0146] W jeszcze innym alternatywnym przykładzie sekwencję nukleotydową kodującą enzym można wytworzyć syntetycznie przy pomocy uznanych standardowych metod, np. metodą fosforoamidynów, opisaną przez Beucage S.L. i wsp., (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869, lub metodą opisaną przez Matthes i wsp., (1984) EMBO J. 3, p 801-805. W metodzie fosforoamidynów, oligonukleotydy są syntetyzowane np. w automatycznym syntezatorze DNA, oczyszczane, denaturowane, wiązane i klonowane w odpowiednich wektorach.

[0147] Sekwencja nukleotydowa może być pochodzenia mieszanego genomowego i syntetycznego, mieszanego syntetycznego i cDNA, lub mieszanego genomowego i cDNA, przygotowane przez wiązanie fragmentów pochodzenia syntetycznego, genomowego lub cDNA (odpowiednio) zgodnie ze standardowymi technikami. Każdy związany fragment odpowiada różnym częściom całej sekwencji nukleotydowej. Sekwencja DNA może być także wytwarzana w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z użyciem specyficznych starterów, jak na przykład opisano w US 4,683,202 lub w Saiki RK i wsp., (Science (1988) 239, str. 487-491).

[0148] Ze względu na degenerację kodu genetycznego, sekwencje nukleotydowe można łatwo produkować, przy użyciu kodonów (trypletów), niektórych lub wszystkich aminokwasów kodowanych przez pierwotną sekwencję nukleotydową, które zmieniono, wytwarzając w ten sposób sekwencję nukleotydową o niskiej

26

EP 2 236 600 B1

homologii do pierwotnej sekwencji nukleotydowej, ale która koduje tę samą sekwencję aminokwasową lub wariant, jak kodowana przez pierwotną sekwencję nukleotydową. Na przykład, dla większości aminokwasów degeneracja kodu genetycznego zachodzi na trzeciej pozycji w kodonie (pozycja chwiejna) (dla porównania patrz Stryer, Lubert, Biochemistry, trzecie wydanie, Freeman Press, ISBN 0-7167-1920-7), w związku z tym sekwencja nukleotydowa, w której wszystkie kodony zostały „zachwiane” na trzeciej pozycji, będzie w około 66% identyczna z oryginalną sekwencją nukleotydową, jednak zmieniona sekwencja nukleotydowa będzie kodowała tę samą pierwotną sekwencję aminokwasową lub jej wariant, jak oryginalna sekwencja nukleotydowa.

[0149] Dlatego też, niniejszy wynalazek odnosi się również do wszelkich sekwencji nukleotydowych, które mają kodon (tryplet) alternatywny w stosunku do co najmniej jednego kodonu kodującego aminokwas, ale który koduje tę samą sekwencję polipeptydu lub jej wariant, jak sekwencja polipeptydu kodowana przez oryginalną sekwencją nukleotydową.

[0150] Ponadto poszczególne organizmy zwykle posiadają zastrzeżenia co do wykorzystania kodonów trypletów stosowanych do kodowania aminokwasów. Właściwe tabele wykorzystania kodonów są powszechnie dostępne i mogą być stosowane do wytwarzania genów zoptymalizowanych pod względem kodonów. Takie techniki optymalizacji kodonu są rutynowo stosowane w celu optymalizacji ekspresji transgenów w heterologicznym gospodarzu.

PRZEKSZTAŁCENIA MOLEKULARNE

[0151] Gdy sekwencja nukleotydowa kodująca enzym zostanie wyizolowana i/lub oczyszczona lub zidentyfikowana zostanie domniemana sekwencja nukleotydowa kodująca enzym, konieczne może okazać się zmodyfikowanie wybranej sekwencji nukleotydowej, na przykład pożądana może być mutacja tej sekwencji w celu wytworzenia enzymu zgodnie ze sposobami niniejszego wynalazku.

[0152] Mutacje mogą być wprowadzane przy użyciu syntetycznych oligonukleotydów. Te oligonukleotydy zawierają sekwencje nukleotydowe flankujące pożądane miejsca mutacji.

[0153] Odpowiedni sposób przedstawiono u Morinaga i wsp. (Biotechnology (1984) 2, str. 646-649). Inny sposób wprowadzania mutacji do sekwencji nukleotydowych kodujących enzym, jest opisany u Nelson i Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, str 147-151).

[0154] Zamiast mutagenezy ukierunkowanej, takiej jak opisano powyżej, mutacje można wprowadzać losowo, na przykład przy użyciu komercyjnego zestawu, takiego jak zestaw do mutagenezy PCR GeneMorph Stratagene lub zestaw do przypadkowej mutagenezy Diversify PCR Clontech.

[0155] Trzecia metoda uzyskania nowych sekwencji polega na fragmentacji nieidentycznych sekwencji nukleotydowych, albo za pomocą dowolnej liczby enzymów restrykcyjnych lub enzymów takich jak DnaseI i ponowne złożenie pełnej sekwencji nukleotydowej, kodującej białka funkcjonalne. Alternatywnie można użyć jednej lub wielu nieidentycznych sekwencji nukleotydowych oraz wprowadzić mutację podczas ponownego składania pełnej sekwencji nukleotydowej.

[0156] Zatem możliwe jest wytworzenie w sekwencji nukleotydowej licznych ukierunkowanych lub losowych mutacji, in vivo lub in vitro, a następnie wykonanie badań przesiewowych w celu odnalezienia kodowanego polipeptydu o ulepszonej w różny sposób funkcjonalności.

[0157] Jako nieograniczający przykład można wskazać, że mutacje lub naturalne warianty sekwencji polinukleotydowej mogą być rekombinowane zarówno z mutacjami typu dzikiego czy innymi, lub naturalnymi wariantami, w celu wytworzenia nowych wariantów. Takie nowe warianty mogą być przesiewane w celu odnalezienia ulepszonych funkcjonalności kodowanego polipeptydu. Produkcję nowych korzystnych

27

EP 2 236 600 B1

wariantów można osiągnąć na różne sposoby, dobrze znane w dziedzinie, na przykład mutagenezę Error Threshold (WO 92/18645), mutagenezę losową za pośrednictwem oligonukleotydu (US 5,723,323), tasowania DNA (US 5,605,793), składania genów z egzo pośrednictwem (WO 0058517). Inne odpowiednie metody są opisane na przykład w WO 0134835, WO 02/097130, WO 03/012100, WO03/057247, WO 2004/018674, US 6,303,344 i US 6,132,970.

[0158] Stosowanie wyżej wymienionych i podobnych metod przekształceń molekularnych pozwala na identyfikację i wybór wariantów enzymów do zastosowania w niniejszym wynalazku, które mają korzystne cechy, bez wcześniejszej znajomości struktury lub funkcji białek i pozwala na wytwarzanie nieprzewidywalnych, ale korzystnych mutacji lub wariantów. W dziedzinie istnieją liczne przykłady stosowania przekształceń molekularnych w celu optymalizacji lub zmiany aktywności enzymów, takie przykłady obejmują, ale nie są ograniczone do jednej lub więcej z następujących czynności: zoptymalizowanie ekspresji i/lub działalności w komórce gospodarza lub in vitro, zwiększenie aktywności enzymatycznej, zmiana specyficzności wobec substratu i/lub produktu, zwiększenie lub zmniejszenie stabilności enzymatycznej lub strukturalnej, zmiana aktywności/specyficzności enzymatycznej w korzystnych warunkach środowiskowych, np. temperatura, pH, substrat.

[0159] Powyższe metody przekształceń molekularnych mogą być zastosowane w sposobach wytwarzania wariantu enzymu fitazy, jak tu opisano.

SEKWENCJE AMINOKWASOWE

[0160] Zakres niniejszego wynalazku obejmuje wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące sekwencje aminokwasowe enzymów, posiadających specyficzne właściwości, określone w niniejszym dokumencie.

[0161] Stosowane tu określenie „sekwencja aminokwasowa” jest równoznaczna z określeniem „polipeptyd” i/lub określeniem „białko”. W niektórych przypadkach określenie „sekwencja aminokwasowa” jest równoznaczna z określeniem „peptyd”. W niektórych przypadkach określenie „sekwencja aminokwasowa” jest równoznaczna z określeniem „enzym”.

[0162] Sekwencja aminokwasowa może być przygotowana/wyizolowana z odpowiedniego źródła, może być syntetyczna lub może być przygotowana z wykorzystaniem technik rekombinacji DNA.

[0163] Enzym zakodowany przez wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego objęte niniejszym wynalazkiem może być stosowany w połączeniu z innymi enzymami. Dlatego też niniejszy wynalazek obejmuje kombinację enzymów, przy czym kombinacja zawiera enzym zakodowany przez wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego niniejszego wynalazku i inny enzym, którym może być inny enzym wytworzony sposobami zgodnymi z niniejszym wynalazkiem. Ten aspekt został omówiony w dalszej części.

[0164] Korzystnie jest, gdy sekwencja aminokwasowa w przypadkach powiązanych z wynalazkiem i objęta per se zakresem wynalazku nie jest enzymem natywnym. Pod tym względem, określenie „enzym natywny” oznacza cały enzym, który jest w swoim naturalnym środowisku, a którego ekspresja została dokonana przez jego natywną sekwencję nukleotydową.

WARIANTY/ HOMOLOGI/ POCHODNE

[0165] Niniejszy wynalazek obejmuje także zastosowanie wariantów, homologów i pochodnych dowolnej sekwencji aminokwasowej enzymu lub jakiejkolwiek sekwencji nukleotydowej kodującej taki enzym.

28

[0166] Tutaj określenie „homolog” oznacza jednostkę posiadającą pewną homologię sekwencji aminokwasowych i sekwencji nukleotydoych. Określenie „homologia” może być utożsamiane ze słowem „identyczność”. Odpowiednio „homologiczny” w tym kontekście odnosi się do procentowej identyczności

EP 2 236 600 B1

sekwencji dwóch enzymów, po ich dopasowaniu przy użyciu algorytmów dopasowania sekwencji opisanych bardziej szczegółowo poniżej.

[0167] W tym kontekście, homologiczną sekwencję aminokwasową rozumie się jako obejmującą sekwencję aminokwasową, która może być identyczna co najmniej w 75, 80, 81, 85 lub 90%, najlepiej identyczna co najmniej w 95, 96, 97, 98 lub 99% z sekwencją. Zazwyczaj wszystkie homologi będą zawierać te same miejsca aktywne itp. – np. jak przedmiotowa sekwencja aminokwasowa. Chociaż homologię można rozpatrywać w kontekście podobieństwa (np. resztek aminokwasowych o podobnych właściwościach chemicznych/ funkcjach), w kontekście niniejszego wynalazku korzystne jest, aby dokonać ekspresji homologii w zakresie identyczności sekwencji.

[0168] „Funkcjonalny fragment” oznacza fragment polipeptydu, który zachowuje charakterystyczne cechy tego polipeptydu. W kontekście niniejszego wynalazku, funkcjonalny fragment enzymu fitazy jest fragmentem, który zachowuje zdolność karotenoidów do rozszczepiania całego białka.

[0169] W tym kontekście, homologiczną sekwencję nukleotydową rozumie się jako obejmującą sekwencję nukleotydową, która może być identyczna co najmniej w 75 80, 81, 85 lub 90%, najlepiej identyczna co najmniej w 95, 96, 97, 98 lub 99% z sekwencją nukleotydową kodującą enzym niniejszego wynalazku (sekwencja przedmiotowa). Zazwyczaj wszystkie homologi będą zawierać te same sekwencje, które kodują aktywne miejsca itp. Jak na przykład sekwencja przedmiotowa. Chociaż homologię można rozpatrywać w kontekście podobieństwa (np. resztek aminokwasowych o podobnych właściwościach chemicznych/ funkcjach), w kontekście niniejszego wynalazku korzystne jest, aby dokonać ekspresji homologii w zakresie identyczności sekwencji.

[0170] Do sekwencji aminokwasowych i sekwencji nukleotydowych, porównania homologii mogą być prowadzone „na oko”, lub częściej za pomocą łatwo dostępnych programów do porównywania sekwencji. Te dostępne na rynku programy komputerowe mogą obliczyć % homologii pomiędzy dwoma lub większą ilością sekwencji.

[0171] Procent (%) homologii może być obliczony dla przyległej sekwencji, czyli jedna sekwencja jest dopasowywana do innej sekwencji i każdy aminokwas w jednej sekwencji jest bezpośrednio porównywany z odpowiadającym mu aminokwasem w drugiej sekwencji, jedna reszta na raz. To się nazywa dopasowywanie „bez przerw”. Zazwyczaj takie dopasowywania wykonywane są tylko dla stosunkowo krótkiej liczby reszt.

[0172] Choć jest to bardzo prosty i spójny sposób, nie bierze on pod uwagę, że na przykład w przypadku pary identycznych sekwencji, jedna insercja lub delecja spowoduje, że następujące reszty aminokwasowe staną się niedopasowane, a tym samym potencjalnie w rezultacie zajdzie duże zmniejszenie w % homologii podczas dopasowywania globalnego. W związku z tym większość metod porównywania sekwencji jest tak zaprojektowana, aby tworzyć optymalne dopasowania, które biorą pod uwagę możliwe insercje i delecje, bez nadmiernego obniżania ogólnego wyniku homologii. Osiąga się to poprzez wstawianie „przerw” w dopasowywaniu sekwencji, w celu zmaksymalizowania lokalnych homologii.

29

[0173] Jednakże, te bardziej złożone metody przypisują „kary za przerwę” do każdej przerwy, która występuje w dopasowaniu tak, że jeśli dla tej samej liczby identycznych aminokwasów możliwe jest dopasowanie sekwencji z możliwie jak najmniejszą ilością przerw – będące odbiciem wyższego pokrewieństwa między dwiema porównywanymi sekwencjami – to osiągnie ono wyższy wynik niż dopasowanie z wieloma przerwami. Zazwyczaj używa się „afinicznych kosztów przerwy”, które oznaczają stosunkowo wysoki koszt za istnienie przerwy i mniejsze kary za każdą kolejną resztę w przerwie. Jest to najczęściej używany system punktacji przerw. Wysokie kary za przerwę będą oczywiście wytwarzały dopasowania zoptymalizowane z mniejszą ilością przerw. Większość programów do dopasowywania umożliwia modyfikację kar za przerwę. Jednakże dla porównania sekwencji korzystne jest stosowanie wartości domyślnych podczas korzystania z takiego oprogramowania. Na przykład podczas korzystania z

EP 2 236 600 B1

pakietu GCG Wisconsin Bestfit domyślne kary za przerwę w sekwencjach aminokwasowych wynoszą -12 za przerwę i -4 za każde rozszerzenie.

[0174] W związku z tym obliczanie maksymalnej % homologii, po pierwsze wymaga przedstawienia optymalnego dopasowania, biorąc pod uwagę kary za przerwę. Odpowiednim programem komputerowym do przeprowadzania takiego dopasowania jest pakiet GCG Wisconsin Bestfit (Devereux i wsp. 1984 Nuc. Acids Research 12 p387). Przykłady innych programów, które mogą wykonać porównania sekwencji obejmują między innymi pakiet BLAST (patrz Ausubel i wsp., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, wyd 4 – Rozdział 18), FASTA (Altschul i wsp., 1990 J. Mol. Biol. 403-410) i zestaw narzędzi porównawczych GENEWORKS. Zarówno BLAST i FASTA umożliwiają wyszukiwanie w trybie offline jak i online (patrz Ausubel i wsp., 1999 r., Short Protocols in Molecular Biology, str. 7-58 do 7-60).

[0175] Jednak w przypadku niektórych zastosowań korzystne jest użycie programu GCG Bestfit. Nowe narzędzie, o nazwie BLAST 2 Sequences również umożliwia porównania białka i sekwencji nukleotydowej (patrz FEMS Microbiol Lett1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 i [email protected]).

[0176] Mimo że ostateczny % homologii może być mierzony w kategoriach identyczności, proces dopasowania zwykle nie jest oparty na porównaniu par na zasadzie „wszystko albo nic”. Zamiast tego, powszechnie używana jest skalowana macierz wyniku podobieństwa, która przydziela wynik każdej porównanej parze w oparciu o podobieństwo chemiczne lub dystans ewolucyjny. Przykładem takiej macierzy jest powszechnie stosowana macierz BLOSUM62 – macierz domyślna pakietu programów BLAST. Programy GCG Wisconsin co do zasady używają wartości domyślnych lub tabeli porównawczej niestandardowych symboli, jeśli jest dostępna (dalsze szczegóły w instrukcji obsługi). Dla niektórych zastosowań korzystne jest zastosowanie wartości domyślnych dla pakietu GCG lub, w przypadku innego oprogramowania, domyślnej matrycy, takiej jak BLOSUM62.

[0177] Alternatywnie, procentowe homologie można obliczyć korzystając z funkcji wielokrotnego dopasowania w DNASIS™ (Hitachi Software), w oparciu o algorytm, analogiczny do CLUSTAL (Higgins DG i Sharp PM (1988), Gen 73(1), 237-244).

[0178] Kiedy program wytworzy optymalne dopasowanie, to wówczas można obliczyć % homologii, najlepiej % identyczności sekwencji. Oprogramowanie zazwyczaj wykonuje to w ramach porównania sekwencji i generuje wynik liczbowy.

[0179] W preferowanym aspekcie niniejszego wynalazku wykorzystywane jest następujące oprogramowanie i ustawienia do obliczania procentowej homologii/identyczności sekwencji. Dla sekwencji aminokwasowych procent identyczności (homologii) lub „wartości dodatnie” obliczane są za pomocą AlignX VectorNTI (Vector NTI Advance 9.1 z Invitrogen Corporation, Carlsbad, California, USA) dla każdej możliwej pary sekwencji aminokwasowych. Ustawienia są parametrami domyślnymi (kara za otwarcie przerwy – 10, kary za przedłużenie przerwy 0,1).

[0180] Dla sekwencji aminokwasowych procent identyczności (homologii) lub „wartości dodatnie” obliczane są za pomocą AlignX VectorNTI z Informax Inc. (USA) dla każdej możliwej pary sekwencji aminokwasowych. Ustawienia są ustawieniami domyślnymi dla DNA: kara za otwarcie przerwy: 15 i kara za przedłużenie przerwy: 6,66. (te same ustawienia dla wielu dopasowań).

[0181] Najlepiej, jeżeli identyczność aminokwasową (homologię) oblicza się na całej długości sekwencji aminokwasowej lub kwasów nukleinowych w stosunku do odpowiedniego polinukleotydu, który koduje odpowiednią sekwencję aminokwasową o pełnej długości.

30

EP 2 236 600 B1

[0182] Sekwencje mogą również mieć delecje, insercje lub substytucje reszt aminokwasowych, które powodują cichą zmianę i dają w wyniku substancję funkcjonalnie ekwiwalentną. Celowe substytucje aminokwasów mogą być dokonywane na podstawie podobieństwa właściwości aminokwasów (takich jak polarność, ładunek, rozpuszczalność, hydrofobowość, hydrofilowość i/lub amfipatyczny charakter reszt) i dlatego są przydatne do łączenia aminokwasów razem w grupy funkcyjne. Aminokwasy mogą być grupowane wyłącznie w oparciu o właściwości ich łańcuchów bocznych. Jednakże bardziej przydatne jest również włączenie danych dotyczących mutacji. Zestawy aminokwasów uzyskanych w ten sposób mogą być zachowywane ze względów strukturalnych. Zestawy te mogą być opisane w formie diagramu Venna (Livingstone C.D i Barton G.J (1993) „Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation” Comput.Appl Biosci. 9: 745-756)(Taylor W.R. (1986) “The classification of amino acid conservation” J.Theor.Biol. 119; 205-218). Substytucje konserwatywne mogą być dokonane na przykład zgodnie z poniższą tabelą, która opisuje ogólnie przyjęty diagram Venna grupujący aminokwasy.

ZESTAW PODZESTAW

Hydrofobowe F W Y H K M I L V A G C

Aromatyczne F W Y H

Alifatyczne I L V

Polarne W Y H K R E D C S T N Q

Naładowane H K R E D

Naładowane dodatnio H K R

Naładowane ujemnie E D

Małe V C A G S P T N D Drobne A G S

[0183] Niniejszy wynalazek obejmuje również homologiczną substytucję (substytucja i wymiana, używane w niniejszym dokumencie, oznaczają wymianę istniejącej reszty aminokwasowej na alternatywną resztę), która może wystąpić np. substytucja podobne-na-podobne, taka jak zasada na zasadę, kwaśne na kwaśne, polarne na polarne itp. Wystąpić może także substytucja niehomologiczna, tzn. z jednej klasy reszt na inną lub alternatywnie z udziałem włączenia nienaturalnego aminokwasu takiego jak ornityna (zwana dalej Z), ornityna kwasu diaminomasłowego (zwana dalej B), ornityna norleucyny (zwana dalej O), piryloalanina, tienyloalanina, naftyloalanina i fenyloglicyna.

[0184] Nienaturalne aminokwasy również mogą dokonywać wymian.

[0185] Warianty sekwencji aminokwasowych mogą zawierać odpowiednie grupy dystansujące, które mogą być wstawiane między dwie dowolne reszty aminokwasowe sekwencji, w tym oprócz odstępników aminokwasów, takich jak reszty glicyny lub alaniny beta, grupy alkilowe, takie jak grupy metylowe, etylowe lub propylowe. Kolejna forma zmienności wiąże się z obecnością jednej lub więcej reszt aminokwasowych w postaci peptoidów, będzie zrozumiała dla fachowców w dziedzinie. Dla uniknięcia wątpliwości określenie „postać peptoidu” jest używane w odniesieniu do reszt aminokwasowych wariantu, przy czym grupa podstawiająca węgiel α znajduje się na atomie azotu reszty, a nie na atomie węgla α. Procesy wytwarzania peptydów w postaci peptoidu są znane w dziedzinie, na przykład Simon RJ i wsp., PNAS(1992) 89(20), 9367-9371 i Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134.

31

[0186] Sekwencje nukleotydowe stosowane w niniejszym wynalazku mogą zawierać w sobie nukleotydy syntetyczne lub zmodyfikowane. W dziedzinie znane są liczne rodzaje modyfikacji oligonukleotydów. Należą do nich szkielety metylofosfonianowe i fosforotionianowe i/lub dodanie łańcuchów akrydyny lub poli-lizyny na 3’ i/lub 5’ końcach cząsteczki. Dla celów niniejszego wynalazku należy rozumieć, że sekwencje nukleotydowe

EP 2 236 600 B1

opisane w niniejszym dokumencie mogą być modyfikowane w dowolny sposób dostępny w dziedzinie. Zmiany takie mogą być przeprowadzone w celu zwiększenia aktywności in vivo lub długości życia sekwencji nukleotydowych niniejszego wynalazku.

[0187] Wynalazek niniejszy obejmuje również zastosowanie sekwencji nukleotydowych, które są komplementarne do sekwencji przedstawionych w niniejszym dokumencie, oraz wszelkich pochodnych, fragmentów lub ich pochodnych. Jeżeli sekwencja jest komplementarna do jej fragmentu, to wówczas taka sekwencja może być użyta jako sonda do określenia podobnych sekwencji kodujących w innych organizmach itp.

[0188] Polinukleotydy, które nie są w 100% homologiczne do sekwencji niniejszego wynalazku, ale mieszczą się w zakresie wynalazku, można uzyskać w kilka sposobów. Inne warianty sekwencji tu opisanych można uzyskać na przykład poprzez użycie bibliotek DNA złożonych z wielu jednostek, np. jednostek z różnych populacji. Ponadto można uzyskać inne homologi, a te homologi i ich fragmenty będą w stanie wybiórczo hybrydyzować z sekwencjami przedstawionymi na liście sekwencji w niniejszym dokumencie. Takie sekwencje mogą być uzyskane za pomocą sondowania bibliotek cDNA lub bibliotek genomowych DNA innych gatunków oraz za pomocą sond zawierających całą lub część jednej z sekwencji z załączonej listy sekwencji, w warunkach średniej do wysokiej rygorystyczności. Podobne uwagi odnoszą się do uzyskania homologów gatunku i wariantów allelicznych polipeptydu lub sekwencji nukleotydowych wynalazku.

[0189] Warianty i szczepy/gatunki homologów można również uzyskać za pomocą zdegenerowanych PCR, które będą wykorzystywały startery zaprojektowane do docelowej sekwencji w obrębie wariantów i homologów kodujących konserwatywne sekwencje aminokwasów w sekwencjach niniejszego wynalazku. Sekwencje konserwatywne można przewidzieć, na przykład, poprzez dopasowanie sekwencji aminokwasów z kilku wariantów/homologów. Dopasowanie sekwencji można wykonać przy użyciu oprogramowania komputerowego, znanego w dziedzinie. Powszechnie wykorzystywany jest na przykład program GCG Wisconsin PileUp.

[0190] Startery stosowane w zdegenerowanych PCR będą zawierać jedną lub więcej pozycji zdegenerowanych i będą wykorzystywane w warunkach niższej rygorystyczności niż te, używane do klonowania sekwencji ze starterami o pojedynczej sekwencji wobec znanych sekwencji.

[0191] Alternatywnie, takie polinukleotydy można otrzymać poprzez mutagenezę ukierunkowaną scharakteryzowanych sekwencji. Może to być przydatne, gdy na przykład w celu optymalizacji preferencji kodonu dla określonej komórki gospodarza, w której dokonywana jest ekspresja sekwencji polinukleotydu, wymagane są zmiany sekwencji cichego kodonu. Inne zmiany sekwencji mogą być wymagane w celu wprowadzenia miejsc rozpoznania enzymu restrykcyjnego lub aby zmienić właściwości czy funkcje polipeptydów kodowanych przez polinukleotydy.

[0192] Polinukleotydy (sekwencje nukleotydowe) wynalazku mogą być wykorzystywane do produkcji startera, np. startera PCR, startera alternatywnych reakcji amplifikacji, sondy np. oznakowanej metką ujawnianą przy użyciu konwencjonalnych środków stosujących metki radioaktywne lub nieradioaktywne, lub też polinukleotydy mogą być klonowane do wektorów. Takie startery, sondy i inne fragmenty będą mieć co najmniej 15, najlepiej przynajmniej 20, na przykład co najmniej 25, 30 lub 40 nukleotydów w długości, a także są objęte określeniem polinukleotydy wynalazku, jak tutaj stosowano.

[0193] Polinukleotydy, takie jak polinukleotydy DNA i sondy zgodnie z wynalazkiem mogą być wytwarzane metodą rekombinacji, syntetycznie lub za pomocą dowolnych środków dostępnych specjalistom w dziedzinie. Mogą one również być klonowane za pomocą standardowych technik.

32

EP 2 236 600 B1

[0194] Co do zasady, startery zostaną wyprodukowane środkami syntetycznymi, obejmującymi stopniową produkcję jednego nukleotydu pożądanej sekwencji kwasu nukleinowego na raz. Techniki realizacji tej produkcji, używające technik zautomatyzowanych, są łatwo dostępne w dziedzinie.

[0195] Dłuższe polinukleotydy będą na ogół produkowane przy użyciu technik rekombinacyjnych, na przykład za pomocą techniki klonowania PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy). Startery mogą być tak zaprojektowane, aby zawierały odpowiednie miejsca rozpoznania enzymu restrykcyjnego, tak aby zamplifikowane DNA mogło być klonowane do odpowiedniego wektora do klonowania.

BIOLOGICZNIE AKTYWNE

[0196] Korzystnie jest, gdy warianty sekwencji itp. Są co najmniej tak biologicznie czynne jak sekwencje przedstawione w niniejszym dokumencie.

[0197] Stosowane tu określenie „biologicznie aktywny” odnosi się do sekwencji o podobnej funkcji strukturalnej (ale niekoniecznie w tym samym stopniu), i/lub podobnej funkcji regulacyjnej (ale niekoniecznie w tym samym stopniu), i/lub podobnej funkcji biochemicznej (ale niekoniecznie w tym samym stopniu), jak naturalnie występująca sekwencja.

[0198] W szczególności, sekwencje wariantów lub ich zmodyfikowane postaci mają profil enzymatyczny podobny do profilu fitazy określonej w dokumencie. Profil ten zawiera cechy, takie jak bycie wydzielanym białkiem, posiadającym optymalne pH w zakresie od pH 2 do 5,5, najlepiej 4,0-4,5, zachowującym co najmniej 50% maksymalnej aktywności w zakresie pH 2,0-5,5 i/lub mającym aktywność specyficzną ponad 300 U/mg.

HYBRYDYZACJA

[0199] Wynalazek obejmuje również sekwencje, które są komplementarne do sekwencji kwasu nukleinowego niniejszego wynalazku lub sekwencje, które są w stanie hybrydyzować albo do sekwencji niniejszego wynalazku, albo do sekwencji, które są do niej komplementarne.

[0200] Stosowane tu określenie „hybrydyzacja” obejmuje „proces, w którym nić kwasu nukleinowego łączy się z nicią komplementarną poprzez parowanie zasad”, jak również proces amplifikacji przeprowadzony w technologii reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).

[0201] Niniejszy wynalazek obejmuje również zastosowanie sekwencji nukleotydowych zdolnych do hybrydyzacji do sekwencji komplementarnych do sekwencji przedstawionych w niniejszym dokumencie, oraz ich wszelkich pochodnych, fragmentów lub ich pochodnych.

[0202] Określenie „wariant” obejmuje również sekwencje, które są komplementarne do sekwencji zdolnych do hybrydyzacji do sekwencji nukleotydowych przedstawionych w niniejszym dokumencie.

[0203] Najlepiej, gdy określenie „wariant” obejmuje sekwencje, które są komplementarne do sekwencji zdolnych do hybrydyzacji w warunkach rygorystycznych (np. 50°C i 0.2Xssc {1Xssc = 0,15M NaCl, 0,015M Na₃ cytrynianu pH 7,0}), do sekwencji nukleotydowych przedstawionych w niniejszym dokumencie.

[0204] A jeszcze lepiej, gdy określenie „wariant” obejmuje sekwencje, które są komplementarne do sekwencji zdolnych do hybrydyzacji w warunkach rygorystycznych (np. 65 i 0.1Xssc {1Xssc = 0,15M NaCl, 0,015M Na₃ cytrynianu pH 7,0}), do sekwencji nukleotydowych przedstawionych w niniejszym dokumencie. [0205] Niniejszy wynalazek dotyczy również sekwencji nukleotydowych, które mogą hybrydyzować do sekwencji nukleotydowych niniejszego wynalazku (w tym sekwencji komplementarnych do tych opisanych w tym dokumencie).

33

EP 2 236 600 B1

[0206] Niniejszy wynalazek dotyczy również sekwencji nukleotydowych, które są komplementarne do sekwencji nukleotydowych niniejszego wynalazku (w tym sekwencji komplementarnych do tych opisanych w tym dokumencie).

[0207] Ponadto w zakres niniejszego wynalazku wchodzą sekwencje polinukleotydowe, które są zdolne do hybrydyzacji do sekwencji nukleotydowych, przedstawionych w niniejszym dokumencie, w warunkach pośredniej do maksymalnej rygorystyczności.

[0208] W korzystnym aspekcie niniejszy opis przedstawia sekwencje nukleotydowe, które mogą hybrydyzować do sekwencji nukleotydowej niniejszego wynalazku lub jej uzupełnienia w warunkach rygorystycznych (np. 50°C i 0,2Xssc ).

[0209] W korzystniejszym aspekcie niniejszy wynalazek przedstawia sekwencje nukleotydowe, które mogą hybrydyzować do sekwencji nukleotydowej niniejszego wynalazku lub jej uzupełnienia, w warunkach wysokiej rygorystyczności (np. 65°C i 0,1Xssc).

MUTAGENEZA UKIERUNKOWANA

[0210] Gdy sekwencja nukleotydowa kodująca enzym zostanie wyizolowana i/lub oczyszczona lub zidentyfikowana zostanie domniemana sekwencja nukleotydowa kodująca enzym, wskazane może być zmutowanie sekwencji w celu przygotowania wyizolowanych cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących enzym niniejszego wynalazku.

[0211] Mutacje mogą być wprowadzane przy użyciu syntetycznych oligonukleotydów. Te oligonukleotydy zawierają sekwencje nukleotydowe flankujące pożądane miejsca mutacji.

[0212] Odpowiedni sposób przedstawiono u Morinaga i wsp. (Biotechnology (1984) 2, str. 646-649). Inny sposób wprowadzania mutacji do sekwencji nukleotydowych kodujących enzym, jest opisany u Nelson i Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, str. 147-151). Kolejny sposób opisano w Sarkar i Sommer (Biotechniques (1990), 8, str. 404-407 – “The megaprimer method of site directed mutagenesis”).

REKOMBINOWANE

[0213] W jednym aspekcie sekwencja do stosowania w niniejszym wynalazku jest sekwencją rekombinowaną – czyli sekwencją, która została sporządzona z wykorzystaniem technik rekombinacji DNA. [0214] Te techniki rekombinacji DNA są w zakresie możliwości fachowca w dziedzinie. Takie techniki są opisane w literaturze, na przykład J. Sambrook, EF Fritsch, i T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

SYNTETYCZNE

[0215] W jednym aspekcie sekwencja do stosowania w niniejszym wynalazku jest sekwencją syntetyczną – czyli sekwencją, która została sporządzona z wykorzystaniem syntezy chemicznej lub enzymatycznej in vitro. Obejmuje to między innymi sekwencje wykonane z optymalnym użyciem kodonów dla organizmów gospodarza – takich jak drożdże metylotroficzne Pichia i Hansenula.

EKSPRESJA ENZYMÓW

[0216] Sekwencja nukleotydowa do stosowania w niniejszym wynalazku może być włączona do rekombinowanego wektora replikacyjnego. Wektor może być używany do replikacji i ekspresji sekwencji nukleotydowej, w postaci enzymu i/lub z kompatybilnej komórki gospodarza.

[0217] Ekspresja może być sterowana za pomocą sekwencji sterujących np. sekwencji regulatorowych.

34

EP 2 236 600 B1

[0218] Enzym wytwarzany przez rekombinowaną komórkę gospodarza za pomocą ekspresji sekwencji nukleotydowej może być wydzielany lub może być zawarty wewnątrz komórek, w zależności od sekwencji i/lub wykorzystywanego wektora. Sekwencje kodujące mogą być wyposażone w sekwencje sygnałowe, które zwiększają bezpośrednie wydzielanie sekwencji kodujących substancję, przez określoną prokariotyczną lub eukariotyczną błonę komórkową.

[0219] Korzystnie jest, gdy enzymy kodowane przez wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego niniejszego wynalazku są wydzielane.

WEKTOR EKSPRESYJNY

[0220] Określenia „plazmid”, „system wektora” lub „wektor ekspresyjny” oznaczają konstrukt zdolny do ekspresji in vivo lub in vitro. W kontekście niniejszego wynalazku, te konstrukty mogą być wykorzystywane do wprowadzania genów kodujących enzymy do komórek gospodarza. Odpowiednio, geny, których ekspresja jest wprowadzana, mogą być dalej nazywane „transgenami zdolnymi do ekspresji”.

[0221] Najlepiej jest, gdy wektor ekspresyjny jest włączony do genomu odpowiedniego organizmu gospodarza. Określenie „włączony” korzystnie obejmuje stabilne włączenie do genomu.

[0222] Sekwencje nukleotydowe opisane w niniejszym dokumencie, w tym sekwencja nukleotydowa niniejszego wynalazku, mogą być obecne w wektorze, w którym sekwencja nukleotydowa jest funkcjonalnie związana z sekwencją regulatorową zdolną do zapewnienia ekspresji sekwencji nukleotydowej za pomocą odpowiedniego organizmu gospodarza.

[0223] Wektory do stosowania w wynalazku mogą być przeniesione do odpowiedniej komórki gospodarza, jak opisano poniżej, w celu zapewnienia ekspresji polipeptydu niniejszego wynalazku.

[0224] Wybór wektora, np. plazmidu, kosmidu lub wektora fagowego będzie często zależał od komórki gospodarza, do której ma zostać wprowadzony.

[0225] Wektory do stosowania w wynalazku mogą zawierać jeden lub więcej selekcyjnych genów markerowych, takich jak gen, który odpowiedzialny jest za odporność na antybiotyk np. odporność na ampicylinę, kanamycynę, chloramfenikol czy tetracyklinę. Alternatywnie wybór może być dokonany przez kotransformację (jak opisano w WO91/17243).

[0226] Wektory mogą być użyte in vitro, na przykład do produkcji RNA lub użyte do transfekcji, przekształcenia, transdukcji lub zainfekowania komórki gospodarza.

[0227] Tak więc, w dalszym wykonaniu, wynalazek przedstawia sposób wytwarzania sekwencji nukleotydowych niniejszego wynalazku przez wprowadzenie sekwencji nukleotydowej do wektora replikacji, wprowadzenie wektora do kompatybilnej komórki gospodarza i hodowlę komórki gospodarza w warunkach, które powodują replikację wektora.

[0228] Wektor może ponadto zawierać sekwencję nukleotydową umożliwiającą wektorowi replikację we wspomnianej komórce gospodarza. Przykładami takich sekwencji są początki replikacji plazmidów Puc19, Pacyc177, Pub110, Pe194, Pamb1, Pij101, Ptz12 i Pet11.

SEKWENCJE REGULATOROWE

[0229] W niektórych zastosowaniach sekwencja nukleotydowa stosowana w niniejszym wynalazku jest funkcjonalnie połączona z sekwencją regulatorową, która jest w stanie doprowadzić do ekspresji sekwencji nukleotydowej, np. przez wybraną komórkę gospodarza. Przykładowo, niniejszy wynalazek obejmuje wektor

35

EP 2 236 600 B1

zawierający sekwencję nukleotydową niniejszego wynalazku, funkcjonalnie połączoną z taką sekwencją regulatorową, czyli wektor jest wektorem ekspresyjnym.

[0230] Określenie „funkcjonalnie połączona” odnosi się do zestawienia, w którym opisane składniki są w związku pozwalając im działać w ich zamierzony sposób. Sekwencja regulatorowa „funkcjonalnie połączona” z sekwencją kodującą jest powiązana w taki sposób, że ekspresję sekwencji kodującej uzyskuje się w warunkach zgodnych z sekwencją sterującą.

[0231] Określenie „sekwencje regulatorowe” obejmuje promotory i wzmacniacze oraz inne sygnały wpływające na regulację ekspresji.

[0232] Określenie „promotor” jest używane w zwykłym sensie tej dziedziny, np. miejsca wiążące polimerazę RNA.

[0233] Zwiększoną ekspresję sekwencji nukleotydowej kodującej enzym niniejszego wynalazku można również osiągnąć poprzez wybór heterologicznych regionów regulatorowych, np. regionów promotora, lidera wydzielania i terminatora.

[0234] Najlepiej, gdy sekwencja nukleotydowa zgodna z niniejszym wynalazkiem jest funkcjonalnie połączona co najmniej z promotorem.

[0235] Przykłady odpowiednich promotorów do kierowania transkrypcji sekwencji nukleotydowej w gospodarzu będącym bakterią, grzybem lub drożdżami są dobrze znane w dziedzinie.

KONSTRUKTY

[0236] Określenie „konstrukt” – które jest synonimem takich określeń jak „koniugat”, „kaseta” i „hybryda” – obejmuje sekwencję nukleotydową do stosowania zgodnie z niniejszym wynalazkiem, bezpośrednio lub pośrednio połączoną z promotorem.

[0237] Przykładem połączenia pośredniego jest zestawienie odpowiedniej grupy dystansującej, takiej jak sekwencja intronu, taka jak Sh1-intron lub intron ADH, pośrednictwa promotora i sekwencji nukleotydowej niniejszego wynalazku. To samo odnosi się do terminu „złączone” w odniesieniu do niniejszego wynalazku, który to termin zawiera bezpośrednie lub pośrednie połączenia. W niektórych przypadkach określenie to nie obejmuje naturalnej kombinacji sekwencji nukleotydowej kodującej białko normalnie związanej z promotorem genowym typu dzikiego, i gdy są one jednocześnie w swoim naturalnym środowisku.

[0238] Konstrukt może nawet zawierać albo dokonywać ekspresji znacznika, który pozwala na wybór konstruktu genetycznego.

[0239] Dla niektórych zastosowań korzystnie jest, gdy konstrukt niniejszego wynalazku zawiera co najmniej jedną sekwencję nukleotydową niniejszego wynalazku funkcjonalnie połączoną z promotorem.

KOMÓRKI GOSPODARZA

[0240] Określenie „komórka gospodarza”, w odniesieniu do niniejszego wynalazku, obejmuje dowolną komórkę, która zawiera sekwencję nukleotydową lub wektor ekspresji, jak opisano powyżej, i która jest wykorzystywana w rekombinowanym wytwarzaniu enzymu o specyficznych właściwościach określonych tu lub w sposobach niniejszego wynalazku.

[0241] Tak więc w kolejnym aspekcie wykonania niniejszego wynalazku przedstawiono komórki gospodarza przekształcone lub transfekowane sekwencją nukleotydową, która dokonuje ekspresji enzymów opisanych w niniejszym wynalazku. Komórki zostaną tak dobrane, aby były zgodne ze wspomnianym wektorem i mogą

36

EP 2 236 600 B1

być na przykład prokariotycznymi (np. bakteryjnymi) komórkami grzybów, drożdży lub roślin. Korzystnie jest, gdy komórki gospodarza nie są komórkami ludzkimi.

[0242] Przykładem odpowiednich organizmów gospodarza bakteryjnego są gatunki bakterii gram-dodatnich lub gram-ujemnych.

[0243] W korzystnym wykonaniu komórką gospodarza jest Escherichia Coli, ponieważ zaobserwowano, że fitaza Buttiauxella P1-29 jest wydajnie wydzielana w E.coli. Enzymy fitazy, w tym warianty, scharakteryzowano po eksresji heterologicznej w jednym lub więcej z następujących gospodarzy ekspresji: Escherichia coli K12; Bacillus subtilis; Saccharomyces cerevisiae. Zatem te komórki gospodarzy są korzystne.

[0244] W zależności od charakteru sekwencji nukleotydowej kodującej enzym niniejszego wynalazku i/lub potrzeby dalszego przetwarzania wyrażonego białka, korzystni mogą być gospodarze eukariotyczni, na przykład drożdże lub inne grzyby. Zazwyczaj komórki drożdży są lepsze od komórek grzybów, z uwagi na łatwiejsze nimi manipulowanie. Jednakże niektóre białka są albo słabo wydzielane z komórek drożdży, albo w niektórych przypadkach nie są właściwie przetwarzane (np. hiperglikozylacja w drożdżach). W takich przypadkach należy wybrać organizm gospodarza spośród innych grzybów.

[0245] Stosowanie odpowiednich komórek gospodarza – takich jak drożdże, grzyby i roślinne komórki gospodarza – może prowadzić do post-translacyjnych modyfikacji (np. mirystylacji, glikozylacji, obcinania, lapidacji i fosforylacji tyrozyny, seryny lub treoniny), które mogą być potrzebne dla nadania optymalnej aktywności biologicznej rekombinowanym produktom ekspresji niniejszego wynalazku.

[0246] Komórka gospodarza może wykazywać niedobór proteazy lub pochodzić ze szczepu pozbawionego proteazy.

[0247] Genotyp komórki gospodarza może być modyfikowany w celu poprawy ekspresji.

[0248] Przykłady modyfikacji komórek gospodarza obejmują niedobór proteazy, suplementację rzadkiego Trna oraz modyfikację potencjału redukcyjnego w cytoplazmie, w celu ułatwienia tworzenia wiązań dwusiarczkowych.

[0249] Na przykład komórka gospodarza E. Coli może dokonywać nadekspresji rzadkiego Trna, celem poprawy ekspresji białek heterologicznych jak zobrazowano/opisano w Kane (Curr Opin Biotechnol (1995), 6, 494-500 „Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in E.coli”). Komórka gospodarza może mieć niedobór wielu enzymów redukujących, tym samym sprzyjając tworzeniu stabilnych wiązań dwusiarczkowych jak zobrazowano/opisano w Bessette (Proc Natl Acad Sci USA (1999), 96, 13703-13708 „Efficient folding of proteins with multiple disulphide bonds in the Escherichia coli cytoplasm”).

[0250] W jednym wykonaniu, komórki gospodarza, w kontekście niniejszego wynalazku obejmują te komórki, które mogą być dodawane bezpośrednio do paszy zwierzęcej.

ORGANIZM

[0251] Określenie „organizm” w odniesieniu do niniejszego wynalazku obejmuje dowolny organizm, który może zawierać sekwencję nukleotydową kodującą enzymy, jak opisano w niniejszym wynalazku i/lub produkty z nich uzyskane i/lub w którym promotor, gdy jest obecny w organizmie, może pozwolić na ekspresję sekwencji nukleotydowej zgodnie z niniejszym wynalazkiem.

[0252] Do odpowiednich organizmów zalicza się prokarioty, grzyby, drożdże lub rośliny.

37

EP 2 236 600 B1

[0253] Określenie „organizm transgeniczny” w odniesieniu do niniejszego wynalazku obejmuje dowolny organizm, który zawiera sekwencję nukleotydową kodującą enzymy, jak opisano w niniejszym wynalazku i/lub produkty z nich uzyskane i/lub w którym promotor może pozwolić na ekspresję sekwencji nukleotydowej w organizmie zgodnie z niniejszym wynalazkiem. Najlepiej, gdy sekwencja nukleotydowa jest włączona do genomu organizmu.

[0254] Określenie „organizm transgeniczny” nie obejmuje natywnych sekwencji kodujących nukleotyd w ich środowisku naturalnym, kiedy są one pod kontrolą swojego promotora natywnego, znajdującego się również w swoim środowisku naturalnym.

[0255] W związku z tym, do organizmu transgeniczego niniejszego wynalazku zalicza się organizm składający się z jednej, lub kombinacji, sekwencji nukleotydowych kodujących enzymy, jak opisano w niniejszym wynalazku, konstruktów, wektorów, plazmidów, komórek, tkanek i ich produktów zgodnie z niniejszym wynalazkiem.

[0256] Transgeniczny organizm może także na przykład obejmować sekwencję nukleotydową kodującą enzym niniejszego wynalazku pod kontrolą heterologicznego promotora.

TRANSFORMACJA KOMÓREK GOSPODARZA/ ORGANIZMU

[0257] Jak wskazano wcześniej, organizm gospodarza może być organizmem prokariotycznym lub eukariotycznym. Przykłady odpowiednich gospodarzy prokariotycznych obejmują E. Coli i Bacillus subtilis.

[0258] Wiedza na temat transformacji gospodarzy prokariotycznych jest dobrze udokumentowana w dziedzinie, patrz na przykład Sambrook i wsp. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-gie wydanie, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Inne odpowiednie sposoby są przedstawione w poniższych przykładach. Jeśli używany jest gospodarz prokariotyczny, to następnie sekwencja nukleotydowa może wymagać odpowiedniej modyfikacji przed transformacją – np. usunięcia intronów.

[0259] Komórki grzybów nitkowatych mogą być przetwarzane przy użyciu różnych metod znanych w dziedzinie, takich jak proces z udziałem tworzenia protoplastów i transformacji protoplastów, po którym następuje regeneracja ściany komórkowej w znany sposób. Zastosowanie Aspergillus jako mikroorganizmu będącego gospodarzem opisano w EP 0 238 023.

[0260] Innym organizmem gospodarza może być roślina. Przegląd ogólnych technik stosowanych do transformacji roślin można znaleźć w artykułach autorstwa Potrykus (Rev Annu Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) i Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27). Dalszą wiedzę dotyczącą transformacji roślin można znaleźć w EP-A-0449375.

[0261] Ogólne informacje na temat transformacji grzybów, drożdży i roślin są przedstawione w następujących sekcjach.

TRANSFORMOWANE GRZYBY

[0262] Organizmem gospodarza może być grzyb – taki jak grzyb nitkowaty. Przykłady takich odpowiednich gospodarzy obejmują dowolnego członka należącego do rodzaju Thermomyces, Acremonium, Aspergillus, Penicillium, Mucor, Neurospora, Trichoderma i tym podobne.

[0263] Wiedza dotycząca transformacji grzybów nitkowatych przedstawiona jest w US-A-5741665, który stanowi, że standardowe techniki transformacji grzybów nitkowatych i hodowli grzybów są dobrze znane w dziedzinie. Szeroko zakrojony przegląd technik stosowanych do N. Crassa znajduje się, na przykład w Davis i de Serres, Methods Enzymol (1971) 17A: 79-143.

38

EP 2 236 600 B1

[0264] Dalsze informacje dotyczące transformacji grzybów nitkowatych są podane w US-A-5674707.

[0265] W jednym aspekcie, organizm gospodarza może być z rodzaju Aspergillus, na przykład Aspergillus niger.

[0266] Transgeniczny Aspergillus zgodnie z wynalazkiem można również wytwarzać według na przykład informacji podanych przez G. Turner 1994 (Vectors for genetic manipulation In: Martinelli S.D., Kinghorn J.R.(Editors) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier Amsterdam 1994. s. 641-666).

[0267] Ekspresja genów w grzybach nitkowatych została omówiona w Punt i wsp. (2002) Trends Biotechnol 2002 May;20 (5):200-6, Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol (1997) 17(4):273-306.

TRANSFORMOWANE DROŻDŻE

[0268] W innym wykonaniu organizmem transgenicznym mogą być drożdże.

[0269] Przegląd zasad heterologicznej ekspresji genów w komórkach drożdży jest przedstawiony na przykład w Methods Mol Biol (1995), 49:341-54, and Curr Opin Biotechnol (1997) 0ct;8(5):554-60

[0270] W związku z tym drożdże, takie jak gatunki Saccharomyces cerevisi lub Pichia pastoris (patrz FEMS Microbiol Rev (2000 24(1):45-66), mogą być używane jako nośnik dla heterologicznej ekspresji genów.

[0271] Przegląd zasad heterologicznej ekspresji genów w Saccharomyces cerevisiae i wydzielania produktów genu przedstawiony jest przez E Hinchcliffe E Kenny (1993, „Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes”, Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose and J Stuart Harrison, eds, 2-gie wydanie, Academic Press Ltd.).

[0272] Do transformacji drożdży opracowano kilka protokołów transformacji. Na przykład transgeniczny Saccharomyces zgodnie z wynalazkiem można wytwarzać postępując zgodnie z informacjami podanymi przez Hinnen i wsp., (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J D (1978, Nature, London, 275, 104); i Ito, H i.wsp. (1983, J Bacteriology 153, 163-168).

[0273] Transformowane komórki drożdży mogą być wybrane przy użyciu różnych selektywnych markerów – takich jak markery auksotroficzne, dominujące markery oporności na antybiotyk.

TRANSFORMOWANE ROŚLINY/KOMÓRKI ROŚLINNE

[0274] Organizmem gospodarza, odpowiednim dla celów niniejszego wynalazku, może być roślina. Przegląd ogólnych technik można znaleźć w artykułach autorstwa Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) i Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27).

HODOWLA I PRODUKCJA

[0275] Komórki gospodarza transformowane za pomocą sekwencji nukleotydowej niniejszego wynalazku mogą być hodowane w warunkach sprzyjających produkcji kodowanego enzymu, co ułatwia pozyskanie enzymu z komórek i/lub pożywki.

[0276] Do hodowli komórek można użyć dowolnej konwencjonalnej pożywki, odpowiedniej do wzrostu wspomnianych komórek gospodarza i uzyskania ekspresji enzymu.

[0277] Białko produkowane przez komórki rekombinowane może występować na powierzchni komórki.

39

EP 2 236 600 B1

[0278] Enzym może być wydzielany z komórek gospodarza i może być dogodnie pozyskany z pożywki hodowlanej przy użyciu dobrze znanych procedur.

WYDZIELANIE

[0279] Konieczne może okazać się wydzielanie enzymu z gospodarza ekspresji do pożywki hodowlanej, z której enzym może być łatwiej pozyskany. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem sekwencja lidera wydzielania może być wybrana na podstawie pożądanego gospodarza ekspresyjnego. W kontekście niniejszego wynalazku można zastosować hybrydowe sekwencje sygnałowe.

[0280] Typowymi przykładami sekwencji heterologicznych lidera wydzielania są te pochodzące z genu amyloglukozydazy grzybowej (AG) (glaA – zarówno wersja 18 jak i 24 aminokwasów np. z Aspergillus ), genu czynnika α (drożdży np. Saccharomyces, Kluyveromyces i Hansenula) lub genu α amylazy (Bacillus).

[0281] Przykładowo, wydzielanie białek heterologicznych w E. Coli jest opisane w Methods Enzymol (1990) 182:132-43.

WYKRYWANIE

[0282] W dziedzinie znane są różne protokoły wykrywania i pomiaru ekspresji sekwencji aminokwasowej. Przykłady obejmują test immunoenzymatyczny (ELISA), radioimmunologiczny (RIA) i fluorescencyjnie aktywowane sortowanie komórek (FACS).

[0283] Fachowcy w dziedzinie znają szeroką gamę etykiet i technik koniugacji, które mogą być stosowane w różnych testach dotyczących kwasów nukleinowych i aminokwasowych.

[0284] Wiele firm, takich jak Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI) i US Biochemical Corp (Cleveland, OH) jest dostawcą zestawów komercyjnych i protokołów dla tych procedur.

[0285] Odpowiednie cząsteczki reporterowe lub etykiety zawierają radionuklidy, enzymy, substancje fluorescencyjne, chemiluminescencyjne lub czynniki chromogenne oraz substraty, kofaktory, inhibitory, cząstki magnetyczne i tym podobne. Patenty informujące o zastosowaniu tych etykiet obejmują US-A-3,817,837; US-A-3,850,752; US-A-3,939,350; US-A-3,996,345; US-A-4,277,437; US-A-4,275,149 oraz US-A-4,366,241.

[0286] Ponadto w sposób pokazany w US-A-4,816,567 wytwarzane mogą być również immunoglobuliny rekombinowane.

[0287] Inne odpowiednie testy do wykrywania aktywności fitazy są znane w dziedzinie i zostały tu zobrazowane.

BIAŁKA FUZYJNE

[0288] Sekwencja aminokwasowa kodowana przez wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego do stosowania według niniejszego wynalazku może być produkowana jako białko fuzyjne, służące na przykład do pomocy w ekstrakcji i oczyszczaniu. Przykłady partnerów białka fuzyjnego obejmują glutationo-S-transferazę (GST), 6xHis, GAL4 (DNA wiążące i/lub domeny aktywacji transkrypcji) i (β-galaktozydazę). Dogodne może być również miejsce cięcia proteolitycznego zastosowane między partnerem białka fuzyjnego a sekwencją białka, aby umożliwić usunięcie sekwencji białka fuzyjnego.

[0289] Najlepiej, gdy białko fuzyjne nie będzie przeszkadzać w czynności sekwencji białka.

[0290] Systemy ekspresji fuzji genów w E. Coli zostały opisane w Curr Opin Biotechnol (1995) 6(5):501-6.

40

EP 2 236 600 B1

[0291] W innym wykonaniu wynalazku sekwencja aminokwasowa kodowana przez wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego niniejszego wynalazku może być związana do sekwencji heterologicznej w celu kodowania białka fuzyjnego. Na przykład w przypadku badań przesiewowych dla bibliotek peptydowych pod kątem czynników wpływających na aktywność substancji, przydatne może być kodowanie substancji chimerycznej, dokonującej ekspresji heterologicznego epitopu, który jest rozpoznawany przez przeciwciała dostępne na rynku.

SEKWENCJE DODATKOWE

[0292] Sekwencje do stosowania zgodnie z wynalazkiem można również stosować w połączeniu z jednym lub więcej interesujących nas dodatkowych białek (POI) lub interesującymi nas sekwencjami nukleotydowymi (NOI).

[0293] Nieograniczające przykłady POI obejmują: ksylanazę, lipazy, fosfatazy kwasowe i/lub inne. Są to enzymy, które na przykład modulują lepkość paszy. NOI może być sekwencją antysensowną w stosunku do dowolnej z tych sekwencji.

[0294] POI może być nawet białkiem fuzyjnym, na przykład służącym do pomocy w ekstrakcji i oczyszczaniu lub zwiększeniu metabolizmu fitynianu in vivo.

[2095] POI może być nawet złączone z sekwencją wydzielania.

[0296] Pozostałe sekwencje mogą również ułatwiać wydzielanie lub zwiększać wydajność wydzielanego POI. Takie sekwencje mogą kodować białka opiekuńcze, jak na przykład produkt Aspergillus niger gen cyp B opisany w zgłoszeniu patentowym UK 9821198.0.

[0297] Możliwe jest zaprojektowanie NOI kodującego POI, w celu zmiany ich czynności z wielu powodów, włączając ale nie ograniczając się do, zmian, które modyfikują przetwarzanie i/lub ekspresję produktu ich ekspresji. Jako dalszy przykład można wskazać, że NOI może być zmodyfikowane w celu optymalizacji ekspresji w określonej komórce gospodarza. W celu wprowadzenia miejsc restrykcyjnych rozpoznawania enzymu konieczne może być dokonanie innych zmian sekwencji.

[0298] NOI kodujące POI mogą występować w syntetycznych lub zmodyfikowanych nukleotydach, takich jak szkielety metylofosfonianowe i fosforotionianowe.

[0299] NOI kodujący POI mogą być modyfikowane w celu zwiększenia wewnątrzkomórkowej stabilności i okresu półtrwania. Możliwe modyfikacje obejmują między innymi dodanie sekwencji flankujących końce 5’ i/lub 3’ cząsteczki lub wykorzystanie fosforotionianu lub 2’ O-metylu zamiast powiązania fosfodiesterazy w szkielecie cząsteczki.

PRZECIWCIAŁA – tylko w celu ilustracyjnym

[0300] Jeden z aspektów niniejszego wynalazku dotyczy aminokwasów, które są immunologicznie reaktywne z aminokwasem SEQ ID Nr 3.

[0301] Przeciwciała mogą być produkowane przy użyciu standardowych technik, takich jak immunizacja substancją wynalazku lub przy użyciu biblioteki fagowej.

[0302] Dla celów niniejszego wynalazku, termin „przeciwciało”, o ile nie wskazano inaczej, obejmuje poliklonalne, monoklonalne, chimeryczne, pojedynczy łańcuch, fragmenty Fab, fragmenty wytwarzane przez biblioteki ekspresji Fab, jak również ich mimetyki. Takie fragmenty obejmują fragmenty całych przeciwciał, które zachowują aktywność wiązania do substancji docelowych, fragmenty Fv, F(ab’) i F(ab’)₂, jak również przeciwciała jednołańcuchowe (scFv), białka fuzyjne oraz inne białka syntetyczne, które zawierają miejsce

41

EP 2 236 600 B1

wiązania antygenu przeciwciała. Ponadto przeciwciała i ich fragmenty mogą być przeciwciałami humanizowanymi. Przeciwciała neutralizujące, czyli te, które hamują aktywność biologiczną polipeptydów substancji, są szczególnie korzystne dla diagnostyki i terapii.

[0303] Jeśli pożądane są przeciwciała poliklonalne, dokonuje się immunizacji wybranego ssaka (np. myszy, królika, kozy, konia itd.) sekwencją niniejszego wynalazku (lub sekwencją zawierającą jej immunologiczny epitop). W zależności od gatunku gospodarza, w celu zwiększenia odpowiedzi immunologicznej można stosować różne adiuwanty.

[0304] Z immunizowanych zwierząt pobiera się surowicę i przetwarza zgodnie ze znanymi procedurami. Jeżeli surowica zawierająca przeciwciała poliklonalne przeciwko sekwencji niniejszego wynalazku (lub sekwencji zawierającej jej immunologiczny epitop), zawiera przeciwciała przeciwko innym antygenom, przeciwciała poliklonalne mogą być oczyszczone metodą chromatografii powinowactwa immunologicznego. Techniki wytwarzania i przetwarzania antysurowic poliklonalnych są znane w dziedzinie. W celu umożliwienia produkcji takich przeciwciał wynalazek przedstawia również polipeptydy lub ich fragmenty haptenizowane do innego polipeptydu celem stosowania jako immunogeny u zwierząt lub ludzi.

[0305] Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko sekwencji niniejszego wynalazku (lub sekwencji zawierającej jej immunologiczny epitop) mogą być łatwo wytwarzane przez specjalistę w dziedzinie i obejmują między innymi techniki hybrydomy Koehler i Milstein (1975 Nature 256:495-497), techniki hybrydomy ludzkich komórek B (Kosbor i wsp., (1983) Immunol Today 4:72; Cote i wsp., (1983) Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030) oraz techniki hybrydomy EBV (Cole i wsp., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan Rickman Liss Inc, str. 77-96).

[0306] Ponadto wykorzystywać można techniki opracowane dla produkcji „przeciwciał chimerycznych”, łączenia genów mysich do genów ludzkich przeciwciał, celem uzyskania cząsteczek o odpowiedniej specyficzności antygenowej i aktywności biologicznej (Morrison i wsp., (1984) Proc Natl Acad Sci 81:6851-6855; Neuberger i wsp., (1984) Nature 312:604-608; Takeda i wsp., (1985) Nature 314:452-454).

[0307] Alternatywnie, opisane techniki służące produkcji przeciwciał jednołańcuchowych (US Patent Nr 4,946,779) mogą być dostosowane do produkcji przeciwciał jednołańcuchowych określonych substancji.

[0308] Wytwarzane mogą być również fragmenty przeciwciał zawierające konkretne miejsca wiązania dla substancji. Na przykład takie fragmenty obejmują między innymi fragmenty F(ab’)₂, które mogą być wytwarzane przez trawienie cząsteczki przeciwciała pepsyną i fragmenty Fab, które mogą być wytwarzane poprzez redukcję mostków dwusiarczkowych fragmentów F(ab’)₂. Alternatywnie można konstruować biblioteki ekspresji Fab, w sposób umożliwiający szybką i łatwą identyfikację monoklonalnych fragmentów Fab o pożądanej specyficzności (Huse WD i wsp., (1989) Science 256:1275-128 1).

ZASTOSOWANIA WIELKOSKALOWE

[0309] W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku, sekwencja aminokwasowa kodująca fitazę pochodzącą od C. Freundii lub sposoby niniejszego wynalazku są stosowane na wielką skalę. W szczególności, sposoby niniejszego wynalazku mogą być wykorzystane do wielkoskalowej produkcji fitazy do zastosowań przemysłowych jako dodatku/suplementu do żywności i kompozycji pasz.

[0310] Korzystnie jest, gdy sekwencja aminokwasowa jest produkowana w ilości od 5 g na litr do około 10 g na litr całkowitej objętości hodowli komórek po hodowli organizmu gospodarza.

[0311] Korzystnie jest, gdy sekwencja aminokwasowa jest produkowana w ilości od 100mg na litr do około 900mg na litr całkowitej objętości hodowli komórek po hodowli organizmu gospodarza.

42

EP 2 236 600 B1

[0312] Korzystnie jest, gdy sekwencja aminokwasowa jest produkowana w ilości od 250mg na litr do około 500mg na litr całkowitej objętości hodowli komórek po hodowli organizmu gospodarza.

ZASTOSOWANIE FITAZ – tylko w celu ilustracyjnym

[0313] Jak wspomniano powyżej, niniejszy wynalazek dotyczy również produkcji fitazy tu opisanej.

[0314] W szczególności, niniejszy wynalazek odnosi się również do wykorzystania sekwencji aminokwasowych, tu przedstawionych, w produkcji organicznych i nieorganicznych związków fosforanowych.

[0315] Tak więc, niniejszy wynalazek dodatkowo dotyczy zastosowania sekwencji nukleotydowych kodujących fitazy do tworzenia wektorów ekspresyjnych lub systemów ekspresji fitaz.

[0316] Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania tych wektorów lub systemów ekspresyjnych do wytwarzania komórek gospodarza, które dokonują ekspresji fitazy.

[0317] Wynalazek dodatkowo dotyczy zastosowania zmodyfikowanych komórek gospodarza w tworzeniu prekursorów organicznych i nieorganicznych związków fosforanowych lub w tworzeniu specyficznych związków organicznych fosforanów.

[0318] Do odpowiednich organicznych i nieorganicznych związków fosforanów zalicza się pentakisfosforan mio-inozytolu, tetrakis-, tris-, bis- i monofosforany.

[0319] Odpowiednio zatem, wynalazek przedstawia sposób wytwarzania organicznego związku fosforanu, obejmujący traktowanie fitynianu fitazą pochodząca z Buttiauxella sp. Najlepiej, gdy sposób charakteryzuje się tym, że enzym składa się z sekwencji aminokwasowych przedstawionych jako SEQ ID Nr: 3 lub sekwencji, która jest co najmniej w 75% z nią identyczna (homologiczna) lub jej fragmentu efektywnego czy zmodyfikowanej postaci. Najlepiej, gdy organiczny fosforan jest fitynianem lub dowolnym możliwym stereoizomerem mio-inozytolu di-, tri-, tetra i pentafosforanu. Do innych odpowiednich fosforanów organicznych zalicza się tetrafosforany inozytolu i oligofosforany inozytolu. W preferowanym wykonaniu, sposób jest procesem biotechnologicznym in vivo.

[0320] Takie sposoby wytwarzania organicznych związków fosforanów mogą obejmować następujące etapy:

a) dostarczenie komórki gospodarza, która zawiera transgeny zdolne do ekspresji zawierające fitazę Buttiauxella sp.;

b) hodowla organizmu transgenicznego w warunkach odpowiednich do ekspresji transgenu; i

c) odzysk organicznego związku fosforanu z hodowli.

[0321] Związki te mogą mieć wiele zastosowań, w tym w testach dla charakterystyki fitaz. Niektóre fosforany inozytolu uczestniczą jako cząsteczki sygnałowe w regulacji wewnątrzkomórkowej i mogą być stosowanymi w badaniach środkami chemicznymi.

[0322] W innym aspekcie przedstawiono sposób produkcji żywności lub pasz dla zwierząt. Pasza dla zwierząt jest zwykle produkowana w mieszalniach pasz, w których surowce są najpierw rozdrabniane do odpowiedniej wielkości cząstek, a następnie mieszane z odpowiednimi dodatkami. Pasze mogą być produkowane jako miazga lub granulaty; w tym drugim przypadku zazwyczaj wykorzystuje się metodę, w której temperaturę podnosi się do poziomu docelowego, a następnie pasza przechodzi przez dyszę do produkcji granulatów o określonej wielkości. Następnie mogą być dodawane dodatki płynne, takie jak tłuszcz i enzymy. Granulaty pozostawia się do ostygnięcia przed transportem. Produkcja pasz dla zwierząt może

43

EP 2 236 600 B1

również składać się z dodatkowego etapu, który obejmuje wytłaczanie lub rozprężanie przed granulatowaniem.

[0323] W związku z tym wynalazek dotyczy zastosowania sekwencji aminokwasowej kodującej fitazę lub komórki gospodarza dokonującej ekspresji fitazy, do produkcji fitazy do stosowania w produkcji produktów żywnościowych i pasz. W jednym aspekcie, przedstawiony został sposób wykorzystania sekwencji aminokwasowej, jak tu opisano, w produkcji produktów żywnościowych i pasz. W innym aspekcie, przedstawiony został tu sposób wykorzystania komórki gospodarza zgodnie z niniejszym wynalazkiem, w produkcji produktów żywnościowych i pasz. W innym aspekcie, przedstawiono tu sposób wykorzystania wektora lub systemu ekspresji zgodnie z wynalazkiem, w produkcji żywności i pasz.

[0324] Niniejszy wynalazek dotyczy również wykorzystania enzymów jako składnika mieszanek paszowych w połączeniu z innymi komponentami podawanymi zwierzętom.

POŁĄCZENIE Z INNYMI KOMPONENTAMI

[0325] Enzymy kodowane przez wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego niniejszego wynalazku mogą być stosowane w połączeniu z innymi komponentami lub nośnikami.

[0326] Odpowiednie nośniki dla enzymów paszowych obejmują pszenicę (grubo zmieloną). Ponadto istnieje wiele technik enkapsulacji, obejmujących techniki oparte na pokrywaniu tłuszczem/woskiem, dodawanie gum roślinnych itp.

[0327] Przykłady innych komponentów obejmują jeden lub więcej z następujących: zagęszczacze, substancje żelujące, emulgatory, środki wiążące, modyfikatory krystaliczne, substancje słodzące (w tym sztuczne), modyfikatory reologii, stabilizatory, przeciwutleniacze, barwniki, enzymy, nośniki, zaróbki, rozczynniki, rozcieńczalniki, środki smarujące, środki zapachowe, substancje barwiące, środki zawieszające, środki dezintegrujące, środki wiążące granulaty itp. Te składniki mogą być pochodzenia naturalnego. Mogą być także przygotowane za pomocą technik chemicznych i/lub enzymatycznych.

[0328] Stosowane tu określenie „zagęszczacz lub środek żelujący”, odnosi się do produktu, który zapobiega separacji poprzez spowolnienie lub uniemożliwienie ruchu cząstek – kropelek niemieszających się cieczy, powietrza lub części stałych nierozpuszczalnych.

[0329] Określenie „stabilizator” użyte tutaj jest zdefiniowane jako składnik lub kombinacja składników, który utrzymuje produkt (np. produkty spożywcze) w stanie niezmiennym z upływem czasu.

[0330] Określenie „emulgator” użyte tutaj odnosi się do składnika (np. składnika produktu spożywczego), który zapobiega separacji emulsji.

[0331] Określenie „środek wiążący” użyte tutaj odnosi się do składnika (np. składnika żywności), który wiąże produkt w wyniku reakcji fizycznych lub chemicznych.

[0332] Określenie „modyfikator krystaliczny” użyte tutaj odnosi się do składnika (np. składnika żywności), który wpływa na krystalizację tłuszczu albo wody.

[0333] „Nośniki” lub „rozróbki” oznaczają materiały nadające się do podawania związku i obejmują znany w dziedzinie materiał, taki jak na przykład jakikolwiek płyn, żel, rozpuszczalnik, ciekły rozcieńczalnik, solubilizator i tym podobne, który nie jest toksyczny i który nie wchodzi w szkodliwy sposób w interakcje z którymkolwiek ze składników kompozycji.

[0334] Do przykładów nośników akceptowalnych pod względem odżywczym zalicza się ziarna, wodę, roztwory soli, alkohol, silikon, woski, wazelinę, oleje roślinne i tym podobne.

44

EP 2 236 600 B1

[0335] Przykłady rozczynników obejmują jedną lub więcej z następujących substancji: celuloza mikrokrystaliczna i inne celulozy, laktoza, cytrynian sodu, węglan wapnia, wodorofosforan wapnia, glicyna, skrobia, cukier mleczny i wysokocząsteczkowe glikole polietylenowe.

[0336] Przykłady środków dezintegrujących obejmują jedną lub więcej z następujących substancji: skrobia (najlepiej kukurydziana, skrobia ziemniaczana lub tapioka), glikolan sodowy skrobi, kroskamelaza sodu i niektóre krzemiany złożone.

[0337] Przykłady spoiw granulacji obejmują jedną lub więcej z następujących substancji: poliwinylopirolidon, hydroksypropylometyloceluloza (HPMC), hydroksypropyloceluloza (HPC), sacharoza, maltoza, żelatyna i guma arabska.

[0338] Przykłady środków smarujących obejmują jedną lub więcej z następujących substancji: stearynian magnezu, kwas stearynowy, behenian glicerolu i talk.

[0339] Przykłady rozcieńczalników obejmują jedną lub więcej z następujących substancji: woda, etanol, glikol propylenowy i gliceryna oraz ich kombinacje.

[0340] Pozostałe komponenty mogą być używane równocześnie (np. gdy są razem zmieszane lub nawet jeśli są dostarczane różnymi drogami) lub kolejno (np. mogą być dostarczane różnymi drogami).

[0341] Stosowane tu określenie „komponent nadający się do spożycia przez ludzi lub zwierzęta” oznacza związek, który jest lub może być dodawany do kompozycji niniejszego wynalazku jako suplement, który może być korzystny odżywczo, stanowić substytut włókien lub ma ogólnie pozytywny wpływ na konsumenta.

[0342] Przykładowo, składniki mogą być prebiotykami, takimi jak alginian, ksantan, pektyna, mączka chleba świętojańskiego (LBG), inulina, guma guar, galakto-oligosacharydy (GOS), frukto-oligosacharydy (FOS), cukier mleczny, oligosacharydy sojowe, palatinoza, izomalto-oligosacharydy, gluko-oligosacharydy i ksylo-oligosacharydy.

ŻYWNOŚĆ LUB PASZE

[0343] Związki mogą być stosowane jako żywność lub pasze, bądź też służyć do ich przygotowania. Określenie „żywność” jest używane tutaj w szerokim znaczeniu i obejmuje żywność oraz produkty spożywcze dla ludzi, jak i żywność dla zwierząt (np. pasze). Określenie „pasza” jest używane w odniesieniu do produktów, które są podawane zwierzętom w hodowli gospodarskiej. W korzystnym aspekcie, żywność lub pasza przeznaczone są do spożycia przez zwierzęta monogastryczne (z żołądkiem jednokomorowym), takie jak świnie, drób i ryby.

[0344] Żywność lub pasza może mogą być w postaci roztworu lub w postaci stałej – w zależności od wykorzystania i/lub sposobu stosowania i/lub sposobu podawania.

SKŁADNIKI I SUPLEMENTY ŻYWNOŚCI I PASZY

[0345] Związki mogą być stosowane jako składniki żywności i pasz.

[0346] Stosowane tu określenie „składnik żywności i pasz” obejmuje preparat, który jest lub może być dodawany do żywności lub środków spożywczych i obejmuje preparaty, które mogą być używane na niskich poziomach w szerokiej gamie produktów.

[0347] Składnik żywności może być w postaci roztworu lub w postaci stałej – w zależności od wykorzystania i/lub sposobu stosowania i/lub sposobu podawania.

45

EP 2 236 600 B1

[0348] Związki mogą być stosowane jako suplementy żywnościowe lub być do nich dodawane.

KOMPOZYCJE ŻYWNOŚCI I PASZ – tylko w celu ilustracyjnym

[0349] Kompozycje żywności dla zwierząt monogastrycznych zazwyczaj obejmują kompozycje zawierające produkty roślinne, w których skład wchodzi fitynian. Do takich kompozycji zalicza się pasze oparte na mące kukurydzianej, mące sojowej, śrucie rzepakowej, kukurydzy, pszenicy, jęczmieniu i sorgo.

[0350] Fitazy opisane w niniejszym dokumencie mogą być żywnością, paszą czy jej kompozycją lub mogą być do nich dodawane.

[0351] Niniejszy wynalazek przedstawia również sposób wytwarzania żywności lub składnika lub suplementu paszy, polegający na zmieszaniu fitazy wytwarzanej w procesie wynalazku lub kompozycji zgodnej z wynalazkiem z innym składnikiem żywności. Sposób wytwarzania lub składnik żywności stanowią także inny aspekt niniejszego wynalazku. Sposoby wytwarzania paszy dla zwierząt są określone powyżej. Enzym może również zostać dodany w postaci stałego preparatu, lub jako dodatek do pasz, takich jak pre-miks. Postać stała jest zazwyczaj dodawana przed lub w trakcie etapu mieszania, a postać płynna jest zazwyczaj dodawana po etapie granulatowania.

ŚRODKI FARMACEUTYCZNE – tylko w celu ilustracyjnym

[0352] Fitazy niniejszego wynalazku mogą być także wykorzystywane w preparatach farmaceutycznych lub w połączeniach z żywnością w celu uzyskania efektu farmaceutycznego. Na przykład w EP 1,389,915 opisano zastosowanie fitazy w żywności lub napojach w celu zwiększenia dostępności wapnia, żelaza i/lub cynku występujących w żywności i napojach dla ludzi.

[0353] Ponadto w EP 1,392,353 opisano lek lub suplement odżywczy zawierający fitazę, przydatny dla zwiększenia biodostępności biopierwiastków, np. wapnia i żelaza oraz w celu zwalczania chorób niedoboru.

[0354] Określenie „środek farmaceutyczny” jest używane tutaj w szerokim znaczeniu i obejmuje środki farmaceutyczne i/lub odżywki dla ludzi, jak również środki farmaceutyczne i/lub odżywki dla zwierząt (tj. W zastosowaniach weterynaryjnych). W korzystnym aspekcie, środek farmaceutyczny przeznaczony jest dla ludzi i/lub w hodowli zwierząt.

[0355] Środek farmaceutyczny może być przeznaczony do celów terapeutycznych natury leczniczej, paliatywnej lub profilaktycznej. Środek farmaceutyczny może być przeznaczony nawet do celów diagnostycznych.

[0356] W przypadku stosowania go jako środek farmaceutyczny lub do przygotowania środka farmaceutycznego, produkt i/lub związki niniejszego wynalazku mogą być stosowane w połączeniu z jedną lub więcej z następujących substancji: farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, farmaceutycznie dopuszczalny rozcieńczalnik, farmaceutycznie dopuszczalny rozczynnik, farmaceutycznie dopuszczalny adiuwant, farmaceutycznie aktywny składnik.

[0357] Środek farmaceutyczny może być w postaci roztworu lub w postaci stałej – w zależności od wykorzystania i/lub sposobu stosowania i/lub sposobu podawania.

SKŁADNIK FARMACEUTYCZNY – tylko w celu ilustracyjnym

[0358] Produkt i/lub związki niniejszego wynalazku mogą być stosowane jako składniki farmaceutyczne. Produkt i/lub kompozycja niniejszego wynalazku może być jedynym składnikiem aktywnym czynnym lub może stanowić co najmniej jeden z wielu (tzn. 2 lub więcej) składników czynnych.

46

EP 2 236 600 B1

[0359] Składnik farmaceutyczny może być w postaci roztworu lub w postaci stałej – w zależności od wykorzystania i/lub sposobu stosowania i/lub sposobu podawania.

[0360] Składnik farmaceutyczny może występować w postaci produktu musującego w celu poprawy właściwości rozpuszczania środka farmaceutycznego.

RODZAJE POSTACI – tylko w celu ilustracyjnym

[0361] Produkt i/lub związki niniejszego wynalazku mogą być stosowane w dowolnej postaci – zarówno kiedy występują pojedynczo, jak i w kompozycji. Podobnie fitazy wytworzone zgodnie z niniejszym wynalazkiem (tj. Składniki, takie jak składniki żywności, funkcjonalne składniki żywności lub składniki farmaceutyczne) mogą być stosowane w dowolnej postaci.

[0362] Odpowiednie przykłady postaci obejmują jedną lub więcej spośród następujących: tabletki, pigułki, kapsułki, czopki, roztwory lub zawiesiny, które mogą zawierać środki aromatyzujące lub barwiące, o działaniu z natychmiastowym, opóźnionym, zmodyfikowanym, przedłużonym, impulsowym lub o kontrolowanym uwalnianiu.

[0363] Przykładowo, jeżeli produkt i/lub kompozycja są stosowane w postaci tabletek – na przykład do stosowania jako składnik funkcjonalny – tabletki mogą również zawierać jedną lub więcej z następujących substancji: substancje pomocnicze, środki dezintegrujące, środki wiążące granulat lub środki smarujące.

[0364] Do przykładów nośników akceptowalnych pod względem odżywczym zalicza się na przykład wodę, roztwory soli, alkohol, silikon, woski, wazelinę i tym podobne.

[0365] Do korzystnych rozczynników substancji pomocniczych zalicza się laktozę, skrobię, celulozę, cukier mleczny czy wysokocząsteczkowe glikole polietylenowe.

[0366] W przypadku zawiesin wodnych i/lub eliksirów związki rozkładu karotenoidów mogą być łączone z różnymi środkami słodzącymi lub aromatyzującymi, barwiącymi lub barwnikami, z emulgatorami i/lub środkami zawieszającymi i rozcieńczalnikami, takimi jak woda, etanol, glikol propylenowy i gliceryna oraz ich kombinacje.

[0367] Do postaci można także zaliczyć kapsułki żelatynowe, kapsułki z włókien, tabletki z włókien itp.

OGÓLNE TECHNIKI REKOMBINACJI DNA

[0368] Niniejszy wynalazek wykorzystuje, jeśli nie zaznaczono inaczej, konwencjonalne techniki chemii, biologii molekularnej, mikrobiologii, immunologii i rekombinacji DNA, które mieszczą się w możliwościach fachowca w dziedzinie. Techniki te są wyjaśnione w literaturze. Patrz, na przykład, J. Sambrook, EF Fritsch i T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-gie wydanie, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; .Ausubel, F. M I i wsp. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; and, D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press. Każdy z tych ogólnych tekstów stanowi odniesienie.

PRZYKŁADY

[0369] Wynalazek jest dalej ilustrowany w następujących, nieograniczających przykładach.

Przykład 1. Test aktywności fitazy.

47

EP 2 236 600 B1

[0370] Mikro-I = mikrolitr

[0371] Testy fitazy zostały przeprowadzone w płytkach do mikromiareczkowania. Mieszanina reakcyjna (100 mikro-l) zawierała: 2mM fitynianu i 0,8mM CaCl2 w 200mM buforu octanu sodu przy pH równym 3,5. Reakcję prowadzono przez 1 godzinę w 37°C, po czym uwolniony fosforan mierzono przez udoskonalenie znanej procedury (Heinonen J.K., Lahti R.J. Anal Biochem. 113 (2), 313-317 (1981)). W skrócie, 200 mikro-l świeżo przygotowanego roztworu AMM (7,5 N H₂SO₄, 15mM molibdenianu amonu i acetonu – 1:1:2) dodano do 100 mikro-l mieszaniny reakcyjnej w każdej studzience mikropłytki. Absorbancję przy 390 nm, zmierzono nie wcześniej niż po 10 min i nie później niż 30 min po dodaniu odczynnika AMM. Ilość fosforanu została ustalona przez sporządzenie krzywej kalibracyjnej z roztworami fosforanowymi o znanych stężeniach. Do oznaczania aktywności fitazy przy różnych wartościach pH zostały wykorzystane następujące bufory (wszystkie 200 mM): glicyna/HCl o pH od 2,0 do3,0, octan sodu/kwas octowy o pH równym 3,5 do 5,5, Tris/kwas maleinowy o pH 6,0 do 7,5.

Przykład 2. Szczep P1-29 produkujący fitazę.

[0372] Szczep bakteryjny P1-29 został pierwotnie wyizolowany z masy materiału rozkładających się roślin zebranych z dna kałuży w lesie w południowej Finlandii. Szczep może być hodowany tlenowo w 30°C w wielu prostych pożywkach np. LB (1% pepton, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 1% NaCl, pH 7,4) lub w pożywce niskofosforanowej PP1 (1% pepton, 1%, ekstrakt z wołowiny, 0,5%, ekstrakt drożdżowy, CaCl2 – 0,2M. Podłoże przygotowuje się przez doprowadzenie pH do około 11 przy pomocy NaOH i wrzeniu przez 10 min. Wytrącony osad usuwany jest przez odsączanie, pH ponownie doprowadza się do 5,5, a pożywkę sterylizuje się w autoklawie przez 15 min w 121°C).

[0373] Po wzroście w ciekłej pożywce PP1 stwierdzono, że szczep wykazuje aktywność fitazy zarówno przy pH równym 3,5 jak i 5,5 (testowane w sposób opisany w przykładzie 1). Stosunek działania przy pH równym 3,5 i 5,5 wynosił około 1,3. Aktywność mierzono również osobno w komórkach i supernatancie hodowli P3-42. Według tych pomiarów, prawie cała aktywność fitazy była związana z komórkami, a 10-20% aktywności stwierdzono w supernatancie pożywki.

[0374] Szczep jest zdeponowany w NCIMB pod numerem 41248.

Przykład 3. Izolacja chromosomalnego DNA ze szczepu P1-29.

[0375] Chromosomalne DNA zostało przygotowane głównie za pomocą standardowych procedur (Ausubel i wsp., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1996). 250 ml kultury hodowanej przez noc w 30°C w pożywce LB, wirowano przy 10 000 obr/min przez 30 min, przemyto 20 ml 50mM tris-HCl, 5mM EDTA pH 8 i ponownie zawieszono w 10 ml zimnego TES (50mM tris-HCl, 5mM EDTA, 15% glukozy pH 8). Lizozym dodano do 10 mg/ml, a i zawiesina komórkowa została inkubowana w 37°C przez 30 – 60 min, aż do wystąpienia rozpadu stwierdzonego przez rozcieńczenie 100 mikro-l mieszaniny reakcyjnej w 1 ml 1% SDS i sprawdzanie „śluzowatej” konsystencji. W tym czasie, do końcowego stężenia 1% i 0,5 mg/ml dodano SDS i Proteinazę K (Sigma). Mieszaninę reakcyjną inkubowano przez 30 minut w 56°C, a następnie dodano 2 ml 5 M NaCl i 1,4 ml 10% bromku cetylotrimetyloamoniowego (Sigma). Inkubację kontynuowano przez 15 minut w 65°C. Roztwór ekstrahowano raz chloroformem/alkoholem izoamylowym (24:1), a raz fenolem z chloroformem. Po ekstrakcji, fazę wodną zmieszano z 0,6 objętości izopropanolu, osad DNA zebrano przez odwirowanie (10 000 obr/min, 15 min), przemyto 70% etanolem, wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem i ponownie zawieszono w 2 ml 10mM tris- HCl, 1mM EDTA pH 8, 5 mikro-g/ml. RNAse.

Przykład 4. Identyfikacja taksonomiczna szczepu bakteryjnego P1-29.

48

EP 2 236 600 B1

[0376] Fragment genu 16S Rrna szczepu P1-29 został wzmocniony w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z polimerazą Taq DNA (Roche) przy użyciu starterów; 536f (CAGCMGCCGCGGTAATWC) i 1392r (ACGGGCGGTGTGTRC), (Lane, D. J. In Nucleic acid techniques in bacterial systematics, Stackbrandt, E. I Goodfellow, M. Eds, John Wiley & Sons, New York: str. 115-117 (1991)). Użyto poniższego programu: 1) pierwszy etap denaturacji DNA przez 5 min w 95°C, 2) 30 cykli 1 min w 94°C, 1 min w 55°C, 1 min w 72°C; 3) etap końcowego rozprężenia w temperaturze 70°C przez 10 min. Produkty PCR, w rozmiarze około 900 par zasad, oczyszczono metodą elektroforezy w 0,8% żelu agarozowym i ekstrahowano z żelu przy użyciu zestawu Gel Purification Kit (Qiagen), zgodnie z instrukcją producenta. Oczyszczone produkty PCR zsekwencjonowano przez Medprobe (Norwegia) jako usługa komercyjna. Zsekwencjonowany obszar został zapisany jako SEQ ID Nr 1. Sekwencja ta została porównana do sekwencji DNA w bazie danych GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Najwyższe dopasowania (688-689 z 691 nukleotydów, 99,6 – 99,7%) stwierdzono w sekwencji genu 16S RNA z kilku szczepów Buttiauxella, takich jak B. Izardii DSM 9397, B. Gaviniae DSM 9393 i B. Noackiae ATCC 51607T. Zatem szczep P1-29 może być sklasyfikowany taksonomicznie jako Buttiauxella sp.

Przykład 5. Klonowanie genu fitazy z Buttiauxella sp. P1-29.

[0377] Chromosomalne DNA z Buttiauxella sp. P1-29 zostało częściowo strawione endonukleazą restrykcyjną Sau3A i frakcjonowane na 1% żelu agarozowym. Fragmenty DNA od 3 do 5 kb zostały wyizolowane z żelu przy użyciu zestawu Gel Purification Kit (Qiagen) i poddane ligacji z końcami BamHI-trawionymi defosforylowanymi lambda-ZAP (Stratagene). Kolejne etapy konstrukcji biblioteki wykonano zgodnie z instrukcją zestawu Stratagene’s ZAP Express Predigested Vector/Gigapack Cloning Kit. Postać fagowa biblioteki została przekształcona w postać plazmidową poprzez zastosowanie procedury „wycięcia masy” opisanej przez producenta (Stratagene). Badanie przesiewowe biblioteki plazmidowej zostało wykonane w podobny sposób do wcześniej opublikowanych metod wykrywania aktywności fitazy na płytkach Petriego (Howson i Davis. Enzyme Microb. Technol. 5, 377-382 (1983); Chen J.C. Biotechnology techniques 12 (10) 751-761 (1998); Riccio M.L. i wsp., J. Appl. Microbiol. 82, 177-185 (1997)). Kilka klonów fitazo-pozytywnych wyizolowano i oczyszczono przez subklonowanie. Izolaty te hodowano w pożywce płynnej (pożywka LB 30°C i 200 obr/min przez około 24 godz.), a w otrzymanych zawiesinach komórkowych zmierzono aktywność fitazy (Przykład 1). Klon, który miał najwyższą aktywność fitazy (około 1,2 U/ml przy pH równym 3,5) został wybrany do dalszej charakterystyki. Wyizolowany z tego klonu plazmid DNA, nazwany Pbk (P1-29) i scharakteryzowany poprzez częściowe sekwencjonowanie wstawki DNA (usługa sekwencjonowania została dostarczona przez Medprobe (Norwegia)). Sekwencja zawierająca gen fitazy jest zapisana jako SEQ ID Nr: 2. Wykryta sekwencja fitazy Buttiauxella sp. P1-29 jest zapisana jako SEQ ID Nr: 3. Porównanie SEQ ID Nr: 3 z sekwencjami w GenBank wykonane przy wykorzystaniu usług BLAST świadczonych przez NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) zidentyfikowało fitazę z Obesumbacterium proteus (GenBank nr dostępu AAQ90419) jako najbliższego znanego homologa fitazy Buttiauxella sp. P1-29. Jednakże poziom homologii jest raczej niski – tylko około 74% reszt aminokwasowych jest identycznych w obu białkach.

Przykład 6. Amplifikacja i ekspresja genu fitazy z Buttiauxella sp. P1-29.

[0378] Gen fitazy został zamplifikowany przez PCR. DNA chromosomalne ze szczepu P1-29 Buttiauxella sp. użyte zostało jako matryca, a oligonukleotydy o29-5 (GGAATTCATATGACGATCTCTGCGTTTAAC) i o29-3 (GGAATTCGGATCCTTA- CTGTAGCTGGCAGCCTG) jako startery. Amplifikację przeprowadzono przy użyciu zestawu Expand High Fidelity PCR System (Roche). Użyto poniższego programu: 1) początkowy etap denaturacji DNA przez 3 min w 94°C; 2) 35 cykli 45 sek w 94°C, 45 sek w 55°C, 1 min w 68°C; 1 min w 72°C, 1 min w 74°C3) etap końcowego rozprężenia w temperaturze 72°C przez 10 min. Uzyskany produkt PCR oczyszczano metodą elektroforezy w 0,8% żelu agarozowym, po czym wykonano ekstrakcję DNA z żelu przy użyciu Gel Purification Kit (Qiagen). Oczyszczony produkt PCR trawiono enzymami restrykcyjnymi NdeI i BamHI i wyizolowano z mieszaniny reakcyjnej przy pomocy PCR Purification Kit (Qiagen). Wektor

49

EP 2 236 600 B1

plazmidowy Pet11a (Novagen) trawiono endonukleazą restrykcyjną NdeI i BamHI, defosforylowano przy użyciu fosfatazy alkalicznej krewetki (Roche) i oczyszczono za pomocą elektroforezy w 0,8% żelu agarozowym. Prążek zlinearyzowanego plazmidu DNA wycięto z żelu i oczyszczono używając zestawu Gel Purification Kit (Qiagen). Te dwa oczyszczone fragmenty DNA zligowano przy użyciu ligazy DNA T4 (Roche). Reakcję ligacji strącono 70% etanolem, przemyto etanolem i ponownie zawieszono bezpośrednio w 50 mikro-l elektrokompetentnych komórkach E. Coli XL1-Blue MRF. Zawiesinę przeniesiono do 0,1 cm kuwety elektroporacji (BioRad) i dokonano elektroporacji przy użyciu Gene Pulser Xcell (BioRad) z ustawieniami 1800 V, 25 mikro-F i 200 Ohm. Natychmiast po elektroporacji dodano 1 ml pożywki LB, zawiesinę komórkową przeniesiono do 15 ml plastikowej fiolki (Falcon) i inkubowano w 37°C z wytrząsaniem (200 obrotów/min) przez 1 godzinę. Transformowane komórki wysiewano na płytki zawierające LB 100 mikro-g/ml i inkubowano przez noc w 37°C. 24 transformanty hodowano w pożywce płynnej, której użyto do testowania aktywności fitazy i izolacji DNA plazmidowego. Wybrano klon wytwarzający najwyższą aktywność fitazy i tworzący oczekiwany wzór restrykcyjny plazmidu DNA. Plazmid zawarty w tym klonie o nazwie Pet11 (P1-29) został użyty do transformacji szczepu gospodarza ekspresji BL21 (DE3) pLysS (Novagen). Przekształconą zawiesinę komórkową wytrząsano przez 1 godz. W 37°C w LB zawierającym 2% glukozy i zaszczepiono w 50 ml LB zawierających ampicylinę (100 mikro-g/ml) i glukozę (2%) oraz hodowano przez noc w 30°C z wytrząsaniem (200 obrotów/min.). OD otrzymanej kultury mierzono przy 600nm, a kultura została wykorzystana do zaszczepienia 11 LB + ampicylina (100 mikro-g/ml) do OD600 równego 0,04. Hodowlę kontynuowano przez noc w 30°C. Aktywność fitazy w takich kulturach zazwyczaj wynosiła 8-12 U/ml. Około 40% aktywności fitazy było wydzielanej do pożywki hodowlanej, a reszta pozostała związana z komórkami. Obserwacje te wskazują, że fitaza Buttiauxella P1-29 jest wydzielana nieco skuteczniej w E.coli niż w jej rodzimym gospodarzu. Aktywność w hodowli szczepu kontrolnego BL21 (DE3) pLysS, transformowanego Pet11 i hodowanego w tych samych warunkach wynosiła poniżej 0,0,5 U/ml.

Przykład 7. Oczyszczanie rekombinowanej fitazy z Buttiauxella sp P1-29.

[0379] Hodowla BL21 (DE3) pLysS transformowana Pet11 (P1-29) została odwirowana w celu usunięcia komórek bakteryjnych, zagęszczona na wyparce obrotowej do około 1/10 początkowej objętości i dializowana wobec wody, aż przewodnictwo roztworu spadło poniżej 250 mikro-S/cm. PH roztworu doprowadzono do 8,0 przy użyciu zasady tris i przeniesiono do kolumny (3x20 cm) z DEAE Sepharose Fast Flow (Roche) zrównoważoną 25mM tris-HCl, pH=8,0. Kolumnę przemyto buforem równoważącym w przepływie 3 ml/min przez 30 min, po czym eluowano trzema kolejnymi gradientami NaCl w 25mM Tris-HCl, pH 8,0: 0-50mM, 50-150mM i 150-500mM. Każdy z trzech gradientów został zaprogramowany na 1 godz. Przy stałym przepływie 3 ml/min. Zebrano 9 ml frakcje i testowano aktywność fitazy. Wykryto jeden silny szczyt aktywności. Białko w szczytowej frakcji zatężono przy użyciu koncentratorów Centriplus (Amicon) i analizowano za pomocą SDS PAGE z użyciem 12% żelu i standardowego systemu buforowego Laemmli. Wyniki tej analizy wskazują, że preparat rekombinowanej fitazy Buttiauxella P1-29 uzyskany przez DEAE Sepharose zawiera jeden widoczny składnik białkowy. Analizy półilościowe oparte na skanowaniu obrazu cyfrowego żelu (Fig. 1) wskazują czystość wynoszącą około 65%.

Przykład 8. Profil pH rekombinowanej fitazy z Buttiauxella sp P1-29.

[0380] Zależność aktywności fitazy Buttiauxella P1-29 (oczyszczonej zgodnie z Przykładem 7) od pH badano w buforach i w warunkach opisanych w Przykładzie 1. Enzym był aktywny w szerokim zakresie pH (2 – 5,5) z maksimum pH wynoszącym około 4,5 i silnym „ramieniem” krzywej pH około pH=3 (Fig. 2).

Przykład 9. Specyficzność substratowa rekombinowanej fitazy z Buttiauxella sp P1-29.

[0381] Frakcje fosforanów inozytolu, zawierające trzy, cztery lub pięć fosforanów na resztę inozytolu, izolowano metodą chromatografii jonowymiennej z częściowego hydrolizatu kwasu fitynowego traktowanego fitazą grzybową (Natuphos). Produkcja i oczyszczanie tych preparatów było usługą komercyjną dostarczoną

50

EP 2 236 600 B1

przez BioChemis Ltd (Sankt Petersburg, Rosja). Zanieczyszczenie każdej frakcji fosforanem inozytolu o różnym stopniu fosforylacji było mniejsze niż 5%, jak oceniono przez HPLC (Sandberg AS, Ahderinne RJ Food Sci. 51 (3), 547-550). Dostępne w handlu 1,6-difosforan fruktozy i 6-fosforan fruktozy (Sigma) były używane jako substraty modelowe stosowane do oceny specyficzności fitazy Buttiauxella P1-29 wobec substratów di- i monofosforanowych. Aktywność fitazy Buttiauxella, oczyszczonej zgodnie z Przykładem 7 za pomocą różnych substratów, była mierzona za pomocą standardowego testu (Przykład 1) przy pH równym 3,5 za pomocą 2mM stężenia substratów w końcowej mieszaninie reakcyjnej. Wyniki (Fig. 3) wskazują, że enzym ma bardzo szeroką specyficzność substratową. Jego aktywność wobec penta-, tetra- i trifosforanów była zasadniczo równa lub nieco wyższa niż aktywność wobec kwasu fitynowego jako substratu. Nawet 1,6-difosforan fruktozy – substrat ubogi dla większości fitaz, był raczej skutecznie hydrolizowany przez fitazę Buttiauxella sp. (w szczególności fitazę pochodzącą z P1-29). Hydroliza 6-fosforanu fruktozy również była wykrywalna, chociaż znacznie mniej wydajnie niż hydroliza innych testowanych substratów.

Przykład 10. Aktywność specyficzna rekombinowanej fitazy z Buttiauxella P1-29.

[0382] Aktywność specyficzną fitazy Buttiauxella P1-29 oceniano przy użyciu oczyszczonego preparatu, zgodnie z Przykładem 7. Aktywność fitazy mierzono przy pH równym 3,5, zgodnie z Przykładem 1. Stężenie fitazy zostało obliczone poprzez pomiar całkowitego stężenia białka przy użyciu zestawu BCA Protein Assay Kit (Pierce) i skorygowaniu go na podstawie zawartości fitazy oszacowanej za pomocą SDS PAGE (Przykład 7). Według tych pomiarów, aktywność specyficzna rekombinowanej fitazy z Buttiauxella P1-29 wynosi około 300 U/mg w 37ºC.

Przykład 11. Tworzenie i charakterystyka wariantów fitazy

[0383] Warianty fitazy zostały skonstruowane przez mutagenezę sekwencji nukleotydowej SEQ ID Nr 2 przy użyciu metod mutagenezy wymienionych powyżej, takich jak metody ujawnione u Morinaga i wsp. (Biotechnology (1984) 2, str 646-649) lub Nelson and Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, str. 147-151) lub w protokole mutagenezy Error Threshold opisanym w WO 92/18645. Inna przydatna metoda mutagenicznej PCR została przedstawiona przez Cadwell i Joyce (PCR Methods Appl. 3(1994), 136-140).

[0384] Warianty enzymu fitazy charakteryzowano po ekspresji heterologicznej w jednym lub więcej z następujących gospodarzy ekspresji: Escherichia coli K12; Bacillus subtilis; Saccharomyces cerevisiae.

[0385] Otrzymano warianty fitazy, które różniły się w jednej lub więcej pozycji aminokwasów z SEQ ID Nr 3, w tym dwiema pozycjami, trzema pozycjami, czterema pozycjami, pięcioma pozycjami, sześcioma pozycjami, siedmioma pozycjami, ośmioma pozycjami, dziewięcioma pozycjami, dziesięcioma pozycjami, jedenastoma pozycjami i dwunastoma pozycjami. W stosownych przypadkach wykonano iteracyjne rundy mutagenezy, jak opisano w niniejszym dokumencie.

Charakterystyka wariantów fitazy

1. Termostabilność

[0386] Termostabilność takich wariantów została scharakteryzowana przez temperaturę inaktywacji enzymu. Temperatura inaktywacji została ustalona przez pomiar aktywności resztkowej enzymu fitazy po inkubacji przez 10 min w różnych temperaturach, a następnie ochłodzeniu do temperatury pokojowej. Temperatura inaktywacji jest zdefiniowana jako temperatura, w której aktywność resztkowa wynosi 50% w porównaniu do aktywności resztkowej po inkubacji przez taki sam okres, w takich samych warunkach, w temperaturze pokojowej. W stosownych przypadkach dokonano interpolacji i ekstrapolacji danych pomiarowych aktywności, w celu określenia temperatury odpowiadającej 50% aktywności resztkowej. Różnice termostabilności w °C obliczono przez odjęcie od siebie temperatur inaktywacji dwóch enzymów.

51

EP 2 236 600 B1

[0387] Tabela 1 przedstawia różnice termostabilności dla różnych wariantów:

TABELA 1:

Różnice stabilności termicznej (TD) dla wariantów uzyskanych z fitazy macierzystej przedst. W SEQ ID Nr 3.

Wariant T.D.

K59E 2,5

T167V 2,5

K240T 2,1

T167I 3,0

K240E 3,3

D244C 4,2

Q289Y 4,4

T209K 1,8

F197S 1,0

D125E/H193R 1,5

A294E/N303K 3,5

T167I/K240T 4,1

D223E/K240E/N351D 2,7

T167I/K240T/A294E/N303K 6,1

T167I/K240E/A242S/A294E/N303K 8,2

A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A294E/N303K 11,5

A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K 15,2

A122T/D125E/H193R/F197S/T209K/A211P/S221N/G225A/K240E/A294E/N303K 12,0

D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K 16,5

A122T/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K/I336F 17,7

N70Y/D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K 20,2

2. Inne właściwości

Inne właściwości także zostały ulepszone.

[0388] Termostabilność, aktywność specyficzną i stabilność pepsyny wybranych wariantów porównano za pomocą wyżej opisanych testów. Stabilność pepsyny tych wariantów określono poprzez pomiar aktywności resztkowej przy pH równym 3,5, 37°C po inkubacji pepsyny, w porównaniu z warunkami kontrolnymi (aktywność resztkowa = aktywność po inkubacji pepsyny/aktywność po inkubacji w warunkach kontrolnych). Inkubacja pepsyny została przeprowadzona przez 2 godziny w pH 2,0, 0,25 mg/ml pepsyny, 1mM CaCl2 i 5 mg/ml BSA w temperaturze 37°C. Warunki kontrolne były następujące: 2 godziny w pH 5,0, 1mM CaCl2 i 5 mg/ml BSA w 37°C.

[0389] Tabela 2 przedstawia właściwości wybranych wariantów (pochodzących od i porównanych z fitazą typu dzikiego zgodnie z SEQ ID Nr 3.

52

EP 2 236 600 B1

TABELA 2:

Stabilność pepsyny dla wariantów uzyskanych fitazy macierzystej przedstawionej w SEQ ID Nr 3.

Wariant

Stabilność pepsyny [% aktywności resztkowej]

A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A294E/N303K 63

A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K

72

A122T/D125E/H193R/F197S/T209K/A211P/S221N/G225A/K240E/A294E/N303K

34

D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K

62

A122T/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K/I336F

61

N70Y/D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K

77

TABELA 3: Aktywność specyficzna dla wariantów uzyskanych z fitazy macierzystej przedstawionej w SEQ ID Nr 3:

Wariant Aktywność specyficzna [% aktywności typu dzikiego przy pH 4,0]

A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K 115

[0390] Niniejszy wynalazek w kolejnych, numerowanych ustępach opisuje również::

1. Polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową odpowiadającą fitazie Buttiauxella sp. lub jego postać zmodyfikowana, polipeptyd homologiczny, wariant, równoważnik funkcjonalny lub fragment efektywny.

2. Polipeptyd, jak opisano w ustępie 1, zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NR: 3 lub sekwencję, która jest co najmniej w 75%, najlepiej co najmniej w 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% z nią identyczna (homologiczna) lub jej funkcjonalny fragment efektywny.

3. Polipeptyd zgodny z ustępami 1 lub 2, gdzie wspomniany polipeptyd jest wyizolowany i/lub oczyszczony.

4. Polipeptyd zgodny z ustępami od 1 do 3, gdzie wspomniany polipeptyd wykazuje aktywność fitazy.

5. Polipeptyd zgodny z ustępem od 1 do 4, charakteryzujący się tym, że jest otrzymywany z, lub najlepiej, gdy pochodzi ze szczepu P1-29 Buttiauxella sp. zdeponowanego pod numerem dostępu NCIMB 41248.

6. Polipeptyd zgodny z ustępami 4 lub 5, lub jego równoważnik funkcjonalny, charakteryzujący się tym, że wspomniana fitaza wykazuje aktywność specyficzną co najmniej 100, korzystniej co najmniej 200, najkorzystniej co najmniej 300 U/mg, przy czym wspomniana aktywność specyficzna jest określona przez inkubację fitazy w roztworze zawierającym 2mM fitynianu, 0,8mM CaCl₂ w 200mM buforu octanu sodu przy pH 4,5, w temperaturze 37°C.

7. Polipeptyd zgodny z ustępami od 4 do 6 lub jego równoważnik funkcjonalny charakteryzujący się tym, że wspomniana fitaza wykazuje maksymalną aktywność przy pH wynoszącym około 3 do 6, korzystniej około 4

53

EP 2 236 600 B1

do 5, a najkorzystniej około 4,5, przy czym aktywność jest określona przez inkubację fitazy w roztworze zawierającym 2mM fitynianu, 0,8mM CaCl ₂ w 200mM buforu octanu sodu, w temperaturze 37°C.

8. Polipeptyd opisany w dowolnym z ustępów od 1 do 7, zawierający mutacje w przynajmniej jednej z następujących pozycji (numerowanie zgodne z numerowaniem w SEQ ID NR 3): 59, 70, 122, 125, 167, 193, 197, 204, 209, 211, 221, 223, 225, 240, 242, 244, 268, 281, 289, 294, 303, 336 lub 351.

9. Polipeptyd opisany w ustępie 8, gdzie wspomniana fitaza zawiera jedną lub więcej z następujących mutacji:

K 59 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub T 70 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W, lub Y; lub A 122 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ,lub Y; lub D 125 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub T 167 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W lub Y; lub H 193 A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub F 197 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub T 204 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W lub Y; lub T 209 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W lub Y; lub A 211 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub G 221 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub 1223 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub S 225 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W lub Y; lub K 240 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub A 242 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub D 244 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub A 268 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub L 281 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub Q 289 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W lub Y; lub A 294 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub N 303 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub I 336 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub N 351. A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, lub Y;

10. Polipeptyd/ enzym fitazy opisany w ustępie 8 lub 9, zawierający przynajmniej jedną mutację wyselekcjonowaną z grupy składającej się z: K59E; T167V; K240T; T167I; K240E; D244C; Q289Y; T209K lub F197S.

11. Polipeptyd/ enzym fitazy opisany w ustępie od 8 do 10, zawierający kombinację mutacji wyselekcjonowaną z grupy składającej się z:

D125E/H193R; lub A294E/N303K; lub T167I/K240T; lub D223E/K240E/N351D; lub T167I/K240T/A294E/N303K; lub T167I/K240E/A242S/A294E/N303K; lub A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A294E/N303K; lub A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K; lub A122T/D125E/H193R/F197S/T209K/A211P/S221N/G225A/K240E/A294E/N303K; lub D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K; lub A122T/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K/I336F lub N7 0Y/D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K.

54

EP 2 236 600 B1

12. Polipeptyd/ enzym fitazy opisany w ustępie od 8 do 11, przy czym wspomniany wyizolowany polipeptyd czy enzym fitazy jest ulepszonym wariantem enzymu fitazy, który w porównaniu do macierzystego enzymu fitazy ma ulepszone właściwości(-ść) wybrane(-ą) spośród:

i. wyższa termostabilność; i/lub ii. aktywność specyficzna; i/lub iii. stabilność proteolityczna;

13. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego wybrana spośród

i)Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca fitazę, jak opisano w którymkolwiek z ustępów od 1 do 12. ii)Kwas nukleinowy, który hybrydyzuje do kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd SEQ ID Nr 3 lub jego homolog, w warunkach średniej rygorystyczności, najlepiej w warunkach wysokiej lub bardzo wysokiej rygorystyczności. iii)Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawierająca sekwencję określoną w SEQ ID NR: 2 lub jej homolog. iv)Kwas nukleinowy, który hybrydyzuje do SEQ ID Nr 2 lub jej uzupełnienia, w warunkach średniej rygorystyczności, najlepiej w warunkach wysokiej lub bardzo wysokiej rygorystyczności.

14. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, zgodnie z ustępem 13, kodująca polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową jak przedstawiono w SEQ ID NR: 3 lub sekwencji, która jest co najmniej w 75%, 80%, 85%, 90%, 95% lub 99% z nią identyczna (homologiczna) lub jej fragment efektywny.

15. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zgodnie z ustępem 13 czy 14 zawierająca sekwencję nukleotydową, która jest taka sama jak, lub jest uzupełnieniem, lub zawiera odpowiednie substytucje kodonów dla dowolnych z SEQ ID NR 2, lub zawiera sekwencję, która wykazuje homologię co najmniej 75%, 80%, 85%, 90%, 95% lub 99% z SEQ ID NR 2.

16. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, zgodnie z ustępami od 13 do 15, gdzie cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd przedstawiony w ustępach od 8 do 12.

17. Plazmid lub system wektora zawierający nukleotyd zgodnie z ustępami od 13 do 16.

18. Plazmid lub system wektora zgodny z ustępem 17, gdzie wspomniany plazmid lub system wektora jest wektorem ekspresyjnym dowolnych enzymów zgodnie z ustępami od 1 do 12, i/lub zawiera polinukleotydy zgodnie z ustępami od 13 do 16 w drobnoustroju.

19. Komórka gospodarza przekształcona lub transfekowana plazmidem, lub systemem wektora opisanymi w ustępie 17 czy 18.

20. Komórka gospodarza opisana w ustępie 19, która zawiera fitazę zawierającą sekwencję aminokwasów, lub jej funkcjonalny fragment, jak określono w SEQ ID NR: 3 lub homologiczną sekwencję polipeptydową, która jest co najmniej w 75% do niej homologiczna.

21. Komórka gospodarza opisana w ustępie 19 lub 20, przy czym wspomniana komórka gospodarza pochodzi z drobnoustroju, włączając bakterie, takie jak B. Subtilis, E. Coli, grzyby, włączając drożdże, takie jak polimorfy H., S. Pombe, S. Crevisiae, i grzyby nitkowate, takie jak Trichoderma spp. I Aspergillus spp., taki jak A. Oryzae.

22. Komórka gospodarza opisana w ustępie 21, przy czym wspomniany drobnoustrój jest prokariotyczną komórką bakteryjną, najlepiej E. Coli.

55

EP 2 236 600 B1

23. Szczep komórkowy P1-29 bakterii Buttiauxella sp. zdeponowany pod numerem dostępu NCIMB 41248.

24. Sposób wytwarzania polipeptydu składający się z ekspresji sekwencji aminokwasów, zgodnie z ustępami od 1 do 12, i/lub ekspresji polinukleotydów, zgodnie z ustępami od 13 do 16, w komórce gospodarza i oddzielenia wspomnianej fitazy od pożywki kultury komórki gospodarza.

25. Sposób produkowania żywności lub paszy zwierzęcej składający się z etapu rozpylenia polipeptydu, opisanego w dowolnym ustępie od 1 do 12, w formie płynnej na wspomnianą żywność lub paszę zwierzęcą.

26. Sposób produkowania żywności lub paszy zwierzęcej składający się z etapu wymieszania polipeptydu, opisanego w dowolnym ustępie od 1 do 12, w formie produktu suchego ze wspomnianą żywnością lub paszą zwierzęcą.

27. Zastosowanie fitazy, opisanej w dowolnym ustępie od 1 do 12, w żywności i paszy zwierzęcej.

28. Kompozycja żywności lub paszy zwierzęcej składająca się albo i) z fitazy opisanej w dowolnym ustępie od 1 do 12, i/ lub ii) paszy zwierzęcej produkowanej sposobem zgodnym z ustępem 25 lub 26.

29. Sposób wytwarzania wariantu enzymu fitazy, który obejmuje następujące po sobie etapy:

a) Wybranie co najmniej jednego enzymu macierzystego fitazy, przy czym co najmniej jeden enzym macierzysty fitazy jest wybrany z i) polipeptydów zgodnych z ustępami 1-12 i/lub co najmniej jednego wariantu enzymu fitazy;

b) Wytworzenie co najmniej jednego wariantu fitazy przez wprowadzenie co najmniej jednej zmiany wspomnianego enzymu macierzystego fitazy, którą jest insercja, delecja, substytucja reszty aminokwasowej lub ich kombinacja, w enzymie macierzystym fitazy w celu uzyskania co najmniej jednego wariantu enzymu fitazy;

c) Badania przesiewowe co najmniej jednego wariantu enzymu fitazy w celu identyfikacji ulepszonego wariantu enzymu fitazy, który w porównaniu do macierzystego enzymu fitazy ma ulepszoną(e) właściwość/właściwości wybraną(e) z:

i. wyższa stabilność termiczna i/lub ii. aktywność specyficzna i/lub iii. stabilność proteolityczna

d) Przygotowanie ulepszonego wariantu enzymu fitazy, najlepiej do produkcji izolowanego i/lub oczyszczonego wariantu enzymu fitazy.

30. Sposób zgodny z ustępem 29, gdzie w etapie b) wygenerowana jest populacja wariantów enzymu fitazy, a w etapie c) badaniu przesiewowemu poddana jest co najmniej część wspomnianej populacji wariantów enzymu fitazy.

31. Sposób zgodny z ustępami 29 lub 30, gdzie etap a) obejmuje poddanie mutagenezie sekwencji nukleotydowej, zgodnej z ustępami od 11 do 13, kodującej macierzysty enzym fitazy i etap b) obejmuje ekspresję zmutowanej sekwencji nukleotydów otrzymanej w etapie (a) w komórce gospodarza i etap c ) obejmuje badania przesiewowe komórek gospodarza, lub ich ekstraktu(ów) pod kątem ulepszonego wariantu enzymu fitazy posiadającego wspomnianą(e) ulepszoną(e) właściwość/ właściwości.

32. Sposób zgodny z ustępami od 29 do 31, który po etapie c) oraz opcjonalnie d), w dalszym ciągu zawiera co najmniej jedną kolejną rundę powtórzenia etapów od a) do c) i opcjonalnie d), przy czym, najlepiej w kolejnej(ych) rundzie(ach), co najmniej jeden macierzysty enzym fitazy z etapu a) jest wybrany spośród co

56

EP 2 236 600 B1

najmniej jednego wariantu enzymu fitazy i/lub ulepszonego wariantu fitazy przygotowanego zgodnie ze sposobem opisanym w ustępach od 29 do 31.

33. Sposób zgodny z ustępami od 29 do 32, przy czym etap c) zawiera badania przesiewowe wykonywane pod kątem komórek gospodarza dokonujących ekspresji ulepszonego wariantu enzymu fitazy, który w porównaniu do i) macierzystego enzymu fitazy i/lub ii) polipeptydu zawierającego SEQ ID Nr 3 ma różnicę stabilności termicznej wynoszącą co najmniej 2,5.

34. Sposób zgodny z ustępami od 29 do 33, przy czym etap c) obejmuje badania przesiewowe wykonywane pod kątem komórek gospodarza dokonujących ekspresji ulepszonego wariantu enzymu fitazy, który w porównaniu do i) macierzystego enzymu fitazy i/lub ii) polipeptydu zawierającego SEQ ID Nr 3 posiada stabilność wobec pepsyny wynoszącą co najmniej 30.

35. Sposób zgodny z ustępami od 29 do 34, przy czym etap c) obejmuje badania przesiewowe wykonywane pod kątem komórek gospodarza dokonujących ekspresji ulepszonego wariantu enzymu fitazy, który w porównaniu do i) macierzystego enzymu fitazy i/lub ii) polipeptydu zawierającego SEQ ID Nr 3, ma współczynnik aktywności specyficznej, który w porównaniu z fitazą kodowaną przez SEQ ID Nr 3 wynosi co najmniej 110.

36. Ulepszony wariant fitazy przygotowany zgodnie ze sposobem przedstawionym w ustępach od 29 do 35.

37. Konstrukt kwasu polinukleinowego, najlepiej konstrukt DNA zawierający sekwencję kwasu polinukleinowego kodującą ulepszony wariant enzymu fitazy, zgodnie z ustępem 16 lub 36.

38. Rekombinowany wektor ekspresji, który zawiera konstrukt kwasu polinukleinowego, zgodnie z ustępem 37.

39. Komórka gospodarza przekształcona kwasem polinukleinowym DNA, zgodnie z ustępem 37, i/lub wektorem, zgodnie z ustępem 38.

40. Sposób wytwarzania ulepszonego wariantu enzymu fitazy, obejmujący hodowlę komórek gospodarza, zgodnie z ustępem 39, w warunkach pozwalających na ekspresję wspomnianego wariantu.

41. Kompozycja paszy lub żywności zawierająca co najmniej jeden ulepszony wariant enzymu fitazy z ustępów od 8 do 12 albo 36, lub komórkę gospodarza z ustępu 38, przy czym kompozycja żywności lub pasz najlepiej, jeżeli jest przygotowana zgodnie ze sposobami z ustępów 25 lub 26.

SEQ ID Nr: 1

ACTACGACGCACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTCT

TTGTATGCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGA

TGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCAGTTTATCACTGGCAGTCTCCT

TTGAGTTCCCGGCCGAACCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGT

TGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCA

GCACCTGTCTCACAGTTCCCGAAGGCACTAAGGCATCTCTGCCAAATTCT

GTGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCA

CATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACC

TTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGACTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGC

CACTCCTCAAGGGAACAACCTCCAAGTCGACATCGTTTACGGCGTGGACT

ACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTC 57

EP 2 236 600 B1

AGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCT

ACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCTA

GCCTGCCAGTTTCGAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGG

SEQ ID Nr 2:

TTTCACATAGCAAACAACAACGAGACGAACTCGACGTTACCGCTTTGCTT

CTGGAGTATATTTATCAGACTCAAACACCCCAAAGAAAAGAGGCTGTAAA

TGACGATCTCTGCGTTTAACCGCAAAAAACTGACGCTTCACCCTGGTCTG

TTCGTAGCACTGAGCGCCATATTTTCATTAGGCTCTACGGCCTATGCCAA

CGACACTCCCGCTTCAGGCTACCAGGTTGAGAAAGTGGTAATACTCAGCC

GCCACGGGGTGCGAGCACCAACCAAAATGACACAGACCATGCGCGACGTA

ACACCTAATACCTGGCCCGAATGGCCAGTAAAATTGGGTTATATCACGCC

ACGCGGTGAGCATCTGATTAGCCTGATGGGCGGGTTTTATCGCCAGAAGT

TTCAACAACAGGGCATTTTATCGCAGGGCAGTTGCCCCACACCAAACTCA

ATTTATGTCTGGGCAGACGTTGATCAGCGCACGCTTAAAACTGGCGAAGC

TTTCCTGGCAGGGCTTGCTCCGGAATGTCATTTAACTATTCACCACCAGC

AGGACATCAAAAAAGCCGATCCGCTGTTCCATCCGGTGAAAGCGGGCACC

TGTTCAATGGATAAAACTCAGGTCCAACAGGCCGTTGAAAAAGAAGCTCA

AACCCCCATTGATAATCTGAATCAGCACTATATTCCCTTTCTGGCCTTGA

TGAATACGACCCTCAACTTTTCGACGTCGGCCTGGTGTCAGAAACACAGC

GCGGATAAAAGCTGTGATTTAGGGCTATCCATGCCGAGCAAGCTGTCGAT

AAAAGATAATGGCAACAAAGTCGCTCTCGACGGGGCCATTGGCCTTTCGT

CTACGCTTGCTGAAATTTTCCTGCTGGAATATGCGCAAGGGATGCCGCAA

GCGGCGTGGGGGAATATTCATTCAGAGCAAGAGTGGGCGTCGCTACTGAA

ACTGCATAACGTCCAGTTTGATTTGATGGCACGCACGCCTTATATCGCCA

GACATAACGGCACGCCTTTATTGGAGGCCATCAGCAACGCGCTGAACCCG

AATGCCACCGAAAGCAAACTGCCTGATATCTCACCTGACAATAAGATCCT

GTTTATTGCCGGACACGATACCAATATTGCCAATATCGCAGGCATGCTCA

ACATGCGCTGGACGCTACCTGGGCAACCCGATAACACCCCTCCGGGCGGC

GCTTTAGTCTTTGAGCGTTTGGCCGATAAGTCAGGGAAACAATATGTTAG

CGTGAGCATGGTGTATCAGACTCTCGAGCAGTTGCGCTCCCAAACACCAC

TTAGCCTTAATCAACCTGCGGGAAGCGTACAGCTAAAAATTCCTGGCTGT

AACGATCAGACGGCTGAAGGATACTGCCCGCTGTCGACGTTCACTCGCGT

GGTTAGCCAAAGCGTGGAACCAGGCTGCCAGCTACAGTAAATATCAGACA

AAAAAAATGCCGCTCGCGATTAAGCGAACGGCATTACTTCCTAGCTTCCC

AGCTCGGATTAGCATGGCGAGAGCCGAAAAACTT

SEQ ID Nr: 3

58

EP 2 236 600 B1

MTISAFNRKKLTLHPGLFVALSAIFSLGSTAYANDTPASGYQVEKVVILS

RHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGGFYRQK

FQQQGILSQGSCPTPNSIYVWADVDQRTLKTGEAFLAGLAPECHLTIHHQ

QDIKKADPLFHPVKAGTCSMDKTQVQQAVEKEAQTPIDNLNQHYIPFLAL

MNTTLNFSTSAWCQKHS ADKS CDLGLSMPSKLSIKDNGNKVALDGAIGLS

STLAEIFLLEYAQGMPQAAWGNIHSEQEWASLLKLHNVQFDLMARTPYIA

RHNGTPLLQAISNALNPNATESKLPDIS PDNKILFIAGHDTNIANIAGML

NMRWTLPGQPDNTPPGGALVFERLADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTP

LSLNQPAGSVQLKIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRWSQSVEPGCQLQ

LISTA SEKWENCJI

[0391]

<110> DANISCO A/S

<120> ENZYMY

<130> P021161WO

<140> PCT/IB2005/003376

<141> 2005-10-17

<150> GB 0423139.5

<151> 2004-10-18

<160>7

<170> Wersja Patentu 3.3

<210> 1

<211> 691

<212> DNA

<213> Buttiauxella

<400> 1

59

EP 2 236 600 B1

actacgacgc actttatgag gtccgcttgc tctcgcgagg tcgcttctct ttgtatgcgc 60

cattgtagca cgtgtgtagc cctactcgta agggccatga tgacttgacg tcatccccac 120

cttcctccag tttatcactg gcagtctcct ttgagttccc ggccgaaccg ctggcaacaa 180

aggataaggg ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat ttcacaacac gagctgacga 240

cagccatgca gcacctgtct cacagttccc gaaggcacta aggcatctct gccaaattct 300

gtggatgtca agagtaggta aggttcttcg cgttgcatcg aattaaacca catgctccac 360

cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcatttg agttttaacc ttgcggccgt actccccagg 420

cggtcgactt aacgcgttag ctccggaagc cactcctcaa gggaacaacc tccaagtcga 480

catcgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt ttgctcccca cgctttcgca 540

cctgagcgtc agtctttgtc cagggggccg ccttcgccac cggtattcct ccagatctct 600

acgcatttca ccgctacacc tggaattcta cccccctcta caagactcta gcctgccagt 660

ttcgaatgca gttcccaggt tgagcccggg g 691

<210>2 <211>1534 <212> DNA <213> Buttiauxella

<400> 2

tttcacatag caaacaacaa cgagacgaac tcgacgttac cgctttgctt ctggagtata 60

tttatcagac tcaaacaccc caaagaaaag aggctgtaaa tgacgatctc tgcgtttaac 120

cgcaaaaaac tgacgcttca ccctggtctg ttcgtagcac tgagcgccat attttcatta 180

ggctctacgg cctatgccaa cgacactccc gcttcaggct accaggttga gaaagtggta 240

atactcagcc gccacggggt gcgagcacca accaaaatga cacagaccat gcgcgacgta 300

acacctaata cctggcccga atggccagta aaattgggtt atatcacgcc acgcggtgag 360

catctgatta gcctgatggg cgggttttat cgccagaagt ttcaacaaca gggcatttta 420

tcgcagggca gttgccccac accaaactca atttatgtct gggcagacgt tgatcagcgc 480

acgcttaaaa ctggcgaagc tttcctggca gggcttgctc cggaatgtca tttaactat t 540

caccaccagc aggacatcaa aaaagccgat ccgctgttcc atccggtgaa agcgggcacc 600

tgttcaatgg ataaaactca ggtccaacag gccgttgaaa aagaagctca aacccccatt 660

gataatctga atcagcacta tattcccttt ctggccttga tgaatacgac cctcaacttt 720

tcgacgtcgg cctggtgtca gaaacacagc gcggataaaa gctgtgattt agggctatcc 780

60

EP 2 236 600 B1

atgccgagca agctgtcgat aaaagataat ggcaacaaag tcgctctcga cggggccatt 840

ggcctttcgt ctacgcttgc tgaaattttc ctgctggaat atgcgcaagg gatgccgcaa 900

gcggcgtggg ggaatattca ttcagagcaa gagtgggcgt cgctactgaa actgcataac 960

gtccagtttg atttgatggc acgcacgcct tatatcgcca gacataacgg cacgccttta 1020

ttgcaggcca tcagcaacgc gctgaacccg aatgccaccg aaagcaaact gcctgatatc 1080

tcacctgaca ataagatcct gtttattgcc ggacacgata ccaatattgc caatatcgca 1140

ggcatgctca acatgcgctg gacgctacct gggcaacccg ataacacccc tccgggcggc 1200

gctttagtct ttgagcgttt ggccgataag tcagggaaac aatatgttag cgtgagcatg 1260

gtgtatcaga ctctcgagca gttgcgctcc caaacaccac ttagccttaa tcaacctgcg 1320

ggaagcgtac agctaaaaat tcctggctgt aacgatcaga cggctgaagg atactgcccg 1380

ctgtcgacgt tcactcgcgt ggttagccaa agcgtggaac caggctgcca gctacagtaa 1440

atatcagaca aaaaaaatgc cgctcgcgat taagcgaacg gcattacttc ctagcttccc 1500

agctcggatt agcatggcga gagccgaaaa actt 1534

<210>3 <211>446 <212> PRT <213> Buttiauxella <220> <221>MIEJSCE <222> (59)..(59) <223> Dowolny aminokwas.

<221> <222>MIEJSCE <222> (70)..(70) <223> Dowolny aminokwas.

<220> <221> MIEJSCE <222> (122)..(122) <223> Dowolny aminokwas.


<220> 61

EP 2 236 600 B1

<221>MIEJSCE <222> (167)..(167) <223> Dowolny aminokwas.





<220> <221> MIEJSCE <222> (211 )..(211) <223> Dowolny aminokwas.





62

EP 2 236 600 B1










<400> 3

63

EP 2 236 600 B1

64

EP 2 236 600 B1

<210>4 <211> 18 <212> DNA <213> Sztuczne

<220> <223> starter oligonukleotydowy

65

EP 2 236 600 B1

<400> 4 cagcmgccgc ggtaatwc 18

<210>5 <211> 15 <212> DNA <213> Sztuczne


<400>5 acgggcggtg tgtrc 15

<210>6 <211> 30 <212> DNA <213> Sztuczne


<400> 6 ggaattcata tgacgatctc tgcgtttaac 30

<210>7 <211> 33 <212> DNA <213> Sztuczne


<400> 7 ggaattcgga tccttactgt agctggcagc ctg 33

66

EP 2 236 600 B1

Zastrzeżenia

1. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego wybrana z:

i) wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej polipeptyd wybrany z grupy składającej się z:


• polipeptydu możliwego do uzyskania ze szczepu P1-29 Buttiauxella sp. zdeponowanego pod numerem dostępu NCIMB 41248;

• polipeptydu możliwego do uzyskania przez ekspresję SEQ ID Nr 2 lub sekwencji nukleotydowej możliwej do uzyskania ze szczepu P1-29 Buttiauxella sp., zdeponowanego pod numerem dostępu NCIMB 41248 lub sekwencji nukleotydowej, która jest z nią co najmniej w 80% identyczna; oraz

polipeptydu możliwego do uzyskania ze szczepu P1-29 Buttiauxella sp. zdeponowanego pod numerem dostępu NCIMB 41248, przy czym peptyd ten jest możliwy do uzyskania przez ekspresję SEQ ID Nr 2 lub sekwencji nukleotydowej możliwej do uzyskania ze szczepu P1-29 Buttiauxella sp. zdeponowanego pod numerem dostępu NCIMB 41248 lub sekwencji nukleotydowej, która jest z nią co najmniej w 80% identyczna,gdzie wspomniany polipeptyd posiada aktywność fitazy, przy czym wspomniany polipeptyd posiada aktywność specyficzną wynoszącą przynajmniej 300 U/mg, przy czym wspomniana aktywność specyficzna jest wyznaczana przez inkubację tego polipeptydu w roztworze zawierającym 2mM fitynian, 0,8mM CaCl2 w 200mM buforze octanu sodu o pH 3,5, w temperaturze 37°C;

ii) wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego zawierającej sekwencję, jak przedstawiono w SEQ ID NR: 2;

iii) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z SEQ ID Nr 2 w warunkach rygorystycznych przy 50°C oraz 0,2 x SSC.

2. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrzeżenia 1, kodująca polipeptyd wybrany z grupy składającej się z:

• polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NR: 3 lub sekwencję aminokwasową, która jest z nią co najmniej w 80% identyczna;

• polipeptyd możliwy do uzyskania ze szczepu P1-29 Buttiauxella sp. zdeponowanego pod numerem dostępu NCIMB 41248;

• polipeptyd możliwy do uzyskania przez ekspresję SEQ ID Nr 2 lub sekwencji nukleotydowej możliwej do uzyskania ze szczepu P1-29 Buttiauxella sp. zdeponowanego pod numerem dostępu NCIMB 41248 lub sekwencji nukleotydowej, która jest z nią co najmniej w 80% identyczna; oraz

• polipeptyd możliwy do uzyskania ze szczepu P1-29 Buttiauxella sp. zdeponowanego pod numerem dostępu NCIMB 41248, przy czym peptyd otrzymywany jest przez ekspresję SEQ ID Nr 2 lub sekwencji nukleotydowej otrzymanej ze szczepu P1-29 Buttiauxella sp. zdeponowanego pod numerem dostępu NCIMB 41248 lub sekwencji nukleotydowej, która jest z nią co najmniej w 80% identyczna,

gdzie wspomniany polipeptyd posiada aktywność fitazy, przy czym wspomniany polipeptyd posiada aktywność specyficzną wynoszącą przynajmniej 300 U/mg, przy czym ta aktywność specyficzna jest wyznaczana przez inkubację wspomnianego polipeptydu w roztworze zawierającym 2mM fitynian i 0,8mM CaCl₂ w 200mM buforze octanu sodu o pH równym 3,5, w temperaturze 37°C.

67

EP 2 236 600 B1

3. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrzeżenia 1 albo zastrzeżenia 2 zawierająca sekwencję nukleotydową, która jest taka sama lub komplementarna do SEQ ID NR 2, lub zawiera sekwencję, która jest co najmniej w 80% identyczna z SEQ ID NR: 2.

4. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, która to cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd posiadający maksimum aktywności przy pH wynoszącym około 3 do 6, przy czym wspomniana aktywność jest wyznaczana przez inkubację wspomnianego polipeptydu w roztworze zawierającym 2mM fitynian i 0,8mM CaCl₂ w 200mM buforze octanu sodu, w temperaturze 37°C.

5. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, przy czym wspomniana cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd posiadający maksimum aktywności przy pH wynoszącym około 4 do 5, przy czym wspomniana aktywność jest wyznaczana przez inkubację wspomnianego polipeptydu w roztworze zawierającym 2mM fitynian i 0,8mM CaCl₂ w 200mM buforze octanu sodu, w temperaturze 37°C.

6. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, przy czym wspomniana cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd posiadający maksimum aktywności przy pH wynoszącym około 4,5, przy czym wspomniana aktywność jest wyznaczana przez inkubację wspomnianego polipeptydu w roztworze zawierającym 2mM fitynian i 0,8mM CaCl₂ w 200mM buforze octanu sodu, w temperaturze 37°C.

7. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 6, przy czym wspomniana cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd zawierający mutacje w co najmniej jednej z następujących pozycji, numerowanych zgodnie z numeracją w SEQ ID Nr 3: K 59, T 70, A 122, D 125, T 167, H 193, F 197, T 204, T 209, A 211, S 221, I 223, S 225, K 240, A 242, D 244, A 268, S 281, Q 289, A 294, N 303, I 336 lub N 351. 8. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 7, przy czym wspomniana cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd zawierający jedną lub więcej z następujących mutacji: K 59 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub N 70 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W lub Y; lub A 122 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub D 125 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub T 167 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W lub Y; lub H 193 A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub F 197 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub T 204 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W lub Y; lub T 209 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W lub Y; lub A 211 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub S 221 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub D 223 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub G 225 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W lub Y; lub K 240 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub A 242 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub D 244 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub A 268 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub S 281 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; llub Q 289 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W lub Y; lub A 294 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub N 303 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub I 336 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub N 351 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W lub Y.

68

EP 2 236 600 B1

9. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 8, przy czym wspomniana cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd zawierający co najmniej jedną mutację wybraną z grupy składającej się z: K59E; T167V; K240T; T167I; K240E; D244C; Q289Y; T209K lub F197S. 10. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zgodna z którymkolwiek z zastrzeżeń 1 do 9, przy czym wspomniana cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd zawierający kombinację mutacji wybraną z grupy składającej się z: .

D125E/H193R; lub A294E/N303K; lub T167I/K240T; lub D223E/K240E/N351D; lub T167I/K240T/A294E/N303K; lub T167I/K240E/A242S/A294E/N303K; lub A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A294E/N303K; lub A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K; lub A122T/D125E/H193R/F197S/T209K/A211P/S221N/G225A/K240E/A294E/N303K; lub D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K; lub A122T/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K/I336F lub N70Y/D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K.

11.Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 10, przy czym wspomniana cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd zawierający kombinację mutacji:

A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K.

12. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według któregokolwiek z zastrzeżeń 7 do 10, przy czym wspomniana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd jest wariantem enzymu fitazy, który posiada wyższą stabilność termiczną i/lub wyższą aktywność specyficzną i/lub wyższą stabilność proteolityczną w porównaniu z enzymem fitazy kodowanym przez SEQ ID Nr 2.

13. System plazmidu lub wektora zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego jak określoną w któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 12.

14. System plazmidu lub wektora według zastrzeżenia 13, przy czym wspomniany system plazmidu lub wektora jest wektorem ekspresyjnym do ekspresji któregokolwiek z polipeptydów, jak zdefiniowano w którymkolwiek z zastrzeżeń 1 do 12 i/lub zawiera polinukleotydy określone w którymkolwiek z zastrzeżeń 1 do 12 w drobnoustroju.

15. Komórka gospodarza transformowana lub transfekowana systemem plazmidu lub wektora określonym w zastrzeżeniu 13 lub 14.

16. Komórka gospodarza według zastrzeżenia 15, która wyraża polipeptyd określony w którymkolwiek z zastrzeżeń 1 do 12.

17. Komórka gospodarza według zastrzeżenia 15 lub 16, przy czym wspomniana komórka gospodarza pochodzi z drobnoustroju.

18. Komórka gospodarza jak określona w którymkolwiek z zastrzeżeń 15 do 17, przy czym wspomniana komórka gospodarza wybrana jest spośród bakterii i grzybów.

19. Komórka gospodarza według którymkolwiek z zastrzeżeń 15 do 18, która to komórka gospodarza wybrana jest spośród bakterii, drożdży i grzybów nitkowatych.

69

EP 2 236 600 B1

20. Komórka gospodarza według któregokolwiek z zastrzeżeń 15 do 19, przy czym wspomniana komórka gospodarza wybrana jest spośród B. subtilis, E.coli, H. polymorpha, S. pombe, S. cerevisiae, Trichoderma spp. i Aspergillus spp. 21. Komórka gospodarza według zastrzeżenia 20, gdzie wspomnianym Aspergillus spp. jest A. oryzae. 22. Komórka gospodarza według któregokolwiek z zastrzeżeń 15 do 20, przy czym wspomniana komórka gospodarza jest prokariotyczną komórką bakteryjną, korzystnie E.coli 23. Komórka gospodarza według zastrzeżenia 22, przy czym wspomnianą komórką gospodarza jest E. Coli. 24. Komórka bakteryjna szczepu bakterii P1-29 Buttiauxella sp. zdeponowanego pod numerem dostępu NCIMB 41248.

25. Sposób wytwarzania polipeptydu obejmujący transformowanie komórki gospodarza polinukleotydem określonym w którymkolwiek z zastrzeżeń 1 do 12, przy czym polipeptyd jest wybrany z grupy składającej się z:





gdzie wspomniany polipeptyd posiada aktywność fitazy, przy czym wspomniany polipeptyd posiada aktywność specyficzną przynajmniej 300 U/mg, przy czym aktywność specyficzna jest wyznaczana przez inkubację wspomnianego polipeptydu w roztworze zawierającym 2mM fitynian i 0,8mM CaCl₂ w 200mM buforze octanu sodu o pH równym 3,5, w temperaturze 37°C.

26. Sposób wytwarzania polipeptydu według zastrzeżenia 25 obejmujący transformowanie komórki gospodarza polinukleotydem, określonym w którymkolwiek z zastrzeżeń 1 do 12, plazmidem lub systemem wektora określonym w dowolnym z zastrzeżeń 13 lub 14. 27. Sposób wytwarzania polipeptydu według zastrzeżenia 25 lub 26, w którym komórka gospodarza jest komórką gospodarza określoną w którymkolwiek z zastrzeżeń 15 do 24. 28. Sposób wytwarzania polipeptydu obejmujący wyrażanie polinukleotydu określonego w którymkolwiek z zastrzeżeń 1 do 12, przy czym wspomniany polipeptyd jest wybrany z grupy składającej się z:



• polipeptydu otrzymanego przez ekspresję SEQ ID Nr 2 lub sekwencji nukleotydowej uzyskanej ze szczepu P1-29 Buttiauxella sp. zdeponowanego pod numerem dostępu NCIMB 41248 lub sekwencji nukleotydowej, która jest z nią co najmniej w 80% identyczna; i

70

EP 2 236 600 B1



29. Sposób wytwarzania polipeptydu według zastrzeżenia 28, obejmujący wyrażanie polinukleotydu określonego w którymkolwiek z zastrzeżeń 1 do 12, na plazmidzie lub wektorze określonym w którymkolwiek z zastrzeżeń 13 lub 14. 30. Sposób wytwarzania polipeptydu obejmujący wyrażanie polinukleotydu jak określonego w którymkolwiek z zastrzeżeń 1 do 12 w komórce gospodarza w pożywce oraz oddzielenie wspomnianego polipeptydu od pożywki dla komórki gospodarza, przy czym wspomniany polipeptyd jest wybrany z grupy składającej się z:

• polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NR: 3 lub sekwencję aminokwasową, która jest z nią co najmniej w 80% identyczna;

• polipeptyd możliwy do uzyskania ze szczepu P1-29 Buttiauxella sp. zdeponowanego pod numerem dostępu NCIMB 41248;

• polipeptyd możliwy do uzyskania przez ekspresję SEQ ID Nr 2 lub sekwencji nukleotydowej możliwej do uzyskania ze szczepu P1-29 Buttiauxella sp. zdeponowanego pod numerem dostępu NCIMB 41248 lub sekwencji nukleotydowej, która jest z nią co najmniej w 80% identyczna; oraz

• polipeptyd możliwy do uzyskania ze szczepu P1-29 Buttiauxella sp. zdeponowanego pod numerem dostępu NCIMB 41248, przy czym peptyd otrzymywany jest przez ekspresję SEQ ID Nr 2 lub sekwencji nukleotydowej możliwej do uzyskania ze szczepu P1-29 Buttiauxella sp. zdeponowanego pod numerem dostępu NCIMB 41248 lub sekwencji nukleotydowej, która jest z nią co najmniej w 80% identyczna,

gdzie wspomniany polipeptyd posiada aktywność fitazy, przy czym wspomniany polipeptyd posiada aktywność specyficzną wynoszącą przynajmniej 300 U/mg, przy czym aktywność specyficzna jest wyznaczana przez inkubację wspomnianego polipeptydu w roztworze zawierającym 2mM fitynian i 0,8mM CaCl₂ w 200mM buforze octanu sodu o pH równym 3,5 w temperaturze 37°C.

31. Sposób wytwarzania polipeptydu według zastrzeżenia 30, obejmujący wyrażanie polinukleotydu jak określonego w którymkolwiek z zastrzeżeń 1 do 12 w plazmidzie lub wektorze, określonym w którymkolwiek z zastrzeżeń 13 lub 14, w komórce gospodarza.

32. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-12, która to cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową jak przedstawiono w SEQ ID NR: 3 lub sekwencję aminokwasową będącą z nią co najmniej w 85% identyczną.

33. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-12, która to cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd otrzymywany ze szczepu P1-29 Buttiauxella sp., zdeponowanego pod numerem dostępu NCIMB 41248.

34. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-12, która to cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd możliwy do uzyskania przez ekspresję SEQ ID NR 2 lub

71

EP 2 236 600 B1

sekwencji nukleotydowej otrzymywanej ze szczepu P1-29 Buttiauxella sp. zdeponowanego pod numerem dostępu NCIMB 41248 lub sekwencji nukleotydowej będącej z nią co najmniej w 85% identyczną.

35. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-12, która to cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd możliwy do uzyskania przez ekspresję SEQ ID Nr 2.

36. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-12, która hybrydyzuje z SEQ ID Nr 2 w warunkach rygorystycznych w 50°C i 0,2 x SSC.

37. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-12, która to cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową jak przedstawiono w SEQ ID NR: 3.

38. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-12, która to cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową, która jest co najmniej w 90% identyczna z SEQ ID NR: 3.




42. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-12 która to cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową, która jest co najmniej w 98% identyczna z SEQ ID NR: 3.


72

EP 2 236 600 B1

Analiza SDS PAGE P1-29

Wzg

lędn

a ab

sorb

ancj

a

Dystans migracji, mm

Figura 1

Profil aktywności pH fitazy P1-29

aktyw

ność, %

maks.maksymalne

j

Figura 2

73

EP 2 236 600 B1

Figura 3

74

EP 2 236 600 B1

ODSYŁACZE CYTOWANE W OPISIE PATENTOWYM

Poniższa lista odsyłaczy cytowanych przez zgłaszającego, załączona jest tylko dla wygody czytelnika. Lista

ta nie stanowi części europejskiego dokumentu patentowego. Chociaż bardzo uważnie zestawiano

odsyłacze, nie można wykluczyć błędów lub opuszczeń i pod tym względem EPO zrzeka się wszelkiej

odpowiedzialności.

Dokumenty patentowe cytowane w niniejszym opisie

• WO 2004015084 A [0007] • WO 2004085638 A [0007] • US 4683202 A [0147] • WO 9218645 A [0157] [0383] • US 5723323 A [0157] • US 5605793 A [0157] • WO 0058517 A [0157] • WO 0134835 A [0157] • WO 02097130 A [0157] • WO 03012100 A [0157] • WO 03057247 A [0157] • WO 2004018674 A [0157] • US 6303344 B [0157] • US 6132970 A [0157] • WO 9117243 A [0225] • EP 0238023 A [0259] • EP 0449375 A [0260] • US 5741665 A [0263] • US 5674707 A [0264] • US 3817837 A [0285] • US 3850752 A [0285] • US 3939350 A [0285] • US 3996345 A [0285] • US 4277437 A [0285] • US 4275149 A [0285] • US 4366241 A [0285] • US 4816567 A [0286] • GB 9821198 A [0296] • US 4946779 A [0307] • EP 1389915 A [0352] • EP 1392353 A [0353] • WO IB2005003376 W [0391] • GB 0423139 A [0391] Literature niepatentowa cytowana w niniejszym opisie • WODZINSKI RJ ; ULLAH AH. Adv Appl Microbiol.,1996, tom . 42, 263-302 [0005] • WYSS M. et al. Appl. Environ. Microbiol., 1999, tom 65 (2), 367-373 [0006] • BERKA R.M. et al. Appl. Environ. Microbiol., 1998,tom . 64 (11), 4423-4427 [0006] • LASSEN S. et al. Appl. Environ. Microbiol., 2001,tom . 67 (10), 4701-4707 [0006] • GREINER R. et al. Arch. Biochem. Biophys, 1993,tom . 303 (1), 107-113 [0006] • KEROVUO et al. Appl. Environ. Microbiol., 1998, tom .64 (6), 2079-2085 [0006] • KIM H.W et al. Biotechnol. Lett., 2003, tom . 25,1231-1234 [0006] • GREINER R. et al. Arch. Biochem. Biophys., 1997,tom . 341 (2), 201-206 [0006] • YOON S.J. et al. Enzyme and microbial technol.,1996, tom . 18, 449-454 [0006] • ZININ N.V. et al. FEMS Microbiol. Lett., 2004, tom .236, 283-290 [0006]

75

EP 2 236 600 B1

• ZINN N. V. et al. Biotehnologia, Glavnoe UpravlenieMikrobiologiceskoj Promy Lennosti Pri, 2003, tom . 2,3-10 [0007] • IGBASAN F.A. et al. Arch. Anim. Nutr., 2000, tom . 53, 353-373 [0008] • GREINER R. et al. Arch. Biochem. Biophys., 1993, tom . 303 (1), 107-113 [0008] • KEROVUO J et al. Biochem. J., 2000, tom . 352, 623-628 [0008] • VATS P et al. Enzyme and Microbial Technology, 2004, tom . 35, 3-14 [0008] • SCHLEMMER U. et al. Arch. Anim. Nutr., 2001, tom . 55, 255-280 [0013] • KEROVUO J. et al. Biochem J., 2000, tom . 352, 623-628 [0013] • NEEDLEMAN, S. B. ; WUNSCH, C. D. Journal of Molecular Biology, 1970, tom . 48, 443-453 [0061] • CADWELL; JOYCE. PCR Methods Appl., 1994, tom . 3, 136-140 [0095] [0383] • CARUTHERS MH et al. Nuc Acids Res Symp Ser, 1980, 215-23 [0142] • HORN T et al. Nuc Acids Res Symp Ser, 1980, 225-232 [0142] • BEUCAGE S.L. et al. Tetrahedron Letters, 1981, tom . 22, 1859-1869 [0146] • MATTHES et al. EMBO J., 1984, tom . 3, 801-805 [0146] • SAIKI R K et al. Science, 1988, tom . 239, 487-491 [0147] • STRYER; LUBERT. Biochemistry. Freeman Press [0148] • MORINAGA et al. Biotechnology, 1984, tom . 2, 646-649 [0153] [0212] [0383] • NELSON; LONG. Analytical Biochemistry, 1989, tom . 180, 147-151 [0153] [0212] [0383] • DEVEREUX et al. Nuc. Acids Research, 1984, tom . 12, 387 [0174] • AUSUBEL et al. Short Protocols in Molecular Biology. 1999 [0174] • AUSUBEL et al. Short Protocols in Molecular Biology, 1999, 7-587-60 [0174] • FEMS Microbiol Lett, 1999, tom . 174 (2), 247-50 [0175] • FEMS Microbiol Lett, 1999, tom . 177 (1), 187-8 [0175] • HIGGINS DG; SHARP PM. Gene, 1988, tom . 73 (1), 237-244 [0177] • LIVINGSTONE C.D. ; BARTON G.J. Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation. Comput.Appl Biosci., 1993, tom . 9, 745-756 [0182] • TAYLOR W.R. The classification of amino acid conservation. J.Theor.Biol., 1986, tom . 119, 205-218 [0182] • SIMON RJ et al. PNAS, 1992, tom . 89 (20), 9367-9371 [0185] • HORWELL DC. Trends Biotechnol., 1995, tom . 13 (4), 132-134 [0185] • SARKAR ; SOMMER. Biotechniques, 1990, tom . 8, 404-407 [0212] • J. SAMBROOK ; E. F. FRITSCH ; T. MANIATIS. Molecular Cloning: A Laboratory Manual,. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 1-3 [0214] • KANE. Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in E. coli. Curr Opin Biotechnol, 1995, tom . 6, 494-500 [0249] • BESSETTE. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, tom . 96, 13703-13708 [0249] • SAMBROOK et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 [0258] • POTRYKUS. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 1991, tom . 42, 205-225 [0260] [0274] • CHRISTOU. Agro-Food-Industry Hi-Tech, 17 March 1997 [0260] • DAVIS; DE SERRES. Methods Enzymol, 1971, tom . 17A, 79-143 [0263] • Vectors for genetic manipulation. TURNER G. Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology. Elsevier, 1994, tom . 29, 641-666 [0266] • PUNT et al. Trends Biotechnol, May 2002, tom . 20 (5), 200-6 [0267] • ARCHER ; PEBERDY. Crit Rev Biotechnol, 1997, tom . 17 (4), 273-306 [0267] • Methods Mol Biol, 1995, tom . 49, 341-54 [0269] • Curr Opin Biotechnol, October 1997, tom . 8 (5), 554-60 [0269] • FEMS Microbiol Rev, 2000, tom . 24 (1), 45-66 [0270] • Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes. E HINCHCLIFFE ; E KENNY. Yeasts. Academic Press Ltd, 1993, tom . 5 [0271] • HINNEN et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 1978, tom . 75, 1929 [0272] • BEGGS, J D. Nature, London, 1978, tom . 275, 104 [0272] • ITO, H et al. J Bacteriology, 1983, tom . 153, 163-168 [0272] • CHRISTOU. Agro-Food-Industry Hi-Tech, 17 March 1994 [0274] • Methods Enzymol, 1990, tom . 182, 132-43 [0281] • Curr Opin Biotechnol, 1995, tom . 6 (5), 501-6 [0290] • KOEHLER; MILSTEIN. Nature, 1975, tom . 256, 495-497 [0305] • KOSBOR et al. Immunol Today, 1983, tom . 4, 72 [0305] • COTE et al. Proc Natl Acad Sci, 1983, tom . 80, 2026-2030 [0305]

76

EP 2 236 600 B1

77

• COLE et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy. Alan Rickman Liss Inc, 1985, 77-96 [0305] • MORRISON et al. Proc Natl Acad Sci, 1984, tom . 81, 6851-6855 [0306] • NEUBERGER et al. Nature, 1984, tom . 312, 604-608 [0306] • TAKEDA et al. Nature, 1985, tom . 314, 452-454 [0306] • HUSE WD et al. Science, 1989, tom . 256, 1275-128 1 [0308] • J. SAMBROOK ; E. F. FRITSCH ; T. MANIATIS. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 1-3 [0368] • AUSUBEL, F. M. et al. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, 1995 [0368] • B. ROE; J. CRABTREE ; A. KAHN. DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques. John Wiley & Sons, 1996 [0368] • Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach. Irl Press, 1984 [0368] • Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA. D. M. J. LILLEY ; J. E. DAHLBERG. Methods in Enzymology. Academic Press, 1992 [0368] • HEINONEN J.K. ; LAHTI R.J. Anal Biochem., 1981, tom . 113 (2), 313-317 [0371] • AUSUBEL et al. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, 1996 [0375] • LANE, D. J. Nucleic acid techniques in bacterial systematics. John Wiley & Sons, 1991, 115-117 [0376] • HOWSON; DAVIS. Enzyme Microb. Technol., 1983, tom . 5, 377-382 [0377] • CHEN J.C. Biotechnology techniques, 1998, tom . 12 (10), 751-761 [0377] • RICCIO M.L. et al. J. Appl. Microbiol., 1997, tom . 82, 177-185 [0377] • SANDBERG A.S. ; AHDERINNE R. J. Food Sci., tom . 51 (3), 547-550 [0381]

rzeczpospolita tŁumaczenie patentu …public.sds.tiktalik.com/patenty/pdf/262075.pdf ·...

Documents