s. 1 © hitec zang gmbh - hre respiration activity monitoring system bioprozessoptimierung
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RRespirationespiration AActivityctivity MoMonitoringnitoring SSystemystem
Bioprozessoptimierung
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Online – Bestimmung der Atmungsaktivitäten
(OTR, CTR, RQ)in Schüttelkolben
Bioprozessoptimierung
RRespirationespiration AActivityctivity MoMonitoringnitoring SSystemystem
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Das Tablar
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Anwendungsgebiete
Online-Verfolgung der Stoffwechselaktivitätvon pro- und eukaryotischen Kulturen in Schüttelreaktoren
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Einfache Ermittlung von Kenngrößen:
Sauerstofftransferrate (OTR)Kohlendioxidtransferrate (CTR)Respirationsquotient (RQ)maximale Wachstumsrate (µmax)volumetrischer Sauerstoffübergangskoeffizient (kLa)…,
die ein sicheres Scale–Up ermöglichen.
Anwendungsgebiete
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Unlimitiertes Wachstum auf Minimalmedium Sauerstofflimitierung
Produktinhibierung( z.B. pH, Temp.) Diauxie
Fermentationszeit
Sau
erst
offtr
ansf
erra
te
Fermentationszeit
Sau
erst
offtr
ansf
erra
te
Fermentationszeit
Sau
erst
offtr
ansf
erra
te
Fermentationszeit
Sau
erst
offtr
ansf
erra
te
maximale Sauerstoff-
transferkapazität
gesamterSauerstoffverbrauch[mol/l]
=
Substratlimitierung(außer C-Quelle)
Fermentationszeit
Sau
erst
offtr
ansf
erra
te
Schnelle Erkennung von charakteristischenbiologischen Phänomenen. OTR Verläufe:
Anwendungsgebiete
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Schnelle Erkennung von charakteristischenbiologischen Phänomenen.CTR-Verläufe:
Anwendungsgebiete
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Ermittlung geeigneter Bedingungen für daskonventionelle Massenscreening(Versuchsdauer, Medien, Betriebsbedingungen …)
Optimieren von Substratkonzentrationen undReduzierung der Entwicklungszeiten für Medien
Bilanzieren von Fermentationen (Toxizitäts- undProliferationsassays)
Wachstumskontrolle unter sterilen Bedingungen
Gezielte Probennahme nach der Sauerstofftransferrate
Qualitätskontrolle
Anwendungsgebiete
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Online-Abgasanalytik
gerührterBioreaktor
OTRCTRRQ
online
geschüttelterBioreaktor
Stand der Technik
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Motivation
„Die Nachteile des Schüttelkolbens als Experimentiersystem, sind die, dass der
Experimentator nur sehr begrenzte Möglichkeiten der Überwachung und
Regelung hat.“Payne et al., 1990
„Die Schwäche von small-scale Flüssigfermentationen:
diskontinuierliche Überwachung“Hilton, 1999
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Was wird gemessen?
Kohlenstoffquelle(Glutamin, Glucose, ...)
Stickstoffquelle(Ammonium, Harnstoff, Hefeextrakt, Pepton, ...)
Phosphorquelle(Phosphat, Phytin)
Schwefelquelle(Sulfat, Cystein, ...)
Spurenelemente, Vitamine
Kohlendioxid
Sauerstoff
Produkt(Alkohol, Proteine, Aminosäuren, ...)
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Unbekannter Fermentationsverlauf
?Zeit
Kulturverlauf
Versuchsende
A
B
Normaler Schüttelkolben:
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BekannterFermentationsverlauf
B
A
Zeit
Kulturverlauf
Versuchsende
A
B
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bestimmt online die Atmungsaktivitäten (OTR, CTR, RQ)
von aeroben Mikroorganismenin Schüttelkolben unter sterilen
Bedingungen
Lösung
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Klare Vorteile
Mehr Informationen über die mikrobiologischenProzesse im Schüttelkolben
Schnelle Charakterisierung und gezielte Optimierung von Medien
Ersetzt teure Versuche im Fermenter
Paralleltechnik (Zeit, Vergleichbarkeit, …)
Schafft optimale Screeningbedingungen
Erkennung des optimalen Inokulierungszeitpunktes
Quasi-Non-Stop-Betrieb durch sehr kurze Rüstzeiten
Reduzierung der Versuchsdauer auf die tatsächlicherforderliche ZeitUnterscheidung betriebsbedingter und biologischer Effekte
Einfache Handhabung
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Messkolben
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Beispielfermentationen
Tierische Zellkultur Hybridoma (50 mL Kulturvolumen)
Ermittlung der optimalen Inokulierungs– und Fed-Batch– Startzeit
Fermentationszeit [h]
OTR
/CTR
[m
ol/(
L·h)
]
Zelld
icht
e [N
/mL]
0 50 100 150 200
OTRCTRZelldichte
Glutamin- undGlucoseverbrauch Glucoseverbrauch
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Medienoptimierung am Beispiel: Osmolalitätsoptimum
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
0,03
0,22 0,24 0,26 0,28 0,3 0,32 0,34 0,36 0,38
Wac
hstu
msr
ate
µ [h
-1]
Osmolalität [osmol/kg]
Das Osmolalitätsoptimumliegt bei 0,318 osmol/kg
Beispielfermentationen
Tierische Zellkultur Hybridoma (50 mL Kulturvolumen)
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Tierische Zellkultur Hybridoma
Vergleich von RAMOS mit einem Rührkesselfermenter mit Abgasanalytik
Fermentationszeit [h]Fermentationszeit [h]
OTR
[m
ol/(
L·h)
]
0 20 40 60 80
Rührkesselfermenter (2 Liter Kulturvolumen)RAMOS (0,05 Liter Kulturvolumen)
Dipl.-Ing. M. Canzoneri
Beispielfermentationen
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Bakterium Corynebacterium glutamicum
Einfluss verschiedener Flüssigkeitsvolumina
Fermentationszeit [h]
Kolben 1 : 10 mLKolben 2 : 15 mLKolben 3 : 20 mLKolben 4 : 30 mLKolben 5 : 40 mLKolben 6 : 50 mL
Sauerstofflimitierung
OTR
[m
ol/(
L·h)
]
Beispielfermentationen
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Einfluss verschiedenerSubstratkonzentrationen
Bakterium Pseudomonas fluorescensO
TR [
mol
/(L·
h)]
1x konzentriert2x konzentriert4x konzentriert
Fermentationszeit [h]
Beispielfermentationen
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Medium- und Prozessoptimierung
OTR
[m
ol/(
L·h)
]
Fermentationszeit [h]
Medium mit 100% Komp. 1,30 mL FlüssigkeitMedium mit 200% Komp. 1,30 mL FlüssigkeitMedium mit 200% Komp. 1,20 mL Flüssigkeit
Hefe Hansenula polymorpha
Beispielfermentationen
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Tierische Zellkultur Hybridoma
Zellwachstum innerhalb eines RAMOS-Versuchs
Beispielfermentationen
Dipl.-Ing. M. Canzoneri
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Tierische Zellkultur Hybridoma
Zellwachstum innerhalb eines RAMOS-Versuchs
Fermentationszeit [h]Fermentationszeit [h]
Zelld
icht
e [N
/ml]
0 40 80 120 160
8-fach Parallelmessung
Beispielfermentationen
Dipl.-Ing. M. Canzoneri
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Handhabungsvorteile
Geringer Platzbedarf –RAMOS passt auf einen normalen Labortisch
Einfaches und schnell erlernbares Handling
Komplett automatisierte Anwendersoftware
Quasi-Non-Stop-Betrieb durch sehr kurze Rüstzeiten
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Bedienoberfläche
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Kolbenübersicht
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Sauerstofftransferrate (OTR)
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Detailansicht für jedeneinzelnen Kolben (OTR, CTR, RQ)
lag-Phase
Sauerstofflimitierung
C-Quelle (Glucose)verbraucht
Ethanol verbrauchtexp-Phase
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O2-, CO2 - Transfer
Sauerstofftransfer (OT) Kohlendioxidtransfer (CT)
Bilanzierung des gesamtenSauerstofftransfers über den Fermentationsverlauf
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Wachstumsrate µ
maximale Wachstumsrate µmaximale Wachstumsrate µ
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OTR CTR
Bringen Sie Licht in Ihre ProzesseBringen Sie Licht in Ihre Prozesse
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Wirtschaftlichkeitsbetrachtung
Optimierung der Fermentationszeit
Amortisationszeit: ca. 6 Monate
OTR
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ol/(
L·h)
]
Fermentationszeit [h]
Medium mit 100% Komp. 1,30 ml Flüssigkeit
Medium mit 200% Komp. 1,30 ml FlüssigkeitMedium mit 200% Komp. 1,20 ml Flüssigkeit
Zusatznutzen: Vermeidung von Fehloptimierungen
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Zellkultur (Hybridoma)• Dosierung
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FTT® Fluid-Train System• Dosierung und Probenahme
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FTT® Fluid-Train System• Geregelte Dosierung
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● Bestimmung von RQ durch OUR, CER online Messungen● exakte Fütterung der Kulturen● signifikant erhöhte Produktionsrate● Verkürzung der Fermentationszeiten
RQFeed™
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● Reproduzierbare biomechanische Messung● Personalisierte Medikamenten- und Toxinforschung ● Ersatz für Tierversuche● Integrierte, vollautomatische und heißsterilisierbare Pipettiereinheit● 24 - 96 Multiwell Einheit mit integrierter Sensorik
CellDrum™ - Zellkraftmessung
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● 1 bis 8(5) Messkanäle für 1 bis 4 Fermenter● Hochauflösende Messung (-c Version)● Feuchtekorrektur (-c Version)● „Echte“ OUR, CER und RQ Messung (-c Version)● Geringe Querempfindlichkeit● Überdruck möglich● Verschleißfreie Sensorik● Kompakt● Zusatzfunktionen integrierbar● Opt. frei programmierbar● Viele Kopplungsmöglichkeiten ● Datenexport möglich
HiSense™ - Präzisionsabgasanalytik
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Zellkultur (Hybridoma)• Ohne Dosierung
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Zellkultur (Hybridoma)• Dosierung auf OTR geregelt ab RQ < 1
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Zellkultur (Hybridoma)• Dosierprogramm
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Zellkultur (Hybridoma)• Parametrierung der Probenahme
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Kooperationen und VeröffentlichungenKooperationen:
Veröffentlichungen:Anderlei T., Büchs J., Device for sterile online measurement of the oxygen transferrate in shaking flasks, Biochem. Eng. J. 7(2), 157-162, 2001 Stöckmann Ch., Maier U., Anderlei T., Knocke Ch., Gellissen G., Büchs J.,The Oxygen Transfer Rate as Key Parameter for the Characterisation of Hansenula polymorphaScreening Cultures, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 30, 613-622, 2003 Anderlei T., Zang W., Büchs J., Online respiration activity measurement (OTR, CTR, RQ)in shake flasks, Biochem. Eng. J. 17(3), 187-194, 2004 Lotter St., Büchs J. Utilization of power input measurements for optimisation of cultureconditions in shaking flasks, Biochem. Eng. J. 17(3), 195-204, 2004 Losen M., Lingen B., Pohl M., BüchsJ., Effect of oxygen-limitation and medium compositionon Escherichia coli in small-scale cultures, Biotechnol. Progress. (accepted)
Fachhochschule Aachen, Abteilung JülichLabor für ZellkulturtechnikProf. Dr. Manfred Biselli
Technische Hochschule Aachen,Lehrstuhl für BioverfahrenstechnikProf. Dr.-Ing. Jochen Büchs