SECUENCIACIÓN DEL ADN

¿QUÉ ES Y EN QUE CONSISTE LA DE SECUENCIACIÓN DE ADN?

Es una técnica en la que se hace un análisis más detallado de la estructura del ADN y consiste en un conjunto de técnicas y métodos bioquímicos que nos permiten averiguar la secuencia de los nucleótidos (A, C, G, T) en el ADN.

ANTECEDENTES A finales de la década de 1970 se

desarrollaron dos métodos que permitían la secuenciación de una molécula de ADN de una manera sencilla y rápida. Al principio, la idea consistía en imitar los clásicos métodos de secuenciación de proteínas, donde las moléculas eran fragmentadas y analizada su composición en función de sus características fisicoquímicas, deduciendo asi su secuencia a partir de fragmentos solapantes.

En 1977, los grupos de A. Maxam y W. Gilbert por un lado, y de F. Sanger por otro desarrollaron sendos métodos de secuenciación específicos para el ADN.

El método de degradación química por Maxam y Gilbert, en 1977

En 1977 Frederick Sanger (galardonado con el Nobel de Química en 1980, con Walter Gilbert y Paul Berg) desarrolla y ´publica las técnicas de secuenciación del ADN, mediante el que pasaría a conocerse como método de los terminadores de cadena o dedeoxi (didesoxi).

En 1986 este método es mejorado por el biólogo molecular estadounidense Leroy Hood con la automatización de las etapas de secuenciación del ADN y el análisis computarizado de los geles obtenidos, incorporando ordenadores y laser en este proceso

MÉTODO ENZIMÁTICO DE SANGER

Conocido como método de los terminadores de cadena o dideoxi, se basa en el uso de dideoxinucleótidos (ddNTP)que se diferencian de los deoxinucleotidos (dNTP) en que carecen del grupo –OH en el carbono 3´ de la ribosa.

Para obtener la secuencia de bases nitrogenadas de un segmento de ADN por este método, se necesitan los siguientes compuestos:

El ADN molde o segmento de ADN que se desea secuenciar.

Un enzima que replique el ADN, normalmente la ADN Polimerasa I del bacteriofago T4.

Un cebador o "primer". El "primer" utilizado suele marcarse radiactivamente.

Los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP).

Por último, se necesitan nucleótidos didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP).

EL MÉTODO DE DEGRADACIÓN QUÍMICA (MAXAM AND GILBERT, 1977).

En este método, un fragmento de ADN de cadena doble o sencilla se marca en los extremos 5´ o 3´ de una o ambas hebras con 32 P (fosforo radioactivo). Después, la muestra de ADN se divide en cuatro alícuotas y se fragmenta en cuatro reacciones químicas distintas. Posteriormente, los fragmentos de ADN generados pueden ser separados por electroforesis en cuatro carriles distintos con base en su tamaño. Conociendo el nucleótido en el que se realizaron los cortes, se puede inferir la secuencia de la molécula original

Las reacciones químicas que se utilizan para fragmentar la molécula de ADN son::

1. Corte de las purinas. 2. Corte de adeninas. 3. Corte de pirimidinas. 4. Corte de citosina.

MÉTODOS CONTEMPORÁNEOS EN LA SECUENCIACIÓN

Avance Descripcion

Reacción en cadena de la

Polimerasa (PCR)

Técnica que permite la amplificaciónexponencial de un fragmento de ADN

Polimerasa Taq Polimerasa termoestable que puedeutilizarse en el PCR

Marcaje del ADN El marcaje y el tipo de detección utilizadopara identificar los fragmentos de ADNsintetizados

Secuenciadores automatizados

Desarrollo de máquinas automatizadascon la capacidad determinar la secuenciade miles de pares de bases por día

Algunos de los avances más importantes que han permitido el desarrollo de métodos automatizados para la secuenciación de ADN (usando el método de Sanger).

SECUENCIACIÓN AUTOMATIZADA

A finales de la década de los 80, con la automatización del ADN y el análisis computarizado de los geles obtenidos, graias a la incorporación de ordenadores y laser en el proceso, apareció la secuenciación automática.

Realmente se trata de una modificación del método de Sanger. Dicha modificación radica en el hecho de que aquí el marcaje no es radioactivo sino por fluorecencia , y en que los productos de la reacción se detectan directamente durante la electroforesis gracias a un laser que capta la fluorecencia emitida por los fluoróforos exitados.

Actualmente el proceso es automatico y requiere de un equipo llamado “secuenciador” por la labor que hace, pero el nombre correcto es “Analizador Genético”. Por razones operativas se suelen analizar cadenas de ADN de unos 500 nucleótidos como máximo.

Una vez introducida la muestra, el proceso analítico es automatico. El análisis de una muestra en un equipo tiene una duración aproximada de 2 h y 45 min, se obtiene una representación grafica cuatricolor. La representación de colores esta normalizada y siempre se utiliza el rojo para la T, el azul para la C, el negro para la G y el verde para la A.